JP2855223B2

JP2855223B2 - 生体適合性被膜

Info

Publication number: JP2855223B2
Application number: JP1501343A
Authority: JP
Inventors: イー．ガイア，パトリック; ゲイルダンカーク，ショーン
Original assignee: BAIO METORITSUKU SHISUTEMUZU Inc
Current assignee: BAIO METORITSUKU SHISUTEMUZU Inc
Priority date: 1987-12-24
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1999-02-10
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: DE3855238T2; EP0407390A1; DK152590D0; ATE137104T1; DK152590A; NO902790D0; EP0407390A4; EP0407390B1; NO180657B; DE3855238D1; WO1989005616A1; CA1335721C; NO902790L; NO180657C; JPH03503005A

Description

【発明の詳細な説明】本願は、1986年10月17日に提出されたアメリカ合衆国
特許願第920,567号の、及び1982年９月29日に提出され
たアメリカ合衆国特許願第428,074号の部分継続出願で
ある1987年10月16日に提出されたアメリカ合衆国特許願
第108,765号の部分継続出願である。

発明の背景生体分子−これは、生物学的活性を示すか又は生物学
的活性を調節する際に有効な化合物の分子である−は通
常、溶液中で又はガラスビーズのような固体支持表面に
吸着若しくはその外に結合されて使用される。アメリカ
合衆国特許第3,959,078号には、固体表面への酵素の結
合について開示されている。

生体分子は、それらが結合する固体又は半固体表面を
変えることができる。例えば、ヘパリンは抗凝結性を付
与するために血液袋のポリエチレン表面に結合させるこ
とができる。エバート（Ebert）他；誘導化され且つ固
定化されたヘパリンの抗凝結活性（The Anticoagulant
Activity of Derivatized and Immobilized Heparin
s），生体材料（Biomaterils）：界面現象及び応用（In
terfacial Phenomena and applications），クッパー
（Cooper）他編，アメリカンケミカルソサエティ
（Am.Chem.Soc.）,1982年，第161〜176頁，現在いくつかの方法が、固体又は半固体基材上に合成
及び自然に産生された分子を固定化するために存在す
る。一般的に用いわれる化学手法は、高度に基材依存性
であるか又は固定化された化学種の充分に減少した活性
を与える。前記化学手法の例は、コポリマーグラフト化
方法〔ラーソン，ピー．エッチ．（Larsson,P.H.），ジ
ョハンソン，エス．ジー．（Johansson,S.G.）；フル
ト，エイ，（Hult,A.）；及びゴスエス．（Gothe,
S.）；トムノアッセイのために適するグラフト化された
プラスチック表面への蛋白質の結合（Covalent Binding
of Protein to Grafted Plastic Surfaces Suitable f
or Immunoasseys）；ジェイ．イムノ・メソッズ（J.Imm
uno.Methods），第98号,1987年，第129〜135頁〕を含
む。

蛋白質及び多糖類としての前記生体分子の第三級及び
第四級構造は、歴史的には本質的に“静的”であると見
られていた。生体分子機能のこの静的外見は、最近機能
のための基礎として分子内構造の動的な運動を理解する
方法を提供した。ジャープラス，エム．（Jarplus,
M）；マッカモン，ジェイ．エイ．（McCammon,J.A.）：
蛋白質の動力学（The Dynamics of Proteins），サイエ
ンティフィックアメリカン（Scientific America
n），四月,1986年，第42〜51頁。この理解の意味は、最
適な活性のためには、蛋白質及び他の生体分子は生体分
子の配座のみならず分子運動も歪めない方法により固定
化されるべきであるということである。

活性の損失に加えて、生体分子の固定化の際に起こり
得る配座の歪みは、特に移植及び医療器具表面の望まし
くない生物的応答を起こす可能性がある。例えば、血餅
形成性の増大又は他体反応の誘導及び移植後の拒絶反応
が報告された。特定の高分子（例えば、蛋白質及び多糖
類）が先に未処理のポリマー又は他の医療器具材料に出
合った場合には、それらは前記表面上に吸着され、次い
で配座及び活性の両方において変性を起こす。軟組織移
植における他体反応及び大部分のポリマーの血餅形成性
は、蛋白質層が器具表面上に吸着された後の被移植体内
の細胞レベルの応答を含む。いわゆる逆被移植体応答
は、器具表面上に固定化された場合に異常な機能を生ず
る変質した高分子構造の影響を受けるかもしれない。

種々の血漿蛋白質は、変性したヘリックス又はベータ
ーシートのような第二構造の損失の結果として遅い配座
の変化を起こす。前記種類の変化による表面に固定化さ
れた蛋白質の変性は、それらを抗原性にするかもしれな
い。ペータース，ジェイ．エッチ．（Peters,J.H.）及
びガートジル，イー．（Goetzl,E.）：配座変性アルブ
ミンにおける高い抗原反応性の再生（Recovery of Grea
ter Antigenic Reactivity in Conformationally Alter
ed Albumin），ジャーナルオブバイオロジカルケ
ミストリー（J.Biological Chem.），第224号,1969年，
第2068頁；スターン，アイ．ジェイ．（Stern,I.J.）
他：血漿蛋白質関連物質の免疫的効果（Immunogenic Ef
fect of Materials on Plasma Proteins），コンフ．プ
ロク．アーティフィシャルハートプログラム（Con
f.Proc.Artificial Heart Program），ナショナルハ
ートインスティチュート（National Heart Institut
e）,1969年，第259頁。いくつかの血漿蛋白質の固定化
は、変性された血餅形成性応答を生ずるかも知れない。
ブラシュ，ジェイ・エル．（Brash,J.L.）；人造表面と
の蛋白質相互作用（Protein Interactions with Artifi
cial Surfases），天然及び人造表面との血液の相互作
用（Interaction of the Blood with Natural and Arti
ficial Surfaces），サルツマン，イー．ダブリュ（Sal
zman,E.W.）編,1981年，マーセルデッカー社（Marcel
Dekker Inc.），第39〜44頁。

生体分子を支持体から離して配置することにより、幾
分か改良された生体分子活性が観察されなければならな
いということが予想されるであろう。スペーサー手段の
使用を示す初期の研究が、ヘパリンに対して行われた。
上記エバート（Ebert）他は、ヘパリンの生体活性は支
持表面から離してヘパリン分子を保持するスペーサーの
長さに関する限定された寸法に相関し得ることを報告し
た。活性化された部分的トロンボプラスチン時間は、ヘ
パリン活性を支持するものとしてウシの血漿について定
量された。ヘパリンは、種々の長さの疎水性樹脂族スペ
ーサーに固定化され、そしてスペーサーの長さにより増
大するヘパリン活性を生じた。しかしながら、アルカン
スペーサーの疎水性のため、水性の生理的条件下での長
鎖の使用はスペーサー分子の旋回又は折り重なりを起こ
し、それ故スペーサーは固体又は半固体表面から生体分
子を離すためのそれらの能力を失うことが予想されるで
あろう。

発明の要約表面への生体分子の結合に関する特定の実用上の問題
は、延長された場合に少なくとも25Åの鎖長により離さ
れた二つの反応性基を有する長鎖化学スペーサーを用い
ることにより避けることができる。反応性基の間のスペ
ーサーの長さは、スペーサーが結合している表面に関す
る如何なる実質的に不利な相互作用からも生体分子基を
離すために充分である。本発明のスペーサーは、一般的
に下記の要求に従っている。

1.スペーサーは、支持表面に及び生体分子に共有結合し
ていてよく、且つ共有結合は所望により異なる予備決定
条件下で起こる。

2.スペーサーと生体分子のカップリングのための反応条
件は、生体分子の損傷を避けるために充分に穏やかであ
り、且つ生体分子とスペーサーの間の不利な相互作用は
最小にされる。

3.好ましくは、スペーサーはその長さが与えられた生体
分子の特定の活性を最適化するために所望により調整し
得るような繰り返し単位含む。

4.生体分子が結合した表面における、大きな容積上の物
理変化は全くない。

本発明の方法は、化学鎖が鎖の延長された長さに沿っ
て測定して少なくとも25Åの基の間の隔たりを提供す
る、二つの反応性基をその上に有するヘテロ二官能性ス
ペーサーの使用により生体分子をその上に固定化するこ
とによる表面処理を含む。本分中での使用において、
“延長された”鎖長は、鎖が好ましい結合角を保持した
状態に一致するその最大長さに延ばされた場合の化学鎖
に沿った二つの位置の間の直線距離に関するものであ
る。例えば、プロパンCH₃−CH₂−CH₃は、約2.5Åの端末
炭素原紙間の“延長された”鎖長を示し（109.5゜の結
合角が観察される）、同様に分子に沿った結合距離（炭
素原紙−炭素原紙）の合計は約3.06Åである。本書記載
のスペーサー鎖に沿って測定した距離は、全て“延長さ
れた”鎖長である。

固定化を行うために結合基を生成させるための目標表
面の予備処理が全く必要ないように、スペーサーは全体
として自己含有的であるのが望ましい。本発明の要点
は、不利な基材／生体分子相互作用が予想し得るように
減少させることができるということを発見したことであ
る。

一実施態様において、本発明は骨格に結合し且つ骨格
により約25Åよりも少なくない延長された鎖長離された
二つの反応性基有し、該反応性基の一つは与えられた刺
激に応答するために表面と共有結合を形成することが可
能であり、そして他の反応性基は生体分子と共有結合を
形成することが可能である化学的骨格からなる、生体分
子を表面に拘束し且つ表面の存在による生体分子への実
質的な有害作用を避けるための長鎖スペーサーからな
る。反応性基の一つは他の反応性基が応答しない刺激に
応答することが望ましい。反応性基の一つは光反応性基
のような潜反応性基であるのが好ましく、そしてこの基
は表面にスペーサーを結合させるために用いるのが望ま
しい。ヘテロ二官能性スペーサーは望ましくほそれが結
合している表面よりも更に親水性であり（即ち、スペー
サーは支持表面に対するよりも用いられた液状媒体に対
して更に可溶性である）；本発明の好ましいスペーサー
はそれ故好ましくはそれらが結合している表面から突き
出ており、それによりスペーサーにより拘束されている
表面の妨害作用から比較的離して生体分子を配置すると
思われる。更に、表面に結合している反応性基（望まし
くは光反応性基）は、好ましくはスペーサーよりも更に
疎水性であり（即ち、この基はスペーサーに対するより
も支持表面に対して更に可溶性である）、そして望まし
くはアリール基例えばアリールアジド又はアリールケト
ン誘導体である。

