WO2013035957A1 - 생체내 분해기간이 조절 가능한 생체적합성 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법 - Google Patents

생체내 분해기간이 조절 가능한 생체적합성 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법 Download PDF

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intestinal submucosa
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crosslinking agent
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윤소미
김다연
이빛나
김문석
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아주대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a biocompatible small intestinal submucosa hydrogel having a controlled in vivo degradation period, and more specifically, to a solution phase by forming a chemical crosslink by aqueous solution of a biocompatible small intestinal submucosa powder.
  • a method for preparing a biocompatible small intestinal submucosa hydrogel having a controlled in vivo degradation period and more specifically, to a solution phase by forming a chemical crosslink by aqueous solution of a biocompatible small intestinal submucosa powder.
  • stem cells are receiving attention in the field of regenerative medicine, and many studies have reported that stem cells are differentiated into various tissues by controlling the actions and functions of various cytokines. Based on these research backgrounds, it is expected to form various artificial organs such as cartilage, bone, and blood vessels by combining cells, genes and stem cells with stimulus-sensitive hydrogels.
  • Natural materials are derived from natural materials, animals and the human body and have very good biocompatibility.
  • a representative example is an extracellular matrix (ECM), which is a biomaterial extracted from a complex human body and an animal, and has characteristics that can control the function of cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the support made of natural materials has been evaluated as an ideal tissue engineering support material because it can provide excellent biofunctionality and biodegradability as well as less inflammatory response after implantation into a living body.
  • swine intestinal submucosa which can be used as a support for regenerating damaged tissue.
  • organ damage caused by various diseases sometimes treatment is performed by bone marrow transplantation or organ donation such as heart, kidney, eyeball, etc. Development is needed.
  • Tissue engineering is a field that requires mutual cooperation between disciplines applied to the regeneration of biological substitutes for the purpose of restoring or preserving lost organ function using the principles of bioscience and engineering.
  • the small intestinal submucosa of pigs is a cell-free tissue with little immune response. More than 90% is composed of collagen types I and II in the skin, and other small amounts of collagen V and VI are present.
  • the small intestinal submucosa is also an extracellular matrix (ECM) with glycosaminoglycans and fibronectin, chondroitin sulfate, heparin, heparin sulfate, hyaluronic acid and basic fibroblast growth factor-2 (FGF-2).
  • ECM extracellular matrix
  • Nerve growth factor NGF
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • EGF epidermal growth factor
  • VEGF insulin-like growth factor-1
  • ECM and cytokines in the small intestinal submucosa can be applied to many fields other than tissue regeneration by helping the functional aspects of cells such as cell adhesion, growth, migration, and differentiation.
  • the small intestinal submucosa with these characteristics was tested by Badylak at "Purdue University" in the United States, and a lot of research is being conducted with “COOK”. As a result of this research, it is currently commercialized as blood vessels of veins and arteries and implants such as dermis, epithelium and bone, regeneration of bile ducts, and implants that tighten the bladder of incontinence patients. Therefore, small intestinal submucosa is applicable to various bioreplacements, and many studies are expected as biocompatible materials.
  • injectable hydrogels have received a lot of attention in the medical field, and are expected to be widely used for the release of bioactive substances from medical fillers and organ / tissue regeneration using a three-dimensional structure.
  • Such injectable hydrogels have the advantage that they can be simply injected into a living body using a syringe or the like without a surgical procedure.
  • injectable hydrogels have a fluid-like characteristic outside the body and can be implanted using a syringe, and gelation occurs after infusion into the body. That is, after transplantation, it may serve as a drug delivery system for sustained release of drugs or bioactive substances, or as a support for sustaining the growth of cells.
  • the general hydrogel is difficult to control the breakdown period has a lot of limitations to be used in drug delivery systems or tissue engineering. Therefore, it is important to prepare a hydrogel that can properly control the decomposition period according to the desired purpose.
  • the present invention was developed in consideration of the above situation, and the problem to be achieved by the present invention is the tissue regeneration by the presence of ECM and cytokines to help the functional aspects of cells such as cell adhesion, growth, migration, differentiation, etc.
  • tissue regeneration by the presence of ECM and cytokines to help the functional aspects of cells such as cell adhesion, growth, migration, differentiation, etc.
  • It provides a method for producing a small intestinal submucosa hydrogel, comprising chemically cross-linking the small intestine submucosa of the animal using a crosslinking agent.
