CN111621052A - 一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性i型胶原蛋白的凝胶基质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质及其制备方法，属于生物材料技术领域；本发明的新型凝胶基质包含改性两性离子聚合磷酸胆碱、改性I型胶原蛋白。首先通过酰胺化反应合成多巴胺接枝改性两性离子聚合磷酸胆碱，然后通过多巴胺氧化聚合时的粘附性，将两性离子聚合磷酸胆碱连接到I性胶原蛋白基质表面，从而获得一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质。该方法制备的新型凝胶基质具有优异的润滑性能，抗炎症因子性能以及良好的生物相容性，并可以很好地结合到受损软骨表面，克服了单一I型胶原蛋白力学性能不足、抗炎症因子性能差的缺点，而且该制备方法简便，原料易于合成，有很好的可行性和实用性，可在关节软骨修复中得到广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质及其制备方法。本发明的新型凝胶基质特别适用于软骨细胞培养，并同时具有抗非特异性吸附性能和润滑性能。
背景技术
关节炎是最常见的慢性疾病之一，据统计，全世界共有3.55亿关节炎患者，其中1.9亿患骨关节炎，超过1650万人患类风湿关节炎。其中，急慢性软骨组织损伤造成的关节炎是全世界公认的致残性疾病，约占关节炎疾病患者的 30%左右，该疾病的治疗在国际上都是个公认的难题。传统的外科治疗方法主要有关节镜下冲洗、微骨折术、关节磨削术等，但存在不能彻底治愈，需要多次微创手术，从根本上并不能为受损软骨周围的软骨细胞提供一个很好的栖息地。
临床上，I型胶原蛋白植入基质(COL I)常用于关节软骨的修复再生，重建的软骨接近正常透明软骨组织，疗效持久，并且适用于损伤面积较大的关节软骨缺损。但是单一I型胶原蛋白基质力学性能不足，抗炎症因子性能较差，严重影响其植入后修复软骨的效果。
二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)是哺乳动物关节滑液中存在的一种含量较高的脂质，研究表明脂质头基具有较好的抗污染能力和极低的摩擦系数，对预防关节磨损或干扰起关键作用。为了开发简便、实用同时具有抗非特异性吸附和润滑双重性能的软骨修复材料，受DPPC结构启发，利用磷酸胆碱头基聚合，得到两性离子毛刷状结构，以进一步提高其润滑性能、抗粘附特性。
为改善I型胶原蛋白植入基质抗非特异性性能差、润滑性能不足的缺点，达到更好治疗软骨损伤的目的，受天然软骨表面结构启发，本发明设计合成了多巴胺接枝改性两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B），通过多巴胺氧化聚合时的粘附性，将两性离子聚合磷酸胆碱牢牢连接到I型胶原蛋白基质表面，从而获得一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质，通过此方法制备得到的凝胶基质既保留了I型胶原蛋白植入基质在软骨细胞迁移、生长和在受损软骨组织粘附的能力，同时又赋予了其优异的抗非特异性吸附性能和润滑性能。
发明内容
为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质。
本发明另一目的在于提供上述基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白新型凝胶基质的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质在生物医药领域中的应用；特别适用于软骨细胞培养，并同时具有抗非特异性吸附性能和润滑性能。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案加以实现的：
一种两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质；是采用多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质，其中，多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）具有如下所述结构：
本发明的两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白新型凝胶基质的制备方法，包括：
1) 酰胺化反应合成多巴胺接枝改性两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）：
a) 将两性离子聚合磷酸胆碱（B）加入到pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，常温下搅拌溶解；
b) 按两性离子聚合磷酸胆碱与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2:1，往步骤a）所获溶液中加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，反应20-30min，
c）按盐酸多巴胺与两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为1-3:1，加入盐酸多巴胺（DOPA），反应1-3 h；
d) 在去离子水中透析以除去催化剂及未反应单体，冷冻干燥得到白色棉花状产物——DOPA-B。
上述步骤b）和c）中所述反应的温度在20-30℃；反应的体系pH为5-6，优选为5.5。
2）I型胶原蛋白凝胶基质的制备：
将含有凝胶液的胶原蛋白溶液倒入细胞培养板中，与培养箱中凝胶化，制备成I型胶原蛋白凝胶基质。
3）两性离子聚合磷酸胆碱连接到I型胶原蛋白基质表面:
a）将多巴胺接枝的两性离子聚合磷酸胆碱溶解在pH=8.5的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为5-20 mg/mL的溶液；
b）将步骤2）制得的I型胶原蛋白基质浸入上述步骤a）溶液中，在25-50℃条件下反应4-12 h，制得两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质。
所述I型胶原蛋白提取后，经过盐析、透析等步骤，以去除杂蛋白及其它已变性的蛋白，获得无毒、无热源、高纯度和高活性的I型胶原。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
1) 本发明的两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质具有很好的抗非特异性吸附性能。在溶菌酶（带正电荷）、牛血清蛋白（带负电荷）中非特性吸附量分别为3.1 ng/cm2、8.8 ng/cm2，远低于在I型胶原蛋白基质表面的非特异性吸附量（详见见表1和图2），克服了单一I型胶原蛋白植入基质抗非特异性吸附性能差的缺点；