他の態様において、本発明は有害な表面効果から充分
に逃れられるように表面から生体分子を充分に離すよう
な方法により、表面に生体分子を結合させる方法に関す
るものである。この方法は、長鎖スペーサーの反応性基
を与えられた支持体と反応させ、次いでスペーサーに含
まれる他の反応性基を生体分子と反応させ、両反応性基
を少なくとも25Åの鎖長により互いに離しておくことか
らなる。表面に対して形成された結合と、生体分子に対
して形成された結合は、共有結合である。

別の態様において、本発明は支持体表面、多数の生体
分子、及び表面に結合し且つ表面から生体分子を離して
おくスペーサー（生体分子は、スペーサーの延ばされた
長さに沿って測定された少なくとも25Åの距離により支
持体から離されている）に関するものである。この態様
において、スペーサーは好ましくは一般的に繰り返し単
位（この単位は好ましくはオキシアルキレン基例えばエ
トキシ基又はイソプロポキシ基である）を有する親水性
鎖からなる。

図面の説明第１図は以下の実施例２において報告したような、ス
ペーサー鎖分子量の関数としての生体分子活性のグラフ
的表現である。

好ましい実施態様の説明生体分子は、生物学的活性を示すか又は生物学的活性
を調整する際に有効な化合物の分子である。生体適合性
剤の例としては、成長因子例えば内皮細胞成長因子、上
皮細胞成長因子、骨芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因
子、血小板誘導成長因子、神経成長因子、又はアンジオ
ジェニン；抗微生物剤例えばリゾチーム又はペニシリ
ン；抗血餅形成剤ヘパリン、アルブミン、ストレプトキ
ナーゼ、組織プラスミノジン活性化剤又はウロキナー
ゼ；血餅形成剤例えばコラーゲン；ヒアルロン酸、キト
サン；及び他の蛋白質、カルボヒドレート及び脂肪酸、
及びそれらの錯体分子混合物が挙げられる。

“支持表面”は、固体又は半固体又は液体物質の表面
を示す。この表面は、硬くてもよいし又はゲル表面のよ
うに半固体であってもよい。この表面は、非剛性の液体
表面例えば多相液体又は液体／固体系からなる不連続相
として存在する液体の不連続容積の表面であってもよ
い。支持表面は、好ましくは以下に定義されたような生
体材料の表面であり、且つ通常は比較的疎水性である。

“生体材料”は、実質的に体液に不溶性であり且つ体
内又は体上に配置すべく又は体液に接触させるために設
計又は構成される材料として定義し得る。血管移植組
織、コンタクトレンズ、シリコーン移植組織及び血液袋
は生体材料の例である。

理想的には、生体材料は下記の特徴の少なくともいく
つかを有するであろう： 1.それは、体内の望ましくない反応例えば血餅、組織
死、腫瘍形成、アレルギー反応、他体反応（拒絶）又は
炎症性反応を起こさないであろう。

2.それは、意図された機能に要求される物理的性質例え
ば強度、弾性、透過性及び柔軟性を有するであろう。

3.それは、容易に殺菌することができる。

4.体に接触させて使用する場合には、それは、１時間で
あるか又は寿命であるかによらず、それが体内に移植さ
れるか又は体に接触して残る期間中、その物理的性質及
び機能を実質的に保持するであろう。

本書における使用において、生体材料の処理された固
体表面は、それが生命有機体に対する真に有益な（真に
有害ではない）効果とともに生体液及び／又は生命有機
体の組織に接触して機能又は存在することができる場合
には、“生体適合性”として特徴付けられる。

生体材料の基礎材料は、いずれかの適する金属例えば
艶出チタン又はステンレススチール；ポリマー例えばポ
リウレタン、ポリビニルピロリドン、シリコーン弾性
体、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ
塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリエ
ステル、ポリアミド、ポリアクリレート（ポリメタクリ
レートを含む）；鉱物又はセラミック例えばヒドロキシ
アピタイト；人体組織例えば骨、皮膚及び歯；有機材料
例えば木材、セルロース及び圧縮された炭素；並びに他
の天然及び合成材料例えばガラス、ゴム、木材等であっ
てよい。本発明に基づいて生物適合性表面を提供し得る
器具の例は、血管移植チューブ、透析チューブ又は膜、
血液酸素供給器チューブ又は膜、限外濾過膜、大動脈内
バルーン、血液袋、カテーテル、縫合糸、軟質又は硬質
組織補綴、合成補綴、人工器官、並びに目のためのレン
ズ例えばコンタクトレンズ及び眼内レンズである。

生体適合性“有効”表面は、生体材料の支持表面に生
体分子自体が有するものと同一の生体適合特性を付与す
るために、生体材料の支持表面に上記において定義され
たようなスペーサーを介して各々共有結合した多数の分
離した生体分子から形成されているものとして定義され
る。生体分子は、架橋された網を形成することによるよ
うにして支持表面を隙間なく取り巻くか又は積層しなく
てよいが、しかし前記表面に所望の生体分子特性を付与
する際にこの生体分子が互いに充分に接近するように、
多数の分離した点によりこの表面を覆ってよい（なお、
これは所望により行われてよい）。例えば、血管移植組
織の表面に沿った分離した場所は、フィブロネクチンの
ような細胞結合因子である生体分子により覆われてよ
い。前記点により形成された生体適合性有効表面は、次
いで細胞の結合のための中心として作用し、それ故変性
された表面となる。

一般的に本発明の化学鎖スペーサーにより保持された
反応性基は、スペーサーの価学鎖の骨格を作っている成
分とは化学的に異なる特別な基であり、そして互いに異
なる。望ましくは反応性基の少なくとも一つは、スペー
サーを支持表面に共有結合させるために予備決定された
刺激に応答する潜反応性基である。望ましくは前記反応
性基は光化学的基であり、その共有結合は化学線及び特
に可視光線又は紫外光線により活性化される。前記基
は、アリール基、アルキル基及びアシルアジド基、アキ
サジジン基、イソシアネート基（ニトレン発生剤）、ア
ルキル及び２−ケトジアゾ誘導体並びにヂアジリン（カ
ルベン発生剤）、芳香族ケトン（三重酸素発生剤）、芳
香族ジアゾニウム誘導体及び多くの種類のカルボニウム
イオン及びラジカル発生剤により代表される。光化学的
反応基の別の記載は、フレデリックジェイ．ダルフラ
ー（Frederick J.Darfler）；及びアンドリューエ
ム．トメツコ（Andrew M.Tometsko），アミノ酸、ペプ
及び蛋白質の化学及び生化学（Chemistry and Biochemi
stry of Amino Acid,Peptides and Pteins）第２章〔ボ
リスヴァインシュタイン（Bis Weinstein）出版〕第
５巻，マーセルデッカー（Marcel Dekker）社，ニュ
ーヨーク,1978年になされている。アジドニトロフェニ
ル例えばフルオロアジドニトロベンゼン、及び芳香族ケ
トンは、暗所中の化学反応条件におけるそれらの安定性
及び生体材料の大部分の部位に対して有用な収率で共有
結合を形成する短命の反応性中間体を形成するための大
部分の生体材料に無害な波長の光による活性化に対する
それらの感受性のために、好ましい基を形成する。

光化学反応基としての使用に適当なニトロフェニルア
ジド誘導体は、大部分はフルオロ−２−ニトロ−４−ア
ジドベンゼンより誘導することができ、そして４−アジ
ド−２−ニトロフェニル（“ANP"）−アミノ−ブチリル
基、ANP−６−アミノカプロイル基、ANP−11−アミノウ
ンデカノイル基、ANP−グリシル基、ANP−アミノプロピ
ル基、ANP−メルカプトエチルアミノ基、ANP−ジアミノ
ヘキシル基、ANP−ジアミノプロピル基、およびANP−ポ
リエチレングリコール基が含まれ、そしてANP−６−ア
ミノカプロイル基、ANP−11−アミノウンデカノイル
基、およびANP−ポリエチレングリコール基が好まし
い。光化学反応基としての使用に好ましいアリールケト
ンには、ベンゾイルベンゾイル基およびニトロベンゾイ
ルベンゾイル基が含まれる。

以上の記載より分かるように、光反応基は、大部分芳
香族でありよって一般に本来親水性よりもむしろ疎水性
である。その有益さは、下記において説明する。

また反応基には、熱化学基（熱エネルギーにより活性
化されるもの）が含まれ、そしてハロゲン化ヒトロフェ
ニル、およびアルキルアミノ基、アルキルカルボキシル
基、アルキルチオ基、アルキルアルデヒド基、アルキル
メチルイミデート基、アルキルイソシアネート基、アル
キルイソチオシアネート基ならびにハロゲン化アルキル
基により象徴されかつこれらが含まれる。他のかかる基
には、ヒドロキシル基、第一アミン基、チオ基そして６
−アミノヘキサノン酸およびアミノウンデカン酸のよう
な基のマレイミド、Ｎ−オキシスクシンイミド、無水メ
ルカプトコハク酸のようなアルキルチオ基が含まれ、そ
してβ−メルカプトプロピオン酸、ホモシステインチオ
ラクトン、およびポリエチレングリコール誘導体が好ま
しい。以上の記載より、多くの熱化学基、例えばカルボ
キル基、ヒドロキシル基およびアミン基は親水性基また
は好水性基であると分かる。

光化学反応基は潜伏性反応基の例であり、即ち、与え
られた外部刺激に応じて反応性になる基であり、そして
支持体表面および生体分子に夫々共有結合する基に対し
て潜伏性反応基を使用することは好ましい。かかる基
は、基のうちの一つが他の基が応じないところの刺激に
応じるように選択される。

