CN111514373A

CN111514373A - 一种基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的i型胶原蛋白凝胶基质及其制备方法

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Publication number: CN111514373A
Application number: CN202010481828.9A
Authority: CN
Inventors: 崔洪金; 姜坤妤; 陈明; 苏荣欣; 袁慧; 黄仁亮; 齐葳
Original assignee: ARTHRO-ANDA TIANJIN BIOLOGIC TECHNOLOGY CO LTD; Tianjin University
Current assignee: ARTHRO-ANDA TIANJIN BIOLOGIC TECHNOLOGY CO LTD; Tianjin University
Priority date: 2020-06-01
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明涉及一种基于聚合磷酸胆碱表面涂层的I型胶原蛋白新型凝胶基质及其制备方法，属于生物材料技术领域；本发明的新型凝胶基质成分为聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白。首先I型胶原蛋白先凝胶化，然后聚合磷酸胆碱在胶原蛋白凝胶表面通过其特殊的分子结构定向组装成桥式结构（loop结构），连接到I型胶原蛋白基质表面，获得聚合磷酸胆碱表面涂层的I型胶原蛋白凝胶基质。该方法制备的新型凝胶基质具有优异的润滑性能，抗非特异性吸附性能以及良好的生物相容性，并对软骨损伤起到良好的修复作用，克服了I型胶原蛋白凝胶润滑性能、抗非特性吸附性能差的不足，在软骨修复材料领域具有极大的潜力和应用价值。

Description

一种基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质及其制备方法。本发明的新型凝胶基质特别适用于软骨细胞培养，并同时具有抗非特异性吸附性能和润滑性能。

背景技术

关节炎是最常见的慢性疾病之一，据统计，全世界共有3.55亿关节炎患者，其中1.9亿患骨关节炎，超过1650万人患类风湿关节炎。其中，急慢性软骨组织损伤造成的关节炎是全世界公认的致残性疾病，约占关节炎疾病患者的 30%左右，该疾病的治疗在国际上都是个公认的难题。传统的外科治疗方法主要有关节镜下冲洗、微骨折术、关节磨削术等，但存在不能彻底治愈，需要多次微创手术，从根本上并不能为受损软骨周围的软骨细胞提供一个很好的栖息地。

临床上，I型胶原蛋白植入基质(COL I)常用于关节软骨的修复再生，重建的软骨接近正常透明软骨组织，疗效持久，并且适用于损伤面积较大的关节软骨缺损。但是单一I型胶原蛋白基质力学性能不足，抗炎症因子性能较差，严重影响其植入后修复软骨的效果。

润滑素（LUB）是关节滑液中的一种特殊构型的糖蛋白，具有极高抗非特异性能力和极低的摩擦系数，对预防关节磨损或干扰起关键作用。LUB蛋白由两个球状粘性末端与中间瓶刷粘蛋白三部分组成，可通过两个末端区域与各种表面强烈粘合，形成三嵌段环形（loop）结构；中间粘蛋白具有大量负电荷，可形成致密的水合层，从而赋予LUB出色的抗非特异吸附性能。尽管如此，LUB的强负电荷可能对带正电的蛋白质存在一定的非特异性吸附；而且LUB吸附在正电荷的表面时，可能造成loop结构的坍塌，影响其抗非特异吸附性能。同时LUB提取工艺较为复杂，大大限制了其在软骨修复中的应用。为了开发简便、实用同时具有抗非特异性吸附和润滑双重性能的软骨修复材料，受LUB结构启发，利用磷酸胆碱两性离子材料取代LUB的粘蛋白结构，接枝在柔性疏水共聚物主链上，为聚合物提供电中性环境，以进一步提高其润滑性能、抗粘附特性以及生物相容性。

为改善I型胶原蛋白植入基质在软骨修复过程中力学性能不足，抗炎症因子性能较差的缺点，达到更好治疗骨关节炎的目的，本发明设计合成了一种高聚物分子-三嵌段聚合磷酸胆碱（ABA），通过三嵌段聚合磷酸胆碱在I性胶原蛋白基质表面的定向组装，从而获得一种基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质，通过此方法制备得到的凝胶基质既不损坏原I型胶原蛋白植入基质粘附受损软骨组织、迁移软骨细胞的能力，同时又赋予了其较好的抗非特异性吸附性能和润滑性能。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白的新型凝胶基质。

