JP2002531182A - 多孔質複合マトリックス並びにその製造方法及び使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒアルロン酸誘導体及び加水分解コラーゲンとから形成される多孔質複合マトリックスに係わるものであって、当該多孔質複合マトリックスは、軟骨と骨組織の組織工学及び筋骨格障害の修復のために生体適合性及び生分解性を有する複合マトリックスとして使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する分野】

本発明は、筋骨格系の欠損・障害を修復するための生体適合・親和性で且つ生
分解性の複合マトリックスとして使用される、ヒアルロン酸誘導体及び加水分解
コラーゲンとから形成される多孔質複合マトリックスに係わる。

【０００２】

【従来の技術】

組織欠損・障害を再生させるためには、生体適合性があり且つ緩徐に生分解性
であるマトリックスであって、適当な条件下において導入した細胞の分化を可能
ならしめて、特異的な細胞間マトリックスを顕著に生成する前記マトリックスを
使用することが必要である。この種のマトリックスとして種々のものが、先行技
術分野においては公知である。

【０００３】 ＷＯ ９７/２７８１９号においては、スポンジ状インプラントとして使用可
能な、プリオンを含まないコラーゲン製品を調製する方法が開示されている。眼
科用途については、かかるコラーゲン製品は、５重量％のヒアルロン酸で架橋さ
せて、透明度を増大させることが出来る。このようなヒアルロン酸は更には、細
胞のインプラント内への浸潤を促進させるのである。

【０００４】 ＷＯ ９１/１８５５８号及びＷＯ ９１/１８６７号またＵＳ ４，８８０、
４２９号は、コラーゲン及び２５重量％までグリコサミノグリカン、例えばヒア
ルロン酸とから形成される複合マトリックスを開示している。

【０００５】 ＥＰ−Ａ−０ ７８４ ９８５においては、ゼラチン、ヒアルロン酸及びヒア
ルロン酸誘導体から選択される生体吸収性のある、親水性材料を含んで成る多孔
質複合製品が開示されている。早期の吸収を防止するために、当該複合製品には
、吸収遅延を行うポリマー層を付加して設けてある。

【０００６】 ＷＯ ９７/１４３７６は、コラーゲンから形成され、結合剤としてヒアルロ
ン酸を含有させることが出来る骨移植マトリックスを開示してある。

【０００７】 ＵＳ ５，６７６，９６４においては、例えば好ましくはヒアルロン酸などの
酸性多糖類を分子間及び分子内で架橋させたエステル類が開示されている。これ
らのエステルは、外科手術用製品など例えばスポンジ状の、生分解性材料として
使用することが出来るのである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】

しかしながら、これら公知の製品は、導入した細胞を分化させるために適した
培地条件を現出させるうえで顕著な制約条件が多々あり（例えば、早期の吸収、
適当でないマトリックス組成）、取り扱い上必要な安定性について充分ではない
。

【０００９】

【課題を解決するための手段】

かくして、本発明の目的の一つは、細胞分化及び細胞間マトリックス産生を促
進支援し且つそれ自体緩徐に分解されるマトリックスを提供することである。更
には、このマトリックスは、インビトロでの細胞の事前培養のみならずインビボ
での移植を行うための取り扱いに極めて適合し且つかかる取り扱いに容易となら
しめるだけの充分な安定を有しているはずのものである。

【００１０】 かかる目的が、特異的な組成を有するヒアルロン酸誘導体及び加水分解コラー
ゲンとから形成される複合マトリックスによって達成されることが見出されたの
である。

【００１１】

【発明を実施するための態様】

即ち、本発明は、多孔質複合マトリックスであって、ヒアルロン酸誘導体及び
加水分解コラーゲンとを含んで成るマトリックス形成材から合成・形成されまた
マトリックス形成材が、ヒアルロン酸誘導体と加水分解コラーゲンとの重量比率
が３０：７０乃至９９：１なる範囲において存在する前記多孔質複合マトリック
スに係わる。

【００１２】 マトリックス形成材としては、本発明に従った複合マトリックスは、重量比率
が好ましくは６０：４０乃至９９：１また特に好ましくはほぼ７０：３０である
ヒアルロン酸誘導体及び加水分解コラーゲンとを含んで成るのである。好ましく
は、該マトリックスは、ヒアルロン酸誘導体及び加水分解コラーゲンのみから合
成・形成される。

【００１３】 ヒアルロン酸誘導体の比率が３０重量％以下であるマトリックスは、安定性が
余りにも低いため技術的に不利であることが、判明したのである。

【００１４】 逆に、ヒアルロン酸誘導体及び加水分解コラーゲンとを含んで成る本発明の複
合マトリックスによって、細胞接着、マトリックスへの細胞装荷及びその後の細
胞分化を、例えば当初上記したＵＳ ５，６７６，９６４から公知であるヒアル
ロン酸誘導体１００％から成るマトリックスと比較して著しく改善することが可
能となったのである。