本発明に従ってスペーサとして使用される化学的主鎖
は、種々の化学種より作ることができ、それには天然お
よび合成ポリマーが含まれ、特にホモポリマーおよびコ
ポリマー、蛋白質鎖および同様のものが含まれる。スペ
ーサ主鎖を形成する化学的鎖は好ましくはそれと関連し
た親水性基、例えばエーテル基、ケトン基および同様の
ものを有する。蛋白質はポリペプチド例えばポリリシン
であってもよい。多糖類のスペーサ鎖例えばチトサン、
デキシトラン、ヘパリン、ヒアルロン酸および種々の澱
粉ならびにセルロースを使用することができる。

特に好ましいものは、種々のモノマーおよびオリゴマ
ーの重合により作ることができる反復単位より成る主鎖
を有するスペーサである。特に好ましいものは、反復す
るエトキシ基（−CH₂−CH₂−Ｏ−）またはイソプロポキ
シ基（−CH₂−CH（CH₃）−Ｏ−）を有する鎖であり、そ
してこれらの中で、ポリ（エチレングリコール）（PE
G）が最も好ましい。反復単位より形成されたスペーサ
は一般に種々の長さに製造することができる。；これ
は、結局、支持体表面よりの距離を変えることにより生
体分子を間隔を置くようにすることを可能にする。特定
でかつ好ましい反応において、本発明の方法は生体分子
を支持体表面に生体分子の活性を実質的に最適化するよ
うに化学的に繋ぐ方法に関する。該方法は生体分子を種
々の長さのスペーサに付着することより成り、そのスペ
ーサは化学的特性において実質的な変化なく種々の長さ
に製造することができるところの化学種からなり、スペ
ーサの他端は共有結合により固体支持体に結合してい
る。生体分子を支持体表面より間隔を置くところの様々
に伸びたスペーサ長は、各々25オングストロームを越
え、そして数百オングストロームまでおよびそれを越え
て変更することができる。生体分子の活性は測定され、
そして生体分子を最適または実質的に最適に提供すると
ころのスペーサ長は選択される。

ここで使用するところの“実質的に最適の活性”は、
上記の方法によって測定された最適活性の少なくとも約
50％の大きさであることを意味し、その最適活性は、測
定されたところの最大の活性であるか、または重大な活
性の増大の結果になるところのスペーサ長がさらに増加
する点における活性である。

本発明のスペーサは、示したように、少なくとも25オ
ングストロームそして好ましくは少なくとも50オングス
トロームの反応基間の伸びた長さを有する。生体分子お
よび支持体表面への付着のための反応基は、スペーサ鎖
の長さに沿って所望通り位置せしめることができるが、
好ましくはスペーサ鎖の端部または末端基として持ち運
ばれる。

スペーサ鎖それ自体は望むらくは親溶媒性であり、即
ち、スペーサ鎖は一般に好水性でありかつ水性環境にお
いて解ける傾向にある。二三の例外を除き、体液は本来
水性であるので、はるかに生体分子の大部分は一般に水
性環境中での使用に適合するような親水性である。望ま
しくはスペーサ化学鎖は、端部基を用いずとも、25℃の
水中において少なくとも部分的に−少なくとも約0.5重
量％の程度にて−可溶である。；好ましくは25℃の水中
でのスペーサ化学鎖の溶解度は少なくとも約２％であ
り、そして最も好ましくは、スペーサ化学鎖は水に混和
できる。スペーサ上の相対的に疎水性の反応基例えば芳
香族の光反応基の存在は、疎水性支持体表面について相
対的疎水性の反応基が優先的に支持体表面の近くに運ば
れる一方スペーサ分子の残りの部分が一般に疎水性表面
から離れたままにあるようにスペーサ分子それ自体を水
溶液中で配向せしめるという独特の効果を有することを
発現せしめる。；この特徴はスペーサを相対的に疎水性
の支持体表面と密に共有結合できるようにすることを前
提としており、そしてこれは結局上記に定義したような
“有効な”生体適合性表面の形成に寄与する。

本発明の特に好ましい態様は、一端に光反応基を持ち
そして他端に生体分子を持つスペーサ主鎖より成り、ス
ペーサは、光反応基と生体分子の間のその伸びた長さに
沿って測定して、少なくとも25オングストロームおよび
少なくとも50オングストロームの伸びた長さを有するも
のである。この態様において、特に好ましいのは、PEG
スペーサである。

支持体表面に対する生体分子の負荷密度は、案内基を
スペーサ中に支持体表面と共有結合する潜伏性反応基に
隣接して組み入れることにより増大することができる。
案内基は、側基としてスペーサ鎖もしくは潜伏性反応基
と結合する一官能性基であるか、または、好ましくは、
潜伏性反応基とスペーサ鎖の残り部分の間に望ましくは
位置する二官能性基でありうる。案内基は、場合場合に
より疎水性または親水性であってよく、そして支持体表
面が疎水性であるとき疎水性であるように、また支持体
表面が親水性であるとき親水性であるように、すべて支
持体表面に近接した結合においてスペーサの潜伏性反応
基を優先的に配向せしめる目的のために選択される。上
記で指摘したように、本発明の長いスペーサ鎖は普通支
持体表面で塗布するところの溶液の形態で用いられ、溶
液の液体ビヒクルは長いスペーサ鎖にある程度の移動性
を与える。よって案内基は、スペーサ分子を親水性液体
媒体中で用いたとき疎水性であり、またスペーサを疎水
性液体媒体中で用いたとき親水性である基として定義す
ることもできる。スペーサ基が支持体表面に深く埋め込
まれるのを抑えるために、別の基、ここに“停止基”と
呼称するものをスペーサ鎖の中に含めることができる。
停止基は一般に親溶媒性；および親水性の点において案
内基と反対の意味にある。；即ち、停止基は、支持体表
面が（もし使用するならば、案内基も）が疎水性である
とき相対的に親水性であるように選択され、また支持体
表面が（もし使用するならば、案内基も）親水性である
とき相対的に疎水性であるように選択される。別言すれ
ば、停止基は、支持体表面が疎水性であるとき親水性で
ありそしてその表面が親水性で液体媒体が疎水性である
とき疎水性であるところの基である。

“停止基”は二官能性であり、使用するとき、常に潜
伏性反応基および案内基が停止基よりも支持体表面によ
り近づくように位置決めされる。停止基は好ましくは長
いスペーサ鎖の大部分と案内基および潜伏性反応基との
間に位置する。

従って案内基および停止基を利用するスペーサ鎖は、
（潜伏性反応基）−（案内基）−（停止基）− −（ス
ペーサ鎖）のように図式的に表わすことができる。

生体分子を相対的に疎水性の表面に結合するのに用い
る一般に親水性の液体系において、案内基（この例にお
いて、疎水性基）の例には、エプシロンアミノカプロン
酸（“EAC"）、アミノウンデカン酸（“AUD"）および他
のアミノアルキルカルボン酸例えばガンマアミノ酪酸お
よびベーターアラニンより誘導された基が含まれる。停
止基（この例において、親水性）には、イヌ血清アルブ
ミン（“CSA"）、単糖類および多糖類、システン酸、グ
ルコン酸、および例えばタウリンのスルホン酸が例であ
る他のイオン化可能基が含まれる。

“親水性”および“疎水性”は、次の言葉に従って、
夫々、好水性および嫌水性として配合物を記載するのに
ここに使用される。：親水性化合物は通常相対的に極性
がありそしてしばしばイオン化可能である。かような化
合物は通常水分子と強く結合している。疎水性化合物は
通常相対的に非極性でありかつ非イオン性である。疎水
性表面は一般に表面上またはその近くにて水分子を氷状
の立体配座の構造にする。勿論、“疎水性”および“親
水性”は相対的な語句であり、そしてここにおいては、
種々の配合物、液体および表面がお互いに関して疎水性
または親水性でありうることの意味で使用される。当該
主題についての論説は、ホフマン（Hoffman）、編集者
への書状（Letter to Editor）：“親水性”および“疎
水性”生体材料表面についての一般的な分類図式（Agen
eral classification scheme for“hydrophilic"and“h
ydrophobic"biomaterial surfaces）,J.Biol.Mat.Res.2
0,pp.ix−xi（1986）において見出される。

本発明は以下の非限定的な実施例を参照することによ
りより容易に理解することができる。実施例において部
は別な方法で示さない限り重量部を表わす。

実施例1: この実施例は最適の活性を会合した生体分子に提供す
るようにスペーサの長さを調節することができる一の方
法を記載する。ジアミノポリエチレングリコール
ポリマー（商標Jeffamine のもとで販売、Jeffereson
Chemical Co.製）を、ポール膜（Pall membranes）（Pa
ll Biosupport Division）に、該ポリマーと該膜の遊離
アミンカップリングにより直接カップリングした。ジア
ミノポリエチレングリコールポリマーは、それぞ
れ、約60、90、190および330オングストロームの長鎖を
有する600、900、2000および3500ダルトンの分子量のも
のであった。非共有結合の全てのスペーサを膜より洗浄
した。

その後グルコースオキシダーゼをスペーサアームの残
りの末端アミンにカップリングするグルタルアルデヒド
により活性化された膜に加えた。酵素の出発濃度は固定
化されたスペーサアームナノモル当り酵素１、２、４
および６ナノグラムに近似するものであった。固定化酵
素の総量を液体シンチレーション技術により分析評価で
きるようにトリチル化（tritiated）グルコースオキシ
ダーゼを使用した。出発濃度の酵素の各々について固定
点酵素分析を行なった。これらの分析より、特定活性の
固定化酵素の特定活性を測定しそして膜に直接共有結合
する酵素より成る対照に対して標準化した。酵素活性に
おける最大の増加は、約190オングストロームの伸びた
鎖長に相当する、20000スペーサ分子量にて見出され
た。この実験の結果を第１図に図解的に描いた。

この実験に従い、分子量2000のジアミノPEGよりなる
スペーサ鎖は一端において光反応基例えばANPとそして
他端においてグルコースオキシダーゼと付着することが
できる。水溶液中のこの生成物は光に暴露することによ
り適当な支持体表面に共有結合することができ、そして
酵素免疫分析に使用することができる。

