KR20160035917A

KR20160035917A - 조직 및 뼈 재생을 위한 실크 피브로인 다공성 3차원 지지체 제작 방법

Info

Publication number: KR20160035917A
Application number: KR1020140127869A
Authority: KR
Inventors: 박찬흠; 문보미; 박현정; 이옥주; 주형우; 이정민; 김정호; 김동욱; 이민채; 김수현
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2014-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2016-04-01
Also published as: KR101652582B1

Abstract

본 발명은 소금과 자당을 이용한 염 침출법을 통해 조직 및 뼈 재생을 위한 실크 피브로인 (또는 실크 단백질) 다공성 3차원 지지체의 제작 방법에 관한 것이다.
조직공학은 생체 내 결손된 장기 및 조직의 재생을 위해 적절한 지지체를 이식하거나 조직 세포를 체외 배양하여 실제 장기나 조직과 유사한 구조와 기능을 가지는 인공 조직을 이식하여 인체 기능의 복원을 목적으로 한다. 따라서 생체재료를 조직 공학용 지지체로 활용하기 위해서는 다공성 구조를 형성해야 한다. 이는 생체재료 자체에 적절한 공극을 지니면 세포의 생장에 필요한 공간을 제공할 수 있으며 공극이 서로 연결되어 개방된 통로를 만들면 세포간 영양분, 대사 물질 및 가스 교환이 원활하게 된다. 또한 성공적인 조직의 유지 및 복원을 위해서는 만들어진 생체재료에 세포의 부착, 증식, 세포외 기질 형성과 동시에 생체 재료를 분해하는 속도 조절이 중요하다. 실크 피브로인은 누에고치에서 세리신을 제거 한 천연 고분자로서 대량 생산이 가능한 단백질이며 FDA에서 안전성이 입증되었고, 다른 합성 고분자들과는 다르게 체내에서 면역반응이 일어나지 않고 염증반응이 적어 생체적합성이 우수하며 결정화도에 따라 분해 속도를 조절 할 수 있어 생화학 및 의학적 응용이 활발한 의료용 소재이다. 이러한 실크 피브로인을 이용해 3차원 다공성지지체를 제작하는 방법으로는 캐스팅 방법, 전기방사, 염 침출법 등이 있다. 그 중 염 침출법에 관한 연구는 활발히 진행되어왔으나, 실크 피브로인 수용액을 이용하여 지지체를 제작하기에는 기계적 강도가 약하고, 염 제거 후 동결건조 과정을 거쳐 제작 시간이 오래 걸리는 등의 제한점이 있다. 본 발명에서는 이러한 단점을 보완하여 기계적 물성을 강화하고, 연골 조직의 분화와 골 재생 효과가 우수한 지지체를 제작하였다. 따라서 본 발명에 따른 제조방법으로 제작된 실크 피브로인다공성 3차원 지지체는 조직 재생용 지지체 뿐만 아니라 정형외과적 인공 뼈, 치주 조직 재생 유도재 및 골 이식재 등으로 활용될 수 있다.

Description

조직 및 뼈 재생을 위한 실크 피브로인 다공성 3차원 지지체 제작 방법{Fabrication method of 3D porous silk fibroin scaffolds for tissue and bone regeneration}

본 발명은 조직 및 뼈 재생용 다공성 3차원 지지체에 관한 것으로, 보다 자세하게는 실크 피브로인(또는 실크 단백질)의 염침출법(salt leaching)을 통한 다공성 3차원 지지체 및 제조방법에 관한 것이다.

실크 피브로인은 누에고치에서 세리신을 제거 한 천연 고분자로서 대량 생산이 가능한 단백질이다. 실크 피브로인은 FDA에서 안전성이 입증되었고, 다른 합성 고분자들과는 다르게 체내에서 면역반응이 일어나지 않고 염증반응이 적어 생체적합성이 우수하며 밀도 또는 결정화도에 따라 분해 속도를 조절 할 수 있어 생화학 및 의학적 응용이 활발한 의료용 소재이다.

따라서 대량 생산성, 조절 가능한 생분해성, 뛰어난 생체적합성을 가진 실크 피브로인 수용액을 이용한 다공성 3차원 지지체는 응용 분야에 적합하게 제작 및 가공되어 응용되어질 수 있다. 다공성 3차원 지지체의 응용분야로는 조직 재생 및 정형외과적 인공 뼈, 치주 조직 재생 유도재, 골 이식재 등이 있으며, 현재까지 다공성 3차원 지지체에 관한 연구가 많이 진행되어왔다. 기존 사용되고 있는 치주 조직 재생 유도재의 주성분은 젤라틴, 콜라겐, 고어텍스(Gore-Tex) 등이 있으며 골 이식재로는 자가골, 동종골, 이종골, 합성골 (PLG, PLA, PLGA, PCL, PVA 등) 등이 사용된다.

조직공학은 생체 내 결손된 장기 및 조직의 재생을 위해 적절한 지지체에 조직 세포를 체외 배양하여 실제 장기나 조직과 유사한 구조와 기능을 가지는 인공 조직을 이식하여 인체 기능의 복원을 목적으로 한다. 따라서 생체재료를 조직공학용 지지체로 활용하기 위해서는 다공성 구조를 형성해야 한다. 이는 생체재료 자체에 적절한 공극을 지니면 세포의 생장에 필요한 공간을 제공할 수 있으며, 공극이 서로 연결되어 개방된 통로를 만들면 세포간 영양분, 대사 물질 및 가스 교환이 원활하게 된다. 또한 성공적인 조직의 유지 및 복원을 위해서는 만들어진 생체재료에 세포의 부착, 증식, 세포외 기질 형성과 동시에 생체 재료를 분해하는 속도 조절이 중요하다.

