JPH03500492A - ４型コラーゲン活性を有するポリペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■型コラーゲン活性を有するポリペプチド類［政府援助］ この発明はナショナル・インスチチューツ・オブ・ヘルスからの助成金によって なされた（助成番号ＡＭ３２６６０）、政府はこの発明に特定の権利をもつ。

［発明の背景］ ｙ型コラーゲンはほとんど基底膜だけに見いだされる独特の糖タンパク質である 。これは、主として間質性結合組織で見いだされる他の形のコラーゲンといくつ かの精造的な特性の点で異なっている［二ニー・トレンズ・イン・ベースメント ・メンプラン・リサーチ、Ｋ、クエーンら１ｍ（レーベンプレス社、Ｎ’ｌ’（ １９８２年））、５９〜６７頁参照］、■型コラーゲンは約５０００００の分子 量（ＭＷ）を有し、２本のα１鎖（ＭＷ：　１８５０００）と１本のα２鎖（Ｍ Ｗ：１７００００）との３本のポリペ１チド鎖からなる。■型コラーゲンは大き い球状をした非コラーゲン性ドメインＮＣＩと、３重うセ〉精造を有するもう１ つのコラーゲン性ドメインとの２種類の主ドメインを有する。後者のドメインは しばしば短い非コラーゲン性配列によって中断される。このコラーゲン性ドメイ ンのアミノ酸配列は部分的にしか分かつていないが、非コラーゲン性ＭＣＩドメ インのα１鎖およびα２Ｍはいずれも配列が分かつている［Ｕ、シュワルツ−マ クドレンら（ＦＥＢＳ・レターズ、２０８巻、２０３頁（１９８６年））および そこに引用された参考文献参照］、第１図に■型コラーゲン分子の線区を示す、 明らかに■型コラーゲンは、異なったドメインに異なった生物活性を備えた非常 に複雑な多ドメイン性タンパク質である。

■型コラーゲンは自己気合して基底膜構造の支持マトリックスを構成する高次形 態となるから、基底膜を構成する必須成分である。

基底膜のそれ以外の種々の巨大分子成分はこの支持枠組み上に組立てられるもの と考えられる８例えばラミニン、ナイドジエンおよびヘパランＨａプロテオグリ カンは■型コラーゲンへ結合することが報告されている。ラミニンはＮ型コラー ゲンのラセン構造に冨んだコラーゲン性ドメイン部分の間で２つの異なった部位 へ結合することが観察された。一方、ナイドジエンおよびヘパランＫｎプロテオ グリカンは非コラーゲン性ＮＣＩドメインへ特異的に結合することが観察された 。Ｎ型コラーゲンのもう一つの特性は、前述のように末端−末端会合および側方 会合による自己気合能である０重合した構造の最終生産物は不規則な多角形の網 状結合である。ＮＣＩドメインは、ラセン１１造に富んだドメイン部分の間でこ れと結合し分子同志を互いに近接させることによって側方横築を開始するので、 網状結合形成にとってＮＣＩドメインは必要なものである。側方構築がない場合 は末端−末端会合だけが起こるので、網状ｔｊＩ造を形成することができない。

Ｎ型コラーゲンの追加的な機能は、細胞表面受容体と介してさまざまな細胞型へ 結合することである［Ｍ、カーキネンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ ケミストリー、２５９巻、５９１５頁（１９８４年）］　、］Ｍシーーキネらは 分子量４７０００の主要表面受容体タンパク質がマウス胚壁内胚葉細胞の場合に この結合を仲介することを報告した。

Ｎ型コラーゲンに帰属されるさまざまな機能は、このタンパク質が基底膜の横築 、細胞遊走、創傷治癒、Ｕ瘍細胞の転移、糖尿病性微小血管病変、高血圧および いくつかの腎疾患に起因する血管性肥厚のような多彩な臨床的に重大な経過に関 与する重要な反応因子であることを示している０例えば肺胞炎および腎炎にそれ ぞれ起因する喀血および血尿によって特徴付けられる疾患であるグツドバスチャ ー痘候群では、Ｎ型コラーゲンのＮＣＩドメインに対する抗体の存在がすべての グツドパスチャー疾患患者の血清で認められる。また別の遺伝学的腎臓疾患であ るアルポート家族性腎炎は明らかにＮ型コラーゲンのＮＣＩドメインの遺伝子欠 損に起因する。また真性糖尿病では、血漿中および基底膜の近傍、即ち細胞外マ トリックスにおけるブドウ糖量の増加により無傷のＮ型コラーゲンおよびラセン 精造に寓んだドメインが化学的に修飾され、機能的に損傷される。

これらの経過の病態生理学を分子レベルでさらによく理解するためには、Ｎ型コ ラーゲンが示す個々の生物学的活性が特異的な（即ち、ＮＣＩまたはラセン構造 に富んだ）サブドメインに帰属するのか、あるいはＮ型コラーゲンのオリゴペプ チドに４Ｊ４ｇＬするのか解明を試みる必要がある。これが達成できれば、重要 な医薬組成物の主成分を提供できる短鎖ペプチドを合成することが可能となり得 る。