実施例2: この実施例は、分子量2000でかつ約190オングストロ
ームの伸びた長さを有する長鎖のポリエチレングリコー
ルスペーサを介して、ポリウレタン管体の一部への管類
表面のトロンビノゲン特性を減じるための生体分子（ウ
ロキナーゼ）の付着を記載するものである。最初に、イ
ヌ血清アルブミン（CSA）を光反応基アジドニトロフェ
ニル−６−アミノカプロイル−Ｎ−オキシスクシンイミ
ド（“ANP−EAC−NOS"）に結合し、生じた材料をANP基
を介してポリウレタン管体に光カップリングした。その
後CNP基に、次にはウロキナーゼ末端基を備えるポリオ
キシエチレン鎖を加えた。

CSA（イヌ血清アルブミン）200ミリグラムを0.1Mホウ
酸塩緩衝液pH9.0 10mlに溶解した。アジドニトロフェ
ニル−６−アミノカプロイル−Ｎ−オキシスクシンイミ
ド（ANP−EAC−NOS）をジメチルホルムアミド中に20ミ
リグラム／ミリリットルで溶解し、そしてANP−EAC−NO
S溶液567マイクロミットルをCSA溶液に室温にて暗室条
件下添加した。８時間の間一定に撹拌した後、溶液を４
℃にて大量に透析した。460ナノメーターでの吸光度に
基づいて、CSA分子当り8.64ANP基がカップリングされた
のを算出した。

ポリウレタン管体（“PUT"）の試験片は、液体が中に
入るのを防止するためにガラス棒の小片で閉栓された端
部を有するが、上記溶液の中に２時間の間暗所にて浸漬
した。その後これら試験片を取り除きそして可視光線に
１時間の間暴露した。この手順を各試験片について一回
以上繰り返した。その後PUT試験片を、可視光線の１時
間暴露に続いてANP−EAC−CSA溶液中に一晩浸漬した。

ポリオキシエチレンビスアミン（約2000分子量のPEG
−ジアミン、Texacoよりの“Jeffamine ED 2001"）30ミ
リグラムを水１ミリリットルの中に溶解しそしてpHを1N
HCLで4.0に調節した。これとは別に、１−エチル−３
−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド
（EDC）200ミリグラムを水５ミリリットルに溶解した。
PUT試料をEDC溶液に浸漬し、その後PEG−ジアミン溶液
を加えた。その後２時間の間室温にて反応を進行せし
め、その後別のEDC200ミリグラムを加えそして反応混合
物を一晩放置することとした。

PUT試料を室温にてグルタルアルデヒド 1.25％とpH
6.8で反応させ、すすぎ、そしてウロキナーゼの溶液
（8.3単位／ミリリットル、約２−３ミリグラム／ミリ
リットル）の中に浸漬しそして４℃にて一晩反応させる
こととした。管体を洗浄して未カップリングのウロキナ
ーゼを除去しそしてその後プラスミノーゲンの活性化お
よびアゾカゼインの消化によりウロキナーゼ活性につい
て分析評価した。測定はポリウレタン管体の試験片当り
ウロキナーゼ0.188ミリグラムが固定化されたことを示
した。

実施例３内皮細胞付着／生育種々の細胞因子をインヴィトロ（in vitro）で試験さ
れたポリマー表面にカップリングして細胞付着および過
剰生育についてこれら因子の効果を測定した。ポリマー
表面としては、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリエチレン
（PE）、ポリプロピレン（PP）およびポリテトラフルオ
ロエチレン（PTFE）GORE−TEX（6mm強化伸展PTFE、W.L.
Gore and Associates,Inc.の商標付製品）であった。試
験した市販の管体には、ポリエステル（Dacron,D,6mm直
編みのダクロンベロア、デュポン（Dupont）の商標付
製品）、シリコンエラストマー（Silastic^R,“S"、0.03
−インチ内径の管、ダウコーニング（Dow Corning）の
商標付製品）およびポリウレタンが含まれる。ポリスチ
レン板を対照として使用した。

化学的結合部分これら実施例に使用された化学的結合部分は、４−ア
ジド−２−ニトロフェニルエプシロンアミノカプロン酸
（ANP−EAC）、４−アジド−２−ニトロフェニルアミノ
ウンデカン酸（ANP−AUDA）およびベンゾイル安息香酸
（BBA）の各Ｎ−オキシスクシンイミド（NOS）エステル
であった。

スペーサへのコラーゲンの共有結合コラーゲンを0.1M MES,pH5.0中で2.0mg/mlに希釈し
た。ANP−PEG−NH₂またはBBA−PEG−NH₂をコラーゲンに
対して10倍モル過剰に加えた。次に、30倍モル過剰のED
Cを半時間の間隔で加えた。室温での４時間の撹拌の
後、生成物をPESに対して透析して非共有結合の光反応
試薬およびPEG−NH₂スペーサを除去した。生成物をUV分
光分析法および蛋白質分析法により分析して光反応基：
蛋白質比を測定した。普通11の比が観察された。

プラスチック表面への生体適合性剤の共有結合上記ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレ
ン、ポリウレタン、ダクロン（Dacron）（ベロア）、
シラスチック（Silastic）（医療用）およびポリテト
ラフルオロエチレンの種々のシート、チューブおよび平
板片を使用した。上記のように調製された光標識生体適
合性剤０ないし500μg/mlを含む溶液のアリコート0.05m
lをプラスチック表面の各0.5cm²部分に加えた。該溶液
を暗黒下、室温で３時間、各片に吸収させた。過剰の液
体を除き、適当な波長で（ANPにはタングステン「スポ
ットライト Spotlite」およびBBAには長波長UV）12時
間光分解することにより生体適合性剤を表面に共有結合
させた。光分解後、光標識生体適合性剤の共有結合して
いない分子を除くために標本片にPBSを４秒間流して洗
浄した。その後、該片を組織培養中に置き、下記により
細胞因子への内皮細胞反応を調べた。

修飾した表面について行なったインビトロ試験 A.放射性標識生体適合性剤放射性標識〔³H〕コラーゲンを上記のように光標識し
てANP−EAC−PEG−コラーゲンを用意し、それをプラス
チック表面へ光カップリングした。該プラスチック表面
をPBSで充分に洗浄してから有機溶媒中に溶解して液体
シンチレーション分光法で測定した。幾つかの代表的な
結果を、表面への共有結合を明らかにしている第１表に
示す。

B.修飾プラスチック表面へのウシ内皮細胞の付着ウシ内皮細胞は長さ８〜24インチの胎仔から集めた。
角膜、大動脈及び臍の内皮細胞を無菌的に集めた。細胞
を、25ミリモルHEPES緩衝液、10％仔ウシ血清および25
μｇアンホテリシンB/mlを加えたダルベッコの改良イー
グル培地〔アール．ダルベッコおよびジー．フリーマン
（R.Dulbecco ＆ G.Freeman）、バイオロジー（Violog
y）第８巻、396頁（1959年）およびジェイ・ディー・ス
ミス・ジー．フリーマン、エム．ボグトおよびアール．
ダルベッコ（J.D.Smith,G.Freeman,M.Vogt ＆ R.Dulbec
co）、バイオロジー（Viology）第12巻、185−196頁（1
960年）に記載〕のような公知の高グルコース細胞成育
培地（growth media）中で37℃にて５％CO₂インキュベ
イターで生育させた。プレート、チューブまたはシート
を準備する毎に、細胞培養は一次培養系から調製した。
細胞を0.25％トリプシン溶液で細胞株から取り、生育培
地に再懸濁した。次いでトリパンブルー（0.4％）溶液
と血球計を使って細胞数を計測した。種々の濃度の細胞
を準備した材料の上に層状に置いた。細胞の付着を５分
から14日間の種々の時間間隔で追跡した。付着は少なく
とも２種の方法で測定した。第一の方法においては、試
料材料を培地から離し、殺菌した食塩液で２回洗浄し
た。次いで細胞染色を行ない、表面状の全細胞数を計測
した。第二の方法では、トリプシン溶液で細胞を表面か
ら離すトリプシン処理（trypsinize）を行ない、トリパ
ンブルー法を用いて計測した。

予備被覆したポリ塩化ビニルプラスチック片上の内皮
細胞の付着および増殖について代表的結果を第２表に示
す。各片に付着した生細胞数はトリパンブルー染色法で
測定した。

C.ヒト臍の内皮細胞の付着一次のヒト内皮細胞を新鮮なヒト臍帯（４日令以前）
から採取した。帯を20mlのコード緩衝液（cordbuffer）
（0.144M NaCl、0.004M KCL、および0.001M PO₄）で
２回洗浄して血液および凝固物を除く。コラゲナーゼを
帯の中に注入し、室温で20分間放置した。温コード緩衝
液（warm cord buffer）10mlを使い、コラゲナーゼと剥
離した細胞を試験管内にどっと入れた。試験管内の懸濁
液を合わせて1500rpmで５〜10分間遠心分離した。上澄
みを捨て、細胞を10mlのコード緩衝液に再懸濁した。二
回目の遠心分離後、細胞をコード緩衝液に際懸濁し、組
織培養ディスクに置いた。全ての細胞を５％CO₂を流し
た37℃のインキュベイター中でインキュベイトした。細
胞は仔ウシ血清を含まないコード培地（cord media）中
で⁵¹Cを使って放射性標識した。

標識細胞を次いで細胞付着試験に使用した。上記プラ
スチックのプレート、シートおよびチューブは前述の通
りに調製した。細胞をトリプシン処理し、トリパンブル
ー法で細胞数を測定した。調製したプラスチックに細胞
を３時間ないし７日間付着させるようにした。細胞をす
すぎ落とし、残りの付着している細胞全数を付着してい
ない細胞数と比較した。それらの比較し得る結果を表わ
す上記第３表が得られた。