【００１５】 更には、分解遅延が可能である成分は、ヒアルロン酸誘導体によって当該複合
マトリックス中に直接吸収されるのである。このことによって、例えば、EP-A-0
784 985において開示された付加的コーティング・被覆処理を回避することが出
来るのであり、またそれ以外の場合必要となるコラーゲンの誘導体化は、場合に
よっては検知されているように誘導体化剤が有する毒性の故に好ましくないであ
って、このようなことも回避することが出来る。

【００１６】 加水分解コラーゲンとして適当なものは、部分及び/又は完全加水分解コラー
ゲンであり、特にゼラチン、即ち高度に加水分解されたコラーゲンである。しか
しながら、フィブリルの線に沿って凝集速度が高い形状のゼラチンも使用するこ
とが出来る。更により高度に凝集したコラーゲンは、マトリックスの安定性改善
に連なる。このような、サイズの異なる分解型を有するコラーゲンは、フィブリ
ル性コラーゲンの加水分解を緩徐に制御することによって製造することが出来る
。

【００１７】 所望ならば、かかる加水分解コラーゲンは、更に誘導体化及び/又は架橋化し
てもよい。

【００１８】 本発明に従った複合マトリックスを製造するためのヒアルロン酸誘導体として
、ヒアルロン酸エステル、例えばエチルエステルまた特にベンジルエステルが、
その生物機械的特性が優れているため好ましく、ヒアルロン酸は、そのエステル
化度が種々に異なることが可能であるからである。本発明に下がテ使用すること
が出来るヒアルロン酸エステルの例としては、アメリカ特許第5,676,064号にお
いて挙げられている。従って、このアメリカ特許の開示を本明細書の記載に合体
させることとする。

【００１９】 有利には、使用したヒアルロン酸誘導体は、その大半が疎水性である。

【００２０】 好ましいヒアルロン酸エステルは、ヒアルロン酸のベンジルエステル（HYAFF
）であり、このものは、例えばイタリアのAbano Therme社の“Fidia Advanced B
iopolymers”から注文することが出来る。ＨＹＡＦＦは、異なるエステル化度の
ものが供給されており、その中でも、ライセンス供与された創傷用包帯材料“JA
LOSKIN”として市販されている、高度エステル化ヒアルロン酸ベンジルエステル
“HYAFF 11”（１００％ベンジルエステル）が、本発明によれば好ましい。

【００２１】 しかしながら、エステル化度がより低い、その他のヒアルロン酸エステル（例
えばHYAFF 11 p 75、エステル化度がほぼ７５％であるヒアルロン酸ベンジルエ
ステル）及び／又は他のアルコールラジカル、例えばヒアルロン酸エチルエステ
ル（例えばHYAFF 7）又は種々のアルコールラジカルの混合物も使用することが
出来る。

【００２２】 本発明に係わる複合マトリックスは、多孔質であり、特に開放孔状である。好
ましくは、かかる複合マトリックスの細孔は、平均直径が１０乃至１０００μｍ
、特に５０乃至５００μｍである。細孔が余りにも大きすぎると（＞１０００μ
ｍ）、細胞を装荷した場合マトリックスからの細胞逸失・欠損が、特にスポンジ
径が小さいものについて大きくなることが判明したのである。細孔が余りにも小
さすぎると（＜１００μｍ）、強力な篩効果が認められ、細胞をマトリックスの
深部域内にまで装荷させることが出来なくなる。しかしながら、かかるマトリッ
クスについて低密度と粗性構造とを持たせることは、より小さい細孔の比率を特
定化することによって達成・実現出来る。かかる手段によって、生体内での分解
の促進を、細胞に接触可能な孔径を変えることなく達成・実現することが出来る
のである。

【００２３】 平均直径が１００乃至３５０μｍの範囲である細孔及び平均直径が３５０乃至
１０００μｍである細孔が、有利であると判明している。当該マトリックスの剃
密度及び粗性構造が所望される場合は、１０乃至１００μｍの範囲、特にほぼ５
０μｍの細孔が更に存在すればよい。孔径がほぼ同じである細孔又は孔径傾斜を
有する細孔も入手可能である。

【００２４】 本発明に従った複合マトリックスは、更に化学的又は物理的に架橋させること
が出来る。このような手段によって、複合マトリックスの生分解性は、必要に応
じて遅延させることが出来る。また、場合によって添加する添加剤が早期に溶出
するのを防止することも出来るのである。適当な架橋剤としては、例えばシアナ
ミドがあるが、このものは、タンパク質や多糖類を架橋しまた生物学的に分解さ
れた場合、尿素にまで分解される過程で外因性の、有毒残留物を生成しない。

【００２５】 本発明に従った複合マトリックスは更に、生物学的活性化合物を含有して成っ
ていてもよい。かかる化合物としては、例えば装荷細胞のマトリックス特性を最
適化させる化合物があり、例えば抗生物質、細胞接着性を改善する化合物、カル
シウム塩、誘導因子又は更に別のグリコサミノグリカン類及びその誘導体が挙げ
られる。有利には、細胞接着性は、高分子量のポリ−Ｌ−リジンの添加又はポリ
ーＬ−リジンの活性化スクシニル誘導体又はフィブロネクチン若しくはＲＧＤ配
列を有するペプチドとの混合物を用いたコーティング・被覆処理によって改善さ
せることが出来る。