［発明の詳細な説明コ この発明は、Ｎ型コラーゲンのα１−ＮＣＩ鎖の断片を正式に表わす３種のポリ ペプチドを提供する。これらのポリペプチドは通常の固相ペプチド合成法によっ て生産でき、下式％式％ （］） ポリペプチドｌ（以下、ｒＴＳ−１，で表わす）はα１．−ＮＣＩドメインの２ ０１〜２１６アミノ酸を正式に表わし、−文字略記法ではＭＦＫＫＰＴＰＳＴＬ ＫＡＧＥＬＲで表わすことができる。ポリペプチド１は単離されたα１−ＮＣｌ アミノ酸残基４９〜５０を正式に表わし、ポリペプチド団は単離されたα１−Ｍ Ｃｌアミノ酸残基１７〜２７を正式に表わす、これらのポリペプチドに対する一 文字アミノ酸略記法は、それぞれＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭおよびＮＰＬＣＰＰ ＧＴＫＩＬである。以下簡潔にするため、ポリペプチドＢをｒＴＳ−２Ｊ　、ポ リペプチド■をｒ　Ｔ　Ｓ−３Ｊと表示する。これらのペプチドのヒトロバシー 指数、実効電荷、リジン数など簡単な特性を下記の第１表に示す。

［第１表］ カイトおよびドフーリットル、ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジー 　１５７巻、１０５頁（１９８２年）これらの合成ポリペプチド類の生物活性を 測定したところ、ＴＳ−２およびＴＳ−３は、（ａ　）ＩＶ型コラーゲンおよび その単離したＮＣ１ドメイン（ＴＳ−２だけ）ｌ＼結合し、（ｂ）ヘパリンへ結 合し、（ｃ）■型コラーゲンへのヘパリンの結合を抑制することが判明した。Ｔ Ｓ−１，ＴＳ−２およびＴＳ−３は大動脈内皮細胞の粘着を促進し。

また黒色腫細胞へ結合する（ＴＳ−３だけ）、シたがってＴＳ−１，７Ｓ−２お よびＴＳ−３は、（ａ）創傷治恒および移植組織の受容を促進し、（ｂ）培簑基 質への細胞付着を促進し、そして／：４たは（Ｃ）腫瘍細胞の転移を抑制するの に有用であり得ると信じられる。ポリペプチドＴＳ−１，’ｒｓ−２；　ＴＳ− ３によって示される生物活性スペクトルにそれぞれ差異のあることから、ＴＳ− １，７Ｓ−２およびＴＳ−３の混合物もまたこの発明の範囲に含まれる。

またポリペプチドＴＳ−２およびＴＳ−３をイン・ビトロまたはイン・ビボでさ らに消化／加水分解することによって、実質上向等な生物活性を有する断片を生 じることが期待されるから、そのような低分子ポリペプチド類もこの発明の範囲 に含まれるものとみなす。

［図面のＰＪＳな説明］ 第１図は■型コラーゲン分子を表わした線区である。２つの３重ラセン部分の鎖 長を最上段に示す、黒塗り区域は他の■型コラーゲン分子との相互作用に関与し ている部位である。

第２図は一文字アミノ酸略記法で示した■型コラーゲンのＣ１−ＮＣＬＭの完全 なアミノ酸配列、第３Ａおよび３Ｂ図は■型コラーゲンの網状結合形成に対する この発明のポリペプチドの効果を示したグラフ、第４図は無傷なＮＣＩドメイン の■型コラーゲンに対する結合を示したグラフ、第５図は無傷なＮＣＩの溶液中 での■型コラーゲンに対する結合のスカツチャードプロットであって、■型コラ ーゲンはプラスチック表面に固定化しである。

第６図は無傷なＮＣＩドメインおよび■型コラーゲンに対するポリペプチドＴＳ −２およびＴＳ−３の結合を示したグラフ、第７ｒ：ｚｉはヘパリンに対するこ の発明のポリペプチドの結合を示したグラフ、第８〜９図は固定化したヘパリン に対するポリペプチドＴＳ−２およびＴＳ−３の結合能を示したグラフである。

第１０〜１１図は■型コラーゲンおよびＮＣＩドメインに対する）Ｈ−ヘパリン の結合を示したグラフ、第１２〜１３図は一定量の■型コラーゲンおよびＮＣＩ ドメインに対しゝＨ−ヘパリンの濃度を増大したときの結合を示したグラフ、第 １４Ａ〜Ｃ図は■型コラーゲンに対する）Ｈ−ヘパリンの結合のポリペプチドＴ Ｓ−１、ＴＳ−２およびＴＳ−３による抑制を示したグラフである。

第１５図はこの発明のべ１チドの大動脈内皮細胞に対する結合を示したグラフ、 第１６図はこの発明のペプチドのＭ４４重腫細胞に対する結合を示したグラフ、 第１７０はこの発明のペプチドの正常ラット線維芽細胞に対する結合を示したグ ラフ、第１８区はＭＭ線維肉腫細胞のペプチドＴＳ−１、ＴＳ−２およびＴＳ− ３に対する結合を示したグラフ、第１９図はこの発明のペプチドのＣ６神経膠腫 細胞に対する結合を示したグラフ、第２０図はペプチドＴＳ−１、ＴＳ−２およ びＴＳ−３のＡ４３１がん腫細胞に対する結合を示したグラフ、第２１図はこの 発明のペプチドの種々の細胞系に対する結合をまとめたグラフである。