이러한 3차원 지지체를 제작하는 방법으로는 생분해성 고분자를 적절한 용매에 용해시킨 고분자 용액에 일정한 크기의 단결정 소금을 혼합하여 건조한 후 소금을 추출해내는 염침출법, 고분자 용액에 수용액상에서 가스를 생성하는 염을 혼합하고 가스를 생성시키는 가스발포법, 고분자 용액에 함유되어 있는 용매를 비용매 속에 담궈 상분리시키는 방법, 고분자 용액을 고전압상에 위치시켜 나노 섬유를 형성시키는 방법, 컴퓨터 프로그램과 쾌속 조형장치를 이용하는 방법, 섬유상 고분자를 원심 분리에 의해 적층하는 방법, 3차원 프린터를 이용하는 방법 등이 있다.

본 연구에 사용된 방법은 염침출법이며 실크 피브로인을 이용한 염침출법에 관한 연구는 활발히 진행되어 왔다. 그러나 실크 피브로인을 이용한 염침출법은 몇가지 제한점이 있다. 실크 피브로인 수용액과 염(salt, NaCl)을 사용하여 만들어진 지지체의 경우 염을 제거 하는 과정 후에 동결건조 과정이 포함되어야 한다. 이는 염을 제거하는 과정에서 물에 침지되었던 실크 피브로인 지지체는 상온 혹은 고온 건조시 수분이 증발하는 과정에서 지지체의 구조가 유지되지 못하는 한계 때문에 동결건조 과정이 필요했다. 또한 염침출법에 사용된 염의 크기에 비해 제작된 지지체의 공극 크기가 작고 균일하지 못하며 격벽의 두께가 얇아 기계적 물성이 매우 약하다. 이것은 실크 피브로인 수용액에 염이 첨가되었을 때 염이 수용액에서 녹은 후 수분이 증발함에 따라 염의 재결정에 의해 지지체 구조(격벽)가 형성 및 유지되기 때문이다. 반면에 염 대신 자당(sucrose 등)을 이용한 방법에서는 실크 피브로인을 수용액이 아닌 유기용매에 용해시켜 사용해야 했다. 자당의 경우 실크 피브로인 수용액에 첨가될 경우 모두 용해되어 버리기 때문에 유기용매를 사용해야 했으며, 유기용매를 사용할 경우에는 제작된 지지체에 유기 용매의 잔존가능성이 있어 생체에 적용할 경우 부작용을 나타낼 수 있다.

상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 실크 피브로인의 대량 생산성, 조절 가능한 생분해성, 우수한 기계적 물성, 뛰어난 생체 적합성 및 골(bone) 재생능 등의 장점을 가지는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체와 그 제조 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 방법은 염과 자당의 비율에 따른 염침출법으로 유기용매의 사용을 피하고 동결건조 과정을 생략 할 수 있으며, 염과 자당의 비율에 따라 격벽의 두께를 조절함으로써 기계적 물성을 조절할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 실크 피브로인 수용액과 자당 또는, 자당과 소금의 혼합물을 이용한 염침출법을 통한 다공성 3차원 지지체를 형성하는 단계를 포함하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 다공성 3차원 지지체는 생분해되고 상기 생분해의 속도 조절이 가능하여 삽입 후 제거수술이 필요하지 않다. 또한 본 발명에 따른 다공성 3차원 지지체는 골 재생 효과 및 기계적 물성이 우수할 뿐만 아니라 천연 고분자인 실크 피브로인을 이용한 지지체이므로 체내에서 면역반응이 거의 일어나지 않아 생체적합성이 우수하다. 더욱이, 혼합된 소금과 자당을 이용한 염침출법으로 제작된 다공성 3차원 지지체는 격벽의 구조, 모양 및 두께 등을 조절함으로 지지체의 물성을 향상시켜 조직 재생 및 정형외과적인 골재생 촉진 기질 뿐만 아니라 치주인대 또는 치주골 재생 촉진 기질로서 유용하게 사용될 수 있다.

도1은 실크 피브로인 수용액을 이용한 다공성 3차원 지지체 제조 방법에 대한 흐름도이다.
도2는 실크 피브로인 다공성 3차원 지지체를 나타낸다.
도3은 실크 피브로인 다공성 3차원 지지체의 주사 전자 현미경 관찰 이미지이다.
도4는 FT-IR을 통한 실크 피브로인 지지체의 구조적 관찰 결과이다.
도5는 소금과 자당 혼합 비율에 따른 실크 피브로인 지지체의 팽윤도, 물 흡수도 및 공극률의 결과이다.
도6은 실크 피브로인 지지체의 압축강도와 탄성계수의 결과이다.
도7은 MTT 어세이(세포 생존율 측정기법)을 통한 실크 피브로인 지지체의 세포독성 및 증식률 확인한 결과이다.
도8은 연골세포 파종 4주차 SEM 이미지를 통한 육안적 관찰한 결과이다.
도9는 연골세포 파종 8주차 SEM 이미지를 통한 육안적 관찰한 결과이다.
도10은 연골세포 파종 후 마손-트리크롬 염색(Masson's trichrome)을 통한 조직학적 관찰 (8주차)한 결과이다.
도11은 실크 피브로인 지지체와 골 분말이 함유된 지지체의 BMSC 세포 파종 및 분화 유도 후 DAPI 염색을 통한 조직학적 관찰(A: 자당, B:소금, C: 골 분말 혼합 및 자당, D: 골 분말 혼합 및 소금)한 결과이다.
도12는 실크 피브로인 지지체와 골 분말이 함유된 지지체의 BMSC 세포 파종 및 분화 유도 후 골분화도에 대한 조직학적 관찰(H&E, Alizarin red S, Von kossa)한 결과이다.
도13은 동물 모델을 이용한 골 결손 모델에서의 골 재생 효과 육안적 관찰한 결과이다.
도14는 마이크로 CT(Micro CT)를 이용한 실크 피브로인 지지체의 골 재생 효과 관찰한 결과이다.
도15는 실크 피브로인 지지체의 골 재생 효과 조직학적 관찰한 결과이다.