  • the present invention also provides a method for forming a small intestinal submucosa drug carrier and a support, characterized in that the gel is formed by in vivo injection of the small intestinal submucosa hydrogel prepared by the above method.
  • the biocompatible small intestinal submucosa hydrogel according to the present invention can delay the decomposition time by chemical crosslinking according to the concentration of the crosslinking agent, and has an advantage of controlling the decomposition period according to the degree of crosslinking formation.
  • the small intestinal submucosa hydrogel according to the present invention has a feature that can be used as a support for drug delivery and tissue engineering to be used as an injection.
  • Example 1 is a photograph showing that the small intestinal submucosa hydrogel according to Example 1 of the present invention and gelled in vivo by injecting it into the subcutaneous of the rat.
  • Figure 2 is a photograph taken after the time elapsed after the subcutaneous intestinal submucosa hydrogel according to Example 1 of the present invention subcutaneously in rats.
  • Example 3 is a photograph taken after a week after the submucosal tissue submucosal hydrogel according to Example 1 of the present invention subcutaneously in rats and the cross-sectional SEM observation.
  • Figure 4 is a graph showing the measurement of the size (volume) of the gel over time after the subcutaneous intestinal submucosa hydrogel according to Example 1 of the present invention subcutaneously.
  • FIG. 5 is a photograph of H & E staining after extracting the gel after a certain time after injecting submucosal tissue hydrogel according to Example 1 of the present invention subcutaneously.
  • Example 6 is a photograph taken after a certain period of time after injecting submucosal tissue hydrogel according to Example 1 of the present invention subcutaneously to mice and ED1 immunofluorescence staining.
  • FIG. 7 is a graph showing the change in the concentration of albumin in the blood of rats over time according to Experimental Example 3 of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph taken after a certain time after injection of chondrocytes into the small intestinal submucosa hydrogel according to Experimental Example 4 of the present invention and safranin-O staining.
  • the method for producing the small intestinal submucosa hydrogel according to the present invention is characterized in that it comprises chemical cross-linking the small intestinal submucosa of animals, more specifically mammals, more specifically mammals except humans using a chemical crosslinking agent.
  • the small intestinal submucosa used in the present invention has ECM and cytokines, it can be applied to many fields besides tissue regeneration by helping the functional aspects of cells such as cell adhesion, growth, migration and differentiation.
  • the small intestinal submucosa of a mammal is separated.
  • the small intestine of a mammal is separated to remove a plant, and then immersed in saline solution and phosphate buffer solution, and then the mesenteric membrane is removed and then cut to a constant length. Invert the small intestine, remove the mucosal layer by friction, and then turn over again to remove the intestinal and muscle layers to separate the small intestinal submucosa.
  • the separated small intestinal mucosa is pulverized after freeze-drying and the ground small intestinal mucosa is mixed with an acidic solution and pepsin.
  • a basic solution to the mixed solution is titrated to pH 5.5 ⁇ 7.8, preferably pH 6.5 ⁇ pH 7.5 to prepare a biocompatible small intestinal submucosa powder capable of gel formation.
  • the acidic solution may be a solution that can be adjusted to pH 2.5 to 4.5, preferably, an aqueous solution containing 1 to 5% by weight of an acid selected from acetic acid, paratoluenesulphonic acid and maleic acid is used.
  • the basic solution is used to titrate acidity and to reduce the inflammatory response of surrounding cells when used as a subcutaneous injection or tissue engineering support, for example sodium hydroxide (NaOH), sodium carbonate (Na2CO3), sodium hydrogencarbonate (NaHCO3), disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4), calcium hydrogen carbonate (Ca (HCO3) 2), calcium hydroxide (Ca (OH) 2), calcium hydroxide (Ca (OH) NO3), calcium hydroxide (Ca (OH) Cl ), Cyan calcium hydroxide (Ca (OH) CN), potassium hydroxide (KOH), ammonium hydroxide (NH4OH) and sodium acetate (CH3COONa) may be used one or two or more.
  • This basic solution is titrated to adjust to an in vivo pH of pH 5.5-7.7.
  • the prepared small intestinal submucosa solution is easily decomposed by body fluids when injected into a living body, it is possible to increase the maintenance period of the gel through a crosslinking reaction and to control the degradation period.
  • the chemical crosslinking agent forms a crosslink between the polymer chains, thereby inhibiting the decomposition by the body fluid, thereby controlling the period of decomposition in the human body.
  • the support using natural materials can improve mechanical properties through chemical treatment such as a crosslinking agent.
  • Chemical crosslinking agents that can be used in the present invention may be selected from aldehyde compounds, water-soluble carbodiimide compounds, epoxy compounds and diisocyanates. More specifically, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbodiimide), dicyclohexyl carbodiimide, 1-ethyl-3- (2-morpholinyl-4-ethyl) carbohydrate as water-soluble carbodiimide compounds As the amide or aldehyde-based compound, formaldehyde, glutaaldehyde, dextrin aldehyde and the like are exemplified, and most preferably 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbide) (EDC).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbide)