［発明の詳細な説明〕 α１鎖のラセン構造に富んだコラーゲン性部分のアミノ酸配列はＷ、バベルらに よって一部報告されている［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオフミスト リー、１４３巻、５４５頁（１９８４年）］、非コラーゲン性α１−ＮＣｌの完 全な配列を第２図に示す。

０１Ｍの球状をしたＮＣＩドメインに関して入手可能な配列情報を検討し、ＴＳ −１，７Ｓ−２およびＴＳ−３と名付けたこの発明の３種のポリペプチドをさら に評価するため合成した。

（ポリペプチドの合成） メリフィールドの固相法を用いてこの発明のポリペ１チドを合成した。この方法 はペプチド合成に最も一般に用いられている方法であって、本明細書に参考文献 として加えたＪ、Ｍ、スチュアートおよびＪ、Ｄ、ヤングの発表［ソリッド・フ ェーズ・ペプチド・シンセシス、ピアス・ケミカル・カンパニー（ロックホード 、ＩＬ）出版、第２版＜３９８４年）コに詳細に報告されている。

メリフィールドのペプチド合成方法では塩化ベンジル基で反応性にした１ｚ架橋 ポリスチレン樹脂を使用する。ハロゲンは保護基を付けたアミノ酸塩と反応する とエステルを形成し、アミノ酸は共有結合によって樹脂に結合する。アミノ酸の 遊離アミノ基の保護にはベンジルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）を使用する。こ の保護基はジクロロメタン（Ｄ　ＣＭ　）中、２５％トリフルオロ酢酸（ＴＣＡ ）で除去される。新たに出現したアミノ基をＤＣＭ中、１０％トリエチルアミン （Ｔ　Ｅ　Ａ　）で遊離塩基へ変換する。ついでジシクロへキシルカルボジイミ ド（ＤＣＣ）を使用することにより、次のＢＯＣ−保護アミノ酸を先に調製した アミノ酸の遊離アミンへ結合させる。アミノ酸の側鎖官能基は、合成期間中ＴＦ Ａに安定なベンジル誘導体により保厩しておく、これらの繰り返し反応はすべて 自動化することができ、この発明のペプチドはユニバージティー・オブ・ミネソ タ・ミクロケミカル施設でベックマン・システム９９０ペプチドシンセサイザー を使用して合成した。

樹脂上に横築したポリペプチド合成に引き続き、樹脂と結きしているポリペプチ ドを無水フッ化水素Ｐｉ（）（Ｆ）で処理して樹脂とベンジルエステルの結合を 切断し、ａｍポリベペプチド切り離す、ベンジル誘導した側鎖保護基もＨＦ処理 によって同様に除去される。ついで１．０Ｍ酢酸を使用してポリペプチドを樹脂 から抽出し、抽出物を凍結乾燥する。

凍結乾燥した粗製ポリペ１チドを、調製用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）でＣ−１８カラムを使用する逆相法により８Ｆ製する。標準的な溶出勾配は Ｈ２Ｏ中、０．１％ＴＦＡ＋アセトニトリルＯ％−６０％である。溶離液の吸収 を２２０ｎｍで測定して分画を採取し、、凍結乾燥する。

精製したポリペプチドの確認はアミノ酸分析によって行なう、システィンまたは トリプトファンが存在する場合は、まず６Ｍ　ＨＣｌで１１０’Ｃで（絶えず沸 胱）または４Ｎメタンスルホン酸中で２４時間嫌気的に加水分解する。加水分解 したアミノ酸をベックマン・システｌ、６３００アミノ酸アナライザーを使用し 、クエン酸緩衝液（ベックマン社提供）を使用するイオン交換クロマトグラフィ ーにより分離する。定量は４４０ｎｍおよび５７０ｎｍの吸収を用い標準曲線と の比較により行なう、ポリペプチドをさらに配列決定によって確認してもよい、 この方法は比較的長鎖長のポリペプチドでアミノ酸組成データの情報がもともと 乏しい場合、ことに有用である。

配列決定は自動化されたモデル４７０Ａ気相シークエネーター（アプライド・バ イオシステム社）でアミン末端から逐次分解するエドマン分解によるＲ、Ｍ、ヒ ユーイックらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５ ６巻、７９９０頁（１９８１年）］によって案施する。

以下に詳細な実施例をあげてさらにこの発明を説明する。

［実施例１］ 液相コラーゲン結合検定 ■型コラーゲンおよびＮＣＩドメインに対するこれらのペプチドの結合能を種々 の方法を用いて評価した。まず第一に予熱した無傷の■型コラーゲンによる網状 結合形成を電子顕ｔＲ鏡水準で回転シャドウィング法により検討した。試験して 統計的に評価した（不規則な網状結合を含んでいる視野数を数えることによって ）組合わせを第１表に示す。