본 발명은 실크 피브로인 수용액과 염으로서 자당, 소금, 또는 자당 및 소금의 혼합 염을 혼합하되, 실크 피브로인 수용액 1 ml 당 상기 염 4 내지 20g 를 혼합하는 단계; 상기 실크 피브로인 수용액 및 염의 혼합물을 건조시키는 단계; 상기 혼합물을 증류수에 침지 시켜 염을 제거하는 단계; 및 상기 염이 제거된 혼합물을 건조하여 지지체를 형성하는 단계를 포함하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법을 제공한다.

상기 실크피브로인 수용액은 1 내지 25 w/v %의 농도가 바람직하다. 또한, 상기 자당 및 소금 입자의 크기는 80 내지 500 ㎛ 인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 상기 다공성 3차원 지지체 제조 방법에 골형성을 촉진하는 하이드록시아파타이트, 골형성 단백질인 BMP-2 또는 BMP-12, 및 인산칼슘으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 실크 피브로인 수용액에 직접 혼합하거나 실크 피브로인 지지체를 골형성 촉진제에 침지시켜 코팅하는 단계를 더욱 포함하는 것을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 지지체에 Polyethylene oxide (PEO), Polyvinyl Alcohol (PVA), 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 젤라틴, 키토산, Polyethylene glycol (PEG), PLG, PLA, PLGA, PCL 으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 실크 피브로인 수용액에 직접 혼합하거나 실크 피브로인 지지체에 코팅하는 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 제조된 다공성 3차원 지지체를 불용화하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 소금과 자당을 이용하여 공극을 형성하는 공정에 의해 골세포 또는 연골세포 등의 부착 및 증식으로 골 또는 연골 형성 가능한 다공성 3차원 지지체를 제공한다.

본 발명을 일실시예를 예로 하여 설명한다.

실크 피브로인 단백질은 누에고치로부터 세리신을 제거하여 제조된다. 누에고치(Bombyx mori)로부터 세리신 단백질 및 불순물 등을 제거하기 위해, 누에고치를 탄산나트륨 등의 염기성 수용액에 넣고 가열한 후 증류수로 세척한다. 상기 과정을 거쳐 얻은 실크 피브로인을 브롬화리튬, 염화칼슘 등으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택한 염 용액에 넣고 용해시켜 실크 피브로인 수용액을 제조한다. 그런 다음, 상기 용액으로부터 이온 성분을 제거하기 위해 증류수로 투석한다. 투석 시간은 36 내지 72시간이 바람직하다. 상기 투석시간이 36시간 미만이면 이온 성분의 제거가 불충분할 수 있고, 72시간 초과하는 것은 불필요한 과정이다. 상기 실크피브로인 수용액은 1 내지 25 w/v %의 농도가 바람직하다. 상기 실크 피브로인 수용액의 농도가 1 w/v% 미만이면 지지체의 구조가 단단하지 못하고, 25 w/v% 초과일 경우 실크 피브로인 용액이 불안정한 상태가 되어 겔화될 우려가 있다.

상기 실크 피브로인 수용액을 이용하여 다공성 3차원 지지체를 제조한다. 상기 다공성 3차원 지지체를 제조하기 위해, 실크 피브로인 수용액 1 ml 당, 염으로서 자당, 소금, 자당 및 소금의 혼합 염을 4 내지 20 g 으로 하여 페트리디쉬에 넣는데, 더욱 바람직하게는 상기 염은 10 내지 15 g 을 페트리디쉬에 넣는다. 상기 염이 4 g 미만이면 염이 실크 피브로인 수용액에 녹아 사용된 염의 크기보다 작은 공극을 형성하게 될 수 있고, 20 g 을 초과하면 실크 피브로인 용액과 접촉하지 않는 염의 양이 증가하게 되어 불필요하게 될 수 있다. 그 위에 실크 피브로인 수용액을 부어준다. 그런 다음, 상기 염을 페트리디쉬에 가득 채운다. 상기 자당과 소금의 혼합 염인 경우, 자당 10 내지 90중량% 및 소금 10 내지 90중량%를 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 자당 30 내지 70중량% 및 소금 30 내지 70중량%를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 혼합 염에서 지지체의 강도를 향상시키기 위해서는 소금이 10 중량% 이상 혼합되는 것이 바람직하고, 소금이 90 중량%를 초과하면 격벽이 두꺼워지고 공극의 연결성이 줄어드는 경향이 있다.

이 때, 지지체의 강도와 세포 친화도를 증가시키기 위해 골형성을 촉진하는 하이드록시아파타이트, 골형성 단백질인 BMP-2 또는 BMP-12, 및 인산칼슘으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 실크 피브로인 수용액에 혼합할 수 있다.

또한, 지지체의 강도를 높이기 위한 물질로서, Polyethylene oxide (PEO), Polyvinyl Alcohol (PVA), 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 젤라틴, 키토산, Polyethylene glycol (PEG), PLG, PLA, PLGA, PCL 으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 상기 실크 피브로인 수용액에 더 포함시킨 후, 본 발명에 의한 염침출법으로 다공성 3차원 지지체를 제조함으로써 본 발명에 의한 다공성 3차원 지지체의 강도를 더욱 높일 수 있다.

