CN110237311B - 一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚多巴胺‑外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用，于心血管支架材料表面修饰技术领域，所述纳米颗粒的制备过程如下：将盐酸多巴胺溶解在Tris缓冲液中，将浓度为25µg/µl‑100µg/µl的外泌体悬液按照1:5‑100体积比加至多巴胺‑Tris缓冲液中，在摇床中，4℃‑60℃，避光，40‑140圈/分，反应15分‑6h后，离心，去除上层液，保留沉积颗粒悬液，按照1:5‑100的体积比将沉积颗粒悬液加入多巴胺‑Tris缓冲液，在摇床中，4℃‑60℃，避光，40‑140圈/分，反应15分‑6h后，离心，去除上层液，所述固体即为聚多巴胺‑外泌体核壳结构纳米颗粒。

Description

一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的 血管支架材料和应用
技术领域
本发明属于心血管支架材料表面修饰技术领域，具体涉及一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用。
背景技术
目前，心血管疾病已成为世界范围内一个快速增长疾病，并且该疾病有很高的致死率。而使用血管内支架则是治疗冠状动脉和外周动脉疾病的重要方法，并且是最迅速的医疗干预方式。裸金属支架（BMS）是最早使用的一种心脏支架，但是放置之后会造成强烈的血小板黏附并激活凝血级联反应，同时激活的还有炎症反应和血管修复过程。这些反应会进一步诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）的迁移和增殖，从而使血管进一步狭窄。为了减少再狭窄，已开发出涂覆有抑制细胞活性的药物涂层的药物洗脱支架（DES），这些药物包括血管内皮生长因子（VEGF），释放NO的分子以及雌二醇等。在降低冠状动脉疾病的临床和血管造影再狭窄方面，由于VSMC增殖和新内膜增生被DES洗脱的细胞毒性和细胞抑制药物抑制了，因此，DES已被证明优于BMS。然而，由于支架同样也会延迟再内皮化进程，导致正常的愈合反应也降低，这就使患DES者晚期局部内皮再生和晚期血栓形成的风险显着高于 BMS患者。因此，开发一种具有快速内皮化功能的血管支架就显得十分重要。
已有大量研究表明，人的血管内部是由单层内皮细胞构成的，中层是VSMC，外部由结缔组织细胞（成纤维细胞等）组成。而血液与内皮细胞、收缩型平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等之间的交流，主要是依靠各类物质以及信号的传递。而外泌体正是细胞间传递信号的重要组成部分，在维持组织间稳态以及行为调控方向起到了重要的作用。外泌体，粒径尺寸一般在40nm-150nm之间，通过进入细胞内部，调控细胞行为。外泌体中包含着母细胞的RNA以及相关的蛋白质、肽段、抗原等因子，在进入细胞后，可以更加精确的地给予靶细胞以母细胞释放的良性信号，从而显著减少细胞与细胞间交流时间，迅速调控细胞活性和功能，从而起到促进材料表面快速内皮化的作用。
为了将外泌体固定于心血管支架表面，则需要对外泌体进行表面改性，在不损伤外泌体本身的功能的前提下，使其具备黏附在材料表面的能力。多巴胺（Dopamine）的来源是贝类，具有良好的生物相容性，在氧气和碱性条件下，可温和的发生自聚-交联反应，可在大部分材料表面形成稳定的多巴胺聚合物薄膜（PDA），是优良的表面改性的选择。综上所述，通过PDA修饰外泌体（健康血液、干细胞、血管内皮细胞、收缩型平滑肌细胞来源），使其具备黏附性能，并进一步修饰支架表面，在心血管之间表面制备一种可以促进材料表面内皮化的修饰层。目前尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用。
基于上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将盐酸多巴胺溶解在pH值7.5~9.0的Tris缓冲液中，将初始浓度为25µg/µl~100µg/µl的外泌体悬液按照1:5~1:500体积比加至多巴胺-Tris缓冲液中，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/分，反应15分~6h，以600转/min~4000转/min以及5min-30min的离心时间后，去除上清液；保留沉积颗粒悬液，按照1:5~1:100的体积比将多巴胺-Tris缓冲液再次加入沉积颗粒悬液加入中后，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/分，反应15分~6h后，以600转/min~5000转/min离心及5min-30min的离心时间后，去除上层液，所得沉积颗粒即为聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒。
进一步地，多巴胺-Tris缓冲液中盐酸多巴胺的浓度为1.0µg/ml~3.0µg/ml，上述离心是在37℃恒温条件下进行。