【００２６】 本発明に従った複合マトリックスを骨組織障害の治療に使用するに際してその
使用を最適化するために、該マトリックスにカルシウム塩類、例えば硫酸カルシ
ウム、りん酸カルシウムや炭酸カルシウムなどを例えば懸濁液又は溶液として含
ませればよい。

【００２７】 本発明に従った複合マトリックスを移植する場合の感染リスクを低減させるた
めに、該マトリックスには抗生物質を含ませてもよい。

【００２８】 更に別の生物学的活性化合物として、本発明に従ったマトリックスには、例え
ば筋骨格障害の修復を最適化させるための誘導因子、特に例えばｂＦＧＦ（線維
芽細胞成長因子、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）やＴＧＦｂｅｔａ（形質転換
成長因子）などのサイトカイン類を含有させてもよい。

【００２９】 本複合マトリックスは、軟骨細胞、間葉幹細胞とその前駆細胞、骨芽細胞及び
結合織細胞から生じた分化組織をインビトロ及びインビボで発生・生成させるた
めに特に適している。本発明は従って、これらの細胞をも含んで成る複合マトリ
ックスにも係わるのである。

【００３０】 本発明の又別の局面は、上記した多孔質の複合マトリックスを製造するための
方法である。この方法は、ヒアルロン酸誘導体及び加水分解コラーゲンを適当な
第一の溶媒に溶解するか又は懸濁させ、該マトリックス形成材であるヒアルロン
酸誘導体及び加水分解コラーゲンが実質的に不溶である第二の溶媒に可溶である
が、第一の溶媒に実質的に不溶であり且つ平均粒径分布が製造される複合マトリ
ックスの所望細孔粒径の範囲内にある微粉質化合物を該溶液又は懸濁液に添加し
、第一の溶媒を除去し、次いで微粉質化合物は可溶であるものの、マトリックス
形成材は実質的に不溶である第二の溶媒に該微粉質化合物を溶解させることから
成る。

【００３１】 適当な第一の溶媒は、特に１，１，１，３，３，３―ヘキサフルオロイソプロ
パノール（ＨＦＩＰ）である。この溶媒は、エステル化ヒアルロン酸、加水分解
コラーゲン（ゼラチン）及び成長因子類やカルシウム化合物など特異的な要件に
必要なその他物質を室温で同時に溶解させるか又は懸濁させることが出来る揮発
性の高い液体である。加水分解コラーゲンの分子単位が大きければ大きいほど、
ＨＦＩＰに対する溶解性はそれだけ低くなる。フィブリル状コラーゲンは、もや
は溶解することはない。

【００３２】 これら出発物質の第一溶媒中の濃度は、本発明に従った方法にとっては重要で
はなく、取り扱い容易な溶液又は懸濁液が得られる限り、変化させることが出来
る。このことは、第一溶媒中での個別の成分の濃度とこれら成分の全濃度の双方
に係わるものである。ヒアルロン酸誘導体と加水分解コラーゲンの個々の濃度が
、最終製品中におけるこれらの成分の重量比率を決定するのである。最終的には
第一の溶媒は、最終製品から除去するので、全濃度が、最終製品の密度及び強度
を決定することになる。

【００３３】 本発明に従った複合マトリックスを取り扱ううえで、湿潤状態でのその機械的
強度が、重要な役割を果たす。複合マトリックスの強度は、当該マトリックス中
でのヒアルロン酸誘導体含有量が高い場合最大となるが、その理由は、この場合
当該マトリックスの膨潤が最低となるからである。加水分解コラーゲン含有量が
増加するにつれて、複合マトリックスは、より一層強く膨潤し、そのため安定性
は低くなる。

【００３４】 好ましくは、５重量％のＨＹＡＦＦが、本発明に従った方法においてはＨＦＩ
Ｐに溶解される。これによって、ゼラチンは、例えば７．５重量％まで変動可能
な濃度で混合することが出来るのであって、その結果溶液中でのマトリックス形
成材の全濃度として１２．５重量％もの高い値が実現されるのである。このよう
な原因で、強度の低下が、大きな膨潤で補償されるのである。全濃度が１２．５
重量％以上である溶液は、極めて粘度が高く、取り扱いが困難である。従って、
最終製品中におけるゼラチン含有量は、ＨＹＡＦＦ含有量を低下させた場合に限
って増加させることが出来る。しかしながら、ＨＹＡＦＦ含有量を低下させれば
（例えば、個別濃度が２，７７重量％であり且つ溶液中におけるマトリックス形
成材の全濃度が9．23重量％とした場合―このことは、ＨＹＡＦＦ対ゼラチンの
重量比率が３０：７０に相当する）、該マトリックスの安定性は低下し、しかも
生体適合性は改善されることはない。

【００３５】 原則として、ゼラチンの添加は、該マトリックスの持つ生体適合性及び組織発
生性に対しては正の効果を及ぼすものである。ヒアルロン酸誘導体と加水分解コ
ラーゲンとの重量比率がほぼ７０：３０であることが、インビトロ及びインビボ
で安定であることが判明しているが、用途によって、例えば軟骨の形成又は骨組
織の再生のためには、最適重量比率は９９：１乃至６０：４０の範囲にあればよ
い。