2) 本发明的两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质具有优异的润滑性能。在磷酸盐缓冲液（PBS，模拟生理环境）中的摩擦系数达0.02左右，见表1，克服了单一I型胶原蛋白润滑性能不足的缺点。
本发明的两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质具有良好的软骨细胞迁移和生长性能，迁移的细胞分布均匀，且迁移的细胞并没有显示出任何形态学上的差别。
附图说明
图1 多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）改性I型胶原蛋白凝胶基质的结构示意图。
图2 I型胶原蛋白凝胶基质与两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质对1mg/mL的溶菌酶（LYS）、牛血清蛋白（BSA）的非特异性吸附实时曲线变化图。
图3 多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性的I型胶原蛋白凝胶基质对软骨细胞培养的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。
本发明基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质的制备方法合成路线示意图如图1所示：
实施例1
1)多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）的制备：
用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH=7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g两性离子聚合磷酸胆碱（B）溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5，然后向溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为2：1），搅拌20min后加入多巴胺（多巴胺和两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为1：1），用1M盐酸将溶液的pH值维持在5，且在20℃下搅拌反应1小时。将反应后的溶液置于透析袋（MWCO：8000-14000 Da）中，且在pH=5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物（DOPA-B），于-20˚C下储存备用。
2)I型胶原蛋白凝胶基质的制备：
将含有凝胶液的胶原蛋白溶液倒入细胞培养板中，与培养箱中凝胶化，制备成I型胶原蛋白凝胶基质。
3) 多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白基质的制备：
将10 mg多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）溶于2 mL pH=8.5的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为5 mg/mL。然后将I型胶原蛋白基质的下半部分浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于25℃下反应4 h。反应后的I型胶原蛋白基质用去离子水次清洗三次，即获得基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱修饰的I型胶原蛋白新型凝胶基质。
4) 抗非特异性吸附量测定：对制得的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质的抗非特异性吸附性能进行测试，具体方法如下：
将获得的多巴胺接枝透改性I型胶原蛋白新型凝胶基质的QCM芯片（COL I-DOPA-B）贴合到QCM系统的流通池内。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为50 μL/min。待基线平稳后，通入1 mg/mL的牛血清白蛋白或溶菌酶，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由QCM系统测定实时变化曲线，读取频率变化值，并计算非特异性吸附量，见表1和图2。针对实施例1中制得的基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I- DOPA-B-4h），牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为20.9 ng/cm2和5.9 ng/cm2，远低于对照组胶原蛋白植入凝胶基质表面吸附量。
表1 不同凝胶基质表面的非特异性吸附量以及摩擦系数
5)摩擦系数测定与润滑性能评价：采用表面力仪对制得的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质的表面摩擦系数进行测定，评价其润滑性能，具体方法如下：
首先在云母片上修饰I型胶原蛋白基质，随后配置5 mg/ml的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱溶液，将修饰后的云母片置于其中，25℃条件下反应4 h，反应后的I型胶原蛋白基质用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即在云母表面获得基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱修饰的I型胶原蛋白新型凝胶基质。将修饰好的云母片固定于表面力仪测试系统内，测量其摩擦系数，重复测量3次，结果汇总见表1。
由表1可见，实施例1中制得的基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质(COL I-DOPA-B-4 h)的摩擦系数为0.06，远低于单一胶原蛋白凝胶基质的摩擦系数(0.25)。
6)细胞迁移与细胞培养评价：对软骨细胞在制得的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白基质的迁移和培养进行评价。具体方法如下：
培养含人源软骨细胞的移植物凝胶基质，后续简称为含细胞凝胶基质，在含细胞凝胶基质中心掏空，将无细胞的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白基质放置在水凝胶中心，经过长达21天的体外培养。
(1) 含细胞凝胶基质制备
A 血液离心，分离自体血清，制备自体培养基；
B从组织运输盒中取出软骨块，放进培养皿，用手术刀将组织切片切成碎块，分离软骨细胞；
