KR101669883B1 - 냉동 분쇄된 연골로 이루어진 필러용 미세원형체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 냉동 분쇄된 연골로 이루어진 필러용 미세원형체 및 이를 포함하는 필러 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미세 원형체는 효소 또는 세척제를 이용하여 면역을 억제시키는 바 시술시 인체에 주입하더라도 면역학적으로 문제가 없으며, 반영구적으로 유지될 수 있는 효과가 있고, 국소마취가 가능한 가는 바늘의 주사에도 적용이 가능한 바, 시술시 안정성을 확보할 수 있다.

Description

냉동 분쇄된 연골로 이루어진 필러용 미세원형체의 제조방법{Method for preparing fine particle composed of frozen pulverized cartilage}

본 발명은 냉동 분쇄된 연골로 이루어진 필러용 미세원형체 및 이를 포함하는 필러 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

필러 (Filler)란 피부 속에 직접 채워주는 물질이란 뜻으로 부작용 없이 원하는 피부 부위에 특정 물질을 넣어 줄 수 있는 치료방법이다. 최근에 미용목적으로 많이 사용되고 있으며, 사용되는 대표적인 물질로는 하이알루론산, PAAG, 콜라젠, 진피조직, 근막 조직, 아테콜 등이 있이 있다. 이러한 물질은 일시적으로 흡수되는 것도 있고, 반영구적으로 유지되는 경우도 있다. 그런데 이런 물질은 일시적으로 흡수되는 것은 문제없지만, 반영구적으로 유지되는 것은 인체에는 무해하다고 실험적으로 알려져 있지만 이물질 (foreign body)이기 때문에 면역학적으로 영향을 줄 수 있다.

최근에 많이 사용되는 필러 중 아테콜은 콜라젠과 32~40 마이크론으로 가공한 PMMA (Poly Methyl Meta Acrylate) 미세원형체를 혼합한 물질로 영구적인 주름 치료 제제로 많이 사용되고 있다. 이러한 필러는 인체에 주입되어 콜라젠은 수개월에 흡수되어 없어지고, PMMA가 남아서 필러의 기능을 하게 된다. 이와 유사한 제품으로 래디어스, 레스틸렌 등의 여러 가지 필러 종류가 있으며, 이러한 다양한 필러의 차이점은 지속 기간과 같이 주입하는 미세원형체의 종류에 따라 차이가 있다. 일시적으로 필러의 작용을 하는 것은 여러 가지 종류가 있으나 필요시 반복하여 주입하여야 하기 때문에 많은 불편한 점이 있어 장기간 유지되는 필러가 필요하다. 또한, 인체에서 장기간 유지되는 필러가 일부 있기는 하나, 주입되는 물질이 인공적으로 합성한 물질이거나 다른 이물질이기 때문에 면역학적 안전성에 문제가 있을 수 있다. 상기 아테콜의 경우도, 비록 FDA에서 승인이 되어 안전성이 어느 정도 인정된다고 볼 수 있더라도, 역시 이물질 (foreign body)이기 때문에 장기간 관찰시 면역학적으로 안정성이 의문시 되고 있다.

따라서, 인체에 주입하였을 때 면역학적으로 문제가 없으면서 반영구적으로 유지될 수 있는 새로운 필러용 소재에 대한 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자는 새로운 필러용 소재의 개발을 위하여 예의 노력한 결과, 면역성을 감소시킨 연골을 이용한 필러용 미세원형체를 개발하고, 더욱이 연골에 냉동 분쇄를 도입하여 개체에 적용되는 주사바늘의 내경을 통과하는 크기의 미세한 연골을 제조하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

한국등록특허 KR 10-1182217 한국등록특허 KR 10-1351333 미국특허출원 공개공보 US2009/0209020

본 발명의 일 양상은 필러용 미세원형체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 미세원형체를 포함하는 필러 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 미세원형체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 필러용 미세원형체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 냉동 분쇄된 연골을 소재로 하는 필러용 미세원형체에 관한 것이다.

본 발명에서 필러용 미세원형체의 소재가 되는 상기 연골은 연골세포와 그것을 둘러싸는 다량의 기질로 된 뼈로서, 기질의 구성성분에 따라 초자연골·탄성연골·섬유연골로 구분된다. 본 발명에서 상기 연골은 자신이나 타인으로부터 유래되거나 동물로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 일례로, 상기 연골은 동물의 귀, 코, 갈비뼈 등으로부터 채취가 가능하다.