【００３６】 細孔形成は、第一の溶媒に実質的に不溶である微粉質化合物を添加して行われ
る。ＨＥＩＰを第一溶媒として使用した場合、例えば塩化ナトリウムが細孔形成
のための微粉質化合物として適当である。塩化ナトリウムは、実質的にＨＥＩＰ
には不溶であり、そのうえ無毒であり且つ安価である。

【００３７】 塩化ナトリウム以外に、水溶性であるがＨＦＩＰには不溶であるアルカリ金
属塩又はアルカリ土塁金属塩、特にハロゲン化物が、ＨＦＩＰを使用した場合第
一の溶媒として適当である。しかしながら上記した理由によって、塩化ナトリウ
ムが好ましい。

【００３８】 該微粉質化合物の添加量によって、細孔数が決定され、従って製造されるマト
リックスの密度及び強度も決定されることになる。溶液又は懸濁液と塩化ナトリ
ウム結晶との重量比率として１：２が有利であることが判明した。

【００３９】 細孔粒径は、該微粉質化合物の粒子径を選択することによって決定される。市
販の塩化ナトリウムは主として、直径が500乃至１０００μｍである粒子である
が、より小さい粒径分画は、大きい粒子を乳鉢で摩砕し、次いで計測補正した篩
でふるい掛けすることによって容易に製造することが出来る。

【００４０】 HYAFF、ゼラチン及び塩化ナトリウム結晶の混合物は、濃厚ペーストとして均
質性を有する。例えば不活性のプラスチック（PTFE、PE、PVC）をモールド内にお
いてダイス型でプレス成型することによって、形状を諸々の要件に適合せしめた
マトリックス成形品を製造することが可能である。ＨＦＩＰは溶媒としては極め
て揮発性が高いため、当該混合物の急速な乾燥が生起する。そのため、混合物は
、密閉容器内に保存して、可能な限り早急に加工処理するべきである。乾燥は、
例えばドラフトで一晩行い、次いで真空下数時間行えばよい。当該複合マトリッ
クスは次いでモールドから取り出すことが出来る。

【００４１】 この混合物は乾燥過程でめったに収縮しないので、当該マトリックスを離型す
ることには多大の困難を伴う。従って、モールドは、乾燥内容物がラムで強制的
に取り出すことが出来るように設計するべきである。例えば、直径が３乃至１８
ｍｍであり且つ高さが２乃至１５ｍｍである円柱状のマトリックスは、容易に製
造することが出来る。より大型のマトリックスブロックを製造するために、分解
・解体可能な壁部と底面部とから組み立てられる立体状の、トラフ形状モールド
が特に適当であることが判明している。

【００４２】 本発明に従った複合マトリックスの細孔は、微粉質化合物が溶解するが、マト
リックス形成材は実質的に不溶である第二の溶媒中に微粉質化合物を溶解させる
ことによって得られる。塩化ナトリウム結晶を微粉質化合物として使用した場合
、適当な第二の溶媒は、特に水である。純水中で繰り返し洗浄することによって
、この塩及び場合によってはなお付着する痕跡量のＨＦＩＰが除去される。少量
の試料の場合、各１５分間浸漬後第二の溶媒を四回取り替え交換することが望ま
しく、また大量の試料の場合は各回20分間の浸漬後6回の溶媒を交換することが
薦められる。第一の溶媒を蒸発させることによって複合マトリックスの一回目の
乾燥を行う場合、塩の粒子を含んだ密閉細孔(closed pores)が、主として製造さ
れる。洗浄工程においては、マトリックスの半透性物質が膨潤し、浸透圧活性が
極めて高い塩溶液が、細孔中において形成される。その結果、水を更に吸収した
場合、このような細孔は破裂し、マトリックスは最終的には開放細孔となる。

【００４３】 所望ならば、かかる複合マトリックスは更に、製造中に又は製造後に上記にて
例示した生物学的活性化合物を載荷させることが出来る。有利には、かかる生物
学的活性化合物は、微粉質化合物の添加に先立って当該マトリックスの溶液又は
懸濁液に添加するのである。

【００４４】 このように製造された複合マトリックスは、有利には次に乾燥される。乾燥は
、例えばアセトン中に濃度を増やしながら（５０％、８０％、１００％）浸漬し
、ろ紙に吸い取らせ次いで真空下で乾燥することによって行うことが出来る。

【００４５】 最後に、例えば鋭利なブレードを用いて当該複合マトリックスの表面薄層を除
くに際して、細胞の深部浸透を防止する多数の密閉細孔をこの層内に残留させる
ことが、望ましい。

【００４６】 細胞を装荷させるに先立って、該複合マトリックスは有利には滅菌処理する。
このことは、例えばアルコール、エチレンガスを用いるなど種々の公知滅菌方法
又はガンマ線滅菌によって行うことが出来る。例えば線量３５０、０００ラドの
ガンマ線滅菌が好ましい。