［第■表〕 リバリーらの報告のようにコラ−ゲナーゼ処理によって単離した（ジャーナル・ オブ・セル・バイオロジー、１０Ｂ、Ｉ、２４６７〜２４７３頁（１９８６年） 組合わせ１〜４かち得られた組立ての比較成績を第３Ａ図に示す。

組合わせ５〜７から得られた組立ての比較成績を第３Ｂ図に示す。

またこの図にはＮ型コラーゲンを対照ＮＣＩドメインおよびグリコジル化ＮＣＩ ドメインと使用して得られた結果も示した。

第３Ａおよび３Ｂ表にまとめた成績から、（ａ）対照ＮＣＩドメインはＮ型コラ ーゲンへ結合して網状結合形成を競合し、（ｂ）糖尿病によって修飾され、また はグリコジル化されたＮＣＩドメインは網状結合を競合できないことから、Ｎ型 コラーゲンと結合できないことが確認された。具体的にはポリペ７チドＴ　Ｓ　 −２は網状結合形成を効果的に防止するので、無傷な対照ＮＣＩドメインの効果 をまねびＴＳ−３はＮ型コラーゲンの組立てに対してなんら効果を示さない（第 ３Ｂ図）。

［実施例２〕 固相コラーゲン結合検定 同様に無傷なＮＣＩドメインおよびポリペプチドＴＳ・２およびＴ　Ｓ−３のＮ 型コラーゲンに対する結合を固相結合検定により検討した。Ｎ型コラーゲンをプ ラスチック表面に被覆し、単離したＮＣ１ドメインの結合（Ｎ製したＮ型コラー ゲンからコラーゲナーゼ処哩によってＪｌｌＩｔ）を１２ｓＩ−標識したＮＣＩ ドメインの添加温度を増大することによって検討した。これらの成績を第４０に 示す、添加したＮＣＩ濃度の増加に伴ないＮ型コラーゲンへ結合する′ｌ−ＮＣ ｌ量の増加は、ＮＣＩドメインへの結合に有効なすべての部位が占有されたこと を意味するプラトーに達するまで観察された。

標識していないＮＣＩドメインの過剰によって競合できたことから１２５１−Ｎ ＣＩのＮ型コラーゲンに対するこの飽和性結合は特異的であると言い得る（第４ 図）。

スカッチャードプロットによるＮＣＩドメインのＮ型コラーゲンに対する結合親 和性の分析から、２つの異なった結合定数を有する２種類の結合部位が存在する ことが判明した（第５図）、２つの結合定数はそれぞれ４０ｎＭおよび３３０ｎ Ｍであった。

ＰＢＳに加えたＮ型コラーゲン（１０，ｕｇ／ｍｌ、５０λ）をプラスチック製 ウェルへ加え、４℃で１夜インキュベートすることによりグラスチック表面へ結 合させた。ついでＢＳＡ、ペプチドＴＳ−２またはペプチドＴＳ−３の存在で　 １２＄７−標１４ＮＣＩドメインを固定化したＮ型コラーゲンと相互作用させた 。ペプチドＴＳ−３を”’ｌ−ＮＣ１溶液へ添加しても、”ｌ−ＮＣｌのＩＶ型 コラーゲンニ対するその後の結合になんらの効果をもたらさなかった（第６図） 。

”ｌ−ＮＣｌ溶液中にペプチドＴＳ−２が存在すると、１２うｌ−ＮＣ１のＮ型 コラーゲンに対する結合は、それがプラトーに達するまで劇的な増加を生じた（ 第６図）、これらの成績からペプチドＴＳ−２はＮ型コラーゲンと結合すると同 時に、単離したＮＣＩドメインに対しても結合できることが分かる。ペプチドの この二重結合能は、高濃度のペプチドＴＳ−２を使用したとき観察されたＮＣＩ ドメインのＮ型コラーゲンに対する結合の増大を説明するものと言える。

Ｃ実施例３〕 ヘパリン結合検定 この発明のポリペプチドのヘパリンに対する結合能を試験するため、各ポリペプ チド２ｍｇ／ｍｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ７，８）を調製し、 これと同一のＦ１衝液で１：ｌに系列希釈し、２ｍｇ／ｍｌから１μｇ／ｍ１＊ での濃度を作成しな、それぞれの希釈液から１００ｕ＋をとり、１Ｈ−ヘパリン （５００００ｄｐｍ／ｍｌ）と３７℃で２時間インキュベートしたのち、混合物 をニトロセルロースで被覆したウェルへ添加しな、ついでウェルを１０ｍＭ）リ ス−ＨＣＩ（ＰＨ８，０）で洗浄した（４×、２分間ずつ）、各希釈度毎に各ペ プチドへ結合したゝＨ−ヘパリン量を第７図に示す、この実験の結果からペプチ ドＴＳ−２およびＴＳ−３はヘパリンへ結合するが（ＴＳ−２１７）方が量的に ＴＳ−３より一層多い）、Ｔｓ−１はヘパリンと相互作用しない。