  • the concentration of the crosslinking agent in the crosslinking reaction is preferably 0.001 mM to 1 M concentration, more preferably 0.01 to 100 mM, most preferably 0.1 to 10 mM.
  • the present invention provides a method for forming a small intestinal submucosa drug carrier and a support, characterized in that the gel is formed by injecting the prepared small intestinal submucosa hydrogel in vivo.
  • the small intestinal submucosa according to the present invention is an injection-type hydrogel that can control the decomposition period of the gel after forming a gel in place upon in vivo injection into an aqueous solution by forming a chemical crosslink by a crosslinking agent, and injectable drug delivery formulation. And it can be used as a histological support.
  • the inside and the outside of the plant were washed thoroughly with water, and then the plant was cut into a length of about 10 cm and placed in saline.
  • the extruded plant was subjected to physical force to remove the dense layer on the outer layer, and then turned upside down to remove the mucosal muscle layer to separate only the small intestinal submucosa layer. It was again washed with brine and stored in a -80 ° C. cooler.
  • the small intestinal submucosa stored and stored at -80 ° C as in (1) was lyophilized, and then prepared into powder of 10 to 30 ⁇ m using a freeze mill (6700, SPEX Inc., USA).
  • 1% by weight of the small intestinal submucosa in powder form was stirred for 48 hours at room temperature using 3% acetic acid, 0.1% pepsin and distilled water. Subsequently, the formed small intestinal submucosa solution was adjusted to pH 7.4 using 1N sodium hydroxide (NaOH). The pH-adjusted solution was lyophilized and then ground using a freeze mill to obtain a final biocompatible small intestinal submucosa powder.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the small intestinal submucosa powder prepared above was dissolved in 5 ml vials at 15% by weight in a phosphate buffer solution, and then 0.1 mM of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbodiimide) (EDC) as a crosslinking agent (Example 1) was used. ), 1.0 mM (Example 2), 10 mM (Example 3) was added and stirred at room temperature for 24 hours. This cross-linked small intestinal submucosa solution was confirmed to form a hydrogel capable of injection.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbodiimide)
  • Example (3) 15% by weight of the small intestinal submucosa powder prepared in Example (3) was dissolved in phosphate buffer solution to prepare an injection formulation.
  • the small intestinal submucosa powder prepared in Examples 1 to 3 was sterilized with ethylene oxide gas and then injected into an in vivo formulation (FIG. 1).
  • Example 1 The gel formed in Example 1 was excised at 1, 2, and 4 weeks, fixed in a 10% formalin solution, and prepared as a paraffin block. Paraffin blocks were sectioned on slides at 4 ⁇ m and subjected to H & E and ED1 staining for histological evaluation.
  • H & E staining is the most basic staining method. Hematoxylin, which is specifically stained at the nucleus of cells, and eosin, which is stained at the cytoplasm, is a staining method that can identify the characteristics of the nucleus and cytoplasm. Proceed to confirm the behavior and morphology (FIG. 5). In addition, ED1 (mouse anti rat CD68; Serotec, UK) expression was confirmed to confirm the inflammatory response of the implanted formulation (Fig. 6). The experiment confirmed that the gel of the present invention is biocompatible and does not cause an immune inflammatory response, thereby confirming that it can be used as a tissue engineering support.
  • the drug was mixed with the small intestinal submucosa solution obtained in Example 1 to confirm the release in vivo (FIG. 7).
  • the prepared small intestinal submucosa powder was dissolved in a phosphate buffer solution so as to be 10, 15 and 20% by weight, respectively, to make a uniform solution.
  • FITC bound albumin (FITC-BSA) was added at a concentration of 1 mg / ml, and then a fully mixed solution was prepared.
  • FITC-BSA FITC bound albumin
  • a solution containing albumin bound to the same concentration of FITC was injected 0.5 ml subcutaneously in three rats.
  • the drug was no longer released in about 1 day, whereas intestinal submucosal hydrogel containing albumin was continuously released for 9 days. Determination of the concentration of the gel removed from the implanted gel in vivo showed that the drug is continuously released until 20 days depending on the concentration of submucosal tissue.
  • chondrocytes were mixed with the small intestinal submucosa solution obtained in Example 1 to confirm in vivo cartilage differentiation (FIG. 8).
  • the prepared small intestinal submucosa powder was dissolved in a phosphate buffer solution to 15% by weight to make a uniform solution.
  • Chondrocytes were added to the small intestinal submucosa solution at a concentration of 2 X 10 6 cells / ml to prepare a completely mixed solution.
  • 0.5 ml of a small intestinal submucosa solution containing chondrocytes was injected subcutaneously into the nude mouse (male, 6 weeks old) with a syringe (21G, 1cc needle). Chondrocytes extracted through safranin-O staining were confirmed to proliferate and differentiate in the small intestinal submucosa gel.