【００４７】 本発明に従った複合マトリックスは、軟骨細胞、間葉幹細胞及びその前駆細胞
、骨芽細胞又は結合組織細胞から分化組織をインビトロ及びインビボで生成させ
るのに適している。特異的に適合させたマトリックス組成及びマトリックス幾何
学形状のお蔭で、筋骨格系の障害の修復がことにおいて可能となるのである。

【００４８】 かくして、本発明はまた、軟骨細胞又は間葉幹細胞及びその前駆細胞から分化
組織を生成・発生させるに際して、摘出したばかり又は増幅させたばかりの細胞
を該複合マトリックスに添加し、次いで所望ならば軟骨形成性、骨形成性又は線
維芽形成性条件下で培養するために上記複合マトリックスを使用する用途にも係
わる。

【００４９】 摘出したばかりの軟膏細胞又は間葉幹細胞やその先駆細胞又はインビトロで増
幅した、脱分化軟骨細胞又は間葉幹細胞及びその前駆細胞を本発明に従った複合
マトリックスに軟骨形成性条件下で添加することによって、生物機械的に装荷可
能な関節軟骨組織を調製することが出来る。即ち、本発明に従った複合マトリッ
クスは、種々の組織型の結合・支持装置・器官、特に軟骨及び骨組織の組織工学
の目的に適している。

【００５０】 このようにして製造された生体適合性で且つ生分解性の複合マトリックスは、
インビトロでの事前培養を伴うか又は伴うことなく、インビボでの分化を行わせ
て、種々の組織型の結合・支持器官、特に異所性又は自所性移植における軟骨組
織や骨組織を得るために適している。

【００５１】 本発明に従った複合マトリックスは、例えば硝子様軟骨から得たヒト軟骨細胞
に適している。剖検及び全プロテーセの実施から得られる残滓軟骨市販品に由来
する硝子様関節軟骨が、ここで言う摘出の起源である。妊娠中絶などから得られ
る胎性軟骨細胞もまた適している。更には、骨髄、滑膜又は骨膜から得られる、
成体の間葉幹細胞及びその前駆細胞及び好ましくは例えば臍帯から得られる胎性
の間葉幹細胞やその前駆細胞も使用することが出来る。胎性の間葉幹細胞は、異
種性の移植においても拒絶反応を欠くという利点がある。また、これらは常時充
分な量だけ入手可能であり、しかも患者への侵襲を加えることなく得ることが出
来るのである。

【００５２】 本発明の更に別の局面は、本発明に従った多孔質の複合マトリックスを含んで
成るインプラントである。このようなインプラントは、好ましくは当該複合マト
リックスでコーティング・被覆処理されており、骨及び周辺結合組織内への一体
化が改善されるという利点を有する。

【００５３】 本発明に従った複合マトリックスでコーティング・被覆処理されたインプラン
トの適当な表面は、特に例えばチタン又はスチールなどの金属表面であるか、ポ
リマー又はセラミックスである。

【００５４】 本発明に従った複合マトリックスは、該マトリックスに細胞を装荷した場合、
大きさ・寸法の変化が僅かしか生起しないという利点を有する。細胞を装荷した
場合、公知のコラーゲンマトリックスは、大きさ・寸法の変化が大きい（当初は
膨潤が激しく、次いで球状形成の傾向が大きい）。しかしながら、組織工学（組
織を欠損・障害部へ導入する目的で組織をインビトロで産生させる）を使用する
ためには、当該マトリックスの寸法安定性もまた、細胞装荷と培養の後で極めて
重要である。このことは、本発明に従った複合マトリックスによって、特にマト
リックス形成材をＨＦＩＰを用いて同時に混合することによって行われる。更に
、下記する更なる利点が、本発明に従った複合マトリックスを用いれば得られる
。

【００５５】 定常培養においては、増幅軟骨細胞の複合マトリックス中での再分化が可能で
ある。軟骨に典型的なプロテオグリカン類（コンドロイチン硫酸塩、ケラタン硫
酸塩、アグレガンなど）及びコラーゲンＩＩが形成される。これらは、２、４及
び６週間培養した後検出することが可能である。

【００５６】 該複合マトリックスで培養した軟骨細胞からインビトロで産生させた産生物は
、細胞を当該マトリックスに適用した時点での出発状態と比較して生物機械的安
定性が増大している。

【００５７】 細胞が存在しない場合、当該マトリックスは、ほぼ14日後にインビトロで溶解
する。インビボでは、吸収がほぼ６−８週間後に認められる（ヌードマウス、ウ
サギ）。

【００５８】 骨髄細胞がインビトロで硝子様組織へ分化する能力が優れている。

【００５９】 ウサギ膝関節の骨軟骨障害に導入した場合、細胞マトリックス構築組織の一体
化を認めることが可能であり（細胞はこの場合、骨髄細胞又は軟骨細胞である）
、軟骨組織への分化を認めることが可能である。骨障害部においては、骨一体化
と分化が行われて新しい骨組織生成が認められる。

【００６０】 当該膝関節内での異物炎症の傾向は、一切検知されない（関節水腫も炎症細胞
の顕著な増大も認められない）。

【００６１】 細胞マトリックス構築組織をインビトロ事前培養した後ウサギの半月板損傷部
に導入することも可能であり、また当該半月板損傷の再生は良好であり、当該膝
関節内での炎症生起の傾向も全く無い。

