NO180657B - Langkjedet spacer for feste av et biologisk molekyl, blanding inneholdende denne, samt anvendelse av disse og biomateriale - Google Patents

Description

Foreliggende patentsøknad omhandler en langkjedet spacer for feste av et biologisk molekyl til en bæreroverflate uten for-akt ivering av bæreroverflaten, beskiktningsblanding og blanding inneholdlende spaceren, anvendelse av spacer og blandinger samt et biomateriale.

Biomolekyler - dvs. molekyler av forbindelser som deltar i

en biologisk aktivitet eller er virksomme ved modulering av en biologisk aktivitet - anvendes vanligvis i løsning eller er adsorbert eller på annen måte knyttet til faste underlags-overf later så som glassperler. U.S. patent nr. 3.959.078 refererer til tilknytning av enzymer til faste overflater.

Biomolekyler kan forandre de faste eller halvfaste overflatene som de er knyttet til. Heparin kan f.eks. bindes til polyetylenoverflater i en blodpose, og forsyne overflaten med ant i-koagulerende egenskaper. Ebert et al.,; The Anticoacrulant Activity of Derivatized and Immobilized Heparins, i Biomaterials: Interfacial Phenomena and applications, Cooper et al., utgivere, Am. Chem. Sooc. 1982, s. 161-176.

Flere fremgangsmåter finnes for tiden for å immobilisere syntetiske og naturlig fremstilte molekyler på faste eller halvfaste substrater. Den kjemien som typisk anvendes er enten i høy grad substrat-avhengig, eller fører til en signifikant redusert aktivitet for det immobiliserte molekylet. Et eksempel på slike kjemiske mekanismer omfatter fremgangsmåter for innpoding av kopolymerer, Larsson, P.H.; Johansson, S.G.; Hult, A.; og Gothe, S.: Covalent Binding of Proteins to Graftet Plastic Surfaces Suitable for Immunoassays; J. Immuno. Methods, 98, 1987, s. 129-135.

De tertiære og kvaternære strukturene for slike biomolekyler som proteiner og polysakkarider har historisk blitt betraktet som "statiske" av karakter. Dette statiske syn på biomolekylære funskjoner er nylig blitt erstattet med en forståelse av de dynamiske bevegelsene i intramolekylære strukturer som basis for funksjonen. Jarplus, M.; McCammon, J.A.: The Dynamics of Proteins. Scientific American, April 1986, s. 42-51. En implikasjon av denne forståelse er at for optimal aktivitet bør proteiner og andre biomolekyler immobiliseres ved metoder som ikke forvrenger verken konformasjonen eller biomolekylenes molekylære bevegelser.

I tillegg til aktivitetstapet kan den forvrengningen av den konformasj onen som kan forekomme ved immobilisering av et biomolekyl, føre til uønskede biologiske responser, spesielt på overflaten av implantater og medisinsk utstyr. For eksempel er det rapportert øket trombogenisitet eller induksjon ved fremmedlegeme -reaksjoner og forkastelse etter implantering. Når visse makromolekyler (f.eks. proteiner og polysakkarider) støter på tidligere ubehandlede polymerer eller andre materialer i medisinsk utstyr, kan de adsorberes på disse overflatene og undergå forandringer i både konformasjon og aktivitet. Fremmedlegeme-reaksjoner på implantater i mykt vev og trombogenisiteten for de fleste polymerer, medfører en respons på cellulært nivå hos verten, etter at et proteinsjikt har adsorbert på utstyrets overflate. Den såkalte ugunstige verts-responsen kan føres tilbake til den forandrede makromolekyl-strukturen som frembringer en abnormal funksjon når den immobiliseres på utstyrets overflate.

Forskjellige plasmaproteiner undergår langsomme konformasjons-forandringer som fører til tap av sekundærstrukturer, så som for-andret helix eller beta-ark. Denatureringen av overflate-immobiliserte proteiner ved denne type forandringer kan gjøre dem antigene. Peters, J.H. og Goetzl,E.: Recovery of Greater Antiaenic Reactivity in Conformationally Altered Albumin. J.Biological Chem., 224, 1969, s. 2068; Stern, I.J., et al.: Immunogenic Effects of Materials on Plasma Proteins. Conf. Proe. Artificial Heart Program, National Heart Institute, 1969, s. 259. The immobilizations of some plasma proteins which may produce an altered thrombogenic respons. Brash, J.L.; Protein Interactions with Artificial Surfaces, Interaction of the Blood with Natural and Artificial Surfaces. utg. Salzman, E.W., 1981 av Marcel Dekker, Inc. s. 39-44.