この発明のポリペプチドを９６六（ウェル）のプラスチック平板に被覆した際の ヘパリンとの相互作用能を評価した。最高濃度２ｍｇ／ｍｌのポリペプチドの予 製液を調製し、リン酸緩衝化食塩液（ＰＢＳ　）　＋　Ｎ　ａ　Ｎ　ｓで系列希 釈して最終濃度２ｍｇ／ｍＪ　〜１ｔｔｇ／ｍＪを作成した。各希釈液５０μｍ で９６穴の平板を被覆し、１夜２８℃で放置して乾燥した。ついで非特異的なリ ガンド結合をできるだけ少なくするため、ウェルをＢＳＡ　２ｍｇ／ｍｌで２時 間処理した。

３Ｈ−ヘパリンを添加しく１ウエル当たり５００００ｄｐｍ）、混合物を２時間 インキュベートし、た、十分に洗浄したのち、各ペプチド濃度毎に結合した３旧 ヘパリンをドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ　）で回収し、シンチレーショ ンカウンターで計数した。第８図に示した結果から、ペプチドＴＳ−２はヘパリ ンを強く結合していることが分かる。ペプチドＴＳ−３もヘパリンを結合するが 、その程度はＴＳ−２よりも強くない（第９図）、ペプチドＴＳ−１はバックグ ラウ〉・ド値（ＢＳＡ）以上にヘパリンを結合しない。

ついで）Ｈ−ヘパリンが無傷の天然■型コラーゲンおよび＊ａしたＮＣ，ｌドメ インの双方Ｉ＼結合することを立証した。第１０および１１図は、濃度を増加し た■型コラーゲンおよびＮＣＩドメインに対する】Ｈ−ヘパリンの一定ＪＬ（８ ５０００ｄｐｍ）の結合を示す。

いずれの場合にも飽和性結合が観察された。■型コラーゲンはＮＣ１ドメインよ りも５〜６倍多く　ｓＨ−ヘパリンを結合する。

つぎに３Ｈ−ヘパリン濃度を増大したときの一定量の■型コラーゲン（３μｇ） および等モル量のＮＣＩドメイン（１Ｈｇ）に対する結合を試験した。この場合 も′Ｈ−ヘパリンの■型コラーゲン（第１２図）およびＮＣＩドメイン（第１３ 図）に対する飽和性結合が観察された。この実験系では、■型コラーゲンの方が ＮＣＩドメインより約４倍多い３Ｈ−ヘパリンが結合した。これらの成績は、■ 型コラーゲンに少なくとも２ケ所のヘパリン結合部位があり、１つはＮＣＩドメ インに、もう１つ（複数もあり）は分子のラセン構造に富んだ部分に存在してい ることを示している。

つぎにプラスチックに被覆した無傷の天然■型コラーゲンに対するヘパリンの結 合を抑制するこの発明の３種のペプチド溶液（プラスチックに吸着しない）の抑 制能をスクリーニングした。この実験的検討は、ヘパリン結合検定の際にペプチ ドの被覆差に起因する問題があれば未然に防止しようとするためである。

■型コラーゲン６０μｓ／ｍｌのＰＢＳ十〇、１％トリトン−Ｘ溶液を９６穴の 平板に被覆しく１ウエル当たり５０μｍまたはラミニン３μｇを使用）、２８℃ で１夜乾燥し、ついでＰＢＳに２ｇｍ／ｍ１に希釈したウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）でウェルを被覆した。

２ｍｇ／ｍ１〜１μｇ／ｍｌの種々の希釈範囲でペプチドを３Ｈ−ヘパリンの標 準量（１ウエル当たり３００００ｄｐｍ）とともに２時間インキュベートし、つ いで混合物を■型コラーゲンで被覆した平板へ移して、さらに２時間インキュベ ートした。十分に洗浄したのち各ウェルに残存している放射能活性を測定した。

第１４区に示した結果からペプチドＴＳ−２（第１４Ｂ図）およびＴＳ−３（第 １４Ｃ図）は試験した最高濃度でコラーゲンに対する３Ｈ−ヘパリンの結合を約 ４３％抑制することから、この検定でこれらのペプチドがヘパリンと相互作用す ることが判明した。しかし低濃度ではペプチドＴＳ−２は■型コラーゲンに対す る′Ｈ−ヘパリンの結合をＴＳ−３よりも有意に抑制でき、したがって一層高い 親和性でヘパリンへ結合していた。ＴＳ−１はこの検定ではヘパリンと相互作用 しない（第１４Ａ図）。

ペプチドＴＳ−２およびＴＳ−３は実施したすべての検定でヘパリンｌ−結合す ることができた。ペプチドＴＳ−２がヘパリンおよび■型コラーゲンのいずれと も結合できることは興味深い、これらの成績は、このペプチドに１ケ所以上の結 合部位が存在していることを示している。したがってこのペプチドの１結合部位 に対するヘパリンの結合は、このペプチドの■型コラーゲンに対する結合と競合 する可能性がある。またこのペプチドはヘパリンおよび■型コラーゲンをともに 結合し、しかもそれらを種々の生体材料へ結合するのに利用できるかもしれない 。

［実施例４］ 細胞粘着検定 この検定は下記の細胞系二人動脈内皮細胞、転移性マウス黒色腫（Ｍ４）細胞、 正常ラット線維芽細胞、ＭＭ線維肉！細胞、Ｃ６神経膠腫細胞、乳がん（Ａ４３ １　）細胞で実施した。細胞結合検定は、いずれの細胞系とも同一の方法で行な い、この発明の３種のペプチドＴＳ−１、ＴＳ−２、ＴＳ−３はいずれの場合も 、細胞粘着について個別に検定した。