本发明另一目的在于提供上述基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质的制备方法。

本发明再一目的在于提供上述基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白的新型凝胶基质在生物医药领域中的应用；特别适用于制备软骨修复材料，治疗骨关节炎，改善受损软骨表面润滑性能、抗非特异性吸附性能及良好的生物相容性。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案加以实现的：

一种三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白的新型凝胶基质，是采用三嵌段聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质，其中，三嵌段聚合磷酸胆碱（ABA）具有如下所述结构：

所述基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质的制备方法，包括以下步骤：

1） I型胶原蛋白凝胶基质的制备：

将含有凝胶液的胶原蛋白溶液倒入细胞培养板中，与培养箱中凝胶化，制备成I型胶原蛋白凝胶基质。

2）三嵌段聚合磷酸胆碱定向组装的I性胶原蛋白基质：

a) 将三嵌段聚合磷酸胆碱溶解在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为50-150 µg/ml的溶液。

b) 将步骤1）制得的I型胶原蛋白基质浸入上述步骤a）溶液中，在25-50℃条件下反应1-4 h，制得三嵌段聚合磷酸胆碱定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质。

所述活性I型胶原蛋白从SPF级大鼠鼠尾肌腱中经特殊处理，分离纯化提取。

所述小鼠来源于经过严格检验检疫的屠宰场或具有特殊资质的实验动物养殖、试验部门。

所述I型胶原蛋白提取后，经过盐析、透析等步骤，以去除杂蛋白及其它已变性的蛋白，获得无毒、无热源、高纯度和高活性的I型胶原。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

1) 本发明的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质具有很好的抗非特异性吸附性能。在溶菌酶（带正电荷）、牛血清蛋白（带负电荷）中非特性吸附量分别为 < 0.4 ng/cm²、< 0.2 ng/cm²，远低于各蛋白在I型胶原蛋白基质表面的非特异性吸附量（详见表1和图2），克服了单一I型胶原蛋白植入基质抗非特异性吸附性能差的缺点。

2) 本发明的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质具有优异的润滑性能。在磷酸盐缓冲液（PBS，模拟生理环境）中的摩擦系数为0.014左右，见表1，克服了单一I型胶原蛋白润滑性能不足的缺点。

3)本发明的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质具有良好的软骨细胞迁移和生长性能，迁移的细胞分布均匀，且迁移的细胞并没有显示出任何形态学上的差别。

附图说明

图1 三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质的结构示意图。

图2 I型胶原蛋白凝胶基质与三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质对1mg/mL的溶菌酶（LYS）、牛血清蛋白（BSA）的非特异性吸附实时曲线变化图。

图3 三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质对软骨细胞培养的效果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。

本发明基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质的制备方法合成路线示意图如图1所示：

实施例1

1)I型胶原蛋白凝胶基质的制备:

2) 三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I性胶原蛋白基质:

将原溶液浓度为500 μg/mL的三嵌段聚合磷酸胆碱稀释在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为50 μg/mL的溶液，随后将I型胶原蛋白基质浸入其中，在水浴摇床中于25℃条件下反应1 h。反应后的I型胶原蛋白基质用去离子水清洗三次，即得到三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白基质。

3)抗非特异性吸附量测定：对制得的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质的抗非特异性吸附性能进行测试，具体方法如下：

将获得的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质的芯片（COLI-ABA）贴合到SPR系统的流通池内。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为50 μL/min。待基线平稳后，通入1 mg/mL的牛血清白蛋白、溶菌酶，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定实时变化曲线，读取变化值，并计算非特异性吸附量，见表1和附图2。

针对实施例1中制得的基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I-ABA-1 h），牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为< 2 ng/cm²、<1 ng/cm²，远低于对照组胶原蛋白植入凝胶基质表面吸附量。