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Abstract

본 발명은 생체적합성 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 생체적합성인 소장점막하조직 파우더를 수용액화하여 화학적 가교결합을 형성시키는 방법에 의하여 용액 상으로 형성되며 생체 내 주사시 가교의 정도에 따라 젤의 분해기간을 조절 가능하게 함을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법 및 상기 하이드로젤을 이용한 소장점막하조직 약물전달체 및 지지체의 제조방법을 제공한다.

Description

생체내 분해기간이 조절 가능한 생체적합성 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법
본 발명은 생체내 분해기간이 조절 가능한 생체적합성 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 생체적합성인 소장점막하조직 파우더를 수용액화하여 화학적 가교결합을 형성시키는 방법에 의하여 용액 상으로 생체 내 주사 시 젤이 형성되며 가교의 정도에 따라 젤의 분해기간을 조절 가능하게 함을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법 및 상기 하이드로젤을 이용한 소장점막하조직 약물 전달체 또는 지지체의 형성방법에 관한 것이다.
최근 재생의학 분야에서 줄기세포가 관심의 집중을 받고 있는데, 줄기세포는 여러 가지 사이토카인류의 작용 및 기능 조절에 의해 여러 조직으로 분화한다는 연구가 많이 보고되고 있다. 이러한 연구적 배경을 통해 세포, 유전자 및 줄기세포와 자극 감응형 하이드로젤을 복합화하게 되면 연골, 뼈, 혈관 등 다양한 인공장기의 형성이 가능할 것으로 기대되므로 이에 관한 연구가 중요시되고 있다.
천연소재는 천연물질, 동물, 인체에서 유래한 물질로서 매우 우수한 생체적합성을 가지고 있다. 대표적인 일례로 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 들 수 있는데 이는 복잡한 인체 및 동물에서 추출된 생체재료로서 세포의 기능을 제어할 수 있는 특징이 있다. 천연소재로 제작된 지지체는 생체에 이식 후 염증반응이 적을 뿐 아니라, 뛰어난 생체 기능성과 생분해성 등을 제공할 수 있어 이상적인 조직공학용 지지체의 재료로 평가받고 있다.
이러한 천연소재 물질 중에 돼지의 소장점막하조직이 있는데, 이를 이용하여 손상된 조직을 재생하기 위한 지지체로 응용할 수 있다. 상세하게는 각종 질병으로 인한 장기의 손상을 치유하기 위해 때때로 골수 이식이나 심장, 신장, 안구 등의 장기 기증 등으로 치료를 하는 경우가 있지만 수요에 비해 공급이 상당히 부족하기 때문에 조직공학을 이용한 인공장기의 개발이 필요하다. 이러한 조직공학은 생명과학과 공학의 원리를 이용하여 손실된 기관의 기능을 복원 혹은 보존을 목적으로 생물학적 대체물의 재생에 적용되는 학문간 상호 협조를 필요로 하는 분야이다.