【００６２】 ヒアルロン酸誘導体と組み合わせることによって、ゼラチン又はコラーゲンの
場合乾燥マトリックスを湿潤化させた後で生起する有害な腫脹が、発生すること
がない。このことは、一定の障害部位を修復する必要のために使用する組織工学
マトリックスにとっては有利である。

【００６３】

【実施例】

下記する実施例は、本発明を一層詳細に説明するものである。

【００６４】 実施例１ 本発明に従った複合マトリックスをＨＹＡＦＦ及びゼラチンをＨＦＩＰ中に溶
解させ、塩化ナトリウム結晶を添加し、得られたペーストを成形して乾燥し、次
いで水で繰り返し洗浄して当該塩化ナトリウムを除去することによって製造した
。乾燥した後、当該複合マトリックスをガンマ線滅菌した。

【００６５】 実施例２ 産生法の説明 一次細胞培養のために軟骨細胞を入手すること 成体関節軟骨／胎性軟骨 硝子様関節（成体／胎性）を摘出した後、直ちにＲＰＭＩ培地に移し、可及的
速やかに（２４時間以内）後処理を行った。後処理を行うために、当該軟骨を外
科用メスを用いて先ず骨から機械的に分離し、次いで粉砕処理した（最終寸法：
軟骨破片として１乃至２ｍｍの大きさ）。コラーゲナーゼ、ヒアルロニダ−ゼ及
びＤＮＡ分解酵素を用いた部分酵素消化を、絶えず旋回させながら３７℃におい
て行った。これらの酵素をＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／
ストレプトマイシン（抗生物質添加）を添加したＲＰＭＩ培地に再度腱濁させた
。最適化酵素解離間隔は、１２時間であった。当該酵素活性は、血清含有培地（
１０％ＡＢ血清添加ＲＰＭＩ又は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ）
を添加することによって緩衝させた。なお残存する細胞外マトリックス断片懸濁
液をろ過して遠心分離し、上澄みを廃棄し次いで得られた細胞ペレットを１０％
ＡＢ血清を含むＲＰＭＩ中又は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中に再度懸濁させる
ことによって抽出した。細胞数を数えて、１４乃至２１日間（培地を血清含有培
地で一週間に二度交換）の軟骨細胞の定常培養と増幅を行った。集密状態に到達
した後、細胞を通過処理した（培地を除き、０．２５％トリプシンを添加し、細
胞接着を除去してから血清含有培地を添加し、細胞懸濁液を遠心分離し、次いで
得られた細胞ペレットを新しい培地に再度懸濁させ、細胞数を計算してから改め
て細胞を播種すること）。この場合通常は1対４分割を行った。即ち、一本の培
養ビンから4本分の新たな培養ビンの細胞を得た。改めて集密状態に達した後（
ほぼ２乃至4週間）、細胞（二次培養物）を再度トリプシン処理を行って培養ビ
ンから脱離させて（上記を参照）、調製してマトリックス処理を行った。

【００６６】 しかしながら、一次培養及び三次培養（二段階の通過処理）において細胞を使
用することも可能である。

【００６７】 臍帯から得られた胎性間葉幹細胞及びその前駆細胞 当該細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養し、集密状態に達した後マ
トリックス載荷を行うための一次培養物として使用した。接着性細胞を上記した
トリプシン適用処理して再度得た。

【００６８】 骨髄から得られた成体間葉幹細胞及びその前駆細胞 骨髄を生後4ヶ月のニュージーランド野ウサギの腸骨稜から得た。１０％のウ
シ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を吸引物
に添加し、細胞数を数えた後、２ｘ１０⁶の細胞を１００ｍｍの培養皿で５％Ｃ
Ｏ₂と共に３７℃において培養した。培地を細胞の集密度が８０％になるまで一
週間に二度変えた。接着性細胞を上記したようにトリプシンで処理し、細胞数を
数えて、洗浄し次いで最終濃度が５ｘ１０⁵細胞／μｌとなるようにＤＭＥＭに
再度懸濁させた。

【００６９】 マトリックス処理： マトリックス処理を行うため、細胞ペレットを少量の培地（１ｍｍ³／μｌ）
入れた。その後、当該マトリックス（滅菌、予め乾燥済み）に一方の側から装荷
した。マトリックス中にあった空気の脱気を完全に確保した（作用時間は１乃至
５分間）。次いで、細胞濃度の高い残存培地をピペット先端を使用して減圧と加
圧を行うことによってマトリックスに移した。マトリックス中での細胞の分布が
、可能な限り一様になるように行うべきである。細胞装荷は、洗剤を使用するこ
とによって容易にすることが出来る。