进一步地，所述外泌体来源于血液血清、干细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞；所述外泌体粒径尺寸为40nm~150nm。
当所述外泌体来源于血液血清时，具体获得过程如下：
（1）不抗凝普通采血管采集人血后，4℃静置1h，凝血结束后，将真空采血管置于离心机中离心，离心条件为：转速3000rpm，5分钟，室温；
（2）血清分装入1.5mL离心管，每支0.5mL，后3000g 15min 室温离心，取上清；
（3）每250µL滴加63µL Exoquick混匀；
（4）4℃下静置孵育30min；
（5）1500g低速离心30 min；
（6）去上清后，1500g 5min离心；
（7）PBS溶解沉淀物，并使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，使得浓度为25µg/µl-100µg/µl
（8）-80℃保存外泌体。
当所述外泌体来源于干细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞时，具体获得过程如下：
（1）取10mL的1×106个/mL对数生长期的骨髓间充质干细胞、心肌细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞的条件培养液，以3000g离心15分钟后，取上清；
（2）ExoQuick-TC外泌体试剂盒进行外泌体提取：向条件培养基上清中加入2mL外泌体提取液，混合均匀，并在4℃条件下过夜反应（反应时间为8~16h）；
（3）1500g低速离心30 min，
（4）去上清后，1500g 5min离心，
（5）使用PBS溶解沉淀物，并使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，使得浓度为25µg/µl-100µg/µl。
上述制备方法制得的聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒。
利用上述聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在血管支架材料表面制备修饰层的方法，过程如下：使用tris调节PBS缓冲液的pH至7.4~9.0后，将聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒分散在该PBS缓冲液中，使聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在PBS缓冲液中的浓度为25µg/ml~200µg/ml；将血管支架材料放入其中，使其完全浸没，30~37℃反应30分~36小时，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS缓冲液洗净表面，即得聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒修饰的血管支架材料表面膜层。
进一步地，所述血管支架材料为钛合金、不锈钢、可降解聚乳酸或高分子量（Mw3000～20000）聚乙二醇。
进一步地，所述PBS缓冲液的pH为7.4。
上述制备方法制得的血管支架材料。
上述血管支架材料在血管支架中的应用。
本发明的反应过程和机理主要包括以下两个部分：第一部分，使用聚多巴胺的静电逐层自组装(LbL)功能来封装单个外泌体颗粒。多巴胺的聚合过程是可以在外泌体存活的pH值环境下进行的，对外泌体本身毒性可以忽略不计，同时可以赋予外泌体新的表面功能：促进外泌体粘附在各种基体上。此外，我们设想在单个外泌体上形成聚多巴胺壳后，为后续的表面修饰提供了大量位点。有研究表明，外泌体具有正常的细胞膜结构，而这种生物相容性良好的聚多巴胺涂层正是因为与细胞壁蛋白的胺基或巯基之间形成了共价键而稳定存在的。第二部分，使用聚多巴胺-外泌体颗粒修饰心血管支架表面。聚多巴胺修饰层在有氧、碱性条件下可以引发温和的自聚-交联反应，可与材料发生螯合和自聚合反应，将内部包裹的外泌体固定于材料表面，形成修饰层。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1. 通过使用多巴胺对单个外泌体的外表面进行修饰，使外泌体具备粘附性能的同时能够更好的适应外部环境，减缓外泌体在血流冲击下的释放速率；
2. 特定来源的外泌体，不仅可以在细胞的层面起到治疗效果，还可以在进入细胞后，通过外泌体自身包含的DNA、RNA、特异性蛋白质，肽段和抗原等生物因子调节靶向细胞内部的蛋白质合成以及启动相关级联反应，促进材料表面内皮化，有效抑制介入晚期的血栓和增生等病症；
3. 该多功能修饰层的制备工艺流程比较易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，效果显著。
附图说明
图1 为外泌体（Exosomes）以及多巴胺修饰后的外泌体的TEM的结果。