돼지의 소장점막하조직은 세포가 존재하지 않는 조직으로 면역반응이 거의 일어나지 않으며 90% 이상이 피부에 있는 콜라겐 Ⅰ, Ⅱ 형으로 구성되어 있고 그 외에는 소량의 콜라겐 Ⅴ, Ⅵ형 등이 존재한다. 또한 소장점막하조직은 세포외기질(ECM)로서 글리코스아미노글리칸 및 피브로넥틴, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 하이아루론산과 염기성 섬유아세포 성장인자-2 (base fibroblast growth factor - 2; FGF-2), 신경성장인자 (nerve growth factor; NGF), 변환성장인자-β (transforming growth factor-β; TGF-β), 상피세포 성장인자 (epidermal growth factor; EGF), 혈관 내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor; VEGF) 및 인슐린 성장인자 (insulin-like growth factor-1; IGF-1) 등의 다양한 사이토카인을 다량 함유하고 있다.
이와 같이 소장점막하조직 내에는 ECM 및 사이토카인이 존재하기 때문에 세포의 점착이나 성장, 이동, 분화 등의 세포의 기능적인 면에 도움을 줌으로써 조직 재생 이외에도 많은 분야에 응용될 수 있다.
이러한 특징을 가지는 소장점막하조직은 미국의 "Purdue University"에 있는 Badylak에 의해 실험이 시작되었으며 "COOK"사와 더불어 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구 결과로 정맥이나 동맥의 혈관 및 진피, 상피, 뼈 등의 이식물, 담즙관의 재생, 요실금 환자의 방광을 조여 주는 이식물 등으로 현재 상용화되어있다. 그러므로 소장점막하조직은 여러 가지 생체 대체물로써 다양하게 응용가능하며 생체적합성 재료로 앞으로 많은 연구가 기대된다.
그러나 천연소재로서의 응용에는 한계가 있으므로 기계적 또는 화학적 처리에 의해 물성을 증진시켜야만 한다.
최근 주입형 하이드로젤은 의료분야에서 많은 관심을 받고 있는데, 의료용 충진제로부터 생리활성 물질의 방출 시스템, 삼차원 구조를 이용한 기관/조직재생 등 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 주입형 하이드로젤은 외과적인 수술과정 없이 주사기 등을 사용하여 간단하게 생체 내에 주입될 수 있다는 장점을 가지고 있다. 일반적으로 주입형 하이드로젤의 경우 체외에서는 유체와 같은 특성을 가지고 있어 주사기를 사용하여 이식이 가능하고, 체 내에 주입 후에는 젤화가 일어나게 된다. 즉, 이식 후에는 약물이나 생리활성물질의 지속적인 방출을 위한 약물전달시스템 또는 세포의 성장을 유지할 수 있는 지지체로서의 역할을 할 수 있다.
그러나, 일반적인 하이드로젤은 분해기간 조절이 어려워 약물전달 시스템이나 조직공학에 이용되기에는 많은 한계가 따른다. 따라서 원하는 목적에 따라 분해기간을 적절히 조절할 수 있는 하이드로젤을 제조하는 것이 중요하다.
본 발명은 상기와 같은 상황을 고려하여 개발된 것으로서, 본 발명이 이루고자 하는 과제는 세포의 점착이나 성장, 이동, 분화 등의 세포의 기능적인 면에 도움을 주는 ECM 및 사이토카인이 존재하여 조직 재생이나 상처 치유 이외에도 많은 분야에 응용될 수 있는 소장점막하조직을 이용하여 가교제를 이용한 가교형성을 통하여 쉽게 분해되지 않는 젤 형성이 가능하고, 가교제의 농도에 따라 분해기간이 조절 가능한 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위하여 본 발명은,
동물의 소장점막하조직을 가교제를 이용하여 화학적 가교시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 소장점막하조직 하이드로젤을 생체 내 주사하여 젤을 형성시키는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 약물 전달체 및 지지체의 형성방법을 제공한다.