ペプチドＴＳ−１，ＴＳ−２，７Ｓ−３およびＢＳＡをそれぞれ４段階の異なっ た量（０，５，５，５０，５００μｇ／ｍｌおよび１ウエル当たり１００λ）で 吸着させた９６穴の＠１滴定板を使用して粘着を試験した。６０〜，８０％気密 的となった細胞培養へ３Ｈ−チミジン３ｍＣ１を添加することにより、２４時間 代謝的に標識した。

検定の当日、トリプシン化によって細胞を採取し、血清を添加することによって トリプシンを阻害し、この混合物がなくなるまで細胞を洗浄しＤＭＥＭに再浮遊 させた。細胞を６Ｘ１０’／ｍｌの濃度に調節し、この細胞浮遊液１００μｌを ウェルへ添加した。ついで検定混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。

インキュベーション終了時に、ウェルを温ＰＢＳ　（１０ｍＭ　Ｃａ”＋含有） で洗浄し、粘着細胞群を１％ドデシル硫酸ナトリウム含有０．５Ｍ　ＮａＯＨで 可溶化した。可溶化した細胞をついで液体シンチレーションカウンターを用いて 定量した。測定はそれぞれ３回ずつ行なった。

Ａ、大動脈内皮Ｈｉ胞 大動脈内皮細胞はコラ−ゲナーゼ処理によってウシ大動脈から入手し、使用する まで一１９６℃で凍結した。これらの細胞はＤＭＥＭおよび１０％０％ウシ胎清 の存在で加湿大気中３７℃で初代培養に培養した。大動脈内皮細胞が約７０％気 密的になったら、トリプシンによって細胞を組織培養プラスチックから遊離し、 下記のべ１チド、（ａ）ＴＳ−１、（ｂ）ＴＳ−２、（ｃ）ＴＳ−３で被覆した ９６穴の平板のウェルへ上記の濃度で浮遊液の形で添加した。

検定前の２４時間、細胞を３Ｈ−チミジン３．ＱｍＣｉで代謝的に標識した。ト リプシン化した後、細胞をペプチド被覆ウェルで９０分間のインキュベーション 期間付着させた。十分に洗浄したのち、各ウェルに残存している放射能活性を測 定し、細胞付着の指数としたく粘着％で表わす）。第１５図にまとめた成績から ペプチドＴＳ−１は大動脈内皮細胞の粘着を最も強く起こし、以下、ＴＳ−２、 ＴＳ−３の順であった。第】５表ではＢＳＡによるバックグラウンド値を差し引 いた。

Ｂ、転移性黒色腫細胞 高度転移性の黒色Ｉ１１細胞に１７３５Ｍ４はツーストン（ＴＸ）の１、Ｊ、フ ィドラー博士から原細胞の提供を受けた。細胞受領の際、多数の初期継代細胞に 分けて増殖し、液体窒素中で凍結した。１ｉ瘍細胞は通常６３！！間をこえない 期間、試験管内培養をする。この期間のあとは細胞を棄て、さらにイン・ビトロ またはイン・ビボ案験に使用するために新しい細胞を貯蔵から取り出す、連続試 験管内継代の結果、起こることがある表現型の連続変異をできるだけ少なくする ためこの予防措置をとる。細胞は加熱不活性化した５％ウシ胎児血清を含有する ダルベツコの修飾したイーグル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　）で培養した。培養は３ ７℃インキュベーター中で５％ＣＯｚを含有する加湿大気下に増殖させた。０． ００５％トリプシンおよび１ｍＭＥＤＴＡを使用して細胞をフラスコから静かに 遊離させることによって、細胞を１３！！間に２回継代した。

２μＣｉ／ｍｌ　’Ｈ−ＴｄＲ（）リチウム化チミジン）を使用して前記の内皮 細胞の場合と同じ゛態様で黒色腫細胞を代謝的に標識した。

標識した細胞は内皮細胞の際の記載と同様にして採取した。細胞粘着検定は、先 のウシ大動脈内皮ＭＡ胞検定について記載したのと同様に行なった。

第１６図にまとめた成績からペプチドＴＳ−１、ＴＳ−２およびＴＳ−３がＭ４ 細胞の粘着を促進することが分かる。この点に関してペプチドＴＳ−１が最も強 力であった。比較のためＭ４細胞の無傷な■型コラーゲンおよび単離したＮＣＩ ドメインに対する粘着をこの図に併記する。ＢＳＡに対するバックグラウンド粘 着は差し引いた。

Ｃ８正常ラツト線維芽細胞 この細胞はプラスチック製ウェルで１０％０％ウシ胎清を含有するＤＭＥＭのラ ット真皮外植片培養から得た。これらの条件下では線維芽細胞はプラスチック皿 の底部へ移動した。細胞が集密的になったらトリプシン化によってこれを採取し 、ついで細胞粘着検定のため前記と同様に代謝的に標識した。第１７図からペプ チドＴＳ−１がこれらの細胞の粘着を最も強力に促進し、以下、ペプチドＴＳ− ２および’Ｔ”Ｓ−３の順であるが、ラット線維芽細胞粘着を最小限度促進する ことが分かった。ＢＳＡに対するバックグラウンド粘着は差し引いた。