상기 자당, 소금, 또는 자당 및 소금 혼합 염과 실크 피브로인의 혼합물을 건조시켜 굳히고, 건조된 혼합물의 자당 및 소금은 증류수에 침지시켜 제거한다.

상기 혼합물의 건조는 25 내지 70℃에서 2 시간 이상 건조하는 것이 바람직하다. 상기 건조가 25℃ 미만에서 이루어지면 건조시간이 너무 오래 걸려 실크 피브로인의 변성을 유발 할 수 있으며, 70℃ 초과하여 건조하면 실크 피브로인의 변성을 유발하게 된다. 상기 건조시간은 온도에 따라 달라지나, 2시간 미만이면 지지체가 충분히 마르지 않아 곰팡이가 생기거나 변성이 일어날 수 있다. 상기 증류수에 침지시켜 염을 제거하는 과정은 수시로 증류수를 교환해 주며 염을 제거하는데, 증류수를 수시로 자주 교환해 주면 염을 제거하는 시간이 짧아지며, 증류수를 교환하는 시간이 길어지면 염을 제거하는 시간이 길어지게 되며, 통상적으로 36 내지 72시간 동안 증류수에 침지시켜 제거하는 것이 바람직하다.

상기 염이 제거된 지지체는 예를 들어 바람직하게는 3 내지 8 mm 지름의 펀치로 펀칭한 후, 영하 80 내지 4℃ 또는 영상 20 내지 70℃ 에서 건조하거나, 더욱 바람직하게는 영하 80 내지 30℃ 또는 영상 25 내지 60℃에서 건조하고, 가장 바람직하게는 실온 건조하여 실크 피브로인 다공성 3차원 지지체를 제작한다. 영하 4℃ 초과 내지 영상 20℃ 미만이면 건조시간이 너무 오래 걸려 실크 피브로인의 변성이 일어날 우려가 있고, 영하 80℃ 미만 또는 영상 70℃ 초과에서 건조하는 것은 불필요한 에너지 소모가 될 수 있고 비용의 상승 원인이 될 수 있다. 본 발명에 따른 자당 및 소금 침출법은 상기와 같이 실온건조 또는 동결건조에 의해 건조가 가능한 장점이 있고, 실온건조가 저비용으로 효율적이기 때문에 더욱 바람직하다.

사용되는 염의 크기에 따라 공극 크기가 달라지므로 염의 크기로 공극의 크기를 조절 할 수도 있다. 바람직하게는 상기 염의 크기는 80 내지 500 ㎛, 더욱 바람직하게는 100 내지 250 ㎛ 이고, 80 ㎛미만이면 세포 침투가 어렵고 500㎛ 초과이면 지지체의 강도가 약하게 된다.

또한, 골형성을 촉진하는 하이드록시아파타이트, 골형성 단백질인 BMP-2 또는 BMP-12, 및 인산칼슘으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 제조된 용액에 상기 건조된 실크 피브로인 지지체를 침지시켜 코팅하므로써, 상기 지지체의 강도와 세포 친화도를 높일 수 있다.

또한, 지지체의 강도를 높이기 위한 물질로서, Polyethylene oxide (PEO), Polyvinyl Alcohol (PVA), 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 젤라틴, 키토산, Polyethylene glycol (PEG), PLG, PLA, PLGA, PCL 으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 제조된 용액에 상기 건조된 실크 피브로인 지지체를 침지함으로써 본 발명에 의한 다공성 3차원 지지체의 강도를 더욱 높일 수 있다.

상기 방법으로 제작된 다공성 3차원 실크 피브로인 지지체의 구조는 모두 표면에 균일한 공극과 모양을 가지는 스펀지와 같은 구조이며, 공극의 연결성이 우수하다. 또한, 소금과 자당의 혼합 비율에 따라 공극의 크기가 조절되고 격벽의 모양이 다르다(도3). 즉, 자당의 혼합비율이 증가할수록 공극의 크기는 커지고 격벽의 두께는 얇아지며, 소금의 혼합비율이 증가할수록 공극의 크기는 작아지고 격벽의 두께는 두꺼워진다. 본 발명에 따른 3차원 다공성 실크 피브로인 지지체의 공극의 크기는 80 내지 500 ㎛ 인 것이 바람직한데, 80㎛ 미만이면 세포가 내부로 침투하기 어렵고, 500㎛ 초과이면 지지체의 강도가 약하기 때문이다. 또, 격벽의 두께는 10 내지 100㎛ 인 것이 바람직한데, 격벽의 두께가 10㎛ 미만이면 지지체의 강도가 약하고 100㎛ 초과이면 세포가 지지체의 내부로 침투하는데 시간이 오래 걸린다. 또, 자당의 함유량이 많아질수록 공극의 모양은 비정형적인 형태를 하고 반면, 소금의 함유량이 많아질수록 공극의 모양은 정형적인 구조가 많이 관찰되었다.

본 발명에 따른 다공성 3차원 실크 피브로인 지지체의 제조방법은 불용화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 실크 피브로인 수용액을 지지체나 섬유, 필름 등으로 가공할 경우, 추가적으로 불용화(결정화) 과정이 필요하게 된다. 이러한 불용화 과정은 에탄올 혹은 메탄올 등의 알코올에 침지하거나 증기에 노출시켜 불용화 시킬 수 있으며, 수증기에 노출시켜 불용화 할 수도 있다. 이러한 과정을 거칠 경우, 실크 피브로인으로 제작된 지지체의 분해 또는 생분해 되는 시간이 길어질 수 도 있으며 불용화 처리 된 정도에 따라 분해 속도를 조절함으로써 특성에 맞는 생체재료로 응용이 가능하게 된다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 설명한다. 그러나 이는 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것으로 여겨져서는 안된다.