본 발명에 따른 생체적합성인 소장점막하조직 하이드로젤은 가교제의 농도에 따라 화학적 가교에 의해 분해시간을 지연시킬 수 있으며, 가교 결합의 형성 정도에 따라 분해기간을 조절할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 소장점막하조직 하이드로젤은 주사제형으로 이용되어 약물전달체 및 조직공학용 지지체로서 사용될 수 있는 특징이 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 소장점막하조직 하이드로젤의 모습과 이를 쥐의 피하에 주입하여 생체 내에서 젤화되는 것을 확인한 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 소장점막하조직 하이드로젤을 쥐의 피하에 주입 후 시간 경과 후에 젤을 적출한 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 소장점막하조직 하이드로젤을 쥐의 피하에 주입한 후 1 주일 경과 후에 젤을 적출하고 단면을 SEM으로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 소장점막하조직 하이드로젤을 쥐의 피하에 주입 후 시간의 경과에 따른 젤의 크기(부피)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 소장점막하조직 하이드로젤을 쥐의 피하에 주입 후 일정 시간 경과 후에 젤을 적출하고 이를 H＆E 염색한 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1에 따른 소장점막하조직 하이드로젤을 을 쥐의 피하에 주입 후 일정 시간 경과 후에 젤을 적출하고 이를 ED1 면역 형광 염색한 사진이다.
도 7은 본 발명의 실험예 3에 따라 시간의 경과에 따른 쥐의 혈중 내 알부민의 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실험예 4에 따라 소장점막하조직 하이드로젤에 연골세포를 넣어 주입 후 일정 시간 경과 후에 젤을 적출하고 이를 safranin-O 염색한 사진이다.
이하 본 발명에 관하여 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법은 동물, 더욱 구체적으로는 포유류, 더욱 구체적으로는 인간을 제외한 포유류의 소장점막하조직을 화학적 가교제를 이용하여 화학적 가교시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 상기 소장점막하조직은 ECM 및 사이토카인이 존재하기 때문에 세포의 점착이나 성장, 이동, 분화 등의 세포의 기능적인 면에 도움을 줌으로써 조직재생 이외에도 많은 분야에 응용될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법을 더욱 구체적으로 설명하면,
(1) 소장점막하조직을 산성 용액 및 펩신과 혼합하여 소장점막하조직 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)에서 얻어진 용액을 염기성 용액을 이용하여 생체 적합성 pH로 조절하는 단계;
(3) 상기 (2)에서 얻어진 용액을 동결건조하여 파우더로 제조하는 단계; 및
(4) 상기 (3)에서 얻어진 파우더를 수용액화한 후 화학적 가교제를 혼합하여 가교반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
먼저, 포유류의 소장점막하조직을 분리하는데, 포유류의 소장을 분리하여 공장을 제거한 후 식염수에 침지 및 인산완충용 액에 침지하였다가 장간 막을 제거한 다음 일정한 길이로 자른다. 이렇게 자른 소장을 뒤집어 점막층을 마찰로써 제거한 후 다시 뒤집어 장막과 근육층을 제거하여 소장점막하조직을 분리한다.
상기 분리된 소장점막하조직을 동결 건조 후에 분쇄하고 분쇄된 소장점막하조직을 산성 용액 및 펩신으로 혼합시킨다. 상기 혼합 용액에 염기성 용액을 이용하여 pH 5.5 ~ 7.8, 바람직하게는 pH 6.5 ~ pH 7.5로 적정시켜 젤 형성이 가능한 생체적합성의 소장점막하조직 파우더를 제조한다.
상기 산성 용액은 pH 2.5 ~ 4.5로 조절할 수 있는 용액이면 가능하고, 바람직하게는 아세트산, 파라톨루엔설포닌산 및 말레인산 중에서 선택된 산을 1 ～ 5 중량% 농도로 포함된 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 염기성 용액은 산성을 적정시켜주고, 피하주사 또는 조직공학용 지지체로써 사용되어 질 때 주변의 세포들의 염증반응을 줄이기 위하여 사용되며, 예를 들어 수산화나트륨(NaOH), 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 탄산수소칼슘(Ca(HCO3)2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화질산칼슘(Ca(OH)NO3), 수산화염화칼슘(Ca(OH)Cl), 수산화시안칼슘(Ca(OH)CN), 수산화칼륨(KOH), 수산화암모늄(NH4OH) 및 아세트산나트륨(CH3COONa) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 이러한 염기성 용액을 적정시켜 pH 5.5 ~ 7.8의 생체내 pH와 유사하게 조절한다.
상기 제조된 소장점막하조직 용액은 생체 내에 주입 시 체액에 의해 쉽게 분해되므로 가교 반응을 통하여 젤의 유지 기간을 늘리고, 또한 분해 기간을 제어할 수 있다. 상기 화학적가교제는 고분자 사슬간의 가교결합을 형성시켜 체액에 의해 분해되는 것을 억제시켜 이것으로 인해 인체 내에서 분해되는 기간의 조절이 가능하다. 천연소재를 사용한 지지체는 가교제와 같은 화학적 처리를 통해 기계적 물성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 화학적 가교제로는 알데히드계 화합물, 수용성 카보이미드계 화합물, 에폭시화합물 및 디이소시아네이트 중에서 선택하여 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로는 수용성 카보이미드계 화합물로서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카보이미드), 디시클로헥실카보이미드, 1-에틸-3-(2-몰포리닐-4-에틸)카보이미드, 알데히드계 화합물로서 포름알데히드, 글루타알데히드, 덱스트린 알데히드 등을 예로 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카보이미드)(EDC)이다.
본 발명에 있어서, 가교반응시 상기 가교제의 농도는 0.001 mM~ 1 M 농도인 것이 효율상 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01~100mM, 가장 바람직하게는 0.1~10mM이다.
본 발명은 상기 제조된 소장점막하조직 하이드로젤을 생체 내 주사하여 젤을 형성시키는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 약물 전달체 및 지지체의 형성방법을 제공한다. 본 발명에 따른 소장점막하조직은 가교제에 의해 화학적 가교결합을 형성시켜 수용액 상으로 생체 내 주사 시 그 자리에서 젤이 형성된 후 젤의 분해기간을 조절할 수 있는 주사제형 하이드로젤로서, 주사형 약물전달 제형 및 조직공학적 지지체로 활용될 수 있다.