图2为外泌体、聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）的NTA的颗粒直径分布结果。
图3为外泌体、聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）的zeta电位的测试结果。
图4为基底材料(Materials)、外泌体-聚多巴胺颗粒（EXO- PDA）修饰的材料表面原子力显微镜图像结果。
图5为基底材料(Materials)、聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）修饰的材料表面血管内皮细胞CD31抗体特异性荧光染色结果及其细胞数量统计。
图6为PKH26标记的外泌体--聚多巴胺颗粒修饰层的材料表面与内皮细胞共培后的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细的说明。
如无特别说明，下述实施例中涉及的PBS缓冲液均为pH=7.4、浓度为10mM的PBS缓冲液。培养箱条件为稳定的温度（37℃）、稳定的CO2水平（5%）、恒定的酸碱度（pH值：7.2~7.4）、较高的相对饱和湿度（95%）。该实例中所使用的外泌体提取试剂均来自SBI公司的ExoQuick以及ExoQuick-TC。α-MEM购自Gibco 公司， DMEM培养基购自Thermo Fisher，α-MEM和DMEM直接使用时称为条件培养基，牛胎儿血清（FBS）购自BI，青链霉素混合液（×100）购自索莱宝，将牛胎儿血清和青链霉素混合液按比例加入α-MEM 或DMEM时称为正常培养基，下文中没有特别提示时，使用的均为该种培养基。CD31抗体及对应二抗购自Abacm，PKH26购自Sigma。BCA(Bicinchoninic Acid)蛋白定量试剂盒购自Sigma-Aldrich。使用的骨髓间充质干细胞（MSC）购自中科院上海细胞库，以及内皮细胞购自ATCC(USA)，人血液采集自身体健康的志愿者。
实施例1：
本实施例提出了一种聚多巴胺-血液外泌体核壳结构纳米颗粒的制备方法，
步骤一，提取血液的外泌体，步骤如下：
1. 不抗凝普通采血管（红头管）采集人血后，4℃静置1h。凝血结束后，将真空采血管置于离心机中离心，离心条件为：转速3000rpm，5分钟，室温。
2.血清分装入1.5mL离心管，每支0.5mL，后3000g 15min 室温离心，取上清；
3.每250µL滴加63µL Exoquick（SBI）混匀；
4.4℃下静置孵育30min；
5.1500g低速离心30 min；
6.去上清后，1500g 5min离心；
7.100µl的PBS溶解沉淀物，并使用BCA试剂盒确定外泌体浓度（基本处于25µg/µl-100µg/µl左右），测得浓度为25µg/µl；
8.-80℃保存外泌体；
步骤二，对血液外泌体的修饰
配制Tris缓冲液，其pH值为7.5；将盐酸多巴胺加入Tris缓冲液使盐酸多巴胺的浓度为1.0µg/ml；取初始浓度为25µg/µl的外泌体。外泌体溶液与盐酸多巴胺溶液的混合体积比为1:20，反应条件为摇床，40℃，避光，80圈/分，20分后反应结束；离心条件为37℃恒温，1500转/分，离心10分，去除上层液，保留沉积颗粒悬液。二次沉积膜层时，外泌体沉积颗粒悬液与盐酸多巴胺溶液的混合体积比为1:15，反应条件为摇床，4℃，避光，120圈/分，2小时后反应结束；后进行离心沉淀，离心条件为37℃恒温，3500转/分，离心15分，所得沉淀即为聚多巴胺-血液外泌体核壳结构纳米颗粒。
图1 为外泌体（Exosomes）以及多巴胺修饰后的外泌体的透射电镜(TEM)照片(标尺为100nm)。图1a为表征外泌体形貌所用的透射电镜(TEM)照片，可以清晰的看到茶杯托状的颗粒，是外泌体的典型形貌；图1b是经过多巴胺修饰后的外泌体的透射电镜(TEM)照片，可以清晰的观察到黑的的颗粒，外形类似于茶杯托装，表面修饰有黑色颗粒，是聚多巴胺的典型形貌。
实施例2：
该实施例列举了一种聚多巴胺-骨髓间充质干细胞外泌体核壳结构纳米颗粒的制备方法，
步骤一，提取骨髓间充质干细胞（MSC）的外泌体：
1. 取10mL的1×106个/mL对数生长期的骨髓间充质干细胞的条件培养液，以3000g离心15分钟后，取上清。
2. ExoQuick-TC外泌体试剂盒进行外泌体提取：向条件培养基上清中加入2mL外泌体提取液，混合均匀，并在4℃条件下过夜反应。
3. 1500g低速离心30 min，
4. 去上清后，1500g 5min离心，
5. 100µl的PBS溶解沉淀物，并使用BCA试剂盒确定外泌体浓度（基本处于25µg/µl-100µg/µl左右），-80℃冻存。
该步骤同样可以用于提取心肌细胞（ARCM）、内皮细胞(HUVEC)或收缩型平滑肌细胞(SMC)的外泌体。
步骤二：多巴胺在骨髓间充质干细胞源的外泌体表面的聚合