【００７０】 次いで培養器中(３７℃、５％ＣＯ₂)で2時間培養を行い、これによって細胞を
マトリックスに付着・接着させた。

【００７１】 最後に、細胞―マトリックス構築組織を培地で完全に被覆し、さらに培養を行
った。

【００７２】 培養の説明 定常培養 このために下記する異なる培地を使用した： １０％ＡＢ血清（ヒト）を含むＲＰＭＩ １０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ、又は 含有量が高いグルコースと栄養物及び添加剤（ＩＴＳとピルビン酸塩+デキサ
メタゾン、アスコルビン酸及びＴＧＦ ｂｅｔａｌ）を含むダルベッコ改変イー
グル培地(B. Jonstone in Exp. Cell Res.238(1998)を参照)。

【００７３】 連続流加培養 別の培養条件は、１０％ＡＢ血清を含むＲＰＭＩ培地での連続流加培養である
。

【００７４】 実施例３ 本発明に従った複合マトリックスの細胞再装荷効率を検討するために、実施例
１に従って製造した複合マトリックスに実施例２に従って得た骨髄細胞を装荷し
た。これらマトリックスの内のいくつかは、直ちにホルマリン中に固定し、洗浄
した後パラフィン中に包埋した（グループＩ）。その他の装荷マトリックス（グ
ループＩＩ）は、ITS+premixture (Collaborative Biomechanical Products)、
ピルビン酸塩（１ｍＭ）、アスコルビン酸２−りん酸塩（３７．５μｇ／ｍｌ）
、デキサメタゾン（１０^-7Ｍ）及びＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した
ＤＭＥＭを含んで成る軟骨細胞原性培地中で14日間培養した。

【００７５】 得られた細胞懸濁液を構築組織を若干膨潤させて当該マトリックスに導入した
。グループＩから得たマトリックスのトルイジンブルー染色部を用いて、高い細
胞装荷がマトリックスの全ての細孔中にそんざいすることを証明することが可能
であった。軟骨細胞原性培養条件下で14日間保持した後（グループＩＩ）、当初
軟弱であった細胞マトリックス構築組織が、硬化した。トルイジンブルー染色部
から、顕著な異染性細胞外マトリックスが複合マトリックス全体に存在すること
が明らかとなった。この細胞外マトリックスは、コラーゲンＩＩを含有していた
。

【００７６】 実施例４ 実施例３において記載した細胞装荷複合マトリックスを免疫不全マウス（グル
ープＩＩＩ）の皮下に移植した。これらのマトリックスを実施例3において記載
した軟骨細胞原性培地にてインビトロで14日間培養し、これら移植インプラント
を3週間後に摘出し、ホルマリンに固定し、脱カルシウム処理し、パラフィンに
包埋した。

【００７７】 得た試料から５μｍ厚の円盤状物を切り出し、トルイジンブルーを用いて染色
した。染色部を骨軟骨分化度（０（マトリックス細孔中に骨も軟骨も認められな
い）乃至４（細孔の７５％以上が骨及び/又は軟骨を含む））に従って評価した
。

【００７８】 インビボで3週間保持した後、グループＩＩＩにもまたグループＩＶの移植イ
ンプラントにおいても有意の寸法変化は生起しなかった。しかしながら、インビ
トロで１４日間事前培養した移植インプラント（グループＩＶ）は、細胞装荷直
後に移植した複合マトリックス（グループＩＩＩ）よりも定性的により硬度が高
いように思われる。トルイジンブルーによる染色は、両グループの複合マトリッ
クスにおいては、細孔が軟骨と骨とで充填されており、骨軟骨分化を生成せしめ
た。しかしながら、グル−プＩＶの複合マトリックスは、骨と軟骨をより多量に
含有していた（平均評価＝４、グループＩＩＩに対する評価３と比較した）。さ
らに、グループＩＶの試料中の骨含量は、より高かった（グループＩＩＩにおけ
る骨：軟骨：線維組織比率は、４０：２０：４０であり、またグループＩＶでは
、８５：１０：５であった）。