Ｄ、ＭＭ線維肉ｊ！細胞系の単離および細胞粘着検定マウス線維肉腫細胞（ｕ　 ｖ−２２３７−ＭＭ）はユニバージティー・オブ・テキサス・ヘルス・サイエン ス・センター（ツーストン、ＴＸ）のアンダーフン病院のＴ、Ｊ、フイドラー博 士から腫細胞の提供を受けた。培養、標識および採取方法はＡ項記載と同様に行 なった。

第１８図にこの検定の成績をまとめた。ＢＳＡに対するバックグラウンド粘着は 差し引いた。

Ｅ、Ｃ６細胞系の単離および細胞粘着検定ラットＣ６神経膠腫細胞系はアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した（登録番号ＣＣＬ１０７） ９．培養方法はＡ項の記載と同様に行なった。標識および採取方法は実施例４の 記載と同様に行なった。この検定の結果を第１９図にまとめた。ペプチドＴＳ− １，ＴＳ−２およびＴＳ−３はＣ６神経膠腫細胞の粘着を促進した。最高濃度で はペプチドＴＳ−１が粘着促進が最も強かった。ＢＳＡに対するバックグラウン ド粘着は差し引いた。

Ｆ、Ａ４３１乳がん細胞 Ａ４３１ａ胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。

培養、標識および採取方法は前記と同様に実施した（実施例４およびＡ項記載の 方法を参照）。この検定の結果を第２０図にまとめた。ＢＳＡに対するバックグ ラウンド粘着は差し引いた。

第２１図は上記のペプチドＴＳ−１，ＴＳ−２およびＴＳ−３の以前に報告した 細胞系に対する粘着に関する成績をまとめたものである。また２種の無関係なペ プチドを使用した。陽性対照としてＪＭ−８（フィブロネクチンの配列に由来す るペプチドであって、細胞粘着を促進することが知られている）およびＦ−１１ （ラミニンのβ、鎖の配列に由来するペプチドであって、細胞粘着を促進せず陰 性対照として使用）である、また比較のため、単離したＮＣＩドメイン′に対す る粘着も併記した。ＢＳＡに対するバックグラウンド粘着は差し引いた。

以上をまとめると、ぺ１チドＴＳ・−１は大動脈内皮細胞、転移性がんｍＭ、細 胞、正常ラット線維芽細胞、ＭＭ！！維肉腫細胞、Ｃ６神経膠腫細胞およびＡ４ ３１乳がん細胞の粘着を促進する。ペプチドＴＳ−２は、（ａ　）ＩＶ型コラー ゲンおよび（ｂ）ヘパリンへ結合し。

（ｃ）上記細胞系の粘着を促進する。ペプチドＴＳ−３は、（ａ）ヘパリンｌ− 結合し、（ｂ）上記細胞系の粘着を促進する。

ポリペプチドＴＳ−１、ＴＳ−２およびＴＳ−３について多数の実際的応用が考 えられる。そのような応用には天然または人工の材料を体内に配置することによ って起こる創傷の治癒促進が含まれる。

そのような人工材料としては、細胞粘着が正常宿主組織による人工移植の受容に 重要な因子である人工脈管、眼内コンタクトレンズ、米国特許第４５７８０７９ 号に報告されているように、医用装置は生体内で細胞を表面へ誘引し、あるいは 移植前に固有の表面上に所望の細胞型の増殖を促進することにさえこれらのポリ ペプチドを利用するように設計することができる。そのような試みの例とじて血 管または脈管移植片のような一般にニトロセルロース、発泡口フッ化エチレン樹 脂またはポリエステル線維、特にダクロン（商標、ポリリエチレンテトラフタレ ート）線維のような合成樹脂を織ったり編んだりした人工装置上の内皮細胞増殖 の誘導がある。

心臓挿入を意図し、た装置としては一時的な左心室補助装置、心臓弁、大動脈内 バルーンポンプ、人工心臓などが挙げられる。そのような装置は好ましくはポリ エーテル型のポリウレタンエラストマー（カーディオタン（商標）、コントロン 社）のような合成樹脂または加硫ポリオレフィンゴム（ヘキシジン（商標）、グ ツドイヤー社）から作成される。

はとんどの細胞型はコラーゲンまたはこの発明のポリペプチドに誘引されるが、 内皮細胞、上皮細胞および線維芽細胞はこの発明のポリペプチド類に特に強く誘 引され得る。この点は事故後または手術後の創傷縫合および創傷治癒を促す貼布 組織片を被覆するのにここに挙げたポリペプチドの可能性ある有用性を示してい る。

そのような場合、これらのペプチドをコラーゲン、グリコサミノグリカンまたは １０チオグリカンのような生体分子と結合させることは好都合であり得る。コラ ーゲン、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンは結合組織および基底膜 の主要構成成分である。