配制Tris缓冲液，其pH值为7.5-9.0；将盐酸多巴胺加入Tris缓冲液使盐酸多巴胺的浓度为1.0µg/ml；取外泌体的初始浓度为25µg/µl。外泌体溶液与盐酸多巴胺溶液按照1:40体积比混合，反应条件为摇床，4℃，避光，100圈/分，20分后反应结束；后进行离心沉淀，离心条件为37℃恒温，2000转/分，离心20分，去除上层液，保留沉积颗粒悬液。二次沉积膜层时，外泌体沉积颗粒悬液与盐酸多巴胺溶液按照1:80体积比混合，反应条件为摇床，37℃，避光，80圈/分，1小时后反应结束；离心，离心条件为37℃恒温，2500转/分，离心15分，所得固体即为聚多巴胺-骨髓间充质干细胞外泌体核壳结构纳米颗粒。
图2为外泌体、聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）的NTA的颗粒直径分布结果。图2a为外泌体的粒径，均匀分布在100nm左右的区间；图2b是聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）的粒径，颗粒直径大部分分布有所提升。
图3为外泌体、聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）的zeta电位的测试结果。图3a外泌体的zeta电位，主要分布于+50mv至+120mv之间；图3 b是聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）的zeta电位，主要分布于-5 mv 至-50 mv之间。
实施例3：
一种将聚多巴胺-骨髓间充质干细胞外泌体核壳结构纳米颗粒沉积在医用不锈钢表面的方法：
取实施例子2中的聚多巴胺-骨髓间充质干细胞外泌体核壳结构纳米颗粒作为原料，在抛光的316L SS不锈钢表面制备外泌体-聚多巴胺结构膜层。
使用Tris调节PBS缓冲液的pH至7.5后，将聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒分散在该PBS缓冲液中，使聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在PBS缓冲液中的浓度为100µg/ml。将血管支架材料放入其中，使其完全浸没，33℃反应30分，避光。反应完毕后吸除残余反应液，用PBS缓冲液洗净表面，即得聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒修饰的血管支架材料表面膜层。
对所得的316L SS不锈钢表面连接的外泌体-聚多巴胺结构膜层进行AFM测试。图4为基底材料(Materials)、外泌体-聚多巴胺颗粒（EXO- PDA）修饰的材料表面原子力显微镜图像结果。可以发现，图4b的表面出现颗粒起伏结构，尺寸大小接近聚多巴胺-外泌体颗粒尺寸。
实施例4：
一种将聚多巴胺-血液外泌体核壳结构纳米颗粒沉积在医用聚乳酸（PLGA）表面的方法：
步骤一：使用Tris调节PBS缓冲液的pH至7.5后，将聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒分散在该PBS缓冲液中，使聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在PBS缓冲液中的浓度为150µg/ml。将血管支架材料放入其中，使其完全浸没，35℃反应6小时，避光。反应完毕后吸除残余反应液，用PBS缓冲液洗净表面，即得聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒修饰的血管支架材料表面膜层。
步骤二：血管内皮细胞与膜层的共培养过程
取10mL的1.5×105个/ml对数生长期的的血管内皮细胞，每50cm2表面加入1ml内皮细胞悬浊液，在培养箱中培养24h后取出。
步骤三：CD31染色流程
用PBS轻轻冲洗表面三遍；使用1ml、4%的多聚甲醛固定表面细胞30min；使用PBS冲洗表面3遍；使用1ml、5%BSA封闭液反应30min，使用PBS冲洗表面3遍；将CD31抗体(ab28364)原液按照1:20的体积比使用PBS进行稀释，按照每个样品表面30µl加入，在37℃孵育60分钟，使用PBS冲洗表面3遍；将二抗 (ab150077)按照1:200的体积比使用PBS进行稀释，按照每个样品表面40µl加入；在37℃孵育120分钟，使用PBS冲洗表面3遍。
使用共聚焦显微镜进行观察，激发波长为488nm，滤光片为500-550nm。
图5为基底材料(Materials)、聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）修饰的材料表面内皮细胞CD31抗体特异性荧光染色结果。图5a是内皮细胞的CD31抗体的荧光分析的结果(标尺为100µm)；图5b是材料表面的细胞计数结果（n=3）。从图5可以发现，聚多巴胺-外泌体（PDA-EXO）修饰的材料表面的内皮细胞数量和功能较高，证明其具有良好的促表面内皮化功能。
实施例5：
一种将聚多巴胺-血液外泌体核壳结构纳米颗粒沉积在医用Ti合金表面的方法，
步骤一：取10µL外泌体（来源：实施例1所得外泌体）冻存液，于37℃溶解，稀释于500µL的PBS溶液中，加入0.5µL的5µM的PKH26溶液，在37℃摇床杂交反应10分钟。使用500µld的BSA（5%）终止荧光染色；1500g低速离心30 min，去上清后，再次加入500µlPBS溶液，1500g 低速离心5min，去上清。使用100µl PBS溶解沉淀物，保存于4℃，避光，待用。