D.内皮細胞を使った増殖の測定次の方法で、上記のプラスチック表面を細胞が増殖し
て覆う時の、開始時からの細胞の増殖を追跡した。細胞
因子０ないし500μｇを含む生体適合性剤溶液を１ない
し6cmの長さの表面上に濃度勾配をつけて被覆した。細
胞を組織からトリプシンまたは何らかのプロティナーゼ
を使って取ることはしなかった。該組織を勾配の低い方
の開始点に置いて印をつけた。室温で15分間組織を落ち
着かせた。生育培地をプラスチック上を湿って覆うよう
に加えた。全ての手順は無菌条件で行なった。次いでプ
レートを５％CO₂インキュベーター中、37℃でインキュ
ベートした。増殖を２週間またはプラスチックの長さが
完全に覆われるまで毎日測定した。上記第２表に示した
ように、処理した表面上の増殖を非処理対照の表面と比
較した。全ての材料をすすぎ、永続走査電子顕微鏡観察
のために染色した。

これらの結果は、生育因子のフィブロネクチン（FN）
およびコラーゲン（COL）をプラスチック表面に共有結
合的に付着させると、プラスチックのウシ内皮細胞へ生
体適合性が改善されることを示した。細胞がプラスチッ
ク表面で生育した距離で示されるように、細胞は対照表
面より修飾表面に優先的に付着した。

実施例４コンタクトレンズおよび眼内レンズ移植物の表面の修飾本実施例の実験は、インビトロでの非処理レンズと比
較した、調製レンズ上への人工涙液からの蛋白沈着の測
定を含む。

化学的連結基への生体適合性剤の結合 A.光標識ポリエチレングリコールの調製分子量1000（PEG−1000）と4000（PEG−4000）のポリ
エチレングリコールを、本明細書で参考文献に入れた
「キムラおよびエス．レーゲン（Kimura ＆ S.Rege
n）、ジャーナルオブオーガニックケミストリー
（Journal of Organic Chemistry）第48巻、195頁（198
3年）」の相輸送法（phase transfer method）の修飾法
によりフルオロニトロアジドベンゼン（FNAB）で標識し
た。要約すると、４−アジド−２−ニトロフェニルポリ
エチレングリコール（ANP−PEG）の相輸送合成は、下記
のような60％水性水酸化カリウム・トルエンとFNABおよ
びPEGとの混合、それに続く抽出および薄層クロマトグ
ラフィー（TLC）精製を含む。

ANP−PEG−1000 ANP−PEG−1000は、0.05ミリモルのPEG−1000を5mlの
60％KOHに、および0.5ミリモルのFNABを10mlのトルエン
に加えて調製した。この反応混合物を室温で16時間、急
速に撹拌した。生成物を有機溶媒層から分離した。クロ
ロホルム／メタノール/H₂O/酢酸または水酸化アンモニ
ウム 85/15/1/1での薄層クロマトグラフィー（TLC）に
より非標識PEGからANP−PEG−1000のモノ−およびジ−
置換誘導体を分離した。ANP−PEG−1000に相当するバン
ド（低いRf値）をシリカゲルからTLC溶媒で抽出し、残
存の酸または塩基を除くために共沸蒸留した。最終生成
物は水に可溶で、出発物質PEGの30〜40％がANP−PEG−1
000に転化した。

ANP−PEG−4000 ANP−PEG−4000を、反応中に全ての試薬を溶液中に残
らせつつ50℃で反応混合物を急速に撹拌すること以外
は、上記と同じ方法で調製した。ANP−PEG−4000−OHの
収率は10％であった。

B.光標識スペーサの調製ポリオキシプロピレンポリアミンおよびポリオキシエ
チレンポリアミン〔ジェファミン（Jeffamines）と呼
ぶ。ジェファーソンケミカルカンパニーインコー
ポレーテッド（Jefferson Chemical Co.,Inc.）の商
標〕を、これらポリマーにNAP−EACA,BBAおよびnBBAの
Ｎ−オキシスクシンイミド（“NOS"）エステルをカップ
リングすることによって光標識した。これらのNOS−誘
導体を0.5倍ないし１倍量でジェファミンに高度に脱水
した（高純度）溶媒中で加えた（ANP−EAC−NOSは脱水
テトラヒドロフラン中、BBA−NOSは脱水ジオキサンまた
はジメチルホルムアミド中、ニトロBBA−NOSは脱水ジオ
キサンまたはジメチルホルムアミド中）。暗黒下、室温
で16時間反応させた後、生成物をクロロホルム／メタノ
ール/H₂O/酢酸 85/15/1/1のTLCで分離した。モノ置換
ジェファミン誘導体をTLC溶媒で抽出し、水と共沸蒸留
して残存する酢酸を除いた。水溶性生成物ANP−EAC−ジ
ェファミン、BBA−ジェファミン、およびnBBA−ジェフ
ァミンをそれぞれ15％、10％および12％の収率で分離し
た。

C.ANP−ヒアルロン酸の調製ヒト胎盤ヒアルロン酸（見掛けの分子量100,000−13
0,000）の末端糖を、本明細書で参考文献としたイー．
ジャノウィッツおよびエス．イー．チャーム（E.Junowi
cz ＆ S.E.Charm）“蛋白固定化およびアフィニティ−
クロマトグラフィーのための参加多糖の誘導/The Deriv
atization of Oxidized Polysaccarides for Protein I
mmobilization and Affinity Chromatography"ビオキミ
カエビオフィジカアクタ（Biochimica et Biophy
sica Acta）第428巻、157−165頁（1976年に記載されて
いる過ヨウ素酸法（periodate procedure）によって活
性化した。この方法では、このように末端の糖を活性化
するヒアルロン酸の溶液に過ヨウ素酸ナトリウムまたは
カリウムを加えることを伴う。ヒアルロン酸を10倍過剰
のジェファミンに加え、室温で４時間反応させた。シア
ノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって連結
を安定化させ、充分に透析して過剰のジェファミンを除
去した。DMFに溶解した10倍モル過剰のANP−EAC−NOS
を、0.1M炭酸塩、pH9.0に溶解したジェファミンに注射
器で加えた。この添加は16時間かけて暗黒下、室温で行
なった。過剰のANP−EAC−NOSとANP−EAC−ジェファミ
ンをゲル濾過クロマトグラフィーによって除いた。コン
タクトレンズポリマー骨格への基の光カップリングに必
要なアジド基の組み込みは、ANP基を検出するための赤
外吸収分光法、ジェファミンスペーサを検出するための
ポリエチレングリコール分析法および誘導体のウロン酸
含量を定量するための、ここに参考文献として掲げたテ
ィー．ビターおよびエイチ．ミュアー（T.Bitter ＆ H.
Muir）、アナリティカルバイオケミストリー（Analyt
ical Biochemistry）第４巻、330−334頁（1962年）に
記載された修正カルバゾール分析法で分析した。

１個のANP、１個のジェファミンおよび１個のヒアル
ロン酸分子を持つ画分を集め、生体適合性剤として使用
した。

D.光標識ヒアルロン酸、メチルセルロースおよびコンド
ロイチン硫酸の調製 ANP−EAC−ジェファミン、BBA−ジェファミンおよび
ニトロ−BBA−ジェファミンをヒアルロン酸およびコン
ドロイチン硫酸のウロン酸残基のカルボキシル基に以下
のようなカルボジイミド法により連結した。0.1NHClでp
H4.5に調節した水中で、５モル過剰の光標識ジェファミ
ンおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドをHClと共に多糖ポリマーに混合し
た。混合物を暗黒下、室温で24時間反応させた。生成物
をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、次いで光基と
炭水化物含量を上記のようにして分析した。

2.レンズ表面に対する生体適合性剤の光カップリング上記のようにして得られた光標識生体適合性剤をコン
タクトレンズ材料に250〜1000ピコモル剤／コンタクト
レンズの濃度で加えた。溶液をコンタクトレンズ上に暗
黒下、室温で３時間吸着させた。次いで光標識剤を適当
な波長で（ANPでは450nm、BBAおよびnBBA誘導体では320
nm）12時間、光分解によってプラスチックに共有結合さ
せた。光分解後、コンタクトレンズを５×5mlの通常の
食塩液（0.85％NaCl）で洗浄して共有結合していない基
を除去した。

3.インビトロ蛋白吸着試験人工ヒト涙液を、ここに参考文献としたビー．ピー．
グルア（B.P.Gloor）“涙装置（The Lacrimal Apparatu
s）”「アルダーの眼の生理学：臨床応用（Alder's Phy
siology of the Eye:ClinicalApplicationns）」、アー
ル．エー．モーゼス（R.A.Moses）編、シー．ヴィ．モ
スビーカンパニー（C.V.Mosby Co.,）セントルイス
ミズリー（St.Louis MO）（1981年）に記載されている
ような配合によって調製した。この文献に示されている
ように、ヒトの涙に存在する主要蛋白は血清アルブミン
（HSA）、ガンマーグロブリン（HGG）およびリゾチーム
（LYZ）である。ヒトの涙に存在する主要なステロール
はコレステロールとコレステロールエステルである。

人工涙液の調製上記の放射性標識蛋白質を人工涙液の調製に使用し
た。放射性標識した蛋白質またはトリチウム標識された
コレステロールの１種を各人工涙液混液に含ませた。他
の成分は放射性標識されていない。コンタクトレンズ材
料を人工涙液中、37℃で１週間、ゆるやかにゆすりなが
らインキュベートした。終了後、レンズ材料を0.85％Na
Clの５×10mlで洗浄した。次いで、レンズ材料に吸着し
た蛋白質の量を液体シンチレーション測定で分析した。

インビトロ蛋白沈着結果は、ある種のコンタクトレン
ズ材料上に人工涙液から起こる蛋白沈着が１週間で有意
に減少することを示した。

実施例６固体表面へのフィルムのカップリングヒアルロン酸の光標識誘導体（ANP−EAC−ジェファミ
ン、BBA−ジェファミンおよびニトロ−BBA−ジェファミ
ン）を調製した。光反応性被覆材料からフィルムを作
り、暗黒下にコンタクトレンズの表面上に置く（浸漬し
て乾燥による）。生体用材表面への共有結および分子間
架橋によるフィルムの強化を照明によって行なった。

