JP2013150648A - 人工軟骨の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる成形体を105〜110℃及び0 Pa〜大気圧で16〜23時間熱脱水架橋する工程を有することを特徴とする、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる人工軟骨を製造する方法。
【選択図】なし
Description
人工軟骨は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなり、15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含むのが好ましい。コラーゲン線維に、ヒアルロン酸及び/又はプロテオグリカンを添加することにより、柔軟性に優れた人工軟骨を得ることができる。人工軟骨中のコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の量は、それぞれ45〜65質量%、20〜40質量%及び2〜5質量%であるのがより好ましい。
人工軟骨を製造する本発明の方法は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる成形体を105〜110℃及び0 Pa〜大気圧で16〜23時間熱脱水架橋する工程を有する。コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる成形体は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の混合物を得る工程、及び前記混合物を凍結乾燥する工程からなるのが好ましい。なお、前記凍結乾燥物を粉砕し水に分散させた後、その分散物を再度凍結乾燥する工程を有しても良い。
コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の混合物を得る工程は、ヒアルロン酸及びコラーゲンからなる第1の組成物を得る工程と、プロテオグリカン及びコラーゲンからなる第2の組成物を得る工程と、前記第1及び第2の組成物を混合する工程とからなるのが好ましい。
得られた混合物は、熱伝導性のよい容器(金属のバット等)に入れ、-80〜-60℃で一晩以上凍結する。凍結した混合物は、棚温度-50〜-5℃程度(好ましくは-40〜-5℃)で混合物の水分(氷)がほぼなくなるまで10時間〜10日程度真空引きし(第1の乾燥)、真空引きしたまま棚温度を20〜40℃程度(好ましくは25〜40℃)に上げてさらに3〜24時間乾燥(第2の乾燥)する。このように、二段階に温度を変化させて凍結乾燥することにより、結合水までもが除去され、より乾燥されたものとなり、得られる凍結乾燥物は保存性に優れたものとなる。
得られた凍結乾燥物はミル等の固体粉砕器で粉砕する。粉砕の方法は特に限定されるものではないが、凍結乾燥物があまり高い温度にならないように行うのが好ましい。
粉砕した凍結乾燥物は3〜20質量%の濃度となるように生理食塩水と混合し、ホモジナイザー等の器具を用いて、3〜25℃及び1,000〜15,000 rpmの条件で、30秒〜3分間×1〜5回分散する。
得られた分散物は、シャーレ等の容器に入れフタをし、30〜40℃で1〜5時間静置してゲル化させる。
ゲル化させた分散物は再度凍結乾燥し成形体とする。ゲル化させた分散物を2〜10℃で1〜20時間冷蔵し、さらに-20〜-60℃程度で一晩凍結する。凍結する際には、ステンレスバット内に置いた網皿の上に容器をのせて行うのが好ましい。凍結した分散物は、前述の第1の凍結乾燥の場合と同様にして乾燥する。
凍結乾燥後の分散物は、機械的強度を高めるとともに、体内に挿入された人工軟骨を長期間に渡って保持し得るようにするため、熱脱水架橋処理を行いコラーゲン及び/又はプロテオグリカンを架橋する。熱脱水架橋は、凍結乾燥後の分散物を105〜110℃及び0 Pa〜大気圧の真空オーブン中に16〜23時間保持することにより行う。保持時間は、好ましくは16〜20時間である。
人工軟骨は紫外線、γ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理するのが好ましい。特に、25 kGy以下のガンマ線を照射することにより滅菌するのが好ましい。
(1)原料溶液の調製
5m M塩酸にコラーゲンを溶解し、1質量%コラーゲン溶液を作製した。また注射用水にプロテオグリカンを溶解し、1質量%プロテオグリカン溶液を作製し、さらに、注射用水にヒアルロン酸を溶解し、0.2質量%ヒアルロン酸溶液を作製した。なおこれらの調製は全て4℃で行った。
前記コラーゲン溶液及びプロテオグリカン溶液を、1:1(質量比)で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Aを得た。同様に、前記コラーゲン溶液及びヒアルロン酸溶液を、2:1(質量比)で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Bを得た。混合液A及びBを1.5:1(質量比)で混合し、ホモジナイザーで2,OOO rpmの回転数で1分間の攪拌を30秒のインターバルをおいて3回行った。なお攪拌は試料の温度を5℃に保温して行った。
得られた混合物をバットに流し込み-80℃で6日間凍結した後、棚温度-5℃で8日間真空引きし第1の乾燥を行った。この第1の乾燥で、混合物の水分(氷)はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに4時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
得られた凍結乾燥物をミルで粉砕した後、粉砕した凍結乾燥物を1O.7質量%となるように生理食塩水を混合し、ホモジナイザーで10,OOO rpmの条件で、1分間の分散を5回(インターバル:1分)行った。なお、ホモジナイザーによる分散は5℃に保温して行った。
得られた分散物を、自転・公転ミキサー(シンキー社製、あわとり練太郎ARE-250)で1分攪拌し、分散物中に含まれる気泡を取り除いた。
得られた分散物をガラス製のシャーレに入れフタをし、37.5℃で3時間静置してゲル化した後、5℃で3時間冷蔵した。
ステンレスパット内に置いた網皿の上に前記冷蔵した材料をシャーレごと置き-60℃で3日間凍結した後、棚温度-40℃で7日間真空引きし第1の乾燥を行った。この第1の乾燥で、混合物の水分(氷)はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに4時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
得られた凍結乾燥物を、直径4.2 mm及び厚さ4 mmに成形し、真空オーブンで真空下(0 Pa)で105℃、110℃、115℃、及び表1に示す時間条件で熱脱水架橋処理し人工軟骨を得た。
実施例1と同様にして得られた凍結乾燥物を、直径4.2 mm及び厚さ4 mmに成形し、真空オーブンで大気圧下で105℃20時間で熱脱水架橋処理して人工軟骨を得た。得られた人工軟骨は、真空下で105℃20時間で熱脱水架橋処理した人工軟骨と同様の着色及び架橋度の評価であった。
Claims (4)
- コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる人工軟骨を製造する方法であって、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる成形体を105〜110℃及び0 Pa〜大気圧で16〜23時間熱脱水架橋する工程を有することを特徴とする人工軟骨の製造方法。
- 請求項1に記載の人工軟骨の製造方法において、前記成形体は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる組成物を凍結乾燥して得ることを特徴とする方法。
- 請求項2に記載の人工軟骨の製造方法において、前記組成物が、15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の人工軟骨の製造方法において、架橋後の人工軟骨にガンマ線照射処理することを特徴とする方法。
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