ある場合には、合成ポリマーの代わりに全部または一部を天然由来の組織で作成 した人工装置を使用する。その−例としてヒトの欠損した心臓弁なブタの心臓弁 と置換して使用する。またそのような人工弁にはヒトの硬膜またはウシの心嚢が 含まれる。別の例としてはウシの動脈を脈管移植片として使用する。

生体水準で細胞反応を修飾し、それによって治療結果を改善するため、この発明 のポリペプチドでこれらの生体材料表面を被覆することも有用であり得る。これ は当分野で既知の種々の方法、例えば上記の親和性に基づいて標的表面へポリペ プチドを直接結合することにより、あるいは種々の架橋反応または試薬を使用し てポリペプチドを材料へ共有結合的に結合することによって達成される。（人工 装置における合成樹脂および生体材料の使用に関する総説としては１本明細書に 参考文献として加えたケミカル・アンド・エンシュアリング・ニューズ（１９８ ６年４月１４日号）、３０〜４８頁を参照）。

また一時的または半永久的に体内へ、ｒ！Ａえば血管または腹腔へ挿入する使用 の目的で、またときには経皮的装置と呼ばれる人工装置の表面を被覆することに その価値が示される。そのような装置には制御薬物送達貯蔵器または潅流ポンプ などが挙げられる。

またポリペプチドＴＳ−１、’ｒ’ｓ−２およびＴＳ−３は内皮細胞、線維芽細 胞または上皮細胞をイン・ビトロに使用することを目的とする天然由来または人 工材料への粘着を促進するのに使用できる。

例えば微量滴定板のウェルまたは微孔性線維またはビーズの培地含有表面のよう な倍大基質を細胞付着ポリペプチドで被覆することができる。これは培地におけ るフィブロネクチンの使用を回避することができ、したがって一層限定された倍 大条件と同時に−・層良好な再現性を提供することができる。

細胞付着表面の商業的利用の一例として、サイトデックス（商標）粒子（ファー マシア社製造）をゼラチンで被覆して、同数の粘着細胞を皿で可能なよりもはる かに少容量の培地で増殖することが可能となる。一般にこれらのビーズの活性は 増殖培地におけるフィブロネクチンの使用によって左右され、この発明のポリペ プチドはそのような目的に改善された化学的に限定された被覆を提供することが 期待される。その他の表面または材料もこれを被覆してガラス、アガロース、合 成樹脂または長鎖多糖類のような付着を増強し得る。

最後にＴＳ−１，７Ｓ−２およびＴＳ−３は身体の外部適用または身体ｌ＼装着 することを８図とする医療用具の表面を被覆するのに使用できる。そのような用 具とは、創傷貼布剤または包帯を表わす８昧を含んだ「帯具」などの用語が挙げ られ、吸収性セルロース線維、合成線維またはそれらの混合物から形成された表 面を含むことができる。これらの表面は、細胞増殖、創傷治億および移植片付着 などを促進する゛丁Ｓ−１、ＴＳ−２および／またはＴＳ−３の有効量で被覆す ることができる。

この発明は種々の特殊な好ましい懸様および技術に言及して説明を行なった。し かしながら、多くの変更および修飾をこの発明の精神と範囲にもとることなく実 行することができるものである。

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Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）本質的に下式 【配列があります】 【配列があります】 で示されるポリペプチドまたはそれらの混合物からなる組成物。
2. （２）本質的に下式 【配列があります】 【配列があります】 で示されるポリペプチドまたはそれらの混合物からなる組成物で被覆した表面を 含んでいる生体内に設置するために設計された人工装置。
3. （３）表面が脈管移植片の一部を構成する請求項２記載の人工装置。
4. （４）表面が眼内コンタクトレンズの一部を構成する請求項２記載の人工装置。
5. （５）表面が心臓弁の一部を構成する請求項２記載の人工装置。
6. （６）表面が代用股関節移植片の一部を構成する請求項２記載の人工装置。
7. （７）表面が経皮的装置の一部を構成する請求項２記載の人工装置。
8. （８）表面が合成樹脂で作られた請求項２記載の人工装置。
9. （９）合成樹脂がニトロセルロース、ポリウレタン、発泡四フッ化エチレン樹脂 、ポリエステルおよびポリオレフィンからなる群から選ばれた請求項８記載の人 工装置。
10. （１０）表面が天然由来の組織から作られた請求項２記載の人工装置。
11. （１１）本質的に下式 【配列があります】【配列があります】で示されるポリペプチドまたはそれらの 混合物からなる組成物で被覆された表面を有する細胞培養基質。
12. （１２）表面が合成樹脂で作ちれた請求項１１記載の細胞培養基質。
13. （１３）表面がビーズの一部を構成する請求項１１記載の細胞培養基質。
14. （１４）表面が微孔性線維の一部を構成する請求項１１記載の細胞培養基質。
15. （１５）表面が微量滴定板のウエルの一部を構成する請求項１１記載の細胞培養 基質。
16. （１６）本質的に下式 【配列があります】 【配列があります】 で示されるポリペプチドまたはそれらの混合物からなる組成物で被覆された線維 性表面を含んでいる帯具。
17. （１７）線維表面がセルロース線維である請求項１６記載の帯具。