[실시예1]

1) 실크 피브로인 단백질 제조

세리신 단백질 및 불순물 등을 제거하기 위해 누에고치(Bombyxmori) 120g 을 0.5% 탄산나트륨 수용액 3L에 넣고 가열한 후 증류수로 세척하여 실크 피브로인 섬유를 얻었다. 상기 실크 피브로인 섬유 60g을 CaCl₂:EtOH:H₂O를 1:2:8 비율로 혼합한 용액에 넣고 98℃로 4시간 동안 가열하여 용해시켰다. 그런 다음, 상기 용액으로부터 이온 성분을 제거하기 위해 증류수로 투석했다. 투석은 40시간 하였고, 고농도의 용액을 얻기 위하여 polyethylene glycol(PEG)를 투석막 바깥쪽에 뿌려서 수분을 제거하여 농축하였다. 그 결과 10 w/v%의 실크 피브로인 수용액을 얻었다.

2) 실크 피브로인을 이용한 다공성 3차원 지지체 제조

자당과 소금 (자당:소금)을 100:0 (S100N0), 70:30 (S70N30), 50:50 (S50N50), 30:70 (S30N70) 및 0:100 (S0N100) 의 중량비율로 혼합한 각각의 혼합물 50g 을 각각의 페트리디쉬에 깔고 그 위에 각각 상기 실시예 1의 1)에서 제조한 실크 피브로인 수용액 20 ml 을 부어주었다. 그 후 상기 소금과 자당 혼합물 150g 으로 각각의 페트리디쉬를 가득 채웠다. 이 혼합물들은 60℃ 건조기에서 3시간 건조시켜 굳혔다. 건조된 혼합물들에서 소금 및 자당을 증류수에 침지시켜 제거하는데, 72시간 동안 수시로 증류수를 교환해 주며 상기 염을 제거했다. 염이 제거된 판 모양의 지지체들을 8 mm 지름의 펀치로 펀칭한 후 24시간 동안 실온 건조하여 실크 피브로인 다공성 3차원 지지체를 제작했다(도 2).

3) 3차원 다공성 실크피브로인 지지체의 구조

상기 방법으로 제작된 3차원 다공성 실크 피브로인 지지체의 구조를 확인하기 위하여 주사 전자 현미경을 이용하여 관찰 하였다. 모두 표면에 균일한 공극과 모양을 가지는 스펀지와 같은 구조였다. 또한, 공극의 연결성이 우수했다. 이 때, 소금과 자당의 혼합 비율에 따라 공극의 크기 및 격벽의 모양이 다르다. 자당의 혼합비율이 많아질수록 공극의 모양은 비정형적이고 격벽이 얇으며, 소금의 혼합비율이 많아질수록 공극의 모양은 정형적이고 격벽의 두께가 두꺼워졌다(도3).

4) 3차원 다공성 실크 피브로인 지지체의 구조 분석

상기 방법으로 제작된 3차원 다공성 실크 피브로인 지지체의 구조분석을 위해 FT-IR을 시행하였다. 실크 피브로인을 동결 건조하여 얻은 스펀지를 에탄올에 침지하여 결정화한 후 흡광도(a)를 FT-IR 스펙트럼으로 보았다. FT-IR 스펙트럼을 보면 아마이드 I, II 그리고 III 피크가 1620, 1514, 1232 cm^-1 에서 나타나는데 이는 실크 피브로인의 β-시트 구조(β-sheet conformation)에 해당하는 특성 피크이다. 이때, 소금과 자당의 혼합 비율에 따라 아마이드 I와 아마이드 II의 피크값이 조금씩 이동(shifting) 되었다(도4). FT-IR 스펙트럼의 1260과 1235 cm^-1 피크의 비를 이용하여 실크 피브로인의 결정화도를 확인하였다. 결정화도를 계산하는 식은 아래와 같다.

A_1235cm ^-1 : Absorbance at 1235cm^-1

A_1260cm ^-1 : Absorbance at 1260cm^-1

동결건조된 실크 피브로인을 에탄올에 15분 이상 침지하여 결정화 한 것은 82% 정도의 결정화도를 보여주었고, 자당만을 이용한 경우 79%로 가장 낮은 결정화도를 보여주었으며 소금만을 이용한 경우 81%로 대조군과 가장 가까운 결정화도를 나타내었다(표1). 결정화도의 차이에 따라 지지체의 강도 및 탄성값에 대한 차이를 나타내는 것으로 생각되며, 소금과 자당의 비율을 조절함으로써 생분해 시간을 조절할 수 있는 지지체를 제작 할 수 있다.

실크 피브로인 지지체의 결정화도

자당/소금 비율에 따른 혼합물의 침출에 의한 실크피브로인 스캐폴드 (Silk fibroin scaffolds with sucrose/salt mixture leaching)	결정화 지수(Crystallinity index) (%)
대조군(Control, Ethanol)	82.20±0.03
S100N0 (자당:소금=100:0)	79.60±0.12
S70N30 (자당:소금=70:30)	80.99±0.15
S50N50 (자당:소금=50:50)	80.73±0.36
S30N70 (자당:소금=30:70)	80.93±0.07
S0N100 (자당:소금=0:100)	81.02±0.38

결정화지수 : 평균±표준편차(Mean value±standard deviation)

5) 실크 피브로인 지지체의 특성 평가

① 팽윤도와 물 흡수도

상기 실시예에서 제작된 실크 피브로인 지지체의 팽윤도와 물 흡수도를 확인하기 위해, 지름 8 mm, 높이 3 mm 크기의 지지체를 생리식염수에 3시간동안 침지시켜 팽윤도와 물 흡수도를 측정하였다. 팽윤도와 물 흡수도는 아래와 같은 식으로 계산되었다.