Ved spacing av biomolekyler vekk fra et underlag skulle man vente at det kunne observeres en noe forbedret biomolekyl-aktivitet. Begynnende studier som viser brukbarheten av spacerarmer, er blitt utført med heparin. Ebert et al., supra, rapporterte at heparinets bioaktivitet i en viss utstrekning kunne korreleres med lengden av en spacer som holdt heparin-molekylene vekk fra en underlagsoverflate. Aktivert partiell trombo-plastintid ble undersøkt med bovint plasma som indikator for heparinaktivitet. Heparin ble immobilisert med hydrofobe alifatiske spacere av varierende lengde, og ga en heparinaktivitet som økte med spacer-lengden. På grunn av den hydrofobe karakteren av alkan-spacere skulle man imidlertid vente at bruk av lengre kjeder under vandige fysiologiske betingelser ville føre til en oppkveiling eller tilbakebøyning av spacer-molekylene, slik at spacerne mistet sin evne til å holde biomolekylene borte fra en fast eller halvfast overflate.

Guire P.E. et al., Glycoconjugate Research, Vol. 2, 1979, Ac Press, s. 1051-1054, beskriver bruken av vesentlig kortere spacere for tilknytning av et enzym til en overflate, den lengste spaceren eksemplifisert i Gire et al. forekommer å være 11-aminoundekanoyl, hvilket er vesentlig mindre enn spacere som krevet i foreliggende søknad.

0'Carry, P. et al., Biochem. Soc. Trans., Vol. 1, 1973,

s. 289-290, beskriver på sin side helt andre anvendelser av spacerarmer, nemlig til bruk i affinitetskromatografi og hverken lærer eller foreslår bruk av fotokjemi.

Spaceren og relaterte krav ifølge foreliggende oppfinnelse kjennetegnes av sin kjedelengde og av de fotoreaktive gruppene som utnyttes. Begge trekk bidrar til forbedrede egenskaper med hensyn til håndterbarhet, stabilitet og effektivitet.

Visse av de praktiske problemene som henger sammen med tilknytning av et biomolekyl til en overflate, kan unngås ved å bruke en langkjedet kjemisk spacer som har to reaktive grupper adskilt ved en kjedelengde på i det minste 25 Ångstrøm i utstrakt tilstand. Lengden av spaceren mellom de reaktive gruppene er tilstrekkelig til å holde biomolekylgruppen utenfor en i høy grad uheldig påvirkning som henger sammen med den overflaten som spaceren er knyttet til. Spacerene ifølge oppfinnelsen er langkjedete for feste av et biologisk molekyl til en bæreroverflate uten foraktivering av bæreroverflaten, og de erkarakterisert vedat spaceren har en kjemisk ryggrad som bærer to reaktive grupper, hvilke er atskilt ikke mindre enn 25 Ångstrøm fra hverandre ved ryggradens kjedelengde, og ikke har latente reaktive grupper mellom seg, hvorunder en slik reaktiv gruppe (I) er en latent fotoreaktiv gruppe som kan danne en kovalent binding til bæreroverflaten som

respons på aktinisk stråling, og den andre reaktive gruppe (II)

er istand til å danne en kovalent binding med et biomolekyl. De tilfredsstiller vanligvis følgende krav: 1. Spaceren kan være kovalent bundet til en underlagsoverflate og til et biomolekyl, og de kovalente bindingene forekommer helst

under forskjellige forutbestemte betingelser.

2. Reaksjonsbetingelsene for kobling av spaceren til et biomolekyl er tilstrekkelig forsiktige til å unngå å ødelegge biomolekylet, og uheldige påvirkninger mellom biomolekylet og

spaceren blir minimalisert.

3. Fortrinnsvis inneholder spaceren repeterende enheter, slik at dens lengde kan justeres som man ønsker for å optimalisere de

spesifikke aktivitetene for et gitt biomolekyl.

4. Det er ingen signifikante generelle fysiske forandringer av den overflaten som biomolekylet er knyttet til.

Anvendelse av en langkjedet spacer ifølge oppfinnelsen innbefatter omsetning av en latent fotoreaktiv gruppe i den langkjedete spaceren med en gitt bæreroverflate, og omsetning av en ytterligere reaktiv gruppe som spaceren bærer med et biomolekyl, slik at den kjemiske kjeden gir en spacing mellom gruppen på i det minste 25 Ångstrøm, målt langs kjedens utstrakte lengde. Som anvendt heri refererer "utstrakt" kjedelengde til avstanden i rett linje mellom to posisjoner langs en kjemisk kjede når kjeden er utstrakt til sin maksimale lengde, fremdeles under bibehold av de riktige bindings-vinklene. For eksempel har propan, CH3-CH2-CH3, en "utstrakt" kjedelengde mellom de ytterste karbonatomene på ca. 2,5 Å (under hensyntagen til en bindingsvinkel på 109,5°, mens summen av (karbon-karbon) bindingsavstandene langs molekylet er ca. 3,06 Å. Avstandene målt langs spacerkjedene beskrevet heri, er alle "utstrakte" kjedelengder.

Spacerne skal helst være fullstendig uavhengig ved at det ikke er nødvendig med noen forbehandling av en måloverflate for å frem-bringe bindingsgrupper som kan utvirke immobilisering. Et viktig trekk ifølge oppfinnelsen er den oppdagelsen at en uheldig substrat /biomolekyl påvirkning kan reduseres planmessig.