表1 不同凝胶基质表面的非特异性吸附量以及摩擦系数

4)摩擦系数测定与润滑性能评价：采用表面力仪对制得的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质的表面摩擦系数进行测定，评价其润滑性能，具体方法如下：首先在云母片上修饰I型胶原蛋白基质，随后配置50 μg/mL的三嵌段聚合磷酸胆碱溶液，将修饰后的云母片置于其中，25℃条件下反应1 h，反应后的I型胶原蛋白基质用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即在云母表面获得基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质。将修饰好的云母片固定于表面力仪测试系统内，测量其摩擦系数，重复测量3次，结果汇总见表1。

由表1可见，实施例1中制得的基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I-ABA-1 h）的摩擦系数为0.03，远低于单一胶原蛋白凝胶基质的摩擦系数（0.25）。

5)细胞迁移与细胞培养评价：对软骨细胞在制得的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白基质的迁移和培养进行评价。具体方法如下：

培养含人源软骨细胞的移植物凝胶基质，后续简称为含细胞凝胶基质，在含细胞凝胶基质中心掏空，将无细胞的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白基质放置在水凝胶中心，经过长达21天的体外培养。

（1）含细胞凝胶基质制备

A 血液离心，分离自体血清，制备自体培养基；

B从组织运输盒中取出软骨块，放进培养皿，用手术刀将组织切片切成碎块，分离软骨细胞；

C 将分离后的软骨细胞放入细胞培养瓶中进行培养，37℃约15-40 h；

D 悬浮细胞，取不含任何未溶解的软骨细胞的消化产物于50 ml的离心管中，加入A步骤制备的自体培养基；

D 加入含胶原蛋白的凝胶液，混匀后倒入细胞培养板，放入37℃培养箱中放至凝胶化；

E 凝胶化后加入培养基进行细胞培养，即成为含细胞的凝胶基质。

（2）三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的胶原蛋白凝胶基质和含细胞凝胶基质复合物制备

a) 用Φ9 mm的角膜环钻在制得的三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的胶原蛋白凝胶基质中间部位垂直切取一块圆形凝胶柱。

b) 用Φ7.5 mm的角膜环钻在培养了7天的含细胞凝胶基质中间部位垂直切下一块圆形含细胞凝胶基质的凝胶柱，形成凝胶孔。

c) 打入配好的纤维蛋白胶，迅速将三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的胶原蛋白凝胶柱垂直放置进凝胶孔，并用镊子轻轻压一下，确保凝胶柱完全进入含细胞凝胶基质的凝胶孔。

采用显微镜下观察软骨细胞情况。如图3所示：第4天，凝胶中的可见极少部分细胞呈蝌蚪样；第7天，凝胶中的可见部分细胞呈蝌蚪样，部分细胞呈梭型，细胞成群分布在不同层面。随着培养时间增加至14天，三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的胶原蛋白凝胶中的细胞有明显增加，表明人源软骨细胞移植物中的软骨细胞成功的迁入至三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的胶原蛋白凝胶胶中，迁移的细胞分布均匀，且迁移的细胞并没有显示出任何形态学上的差别。

实施例2

1) I型胶原蛋白凝胶基质的制备:

2) 三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I性胶原蛋白基质:

将原溶液浓度为500 μg/mL的三嵌段聚合磷酸胆碱稀释在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为100 μg/mL的溶液，随后将I型胶原蛋白基质浸入其中，在水浴摇床中于37℃条件下反应2 h。反应后的I型胶原蛋白基质用去离子水次清洗三次，即得到三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I性胶原蛋白基质。

3) 抗非特异性吸附量测定：测试方法同实例1。

测试结果见表1和图2。针对实施例2中制得的基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质（COL I-ABA-2 h），牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为< 0.2 ng/cm²、< 0.4 ng/cm²，远低于对照组胶原蛋白植入凝胶基质表面吸附量。

4) 摩擦系数测定与润滑性能评价：测试方法同实例1。

由表1可见，实施例2中制得的基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I-ABA-2 h）的摩擦系数为0.015，远低于单一胶原蛋白凝胶基质的摩擦系数（0.25）。