步骤二：将步骤一中所得的带有PKH26标记的外泌体--聚多巴胺作为原料，在Ti合金表面制备外泌体-聚多巴胺结构膜层。使用Tris调节PBS缓冲液的pH至8.4后，使用PBS将PKH26标记的外泌体-聚多巴胺颗粒调整浓度为120µg/ml，将Ti合金浸没在该溶液中，细胞培养箱中避光反应18小时后结束。
步骤三：取10mL的5000个/ml对数生长期的血管内皮细胞，按照每50cm2表面加入1ml内皮细胞悬浊液，在培养箱中培养1D后取出，避光。使用PBS冲洗表面3次，使用1ml、4%的多聚甲醛固定表面细胞30min，再次使用PBS冲洗表面3次。
步骤四：使用0.05mol/ml的DAPI对步骤五的样品进行5分钟染色，使用PBS冲洗干净表面残留物。
图6为PKH26标记的外泌体--聚多巴胺颗粒修饰层的材料表面与内皮细胞共培养后的结果，经修饰的外泌体进入血管内皮细胞后的激光共聚焦图片（红色荧光由外泌体膜特异性因子PKH26表达，蓝色荧光是血管内皮细胞核染色区域）：图6中，表达红色荧光的外泌体围绕并覆盖了表达蓝色荧光的细胞核区域，证明经过多巴胺修饰的外泌体可以正常进入细胞内部，进而调控细胞功能。

Claims (4)

1.一种利用聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在血管支架材料表面制备修饰层的方法，其特征在于，过程如下：使用Tris调节PBS缓冲液的pH至7.4~9.0后，将聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒分散在该PBS缓冲液中，使聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在PBS缓冲液中的浓度为25µg/mL ~200µg/mL ；将血管支架材料放入其中，使其完全浸没，30~37℃反应30min~36h，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS缓冲液洗净表面，即得聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒修饰的血管支架材料表面膜层；所述聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒通过下述过程获得：
将盐酸多巴胺溶解在pH值7.5~9.0的Tris缓冲液中，多巴胺-Tris缓冲液中盐酸多巴胺的浓度为1.0µg/mL ~3.0µg/mL ，将初始浓度为25µg/µL ~100µg/µL 的外泌体悬液按照1:5~1:500体积比加至多巴胺-Tris缓冲液中，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/min，反应15min~6h，以600转/min~4000转/min以及5min-30min的离心时间后，去除上清液；保留沉积颗粒悬液，按照1:5~1:100的体积比将多巴胺-Tris缓冲液再次加入沉积颗粒悬液加入中后，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/min，反应15min~6h后，以600转/min~5000转/min离心及5min-30min的离心时间后，去除上层液，所得沉积颗粒即为聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒；所述外泌体来源于血液血清、干细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞；所述外泌体粒径尺寸为40nm~150nm；所述血管支架材料为钛合金、不锈钢、可降解聚乳酸或重均分子量为3000~20000的聚乙二醇；所述PBS缓冲液的pH为7.4。
2.根据权利要求1所述利用聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在血管支架材料表面制备修饰层的方法，其特征在于，血管支架材料为钛合金时，聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在PBS缓冲液中的浓度为120µg/mL ，反应时间为18h；或血管支架材料为不锈钢时，聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在PBS缓冲液中的浓度为100µg/mL ，反应时间为30min；或血管支架材料为可降解聚乳酸时，聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在PBS缓冲液中的浓度为150µg/mL ，反应时间为6h。
3.权利要求1或2所述的制备方法制得的血管支架材料。
4.权利要求3所述的血管支架材料在血管支架中的应用。
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