이하 본 발명을 아래 실시예에서 상세히 설명하지만, 본 발명의 보호범위가 하기 실시시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1~3]
(1) 돼지에서의 소장점막하조직 분리 및 보관
사후 4시간 이내의 돼지의 공장을 이용하여 지방조직을 우선 제거하고, 물로 깨끗이 공장 안과 밖을 세척한 다음, 공장을 대략 10 cm 정도의 길이로 잘라 식염수에 넣고 세척하였다. 잘라낸 공장을 물리적 힘을 가해서 바깥층에 있는 치밀층을 제거하고 다시 뒤집어서 점막 근육층을 제거하여 소장점막하조직 층만을 분리하였다. 이를 다시 식염수로 세척하고, -80 ℃ 급저온 냉각기에 보관하였다.

(2) 소장점막하조직 분말의 제조
상기 (1)에서와 같이 -80 ℃에서 보관 저장된 소장점막하조직을 동결 건조 후, 동결분쇄기(6700, SPEX Inc., USA)를 이용하여 10~30 ㎛ 크기의 분말로 제조하였다.

(3) 생체적합성 소장점막하조직 파우더의 제조
분말 형태를 갖는 소장점막하조직 1 중량%을 3%의 아세트산과 0.1%의 펩신 및 증류수를 이용하여 상온에서 48시간 동안 교반시켜 주었다. 이 후에 형성된 소장점막하조직 용액을 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 7.4를 맞추었다. pH를 맞춘 용액을 동결건조 후에 동결분쇄기를 이용해 분쇄시켜 최종 생체적합성 소장점막하조직 파우더를 얻었다.

(4) 화학적 가교제를 이용한 가교 반응
상기 제조된 소장점막하조직 파우더를 5ml 바이알에 15 중량%로 인산완충용액에 녹인 후, 가교제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카보이미드)(EDC)를 각각 0.1mM(실시예 1), 1.0mM(실시예 2), 10 mM(실시예 3)로 첨가하여 24시간 동안 상온에서 교반시켰다. 이렇게 가교된 소장점막하조직 용액은 주사제형이 가능한 하이드로젤이 형성됨을 확인하였다.

[비교예 1]
실시예 1의 (3)에서 제조된 소장점막하조직 파우더 15중량%를 인산 완충 용액에 녹여 주사제형으로 제조하였다.

실험예 1. 가교된 소장점막하조직 파우더의 in vivo 주입
상기 실시예 1~3에서 제조한 소장점막하조직 파우더를 에틸렌 옥사이드 가스로 멸균한 후 in vivo 상에서 주사제형으로 만들어 주입하였다(도 1).
SD rat(male, 8주령, 350-380 g)의 피하에 실시예 1~3에서 얻어진 하이드로젤 용액을 주사기를 이용하여 1ml 주입하였다. 비교 모델로서 비교예 1에서 얻은 가교제를 첨가하지 않은 소장점막하조직 용액을 SD rat 피하에 주입하였다.

상기에서 주입 즉시 생체 내에서 단단하게 젤이 형성됨을 확인하였다. 형성된 젤을 1, 2, 4, 6, 8 주 경과한 시점에 주사부위를 절제하여 형성된 젤의 분해 정도를 관찰하였고(도 2), 1 주 경과한 시점에 젤의 단면을 SEM이미지를 통해 관찰하였다(도 3). 가교되지 않은 소장점막하조직 용액에 비해 가교된 소장점막하조직 용액이 생체 내에서 젤이 더 단단하게 유지됨을 확인하였고, 시간의 경과에 따른 젤의 크기를 관찰하였을 때 분해가 느려짐을 확인하였다(도 4). 이는 가교제로 인한 가교가 형성되었고, 이렇게 가교된 소장점막하조직을 이용하여 젤의 분해속도 조절이 가능함을 나타낸다.