もうひとつの実施例において、実行股関節をANP−EAC
−ジェファミン−ヒアルロン酸（0.1:1mg/ml）に暗黒下
で３時間浸漬した。関節を溶液から取り出し、乾燥して
人工関節上に被覆材料の薄いフィルムを形成させた。次
いで４℃で８時間、400ないし450nmの照明を当ててフィ
ルムを関節に共有結合させた。次に関節を整理食塩液で
すすいで未カップリングのANP−EAC−ジェファミン−ヒ
アルロン酸を除去した。骨に結合したヒアルロン酸は摩
擦を低減し、関節領域での骨の摩耗を減らす。

実施例７この実験では、眼内レンズ（IOL）と眼の長期生体適
合性の改善のために市販の眼内レンズ（IOL）材料への
生体分子の共有付着（covalent attachment）を述べ
る。

光試薬（photoreagents）の合成アジド−ニトロフェニル−基フルオロ−ニトロ−アジドベンゼン（FNAB）カップリ
ング基を４−ヒルオロ−３−ニトロ−アニリンから調製
した。アニリン（10.0g）をMCl 60mlとH₂O10mlに加え
た。その混合物を撹拌しながら40〜45℃に温めた。NaNO
₂の5.60g分量をH₂O 9.0mlに溶解し、そしてNaN₃をH₂O1
5.0mlに溶解した。アニリン/HCl混合物を乾燥氷／イソ
プロパノール浴中で−20℃に冷却し、続いてNaNO₂溶液
を15分間にわたって滴下添加した。添加終了後、混合物
を−20℃で更に15分間撹拌した。反応混合物を−20℃な
いし−10℃に維持しながらNaNO₃溶液を滴下添加した。
泡立ちを少なくするため小量のエーテルを添加した。−
20℃で30分間撹拌した後、氷−冷H₂Oを加えて生成物を
沈殿させ、次いで濾過によりFNABを収集した。乾燥後、
精製物を30〜60℃の石油エーテルから晶出させた。この
走査で精製物が76％の収率で得られた。

４−アジド−3,5−ジクロロ−2,6−ジフルオロ−ピリジ
ニウム基 3,5−ジクロロ−2,4,6−トリフルオロピリジンの1.01
0g（5.0ミリモル）分量を計って50ml丸底フラスコ内に
入れ、アセトニトリル20mlで希釈した。NaN₃ 5.0ミリモ
ル（325mg）を室温で10〜15mgづつ分別して加え、反応
を発熱反応として追跡した。固体アジドがアセトニトリ
ル中で限られた溶解度を持つことが明瞭となった。反応
を計２時間続行させた。石油エーテル溶媒系での薄層ク
ロマトグラフィー（TLC）で出発物質の全てが反応して
いたことが示された。減圧下、冷水浴上でアセトニトリ
ルを除いた結果、油質固体が生成した。生成物をエーテ
ル40mlおよびH₂O10mlに溶解し分液ロート中で振盪し、
そして水相を取り除いた。エーテル相をH₂Oで洗浄し、
そして合わせた洗浄水をエーテル10mlで裏抽出した。合
わせた有機画分をMgSO₄で乾燥した。TLCは生成物の生成
を示した。97.5重量％収率の粗生成物が透明油状物の形
態で得られた。

光標識表面変成試薬の合成光標識表面変成試薬の構造を表４に示す。ポリエチレ
ングリコール（“PEG"）は、前述の実施例に関連した方
法で製造される。PEGの４−アジド−3,5−ジクロロ−2,
6−ジフルオロピリジン誘導体は、この基をビス−アミ
ノ−PEGに添加し、続いて85:1:1のクロロホルム：メタ
ノール:H₂O:酢酸系での薄層クロマトグラフィで精製す
ることにより、製造される。

ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸の光活性誘
導体は、水溶性カルボジイミド、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（EDC）
の存在下で、ヒアルロン酸溶液へANP−PEG−NH₂,BBA−P
EG−NH₂又はＮ−（４−アジド−3,5−ジクロロ−６−フ
ルオロ−ピリジニル）−PEG−NH₂を添加することによっ
て製造された。

結果として得られた誘導体は、バイオ−ラド（Bio−R
ad）Ｐ−200カラムでのゲル濾過クロマトグラフィによ
り、又は透析により精製され、ウロン酸分析ポリエチレ
ングリコールアッセイ、光反応基の存在を決定するため
の分光側光法によって、並びに光反応基のアジド基、又
はカルボニル基の完全さを評価するための赤外分光法に
よって測定される。

これらの試薬の合成法、及び特徴についての説明を以
下で述べる。

コラーゲンに対する光反応基のカップリング操作コラーゲンを0.1MのMES中に、PH5.0で2.0mg/mlの濃度
に希釈する。ANP−PEG−NH₂（分子量1450）をコラーゲ
ンに対し、10Xモルの過剰量に添加する。次に、30分間
隔で、EDCの10Xモル過剰量を３回添加する。室温で４時
間撹拌後、非共有的に結合した光試薬とPEG−NH₂スペー
サーを除くため生成物をPBSから透析する。生成物を紫
外線分光法、及び光官能基：蛋白質率を決定するための
プロテインアッセイによって分析する。11の割合で通常
観察される。

ANP−PEG−NH₂,BBS−PEG−NH₂およびADDP−PEG−NH₂の
製造方法ビス−アミノポリ（オキシエチレン）グリコール及び
ポリ（オキシプロピレン）グリコールポリマーは、蛋白
質のために述べられたものと類似の方法によって光活性
カップリング試薬で標識される。しかし、ポリマーおよ
び光反応基のどちらも有機溶媒に可溶である。

PEGに対して0.5Xモル率の光反応基を、乾燥溶媒中
（ジオキサン、ジメチルホルムアミド、又はテトラヒド
ロフラン）の合成ポリマーに添加し、16時間暗黒下、室
温で撹拌する。その時間の最後に、モノ−標識されたPE
G生成物を8515:1:1のクロロホルム：メタノール:H₂O:酢
酸系での薄層クロマトグラフィによって出発物質から精
製する。

ANP−PEG−1450の製造方法 ANP−PEGは通常、前述に関連した相間移動反応によっ
て製造される。フルオロ−ニトロ−アジドベンゼン、お
よびPEGをトルエンに溶解し、KOHの添加によって最終濃
度が60％になる。

混合物を乳濁製剤にするために撹拌し、全18時間、35
−40℃で加熱する。9:1のCH₂Cl₂:メタノール溶媒系を使
用したTLCによって反応をモニターする。

ジ−ANP及びモノ−AMP生成物を紫外線下で映像化し、
３個の生成物すべては、ドラーゲンドルフ試薬でオレン
ジ色に着色される。選択的抽出操作が、PEG生成物をそ
の相対極性に基づいてトルエン中に強制的に入れるため
に水層のイオン強度を注意深く増加させることにより混
合物に対して実施された。

反応混合物を冷却後、KOH層を除去する。飽和NaClを
注意深く添加し、そして得られるトルエン層を遊離PE
G、モノ−ANP−PEGおよびジ−ANP−PEG生成物の分布を
評価するためにTLCによってモニタリングする。

ジ−ANP−PEG生成物をすべて除去した後、固体のNaCl
を水層に添加し、モノ−ANP生成物をトルエンとの混合
物から抽出する。抽出は、TLCでトルエン層のモノ−ANP
が見られなくなるまで繰り返される。

これらの抽出物は合わされ、MgSO₄で乾燥され、減圧
下で蒸発され、望みのモノ−ANP−PEG生成物を得る。

光活性カップリング試薬で誘導されたヒアルロン酸、及
びコンドロイチン硫酸の製造方法 ANP−EAC−PEG−NH₂またはBBA−PEG−NH₂の末端アミノ
基は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピ
ル）カルボジイミド（EDC）を使用して、ヒアルロン
酸、又はコンドロイチン硫酸のカルボキシ基にカップリ
ングする。

ヒアルロン酸をPH5.0、0.1MES緩衝液に溶解する。

カルボヒドラーゼに対し、5Xモル過剰量に匹敵する量
のANP−EAC−PEG−NH₂またはBBA−PEG−NH₂を添加す
る。

次に、固体EDCをポリサッカライドの5Xモル量におい
て、１時間かけて３度に分けて添加する。

６−８時間撹拌後、生成物を透析によって精製する。
生成物を紫外線分光法、ウロン酸アッセイ、及びPEGア
ッセイによって、光反応基：スペーサー：ポリサッカラ
イドの割合を決定するために分析する。１個のヒアルロ
ン酸に対して10個の光反応基、及びコンドロイチン硫酸
分子それぞれに対して９個の光反応基のような代表的な
割合を得る。

この点に関連した幾つかの化合物を表３および４に列
挙する。

IOL材料に対する生体分子の付着 IOL材料（PMMAボタン、ポリプロピレン、ポリエチレ
ン、シリコン、ジメチル−シロキサン、及びポリプロピ
レン鞏膜を伴ったPMMAレンズ）をH₂Oに溶解したコーテ
イング溶液に浸漬する。

３時間沈めた後、レンズ材料を除去し、空気流または
窒素下で、素早く乾燥させる。次いで、表面変成試薬を
適当な波長の光分解によって共有結合的に結合する。レ
ンズ片を脱イオンされたH₂Oで洗浄する。

このコーテイング操作がレンズの表面に影響を及ばす
かどうかを測定するため、対照のレンズに対するコーテ
イングされたレンズの光沢、及び仕上がりを走査電子顕
微鏡で評価する。

生体分子の負荷密度は、合成ポリマーの放射線同位元
素によって標識された誘導体、及び天然に誘導された生
体分子を使って評価される。各々同一の寸法のマトリッ
クス材料に対する表面変成試薬の最大マイクログラム数
を決定するために、各マトリックス片は液体シンチレー
ション分光法によって分析される。

計数効率は、これらのマトリックスそれぞれに、トリ
チウムで標識された化合物を標準的に添加することによ
って決定され、それにより負荷の正確な評価がなされ
る。その結果は、光標識合成ポリマー、蛋白質、及び長
鎖ポリサッカライドと、ポリビニルクロリド（PVC）、
ポリプロピレン（PP）、ポリエチレン（PE）、シリコ
ン、及びポリメチルメタクリレート（PMMA）との共有結
合を示した。