C 将分离后的软骨细胞放入细胞培养瓶中进行培养，37℃约15-40h；
D 悬浮细胞，取不含任何未溶解的软骨细胞的消化产物于50 ml的离心管中，加入A步骤制备的自体培养基；
D 加入含胶原蛋白的凝胶液，混匀后倒入细胞培养板，放入37℃培养箱中放至凝胶化；
E 凝胶化后加入培养基进行细胞培养，即成为含细胞的凝胶基质。
(2)多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质和含细胞凝胶基质复合物制备。
a) 用Φ9 mm的角膜环钻在制得的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质中间部位垂直切取一块圆形凝胶柱；
b) 用Φ7.5 mm的角膜环钻在培养了7天的含细胞凝胶基质中间部位垂直切下一块圆形含细胞凝胶基质的凝胶柱，形成凝胶孔；
c) 打入配好的纤维蛋白胶，迅速将多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶柱垂直放置进凝胶孔，并用镊子轻轻压一下，确保凝胶柱完全进入含细胞凝胶基质的凝胶孔。
采用显微镜下观察软骨细胞情况。如图3所示：第4天，凝胶中的可见极少部分细胞呈蝌蚪样；第7天，凝胶中的可见部分细胞呈蝌蚪样，部分细胞呈梭型，细胞成群分布在不同层面。随着培养时间增加至14天，两性离子聚合磷酸胆碱改性胶原蛋白凝胶中的细胞有明显增加，表明人源软骨细胞移植物中的软骨细胞成功的迁入至两性离子聚合磷酸胆碱改性胶原蛋白凝胶胶中，迁移的细胞分布均匀，且迁移的细胞并没有显示出任何形态学上的差别。
实施例2
1)多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）的制备：
用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH=7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g两性离子聚合磷酸胆碱（B）溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5.5，然后向溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为2：1），搅拌25min后加入多巴胺（多巴胺和两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为2：1），用1M盐酸将溶液的pH值维持在5.5且在25℃下搅拌反应2小时。将反应后的溶液置于透析袋（MWCO：8000-14000 Da）中，且在pH=5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物（DOPA-B），于-20˚C下储存备用。
2)I型胶原蛋白凝胶基质的制备：
将含有凝胶液的胶原蛋白溶液倒入细胞培养板中，与培养箱中凝胶化，制备成I型胶原蛋白凝胶基质。
3) 多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白基质的制备：
将20 mg多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）溶于2 mL pH=8.5的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为10 mg/mL。然后将I型胶原蛋白基质的下半部分浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37℃且100 rpm的摇速下反应8 h。反应后的I型胶原蛋白基质用去离子水次清洗三次，即获得基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱修饰的I型胶原蛋白新型凝胶基质。
4) 抗非特异性吸附量测定：测试方法同实例1。
测试结果见表1和图2。针对实施例2中制得的基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I-DOPA-B-8 h），牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为16.5 ng/cm2和4.3ng/cm2，远低于对照组胶原蛋白植入凝胶基质表面吸附量。
5)摩擦系数测定与润滑性能评价：采用表面力仪对制得的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质的表面摩擦系数进行测定，评价其润滑性能，具体方法如下：
首先在云母片上修饰I型胶原蛋白基质，随后配置5 mg/ml的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱溶液，将修饰后的云母片置于其中，37℃条件下反应8 h，反应后的I型胶原蛋白基质用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即在云母表面获得基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱修饰的I型胶原蛋白新型凝胶基质。将修饰好的云母片固定于表面力仪测试系统内，测量其摩擦系数，重复测量3次，结果汇总见表1。
由表1可见，实施例1中制得的基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I-DOPA-B-8 h）的摩擦系数为0.04，远低于单一胶原蛋白凝胶基质的摩擦系数（0.25）。
6)细胞迁移与细胞培养评价：测试方法同实例1。
测试结果与图3类似，此实例没有给出图示：第4天，凝胶中的可见极少部分细胞呈蝌蚪样；第7天，凝胶中的可见部分细胞呈蝌蚪样，部分细胞呈梭型，细胞成群分布在不同层面。随着培养时间增加至14天，两性离子聚合磷酸胆碱改性胶原蛋白凝胶中的细胞有明显增加，表明人源软骨细胞移植物中的软骨细胞成功的迁入至两性离子聚合磷酸胆碱改性胶原蛋白凝胶胶中，迁移的细胞分布均匀，且迁移的细胞并没有显示出任何形态学上的差别。
实施例3
1)多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）的制备：
用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH=7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g两性离子聚合磷酸胆碱（B）溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至6，然后向溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为2：1），搅拌30min后加入多巴胺（多巴胺和两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为3：1），用1M盐酸将溶液的pH值维持在6且在30℃下搅拌反应3小时。将反应后的溶液置于透析袋（MWCO：8000-14000 Da）中，且在pH=5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物（DOPA-B），于-20˚C下储存备用。