실험예 2. 소장점막하조직 젤의 조직학적 평가
상기 실시예 1에서 형성된 젤을 1, 2, 4 주 경과한 시점에 절제하여 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후 파라핀 블록으로 제조하였다. 파라핀 블록은 4 μm로 슬라이드에 절편한 후 조직학적 평가를 위하여 H＆E, ED1 염색을 실시하였다.
H＆E 염색은 가장 기본적인 염색법으로 세포의 핵에 특이적으로 염색되는 헤마톡실린(hematoxylin)과 세포질에 염색되는 에오신(eosin)을 이용한 염색법으로 핵과 세포질의 성상을 확인할 수 있는 염색법으로서 이식 체의 전체적인 세포 거동과 몰폴로지를 확인하기 위하여 진행되었다(도 5). 또한 이식된 제형의 염증 반응 확인을 위하여 ED1 (mouse anti rat CD68; Serotec, UK) 발현을 확인하였다(도 6). 상기 실험을 통하여 본 발명의 젤이 생체적합성을 가지며 면역 염증 반응을 일으키지 아니함을 확인하여 조직공학적 지지체로 이용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 3. in vivo 약물 방출 실험
약물 전달체로서의 가능성을 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 얻은 소장점막하조직 용액에 약물을 혼합하여 생체 내 방출을 확인하였다(도 7). 상기 제조된 소장점막하조직 파우더를 인산완충용액에 각각 10, 15, 20 중량%가 되도록 녹여 균일한 용액을 만들었다. FITC가 결합된 알부민(FITC-BSA)을 1 mg/ml 의 농도로 첨가한 후 완전히 혼합된 용액을 제조하였다. SD rat(male, 8주령, 350-380 g) 9마리의 피하에 알부민을 함유한 소장점막하조직 용액을 주사기(21G, 1 cc needle)로 0.5 ml 주입하였다. 또한, 비교 모델로서 동일한 농도의 FITC가 결합된 알부민을 함유한 용액을 3마리의 쥐의 피하에 0.5 ml 주입하였다. 알부민만을 직접 쥐의 피하에 주사한 경우는 약 1일 만에 더 이상 약물이 방출되지 않는 반면, 알부민을 함유한 소장점막하조직 하이드로젤의 경우 9일 정도의 약물이 지속적으로 방출됨을 확인하였고, 또한 생체내에 이식된 젤을 제거한 젤의 농도 측정을 통해 소장점막하조직의 농도에 따라 20일까지 약물이 지속적으로 방출됨을 알 수 있었다.

실험예 4. in vivo 연골세포 전달체 실험
세포 전달체로서의 가능성을 확인하기 위하여 상기 실시에 1에서 얻은 소장점막하조직 용액에 연골세포를 혼합하여 생체 내 연골분화를 확인하였다(도 8). 상기 제조된 소장점막하조직 파우더를 인산완충용액에 15 중량%가 되도록 녹여 균일한 용액을 만들었다. 연골세포를 2 X 106cells/ml의 농도로 소장점막하조직 용액에 첨가한 후 완전히 혼합된 용액을 제조하였다. Nude mouse(male, 6주령)의 피하에 연골세포를 함유한 소장점막하조직 용액을 주사기(21G, 1cc needle)로 0.5 ml 주입하였다. 적출하여 safranin-O 염색을 통해 주입한 연골세포가 소장점막하조직 젤 내에서 증식과 분화된 것을 확인하였다.

본 발명의 기술적 사상 또는 범위 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다. 따라서, 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위 및 그 동등범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (7)

  1. 인간을 제외한 동물의 소장점막하조직을 화학적 가교제를 이용하여 화학적 가교시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법.

  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제조방법은
    (1) 소장점막하조직을 산성 용액 및 펩신과 혼합하여 소장점막하조직 용액을 제조하는 단계;
    (2) 상기 (1)에서 얻어진 용액을 염기성 용액을 이용하여 생체 적합성 pH로 조절하는 단계;
    (3) 상기 (2)에서 얻어진 용액을 동결건조하여 파우더로 제조하는 단계; 및
    (4) 상기 (3)에서 얻어진 파우더를 수용액화한 후 화학적 가교제를 혼합하여 가교반응시키는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법.

  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 화학적 가교제는 알데히드계 화합물, 수용성 카보이미드계 화합물, 에폭시화합물 및 디이소시아네이트 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법.

  4. 청구항 3에 있어서, 상기 화학적 가교제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카보이미드), 포름알데히드, 글루타알데히드, 덱스트린 알데히드 또는 디시클로헥실카보이미드, 1-에틸-3-(2-몰포리닐-4-에틸)카보이미드인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법.



  5. 청구항 2에 있어서, 상기 (2)의 생체 적합성 pH는 pH 5.5~7.8인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법.

  6. 청구항 2에 있어서, 상기 (4)의 가교반응시 가교제의 농도는 0.001 mM~ 1 M 농도인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 하이드로젤의 제조방법.



  7. 청구항 1 또는 2의 방법으로 제조된 소장점막하조직 하이드로젤을 생체 내 주사하여 젤을 형성시키는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직 약물 전달체 및 지지체의 형성방법.

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