W_s : 젖은 상태의 지지체 무게

W_d : 건조 상태의 지지체 무게

측정된 팽윤도는 자당을 단독으로 사용한 지지체가 가장 높은 팽윤도를 보여주었으며 소금이 혼합되는 양이 증가함에 따라 팽윤도는 감소하였다(도5). 이것은 자당의 혼합 비율이 증가함에 따라 격벽의 두께가 얇아지고, 공극의 크기가 커져 친수성이 증가하여 팽윤도와 물 흡수도가 증가하는 것으로 생각된다. 종래기술에서 생산하는 소금만 이용하는 염침출법에 의해 제조된 지지체보다, 본 발명에 의해 제조된 지지체가 물 흡수도나 팽윤도 등이 우수한 결과를 나타내는데, 이것은 생체 또는 세포 배양시 지지체 내부까지 세포 배양액 등의 침투가 원활하여 영양분 공급 뿐만 아니라 대사활동 물질의 교환이 용이할 것으로 생각된다.

② 공극률

각 지지체의 공극률은 액체 치환법 (liquid displacement process)을 이용하여 측정하였다. 일정 부피의 증류수 (V₁)에 지지체를 10분 동안 침지한 후 지지체가 침지된 증류수의 부피를 확인했다 (V₂). 침지되어 있던 지지체를 제거한 후 남은 증류수의 부피를 측정했다 (V₃). 이때 공극률은 아래 식으로 계산하여 측정값을 얻었다.(도5)

소금과 자당이 50:50으로 혼합된 염을 사용하여 제작된 지지체를 제외한 각 지지체의 공극률은 평균 80% 정도의 높은 공극률을 보여주었다(도5). 소금과 자당의 혼합비율이 50:50으로 혼합되어 제작된 지지체는 70% 정도의 공극률을 보여주었다. 공극률이 높으면 세포 침투와 영양분 및 대사물질 등의 교환이 원활히 이루어 질 수 있게 되므로 바람직하다. 소금과 자당의 비율이 동일한 경우 다른 비율에 비해 공극률은 낮지만, 다른 물성에서는 다른 비율보다 좋은 효과를 보이는 경우가 있으므로, 적용 대상에 따라 소금과 자당의 비율을 적절히 선택하여 지지체를 제작하는 것이 바람직하다.

③ 기계적 물성

각 지지체의 기계적 강도를 측정하기 위하여 만능 물성 측정기계(QM100S, Qmesys, Korea)를 이용해 0.5 mm/min 속도로 압축하였다. 이때 측정한 지지체의 두께는 3 mm로 균일화 하였고, 변형율이 50% 일 때 까지 측정하여 압축강도를 측정하였다 (각 군은 샘플이 3개씩이다, n=3).

압축강도는 건조 상태와 젖은 상태로 나누어 측정하였다. 건조 상태일 때 압축강도는 염침출법에 사용된 소금의 혼합비율이 많아질수록 증가하였으며 (도6-A), 탄성계수 역시 자당보다 소금의 혼합비율이 높아질수록 증가하였다 (도6-B). 반면 젖은 상태에서는 건조 상태와 반대의 결과가 측정되었다 (도6-C,D). 젖은 상태에서는 자당의 혼합비율이 증가할수록 압축강도와 탄성계수가 증가하였고, 소금의 혼합비율이 증가할수록 압축강도와 탄성계수는 감소하였다. 하지만 건조 상태일 때의 압축강도와 탄성계수가 젖은 상태일 때보다 월등히 높은 값을 나타냈다. 이것은 지지체의 구조와 연관성이 있는데, 소금의 혼합비율이 증가할수록 지지체의 격벽은 두꺼워져 압축강도가 증가하고, 자당의 혼합비율이 증가할수록 지지체의 격벽 구조가 얇아짐에 따라 이러한 결과가 나타난 것으로 생각된다. 또한 젖은 상태에서는 팽윤도와 물 흡수도와의 관계가 작용한 것으로 예상된다. 자당의 혼합비율이 높아질수록 팽윤도와 물 흡수도는 증가하여 지지체 내에 물을 머금고 있는 양이 많기 때문에 압축강도와 탄성계수가 증가한 것으로 생각된다. 따라서, 생체내 환경에서는 지지체의 형태가 젖은 상태가 유지되는 것이므로, 소금만으로 염침출법을 이용하여 생산된 지지체보다 소금과 자당의 혼합물에 의해 제조된 본 발명의 3차원 다공성 실크 피브로인이 우수하다.

6) 세포 독성 실험 (MTT assay)

소금과 자당으로 인해 결정화 되어진 실크 피브로인 지지체의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT 에세이(3-[4,5-dimethylthiazol-2-ty]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay)를 측정하였다. 세포 독성 실험에 사용된 세포는 NIH 3T3 세포이며, 지지체에 파종하여 1, 7, 14일 동안 관찰하였다.