【図面の簡単な説明】

添付した図は、本発明に従った複合マトリックスの拡大図を示す。

【図１】安定性の高い組織構造（上）及び脆弱組織構造（下）の５０倍拡大図
を示す。

【図２】同じ安定性の高い組織構造（上）及び脆弱組織構造（下）の１０0倍
拡大図を示す。

【図３】同じ安定性の高い組織構造（上）及び脆弱組織構造（下）の２０0倍
拡大図を示す。

【図4】２００倍拡大（上）及び１０００倍拡大（下）した、細孔内培養増殖
させた軟骨細胞を示す。 図１乃至３において安定性の高い組織構造は何れの場合にも、産生過程におい
て当該マトリックス成分の溶液中での全濃度をより高く維持することによって得
られたものであるが、当該全濃度は、当該脆弱組織構造に対する６．３％から安
定性の高い組織構造に対する９．２％にまで変化させた。 図4における針状構造物は、細胞外マトリックスの産生の開始を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】多孔質複合マトリックスにおいて、該マトリックスが、ヒアルロ
   ン酸誘導体及び加水分解コラーゲンとを含んで成るマトリックス形成材から構築
   され且つ該マトリックス形成材が、ヒアルロン酸と加水分解コラーゲンとの重量
   比率として３０：７０乃至９９：１の範囲で存在する、前記多孔質複合マトリッ
   クス。
2. 【請求項２】該マトリックス形成材が、ヒアルロン酸と加水分解コラーゲンと
   の重量比率として６０：４０乃至９９：１の範囲、好ましくはほぼ７０：３０の
   割合で存在する、請求項１において記載された複合マトリックス。
3. 【請求項３】該加水分解コラーゲンが、部分的に及び／又は完全に加水分解さ
   れる、前記請求項の内の何れか一項において記載された複合マトリックス。
4. 【請求項４】該加水分解コラーゲンが、更に誘導体化され及び／又は架橋化さ
   れる、前記請求項の内の何れか一項において記載された複合マトリックス。
5. 【請求項５】該ヒアルロン酸誘導体が、ヒアルロン酸エステルである、前記請
   求項の内の何れか一項において記載された複合マトリックス。
6. 【請求項６】該ヒアルロン酸エステルが、ヒアルロン酸のエチル又はベンジル
   エステルである、請求項５において記載された複合マトリックス。
7. 【請求項７】平均粒径が１０乃至１０００μｍの範囲にある細孔を含んで成る
   、前記請求項の内の何れか一項において記載された複合マトリックス。
8. 【請求項８】細孔の平均粒径が１００乃至３５０μｍの範囲にある、請求項7
   において記載された複合マトリックス。
9. 【請求項９】細孔の平均粒径が３５０乃至１０００μｍの範囲にある、請求項
   7において記載された複合マトリックス。
10. 【請求項１０】細孔の平均粒径が１０乃至１００μｍの範囲にある、請求項8
    又は9において記載された複合マトリックス。
11. 【請求項１１】架橋結合を複数有する、前記請求項の内の何れか一項において
    記載された複合マトリックス。
12. 【請求項１２】例えば抗生物質、細胞接着を改善する化合物、カルシウム塩、
    誘導因子又は更なるグルコサミノグリカン及びその誘導体などの生物学的活性化
    合物を含んで成る、前記請求項の内の何れか一項において記載された複合マトリ
    ックス。
13. 【請求項１３】軟骨細胞、間葉幹細胞及びその前駆細胞、骨芽細胞又は結合組
    織細胞を含んで成る、前記請求項の内の何れか一項に記載された複合マトリック
    ス。
14. 【請求項１４】該ヒアルロン酸誘導体及び該加水分解コラーゲンを適当な第一
    の溶媒に溶解するか又は懸濁させ、該マトリックス形成材であるヒアルロン酸誘
    導体及び加水分解コラーゲンが実質的に不溶である第二の溶媒に可溶であるが、
    第一の溶媒に実質的に不溶であり且つ平均粒径分布が製造される複合マトリック
    スの所望細孔粒径の範囲内にある微粉質化合物を該溶液又は懸濁液に添加し、第
    一の溶媒を除去し、次いで微粉質化合物は可溶であるものの、マトリックス形成
    材は実質的に不溶である第二の溶媒に該微粉質化合物を溶解させることから成る
    、請求項１乃至１３の内の何れか一項に記載された多孔質複合マトリックスの製
    造方法。
15. 【請求項１５】第一の溶媒が、１，１，１，３，３，３―ヘキサフルオロイソ
    プロパノールである、請求項１４に記載された方法。
16. 【請求項１６】微粉質化合物が、水溶性のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金
    属塩、特に例えば塩化ナトリウムなどのアルカリ金属塩である、請求項１４又は
    １５において記載された方法。
17. 【請求項１７】第二の溶媒が、水である、請求項１４乃至１６の内の何れか一
    項に記載された方法。
18. 【請求項１８】該複合マトリックスが、更に成形され、乾燥され且つ所望なら
    ば滅菌処理される、請求項１４乃至１７の内の何れか一項に記載された方法。
19. 【請求項１９】該複合マトリックスが更に、所望ならば生物学的活性化合物及
    び軟骨細胞、間葉幹細胞及びその前駆細胞、骨芽細胞又は結合組織細胞を装荷さ
    れて有する、請求項１４乃至１８の内の何れか一項に記載された方法。
20. 【請求項２０】軟骨細胞、間葉幹細胞及び前駆細胞、骨芽細胞又は結合組織細
    胞を用い、単離又は増幅したばかりの細胞を該複合マトリックスに添加し、次い
    で所望ならば軟骨細胞、骨芽細胞又は線維素を形成する条件下にて培養すること
    によって分化した組織を生成させる目的に使用する、請求項１乃至１３の内の何
    れか一項に記載された複合マトリックスの使用法。
21. 【請求項２１】種々の組織型の、特に軟骨及び骨組織から成る結合及び支持装
    置・器官のための組織工学の目的に使用する、請求項２０に記載された使用法。
22. 【請求項２２】当該細胞をインビボで分化させて種々の組織型の、特に軟骨及
    び骨組織から成る結合及び支持装置・器官とする目的に使用する、請求項２０に
    記載された使用法。
23. 【請求項２３】請求項１乃至１３の内の何れか一項に記載された多孔質複合マ
    トリックスを含んで成るインプラント。
24. 【請求項２４】請求項１乃至１３の内の何れか一項に記載された複合マトリッ
    クスをインプラント表面に塗布することから成る、請求項２３に記載されたイン
    プラントを製造する方法。