以下の表５は種々の材料に対するカップリング効率を
示す。

湿潤性の測定市販のPMMAまたはシリコンフィルムのコーテイングし
ていないIOL材料に対するコーテイングされたIOL材料の
湿潤性の測定は、質実的に“Protocol for Contact Ang
le Measurements at the Polymer−Water Interface"
〔Guidelined for Blood−Material Interactionsの第
７補遺版、the National Heart,Lung and Blood Instit
ute Working Groupのレポート、U.S.Department of Hea
lth and Human Services、Ａ−30頁、1985年９月〕に示
されている通り、行われる。

表面が変成された時に、PMMAおよびシリコン材料のど
ちらも湿潤性が統計的有意に改良される。

これは以下の表６に示されている通り、対照のレンズ
に比べて表面を変成されたレンズにおける、より低い接
触角の測定によって示される。両材料へのコーテイング
に伴って、湿潤性は有意に改良される。

蛋白質吸着試験対照IOL材料に対して表面を変成されたIOL材料への蛋
白質の吸着が測定される。

トリチウム化されたIV型コラーゲン、ヒト血清アルブ
ミン、及びヒト血漿フィブロネクチンを、アルダーの目
の生理学：臨床応用（アール．エイ．モーゼス編）、シ
ー．ブイ．モスビーカンパニー、セントルイスミズ
リー（1981年）〔B.P.,Gloor,“The Lcrimal apparatu
s"in Alder's Physiology of the Eye:Clinical Applic
ations（R.A.Moses,ed.）,C.V.Mosby Co.,St.Louis,MO
（1981）〕に記載されているように製造し、涙液電解溶
液に希釈する。

そして、変成されたPMMAレンズ、及び対照PMMAレンズ
をこれらの溶液に添加し、７日間蛋白質を吸着させる。

この期間の最後に、それぞれのレンズを緩衝生理食塩
水で洗浄し、テトラヒドロフランに溶解し、液体シンチ
レーション分光法により分析する。対照PMMAレンズに対
して吸着された蛋白質の量は、表面を変成されたPMMAレ
ンズに対する吸着された蛋白質の量と比較される。結果
は以下の表７に示す。

ウシ胎児の角膜内皮細胞による生体適合性の測定ダウ／コーニングシリコン、ポリプロピレン、ポリ
エチレン、ポリビニルクロリド、及びPMMAのレンズの小
片を種々の表面変成試薬によって処理し、光分解し、生
理食塩水で大量に洗浄する。

直径2mmの角膜のボタンを、体長８−24インチの胎児
から集める。

角膜片は、37℃、５％CO₂インキュベーター中で25mmo
lのHEPES緩衝液、10％ウシ胎児角膜、及びアンフォテリ
シンB2.5mg/mlを伴ったダルベッコ（Dulbecco）の変成
イーグル培地（Eagle medium）で成長する。

そして、角膜片をIOLマトリックス材料の方形片の一
端か、又はPMMAレンズの中央に置く。細胞の付着は７日
間モニタリングされる。小片に渡った細胞の成長はmm単
位で測定され、細胞の成長力はライト−ゲムサ（Wright
−Geimsa）着色、又はトリパンブルー（trypan blue）
着色による着所によって測定される。

IOL材料のくもりを防止するため、IOL材料に対する角
膜の内皮および上皮細胞の接着を妨げたいが、細胞に毒
性、又は有害効果を持ちたくない。

さらに、表面変成試薬が細胞毒でないことを試験で示
す。結果は表８に示す。

G.ウサギの死体の目による角膜内皮損傷度の評価レンズ（IOL）の接触によって起こされる内皮の損傷
量を被覆物が減少できるかどうかを決定するために擦傷
試験が行われた。

殺して１ないし２時間以内に成熟ウサギ死体の新鮮な
眼を得た。7mmの穿孔器を使用して、中央部の角膜をボ
タン状に切取り、これを内皮側を上向きにして、顕微鏡
用スライドガラスの上に置いた。

次いで、乾燥したレンズ（IOL）を掴み用具で取り上
げ、静かに角膜のボタン状の角膜の上に置く。

非常に柔らかいタップを使用して（掴み用具の上に引
張り上げない）、レンズを互いに90℃の角度で角膜に押
しつける。次いで、ボタン状の角膜から掴み用具を注意
深く掴んでレンズを取り去り、そして緩やかに対角線方
向に滑らして外す。

次いで、内皮をトリパン青の25％貯蔵液の２〜３滴で
染色し、濯ぎ、次いでアリザリン赤（9.9％NaCl中、0.1
％のNH₄OHで4.2のpHまで滴定した）の２〜３滴で3.5分
間染色した。

各々のレンズを10個のボタン状角膜で試験した。そし
て内皮の損傷の度合いの変化を示す写真を参考にして評
価した。

処理したレンズは損傷度が顕著により低かった。これ
らの検討の結果を下記の表９に示してある。

I.ネコをモデルにした表面を改質したIOLの生体適合性
の評価術前評価商業的に生育した群から購入した、無条件の1.5ない
し2.5年令の10匹の健全雌ネコを使用した。

外科手術の当日に、10％フェニルエフェリン滴の局所
適用をして、最大の瞳孔拡大をした。ファコフラグメン
テーション・アンド・イリゲーション／アスピレーショ
ン（phakofragmentation and irrigation/aspiration）
を使用して、エクストラカプシュラー・カタラクト・エ
クストラクション（evtractcapsular cataract evtract
ion）を行った。個々のレンズに番号を付け、各々のネ
コの一方の眼に対照レンズを、残りの一方の眼に表面を
改質したIOLを入れた。

外科医は、どちらのレンズが被覆してあり、被覆して
ないかは知らなかった。眼に入れるレンズは袋または使
用後用溝（posterior sulcus）に入れておいた。

レンズをセットした後、角膜部分を８−０ナイロン縫
合糸で閉じた。

試験中の全ての動物を24時間、48時間、１週間そして
２週間後に評価した。

術後の評価は、炎症による損傷の事実並びに角膜内皮
細胞検査のための生物学的顕微鏡検査から成り立つ。

術後２週間にわたった動物を観察した後、動物を殺し
眼球を組織学的研究のために取り出した。取り出した眼
球をゼンカーズ（Zenkers）−酢酸中で固定し、洗浄
し、70％アルコールに貯蔵した。

ネコをモデルにした結果ネコをモデルにした試験は、ホストシステムによる表
面改質のIOLの許容度の初期的評価のための内移植シス
テムとして使用した。

アクドナルト−シャッダック（McDonald−Shadduck）
（炎症）評点と厚度計の読みを下記の表10に示した。

期待されたように、全ての試験動物における葡萄膜炎
の程度は低く、炎症の期間は短く角膜の水腫は２週間の
治療期間にも治らなかった。

しかしながら、in vivoおよび組織学的研究のいずれ
をも基礎にしても、試験動物はレンズに対する異常な反
応の事実を示さなかった。

これにより、顕著な眼球の異常は、被覆した眼内のレ
ンズには伴わず、そして角膜の内皮細胞は被覆加工によ
り保護されていると結論できる。

実施例８この実験は、長鎖の親水性スペーサーを使用して、種
々の支持表面に若干数の抗体を付着させることについて
記述する。

光反応性基が、スペーサーを支持表面に付着するのに
使用された。そしてこの光反応性基は、４−フルオロ−
３−ニトロアニリン、ベンゾイル安息香酸および3,5−
ジクロロ−2,4,6−トリフルオロピリジンを包含し、こ
れら全てはオールドリッチ・化学会社（Aldrich Chemic
al Conmpany）から商業的に購入できる。

親水性のスペーサーも商品から努力して得られた。ウ
シの血清アルブミン（BSA）、リボヌクレアーゼＡ（R
N）およびニワトリの卵白オボムコイド（OVO）はシグマ
化学会社（Sigma Chemical Corp.）から得られた。ジア
ミノ−ポリエチレングリコール類はテキサコ化学会社
（Texaco Chemical Corp.）からジェファミン（Jeffami
nes（“JEFF"））の商標名で得られた。ポリエチレング
リコール（分子量1450）はシグマ化学会社から得られ
た。

支持材料はセファデックス・ゲル〔ファルマシア（Ph
armacia）社から購入〕、ポリスチレン・ビーズ、およ
びポリ塩化ビニルおよびポリスチレン製微量滴定板（mi
crotiter plates）を包含する。

光反応基（photogroup）のタンパク質スペーサへのカッ
プリングタンパク質をpH9.0の0.1m炭酸ナトリウムに添加して
1.0〜2.0mg/mlの液にする。

ジメチルホルムアミドまたはエタノール中4mg/mlにし
た光反応基（photogroup）−NOSの100倍過剰をゆっくり
と添加した。カップリング工程は、シリンジ・ドライブ
（syringe drive）により６時間かけて４℃で行った。
カップリングしたタンパク質を、緩衝液に対して透析
し、カップリングしなかった光反応基を除いた。

各々のタンパク質は、カップリング工程に異なった反
応をしたので、最大のカップリング効率とタンパク質の
安定性を呈する、タンパク質に対する光反応基（phtogr
oup）−NOSの改質の比率と緩衝液条件が選択された。

光活性化性（photoactivatable）ポリマースペーサーの
合成分子量1000,1450および3350の水酸基末端性のポリエ
チレングリコール（PEG）の光反応性誘導体は、上述で
引用した木村等の相間移動法の準用により合成された。
ANP−PEG合成の相間移動法は、60％水性KOH/トルエンの
フルオロニトロアジドベンゼンおよびPEGと共に使用す
ることより成り、次いで抽出しそして薄層クロマトグラ
フィーで精製した。

ANP−EACおよびBBAのＮ−オキシ−スクシンイミドエ
ステルの0.5倍量の、超乾燥ゴールドラベル溶媒である
乾燥ジメチルホルムアミドまたはジオキサン中のジェフ
ァミンの１倍量に添加した。