각 지지체 모두에서 파종된 세포의 수는 시간이 지남에 따라 점차 증가하는 양상을 보였고, 자당의 혼합비율이 높은 지지체보다 소금의 혼합비율이 높은 지지체에서 더 많은 세포가 증식한 것을 확인할 수 있었다(도7). 이러한 결과는 지지체의 공극률과 연관성이 있는 것으로 생각된다. 지지체의 공극률이 우수할수록 세포간에 미치는 영향이 증가하고, 세포의 대사활동에 따른 분비물이나 영양분 공급이 원활히 이루어 질 수 있기 때문에 공극률이 증가할수록 세포 증식률도 증가하는 것으로 보여진다. 또한 염침출법에 사용된 염에서 자당의 혼합비율이 높게 사용된 지지체보다 소금의 혼합비율이 높은 지지체 일수록 격벽이 두껍고 세포가 부착할 수 있는 면적이 증가하기 때문에 세포의 증식률이 더 높은 것으로 판단된다.

7) 세포 친화도

실크 피브로인 지지체와 세포의 친화도를 확인하기 위하여 각 지지체에 연골세포를 파종하여 배양한 후 세포의 침투력을 관찰하기 위해 지지체를 단면 절단하여 SEM 이미지를 통하여 육안적으로 관찰 하였다. 도8에서 보듯이, 세포 파종 4주 후의 결과로 세포가 지지체 안쪽으로 파고 들어 부착되어 생장하고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 8주차에는(도9) 4주차보다 더 많은 세포가 지지체의 격벽을 타고 증식하고 있는 것을 관찰 할 수 있었다. 자당의 혼합비율이 높게 제작된 지지체보다 소금의 혼합비율이 높은 지지체 일수록 세포가 부착될 수 있는 면적이 넓어 더 많은 세포가 관찰되었다.

8) 세포 파종 지지체의 조직학적 관찰

연골세포를 파종하여 8주동안 배양한 지지체를 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 24시간 동안 고정한 다음 50%, 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올과 자일렌에 순차적으로 침지하여 수분을 제거하고 파라핀 블록을 만들었다. 조직은 5㎛ 두께로 절편하여 마손-트리크롬 염색(Masson's trichrome)하여 조직학적으로 관찰하였다 (도10).

조직학적 소견으로는 염 침출법에 사용된 염에서 자당의 혼합비율이 높아질수록 콜라겐 침착 정도가 증가함에 따라 실크 피브로인 지지체에 연골세포가 부착되어 증식하면서 연골 조직으로 분화되는 현상을 관찰 할 수 있었다. 이러한 현상은 자당에 의해 결정화된 실크 피브로인 지지체의 경우 소금의 혼합비율이 높아진 지지체보다 얇은 격벽을 가지고 있지만, 공극의 크기가 넓고 공극간의 연결성이 우수한 것을 미루어 보아 연골 세포가 연골 조직으로 분화되기에 적합한 환경을 제공한다고 사료된다.

골 분말이 혼합되지 않은 지지체 (도11-A, B)와 골 분말이 혼합된 지지체(도11-C, D)에서 세포의 증식을 관찰하기 위해, 세포 배양 2주 후 고정하여 파라핀 블록을 만들어 5㎛ 두께로 절편하여 DAPI 염색하여 형광 현미경으로 관찰했다(도11). 세포는 각 지지체의 공극 내 벽면을 따라 증식하는 양상을 보였으며, 우수한 침투력을 보여주었다. 또한, 지지체에 혼합된 골 분말에 의한 세포 독성은 관찰되지 않았다.

골 분말이 혼합되지 않은 지지체 (도12-A, B, E, F, I, J)와 골분말이 혼합된 지지체 (도12-C, D, G, H, K, L)에 BMSC 세포를 파종하여 골 세포로 분화 유도 한 후 H&E, 알리자린 레드 에스 및 본 코사 염색(H&E, Alizarin red S, Von kossa)을 통해 골 분화도를 확인하였다(도12). 알리자린 레드 에스 및 본 코사 염색법(Alizarin red S, Von kossa)은 칼슘의 침착도를 확인할 수 있는 염색법으로, 침착 정도가 높아질수록 더 진한 색을 나타낸다. 실크 피브로인 수용액에 골 분말이 혼합되지 않은 지지체 중 소금으로 제작된 지지체보다 자당으로 제작된 지지체에서 칼슘 침착이 더 많이 이루어진 것으로 보아 골 분화가 더 많이 유도된 것을 알 수 있었다. 또한 골 분말이 혼합된 지지체 역시 소금을 이용하여 제작된 지지체보다 자당을 이용한 지지체에서 더 많은 골 분화가 관찰되었다. 즉, 골 분화를 유도하는데 있어서 염 침출법에 사용된 염으로 자당을 사용하고, 실크 피브로인 수용액에 골 분말이 첨가된 지지체에서 더 많은 골 분화가 관찰되는 것을 알 수 있었다.

9) 동물 모델을 이용한 골 재생 효과

본 연구에서 제작된 실크 피브로인 지지체를 동물 모델에 삽입 후 골 재생 효과를 확인하였다. 동물 모델은 SD 랫트 두개골에 직경 3 mm 크기로 결손 부위를 만들고, 실크 피브로인 지지체를 결손 부위에 삽입하여 4주 후 조직을 적출하였다(도13). 도13의 A 내지 E는 시술과정을 나타내는 것이다.