5) 细胞迁移与细胞培养评价：测试方法同实例1。

测试结果如图3所示：第4天，凝胶中的可见极少部分细胞呈蝌蚪样；第7天，凝胶中的可见部分细胞呈蝌蚪样，部分细胞呈梭型，细胞成群分布在不同层面。随着培养时间增加至14天，三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的胶原蛋白凝胶中的细胞有明显增加，表明人源软骨细胞移植物中的软骨细胞成功的迁入至三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的胶原蛋白凝胶胶中，迁移的细胞分布均匀，且迁移的细胞并没有显示出任何形态学上的差别。

实施例3

1) I型胶原蛋白凝胶基质的制备:

2) 三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I性胶原蛋白基质:

将原溶液浓度为500 μg/mL的三嵌段聚合磷酸胆碱稀释在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为150 μg/mL的溶液，随后将I型胶原蛋白基质浸入其中，在水浴摇床中于50℃条件下反应4 h。反应后的I型胶原蛋白基质用去离子水次清洗三次，即得到三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I性胶原蛋白基质。

3) 抗非特异性吸附量测定：测试方法同实例1。

测试结果见表1和图2。针对实施例2中制得的基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质（COL I-ABA-4 h），牛血清蛋白和溶菌酶的非特异性吸附量分别为< 0.2 ng/cm²、< 0.4 ng/cm²，远低于对照组胶原蛋白植入凝胶基质表面吸附量。

4)摩擦系数测定与润滑性能评价：测试方法同实例1。

由表1可见，实施例2中制得的基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白的凝胶基质（COL I-ABA-4 h）的摩擦系数为0.014，远低于单一胶原蛋白凝胶基质的摩擦系数（0.25）。

5) 细胞迁移与细胞培养评价：测试方法同实例1。

本发明公开和提出的一种基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质及其制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims

1.一种如下式所示特定结构的基于三嵌段聚合磷酸胆碱（ABA）改性的I型胶原蛋白凝胶基质；其特征是基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质。

2.如权利要求1所述基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质的制备方法，其特征在于：通过三嵌段聚合磷酸胆碱在I型胶原蛋白植入基质表面定向组装形成桥连结构（loop结构），从而获得一种基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质。

3.如权利要求2所述基于三嵌段聚合磷酸胆碱表面定向组装的I型胶原蛋白凝胶基质的制备方法；其特征在于：

a) 将三嵌段聚合磷酸胆碱溶解在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为50-150 µg/ml的溶液；

b) 将I型胶原蛋白基质浸入上述步骤a）溶液中，在25-50℃条件下反应1-4 h，制得三嵌段聚合磷酸胆碱定向组装的I型胶原蛋白新型凝胶基质。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：

（1）方法中所配置三嵌段聚合磷酸胆碱溶液所用的溶剂是磷酸盐缓冲液；

（2）方法中所使用磷酸缓冲液pH=7.4;

（3）方法中I型胶原蛋白植入基质浸入三嵌段聚合磷酸胆碱溶液中的时间为1-4 h；

（4）方法中I型胶原蛋白植入基质浸入三嵌段聚合磷酸胆碱溶液中的浓度为50-150 µg/mL；

（5）方法中I型胶原蛋白植入基质浸入三嵌段聚合磷酸胆碱溶液时，尽量保证基质下半部分浸入其中，避免全部浸入，否则会影响植入基质与受损软骨表面的粘附能力。

5.如权利要求3所述的方法，其特征是磷酸盐缓冲液包括10 mM磷酸盐、138 mM氯化钠和2.7 mM氯化钾。

6.如权利要求3所述的方法，I型胶原蛋白植入基质浸入三嵌段聚合磷酸胆碱溶液中的优选浓度为100 µg/mL。

7.根据权利要求1所述基于三嵌段聚合磷酸胆碱改性的I型胶原蛋白凝胶基质，其特征在于所述基于三嵌段聚合磷酸胆碱改性的I型胶原蛋白凝胶基质特用作改善软骨修复材料摩擦性能的改性材料。