暗所、室温で16時間反応させた後、生成物を85/15/1/
1＝クロロホルム／メタノール/H₂O/酢酸中の薄層クロマ
トグラフィーにより精製した。

モノ置換のジェファミン（JEFF）誘導体を、薄層クロ
マトグラフィー用の溶媒で抽出し、そして酢酸を除くた
めに水と共沸蒸留した。

水溶液生成物であるANP−EAC−JEFFおよびBBA−JEFF
は、各々15％および10％の収率で得られた。

不溶性の支持体に対する親水性スペーサーの光カップリ
ング微量滴定板（microtiter plates） 100−3000ngのスペーサーを含有する誘導体になった
親水性スペーサーの溶液を、ポリ塩化ビニルおよびポリ
スチレンの96穴−微量滴定板の窪みに添加する。溶液を
放置して吸着せしめそして乾燥する迄蒸発する。（連続
気流フードで吸着した後、約１時間にわたって70℃のオ
ーブンにこの滴定板を置くことにより補助した。）。

次いで親水性のスペーサーを光分解により支持体に共
有結合的にカップリングした。支持体を、12時間、４℃
で、適当な高強度ランプから10cm離して置いた。

次いで、非共有結合的にカップリングしたスペーサー
を燐酸塩（PBS）の緩衝液で洗い流した。

セファデックスゲルセファデックスＧ−25−150（ビーズ径 50−150μ
ｍ）の20mg分をシリコーン化した12×75mmのボロシリケ
ート（borosilicate）ガラス管に入れ、光活性化性（ph
otoactivatable）の親水性スペーサーを各々のガラス管
に追加した。

溶液を放置して吸着、乾燥した。この工程に要する時
間は、連続気流フードで吸着した後、約１時間にわたっ
て70℃のオーブンにこのガラス管を置くことにより短縮
できた。

不溶性の支持体に誘導体にした親水性スペーサーを光
カップリングした後、興味のある生体分子（開環したペ
ニシリンに対するポリクロナール抗体、ヒトγ−グロブ
リンおよびHGGに対して生成したモノクロナール抗体、
そしてヒトα−フェトプロテインおよびこの腫瘍随伴性
の抗原に対して生成したモノクロナール抗体等）を、タ
ンパク質−タンパク質カップリング法により、スペーサ
ーに結合した。２種の方法が採用された。

グルタルアルデヒドにより、生体分子のε−アミノ基
をスペーサーの末端アミノ基にカップリングした。

水溶性のカルボジイミドである１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・HCl（ED
C）により、生体分子のカルボキシル基を、スペーサー
のアミノ基にカップリングした。

ポリクロナール抗体の活性の評価分別したウサギのポリクロナール抗血清を放射線標識
した。受動的吸着および親水性のスペーサーを介しての
グルタルアルデヒドまたはEDCカップリングにより、マ
トリックスへカップリングした抗体の量を液体シンチレ
ーションスペクトロメトリーにより定量した。

固定化した抗体の活性は［¹⁴C］−ペニシリンの添加
により評価した。全体活性（ｐモル［¹⁴C］Pen）および
特異的活性（［¹⁴C］Pen（ｐモル）／固定化anti−Pen
（ｐモル））は直接のカップリングおよび親水性のスペ
ーサーを介しての固定化により決定された。

モノクロナール抗体モデルの活性の評価 MGGとモノクロナールanti−HGGのペアのモデルがこの
試験のために選ばれた。カップリングした抗原の量を決
定するために、放射線標識したHGGを直接にまたは親水
性スペーサーを介してカップリングした。次いで、免疫
反応性を評価するために、非放射線標識HGGをこの方法
によりカップリングした。次いで、放射線標識したanti
−HGGを固定化したHGGに添加した。

免疫反応性は、液体シンチレーションスペクトロメト
リーにより評価した。

〔anti−HGG（ｐモル）/HGG（ｐモル）〕の比率は、
直接カップリングと親水性スペーサーを介しての固定化
のために比較した。

表11と表12は、ポリスチレン微量滴定板とセファデッ
クス・ゲルに対するカップリングする光反応性のスペー
サーの効率を説明している。

受動的に吸着された生体分子の活性は、親水性スペー
サーを介して固定化された生体分子の活性と比較され
た。

そして、下記の表13はanti−ペニシリンポリクロナー
ル抗体のポリスチレン微量滴定板へのカップリングの結
果を纒めたものである。長鎖の親水性スペーサーを使用
すると、抗体を微量滴定板に吸着させた場合または抗体
を直接この板にカップリングさせた場合と比較して、抗
体に実質的に大きい特異的な活性を付与する。

下の表14には、セファデックスゲル上の固定化モデル
抗原、HGGの活性の比較からのデータを示す。免疫反応
性対の比活性（抗HGGng/HGGng）はスペーサーの使用に
より実質的に改良された。

表15は、一端に光反応基（ANP）および他端に熱反応
基（NOS）を有するポリエチレングリコールスペーサー
へのHGGの共有結合カップリングを示すが、該スペーサ
ーは光反応基の活性化によりポリ塩化ビニルマイクロタ
イタープレートに共有結合されている。興味深いこと
に、データはANP−PEGスペーサー自体がマイクロタイタ
ープレートへのHGGの非特異的吸着の量を大きく減少さ
せることを示し、それらに共有結合されたスペーサーを
有するプレートが支持体への容易な特異的カップリング
を可能にし、その一方で生体分子の非特異的吸着を減少
させることを示している。

本発明の好ましい実施態様を記載してきたけれども、
種々の修正、改良および変更は本発明の精神および添付
した請求の範囲の領域から逸脱しない限り、本発明の範
囲内に包含されることは理解されるべきである。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61L 27/00 A61L 31/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】生体分子を支持体表面に該支持体表面の予
備活性化なしに連結するための長鎖スペーサーであっ
て、該スペーサーは鎖長約50オングストローム以上の延
長された主鎖により分離された２つの反応基を有し、そ
れらの間に潜在性反応基がなく、前記２つの反応基の一
方の反応基（Ｉ）は化学線に反応して支持体表面に共有
結合を形成し得るアリールアジド誘導体またはアリール
ケトン誘導体である潜在性光反応基であり、そして前記
２つの反応基の他方の反応基（II）は生体分子に共有結
合を形成し得る、前記長鎖スペーサー。
【請求項２】反応基の両方が潜在性反応基であり、それ
らの一方の基は他方の基が反応しない刺激に反応する請
求項１記載のスペーサー。
【請求項３】一般的に親水性の化学的主鎖または一般的
に疎水性の化学的主鎖を含む請求項１または２記載のス
ペーサー。
【請求項４】化学的主鎖が１またはそれ以上のエトキシ
基またはイソプロポキシ基を含有する請求項１または２
記載のスペーサー。
【請求項５】化学的主鎖がポリペプチドまたは多糖であ
る請求項１または２記載のスペーサー。
【請求項６】前記生体分子に結合された請求項１ないし
５のいずれか１項に記載のスペーサーを含有し、前記潜
在性反応基は与えられた刺激に反応して前記支持体表面
に共有結合し得る、支持体の表面を変性し該表面を生体
適合性にするための組成物。
【請求項７】反応基のないスペーサーの化学的鎖が25℃
で少なくとも0.5重量％の範囲まで液体担体に可溶性で
ある、液体担体中の請求項６記載の組成物。
【請求項８】請求項１ないし５のいずれか１項に記載の
長鎖スペーサーの潜在性光反応基を与えられた支持体表
面と反応させ、そしてスペーサーにより保持されるもう
１つの反応基を生体分子と反応させることからなる、生
体分子基を支持体表面に該支持体表面の予備活性化なし
に結合する方法。
【請求項９】潜在性反応基が光反応基であり、該光反応
基が反応して支持体表面にスペーサーを共有結合する化
学線にスペーサーを暴露する工程を包含する、請求項８
記載の方法。
【請求項１０】スペーサー鎖が支持体表面に比べて比較
的親水性であり、支持体表面に結合されるべき反応基が
スペーサー鎖の残部に比べて比較的疎水性である光反応
基であり、スペーサーを含有する水性溶液と支持体表面
を接触させて、光反応基を支持体表面に結合可能な近接
状態にし、そしてその後にスペーサーを化学線に暴露し
て、スペーサーを支持体表面に光反応基を介して結合す
る工程を包含する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】支持体表面を請求項６または７記載の組
成物と接触させ、そしてその反応基を反応させて前記表
面と共有結合を形成することからなる、支持体表面を変
性する方法。
【請求項１２】前記支持体表面を請求項７記載の組成物
と30秒以上の間接触させ、そしてその後に光反応基が反
応する化学線に前記溶液を暴露してその反応基の支持体
表面への共有結合を引き起こすことからなる、請求項11
記載の方法。
【請求項１３】ａ）支持体表面に共有結合し得る比較的
疎水性の光反応基を有する化学的鎖からなる親水性スペ
ーサーを含む水性溶液と疎水性表面を接触させ、ｂ）光反応基を刺激して該基に支持体表面への共有結合
を引き起こさせ、そしてｃ）工程ｂ）の前または後のいずれかに、前記スペーサ
ーに生体分子を共有結合させる（ここでスペーサーは支
持体表面と生体分子の間に少なくとも50オングストロー
ムの延長された鎖長を有する）、ことからなる疎水性表面を有する支持体に生体分子を結
合するための請求項８ないし12のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項１４】化学的性質の実質的な変化なしに種々の
長さで製造され得る化学種の主鎖を有する化学スペーサ
ーが支持体表面および生体分子に共有結合され、該スペ
ーサーは前記表面と生体分子の間に、延長されたスペー
サーの長さ方向に沿って測定された少なくとも50オング
ストロームの間隔を与え、そして延長されたスペーサー
の長さ方向に沿って測定された、各々が50オングストロ
ーム以上である前記表面と生体分子の間の種々の間隔を
利用して、生体分子の活性を測定し、そして実質的に最
適な活性を有する生体分子を提示する延長されたスペー
サー長さを選択する、請求項８ないし13のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項１５】支持体表面、１またはそれ以上の生体分
子、および潜在性反応基を介して支持体表面に共有結合
し、そして生体分子に共有結合した請求項１ないし５の
いずれか１項に記載のスペーサーを有する生体材料であ
って、前記生体分子はスペーサーの延長された長さ方向
に沿って測定された少なくとも50オングストロームの距
離だけ支持体表面から間隔がある、前記生体材料。