골 재생 정도를 확인하기 위하여 마이크로 CT를 촬영하여 골의 형성을 확인하였고(도14), H&E 조직 염색을 통해 골 재생을 관찰하였다(도15). 도14의 A는 골 결손 모델에서 아무것도 처리하지 않은 군이고, 도14의 B, F는 자당을 이용해 염침출한 지지체, C, G는 소금만을 이용하여 염침출한 지지체, D, H는 실크 피브로인 용액에 나노하이드록시아파타이트를 혼합하여 자당으로 염침출한 지지체, E, I는 실크 피브로인 용액에 나노하이드록시아파타이트를 혼합하여 소금으로 염침출한 지지체를 삽입한 것이고, Control은 세포를 파종하지 않고 삽입한 군이며, hMSC는 human의 중간엽줄기세포를 파종하여 배양한 후 삽입한 군을 나타낸다. 도 15의 A는 골 결손 모델에서 아무것도 처리하지 않은 군이고, 도15의 B, C는 자당을 이용해 염침출한 지지체, D, E는 소금만을 이용하여 염침출한 지지체, F, G는 실크 피브로인 용액에 나노하이드록시아파타이트를 혼합하여 자당으로 염침출한 지지체, H, I는 실크 피브로인 용액에 나노하이드록시아파타이트를 혼합하여 소금으로 염침출한 지지체를 삽입한 것이고, Control은 세포를 파종하지 않고 삽입한 군이며, hMSC는 human의 중간엽줄기세포를 파종하여 배양한 후 삽입한 군을 나타낸다. 골 결손 모델에 아무 것도 처리하지 않은 군(도14 및 15의 A)에서는 골 재생이 관찰 되지 않았으며, 실크 피브로인 지지체를 삽입한 모든 군에서 골 재생이 일어나 결손 부위가 감소하는 것을 확인하였다(도14 및 15의 B-I). 또한, 실크 피브로인으로만 제작된 지지체보다 골 분말이 함유된 실크 피브로인 지지체에서 더 많은 골 재생이 육안적으로 관찰되었다. 중간엽 줄기세포가 배양된 지지체에서도 골 재생이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다 (도14의 F-I, 도15의 C,E,G,I). 정리하자면, 실크 피브로인지지체는 골 결손 모델에서 우수한 골 재생 효과를 보여주었으며 그 중 골 분말이 함유되고, 자당을 사용하여 염 침출법을 통해 제작된 실크 피브로인 지지체에서 가장 우수한 골 재생 효과를 보여주었다.

H&E 조직 염색을 통한 조직학적 소견으로는 지지체를 처리하지 않은 군 (A)에서는 섬유아세포 (fibroblast)가 결손 부위를 채우고 있으며, 골 재생이 이루어지지 않은 것을 확인 할 수 있었다. 반면에 실크 피브로인 지지체를 처리한 모든 군에서는 골 세포가 지지체를 따라 세포가 증식하는 것을 확인할 수 있는데, 이때 소금을 이용하여 제작된 지지체에 비해 자당을 이용하여 제작된 지지체에서 세포 침투력이 우수한 것으로 관찰되었으며 더 많은 골 재생이 이루어진 것을 확인하였다. 또한 골 분말이 함유된 지지체에서 더 많은 골 재생이 관찰 되었다. 이러한 결과는 도 14의 마이크로 CT 결과와 마찬가지로 자당으로 제작된 지지체가 소금으로 제작된 지지체보다 골 재생이 진행되었으며, 자당으로 제작된 골 분말 함유 지지체에서 가장 우수한 골 재생이 관찰된 것과 동일한 결과를 보여준다.

상기 결과로부터 본 발명의 실크 피브로인을 이용한 다공성 3차원 지지체는 연골 조직의 분화 뿐만 아니라 골 재생 효과가 뛰어나고, 제작에 사용되는 염의 종류에 따라 기계적 강도를 조절 할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 실크 피브로인 다공성 3차원 지지체는 기계적 강도를 조절 할 수 있으며 연골 조직의 재생 및 뼈 조직의 재생에 효과적이므로 정형외과적 인공 뼈, 치주 조직 재생 유도재, 골 이식재 등으로 활용될 수 있다.

Claims

실크 피브로인 수용액과 염으로서 자당, 소금, 또는 자당 및 소금의 혼합 염을 혼합하되, 실크 피브로인 수용액 1 ml 당 상기 염 4 내지 20 g 을 혼합하는 단계; 상기 실크 피브로인 수용액 및 염의 혼합물을 건조시키는 단계; 상기 혼합물을 증류수에 침지시켜 염을 제거하는 단계; 및 상기 염이 제거된 혼합물을 건조하여 지지체를 형성하는 단계를 포함하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 실크피브로인 수용액은 Polyethylene oxide (PEO), Polyvinyl Alcohol (PVA), 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 젤라틴, 키토산, Polyethylene glycol (PEG), PLG, PLA, PLGA, PCL 으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 제조된 다공성 3차원 지지체를 Polyethylene oxide (PEO), Polyvinyl Alcohol (PVA), 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA), 젤라틴, 키토산, Polyethylene glycol (PEG), PLG, PLA, PLGA, PCL 으로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 코팅하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 실크 피브로인 수용액은 하이드록시아파타이트 (hydroxyl apatite), 인산칼슘, BMP-2, 및 BMP-12 로 이루어진 군중에서 하나 이상을 선택하여 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 제조된 다공성 3차원 지지체를 하이드록시아파타이트 (hydroxyl apatite), 인산칼슘, BMP-2, 및 BMP-12 로 이루어진 군 중에서 하나 이상을 선택하여 코팅하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 제조된 다공성 3차원 지지체를 불용화하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 염 입자의 크기는 80 내지 500 ㎛ 인 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 실크 피브로인 수용액은 1 내지 25v/w%인 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 염이 제거된 혼합물의 건조는 실온 건조하는 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 자당 및 소금의 혼합 염의 비율은 자당 10 내지 90중량% 및 소금 10 내지 90중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 및/또는 골 유도 조직 재생용 다공성 3차원 지지체의 제조방법.