본 발명에서 상기 연골은 냉동 분쇄된 형태인 것을 특징으로 한다. 냉동 분쇄는 냉동 및 분쇄가 동시 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 상기 냉동은 기체 냉각 또는 액체 냉각에 의할 수 있으며, 상기 냉각기체로는 -150 ℃ 이상에서 기체상태를 유지할 수 있는 대기공기, 질소, 산소, 및 이들을 혼합한 혼합기체일 수 있으며, 냉각 액체는 대기공기, 질소, 산소, 및 이들을 혼합한 혼합기체가 액화된 상태일 수 있다. 가장 바람직하게는 액체 질소가 이용될 수 있다. 상기 분쇄는 상기 연골에 물리적 힘을 가할 수 있는 수단이면 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들면 막자사발, 드릴, 파쇄기, 믹서기 등을 이용할 수 있다.

상기의 냉동 분쇄에 의하여, 본 발명의 연골은 25 게이지의 주사기 (주사기 내경의 크기는 260㎛)에 적용될 수 있는 크기로 분쇄되며, 바람직하게는 직경이 0.1 ㎛ 내지 220 ㎛이다.

또한, 본 발명에서 상기 연골은 필러용 미세원형체의 소재로 사용되기 위해 세척 처리된 것을 특징으로 한다. 이는 자신이나 타인 또는 이종의 동물 연골을 미세원형체로 포함하는 필러를 인체에 주입하였을 때, 면역거부반응을 최소화하기 위해서이다. 본 발명에서 상기 세척 처리는 효소 또는 세척제를 이용하는 것이 바람직하다. 세척 처리에 사용되는 효소로는 DNase, RNase, 트립신, 프로테아제등이 사용될 수 있다.

또한, 세척 처리에 사용되는 세척제로는 1-3% t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (t-octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100), 도데실 황산 나트륨 (sodium dodecyl sulfate, SDS), 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산 (trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 동물의 연골, 바람직하게는 상기 자신이나 타인 또는 동물로부터 유래한 연골을 소재로 하는 미세원형체를 포함하는 필러 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 필러는 연골로 이루어진 미세원형체를 단독으로 포함할 수도 있으며, 경우에 따라서는 상기 연골로 이루어진 미세원형체 이외에도 흡수성 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 흡수성 물질로는 일반적으로 필러 시술시 필러에 포함되어 이용되며, 생체에 무해한 흡수성 물질이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 콜라젠 (collagen), 하이알루론산 (hyaluronic acid), 지방, 콜리젠 등이 있다.

상기 흡수성 물질은 단독으로 첨가될 수도 있고, 경우에 따라서는 2이상이 함께 첨가될 수도 있다.

또한 본 발명은 1) 연골을 냉동시키는 단계; 2) 상기 냉동된 연골을 분쇄하는 단계; 2) 상기 분쇄물 중 직경 220㎛ 이하의 미세원형체를 분리하는 단계; 및 3) 상기 분리된 연골을 효소 또는 세척제로 세척 처리하는 단계를 포함하는, 필러용 미세원형체의 제조방법을 제공한다.

상기 냉동 분쇄는 냉동 및 분쇄를 동시 또는 순차적으로 수행 할 수 있다.

분쇄물 중 직경 220㎛ 이하의 미세원형체를 분리하는 단계는 공극 직경이 100 내지 150 ㎛인 스트레이너 (strainer)에 통과시키는 것에 의할 수 있다. 상기 스트레이너 (strainer)는 바람직하게는 150 ㎛의 공극 직경을 갖는다. 이러한 과정을 통해 25게이지 주사기를 통과할 수 있는 직경이 220 ㎛ 이내의 필러용 연골 미세원형체를 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 미세 원형체는 효소 또는 세척제를 이용하여 면역을 억제시키는 바 시술시 인체에 주입하더라도 면역학적으로 문제가 없으며, 반영구적으로 유지될 수 있는 효과가 있고, 국소마취가 가능한 가는 바늘의 주사에도 적용이 가능한 바, 시술시 안정성을 확보할 수 있다.