2)I型胶原蛋白凝胶基质的制备：
将含有凝胶液的胶原蛋白溶液倒入细胞培养板中，与培养箱中凝胶化，制备成I型胶原蛋白凝胶基质。
3) 多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白基质的制备：
将40 mg多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）溶于2 mL pH=8.5的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为20 mg/mL。然后将I型胶原蛋白基质的下半部分浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于50℃且100 rpm的摇速下反应12 h。反应后的I型胶原蛋白基质用去离子水次清洗三次，即获得基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱修饰的I型胶原蛋白新型凝胶基质。
4)抗非特异性吸附量测定：测试方法同实例1。
测试结果见表1和图2。针对实施例3中制得的基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I-DOPA-B-12 h），牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为8.8 ng/cm2和3.1ng/cm2，远低于对照组胶原蛋白植入凝胶基质表面吸附量。
5) 摩擦系数测定与润滑性能评价：摩擦系数测定与润滑性能评价：采用表面力仪对制得的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质的表面摩擦系数进行测定，评价其润滑性能，具体方法如下：
首先在云母片上修饰I型胶原蛋白基质，随后配置5 mg/ml的多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱溶液，将修饰后的云母片置于其中，50℃条件下反应12 h，反应后的I型胶原蛋白基质用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即在云母表面获得基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱修饰的I型胶原蛋白新型凝胶基质。将修饰好的云母片固定于表面力仪测试系统内，测量其摩擦系数，重复测量3次，结果汇总见表1。
由表1可见，实施例3中制得的基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I-DOPA-B-12 h）的摩擦系数为0.02，远低于单一胶原蛋白凝胶基质的摩擦系数（0.25）。
6)细胞迁移与细胞培养评价：测试方法同实例1。
测试结果与图3类似，此实例没有给出图示：第4天，凝胶中的可见极少部分细胞呈蝌蚪样；第7天，凝胶中的可见部分细胞呈蝌蚪样，部分细胞呈梭型，细胞成群分布在不同层面。随着培养时间增加至14天，两性离子聚合磷酸胆碱改性胶原蛋白凝胶中的细胞有明显增加，表明人源软骨细胞移植物中的软骨细胞成功的迁入至两性离子聚合磷酸胆碱改性胶原蛋白凝胶胶中，迁移的细胞分布均匀，且迁移的细胞并没有显示出任何形态学上的差别。
本发明公开和提出的一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质及其制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (6)
1.一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质的制备方法，其特征在于：（1）通过酰胺化反应将多巴胺接枝到两性离子聚合磷酸胆碱分子表面；（2）利用多巴胺氧化聚合时的粘附性，将两性离子聚合磷酸胆碱分子连接到I型胶原蛋白凝胶基质表面，其中多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）具有如下结构：
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其酰胺化反应合成多巴胺接枝改性两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）的制备方法：
a) 将两性离子聚合磷酸胆碱（B）加入到pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，常温下搅拌溶解；
b) 按两性离子聚合磷酸胆碱与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2:1，往步骤a）所获溶液中加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，反应20-30 min；
c）按盐酸多巴胺与两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为1-3:1，加入盐酸多巴胺（DOPA），反应1-3 h；
d) 在去离子水中透析以除去催化剂及未反应单体，冷冻干燥得到白色棉花状产物——DOPA-B。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤b）和c）中反应的温度在20-30℃，反应的体系pH为5-6。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两性离子聚合磷酸胆碱连接到I型胶原蛋白基质表面的制备方法具体为：
a）将多巴胺接枝的两性离子聚合磷酸胆碱溶解在pH=8.5的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为5-20 mg/mL的溶液；
b）将I型胶原蛋白基质浸入上述溶液中，在25-50℃条件下反应4-12 h，制得两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质。
5.权利要求1-4任一方法制备的基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质在生物材料领域中的应用。
6.权利要求1-4任一方法制备的基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质特用作改善软骨修复材料摩擦性能的改性材料。
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