도 1은 400배로 확대한 실시예의 약물 a) 처리 전 b) 처리 후 공초점 현미경 결과물이다. (MHC class II, 면역형광염색법)
도 2는 1년 후의 연골의 존재 여부를 확인하는 결과물이다. ((a)H&E의 20배 확대사진 b)H&E의 100배 확대사진)
도 3은 1년 6개월 후의 연골의 존재 여부를 확인하는 결과물이다. ((a)H&E의 20배 확대사진 b)H&E의 100배 확대사진)
도 4는 2년 후의 연골의 존재여부를 확인하는 결과물이다. ((a)H&E의 20배 확대사진 b)H&E의 100배 확대사진)
도 5는 채취한 연골을 급속 액체 질소로 냉동하여 파쇄하는 과정이다. 작은 연골 가루가 관찰된다. (a) 채취한 연골, (b) 급속 액체 질소로 냉동 시킴, (c). 연골이 파쇄되는 과정.
도 6은 파쇄된 연골 가루를 구멍의 크기가 150㎛ 인 스트레이너 (strainer, 채)에 통과 시키는 과정이다. 이러한 과정을 통해 크기가 큰 연골 가루를 제거할 수 있고, 크기가 220㎛ 이하인 연골 미세원형체를 얻을 수 있다.
도 7은 연골을 급속 냉동 파쇄한 후 150㎛ 스트레이너를 통과하여 만들어진 필러용 연골 미세원형체의 결과물이다. 크기가 작아 25 게이지 주사기에 쉽게 통과할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 필러용 미세원형체의 제조

먼저, 개의 귀로부터 연골을 채취하였다.

그런 다음, 상기 채취한 연골을 1x1cm의 크기로 절단한 후에 48시간 동안 프로테아제 억제제가 포함된 0.02% Tris/EDTA에 넣어 4 ℃에서 배양한 후, 1% Triton X-100 용액을 넣어 4 ℃, 48시간동안 배양하였다. 그 후PBS로 세척한 후 24 시간 동안 DNase, RNase가 포함된 배지에 배양하였다. 다시 48시간 동안 0.02% Tris/EDTA에 넣어 처리하고, 생리 식염수에 세척하여 면역성을 없앴다. 상기 면역성이 없어진 연골을 주사기 바늘을 통과할 수 있을 정도로 잘게 갈아서 필러용 미세원형체를 제조하였다.

실시예 2. 필러의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 필러용 미세원형체에 흡수성 물질인 콜라젠 및 하이알루론산을 혼합하여 필러를 제조하였다.

실시예 3. 면역성 실험

상기 개의 연골을 상기에서 기술한 방법으로 시행하여 연골의 면역성 감소 여부를 실험하였다. 면역 거부 반응에 중요한 MHC-II (major histocompatibility complex -II)의 발현여부를 측정하기 위해 면역형광염색법 (immunofluorescence stain) 을 사용하였다 (도 1. a, b). 상기 실시예 1의 약물을 처리하지 않은 경우에 MHC-II 가 발현되지만, 약물을 처리하면 발현되지 않았다. 개의 MHC-II 항체, 1차 항체(primary antibody) (rat anti-canine MHC-II antibody, MCA 1044; Serotec, Oxford, United Kingdom)가 발현되지 않았다.

또한, 상기에서 제조한 미세원형체를 다른 개의 성대에 주입하여 1년, 1년 6개월, 2년 후에도 존재하는 것을 발견하였다 (도 2, 3, 4).

실시예 4: 액체 질소 냉동법에 의한 연골 필러의 제조

인체에서 채취한 연골을 액체 질소에 넣어 급속 냉동시키고, 이를 잘게 부순 후 크기가 큰 연골 조각을 제거하고 일정한 크기를 유지하기 위해 구멍의 크기가 150㎛인 스트레이너 (strainer)을 통과시킨 후 분말 형태의 연골의 크기를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	액체 질소 냉동법에 의한 연골 미세원형체의 크기
평균 크기	48.6 ㎛
표준 편차	19.01 ㎛
가장 작은 크기	7 ㎛
가장 큰 크기	220 ㎛

상기에서 살펴 본 바와 같이, 액체 질소 냉동법에 의하는 경우, 연골은 25 게이지의 주사바늘의 내경인 0.26 mm보다 작은 크기의 직경을 갖는 것을 확인할 수 있다.

Claims (3)

1) 연골을 냉동시키는 단계;
2) 냉동된 연골을 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계;
3) 상기 분쇄물을 공극 직경이 100 내지 150㎛ 인 스트레이너(strainer) 에 통과시켜 직경이 150㎛ 이하인 직경 29 내지 67㎛ 의 크기를 갖는 연골을 분리하는 단계; 및
4) 분리된 연골은 분말형태이며, 이를 효소 또는 세척제로 세척하여 면역원성을 제거시키는 단계; 를 포함하는, 25 게이지 필러주사용 미세원형체의 제조방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 4) 단계의 면역원성을 제거시키는 단계는 MHC-Ⅱ(major histocompatibility complex -II)의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 25 게이지 필러주사용 미세원형체의 제조방법.

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