Særlig er spaceren kovalent bundet til biomolekylet før det bindes kovalent til bærerflaten. Helst skal en av de reaktive

gruppene reagere på en stimulus som den andre ikke reagerer på.

En av de reaktive gruppene er fortrinnsvis en latent reaktiv gruppe så som en fotoreaktiv gruppe, og helst skal denne gruppen anvendes til å knytte spaceren til en overflate. Den heterobifunksjonelle spaceren skal helst være relativt hydrofil sammenlignet med bæreroverf laten som den er bundet til, dvs. at spaceren er mere løselig i et anvendt flytende medium enn den er i underlagsoverflaten; det postuleres at de foretrukne spacerne ifølge oppfinnelsen derfor fortrinnsvis står ut fra overflaten som de er knyttet til, og derved holder biomolekylet relativt langt borte fra de inngripende virkningene av den overflaten som det er festet til med spaceren. Dessuten er den reaktive gruppen som knyttes til en overflate, helst en fotoaktiv gruppe, fortrinnsvis mere hydrofob enn spaceren (dvs. at gruppen er mere løselig i underlagsoverflaten enn spaceren er), og helst er en arylgruppe så som et arylazid- eller et arylketon-derivat.

Oppfinnelsen dekker videre beskiktningsblanding som omfatter spaceren i en flytende bærer og en blanding som omfatter spaceren bundet til et biomolekyl, eventuelt i en flytende bærer.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av de nevnte blandinger for modifisering av en bæreroverflate.

I en ytterliger utførelse gjelder oppfinnelsen et biomateriale som er kjennetegnet ved a det omfatter en bæreroverflate, flere biomolekyler og spacere ifølge hvert av kravene 1-11, som gjennom latent fotoreaktive grupper er bundet til bæreroverflaten og kovalent til biomolekylene, idet biomolekylene har en avstand fra bæreroverflaten målt langs spacerens utstrakte lengde på minst 25 Ångstrøm.

Figur 1 er en grafisk fremstilling av biomolekylaktiviteten som funksjon av molekylvekten for spacerkjeden, som rapportert i eksempel 2 nedenfor.

Et "biomolekyl" er et molekyl av en forbindelse som deltar i en biologisk aktivitet, eller som effektivt vil modulere en biologisk aktivitet. Et eksempel på et biokompatibelt middel kan være en vekstfaktor så som endotelial cellevekstfaktor, epitelial cellevekstfaktor, osteoblastvekstfaktor, fibroblast vekstfaktor, blodplateavledet vekstfaktor, nevral vekstfaktor, eller angiogenin; et antimikrobemiddel så som lysosym eller penicillin; et anti-trombogent middel så som heparin, albumin, streptokinase, vevs-plasminogenaktivator eller urokinase; et trombogent middel så som kollagen; hyaluronsyre, chitosan; og andre proteiner, karbohydrater og fettsyrer, og komplekse molekylkombinasjoner derav.

En "underlagsoverflate" refererer til overflaten av en fast eller halvfast eller flytende substans. Overflaten kan være fast eller kan være halvfast så som overflaten av en gel. Overflaten kan være en ikke-rigid, flytende overflate så som overflaten av et bestemt volum av en væske som eksisterer som en diskontinuerlig fase av en flerfase-væske eller et flytende/fast system. Underlagsoverflaten er fortrinnsvis overflaten av et biomateriale som definert nedenfor, og er vanligvis relativt hydrofob.

Et "biomateriale" kan defineres som et materiale som er i alt vesentlig uløselig i kroppsvæsker, og som er utformet og konstruert for å plasseres i eller på kroppen eller for å danne kontakt med kroppsfluidene. Vaskulære implantater, kontaktlinser, silikon-implantater og blodposer er eksempler på biomaterialer.

Ideelt ville biomaterialet ha i det minste flere av følgende egenskaper: 1. Det vil ikke indusere uønskede reaksjoner i kroppen så som blodlevring, vevsdød, tumordannelse, allerisk reaksjon,

fremmedlegeme-reaksjon, avstøpning, eller betennelsesreaksjon.

2. Det vil ha de fysiske egenskapene så som styrke, elastisitet, permeabilitet og fleksibilitet som er nødvendige for å fungere

som ønsket.

3. Det kan lett steriliseres.

4. Dersom det brukes i kontakt med kroppen, vil det i alt vesentlig beholde sine fysiske egenskaper, og fungere under den tiden som det forblir implantert i, eller i kontakt med kroppen, enten det er en time eller hele livet.

Som anvendt heri, karakteriseres den behandlede faste overflaten av et biomateriale som "biokompatibel" dersom den er i stand til å fungere eller eksistere i kontakt med biologiske fluider og/eller vev i en levende organisme med en netto velgjørende (ikke netto ødeleggende) virkning på den levende organismen. Det foretrekkes lang.tids biokompatibilitet

Basismaterialet i et biomateriale kan være et hvilket som helst egnet metall så som polert titan eller rustfritt stål; et polymer så som polyuretan, polyvinylpyrrolidon, silikonelastomerer, polyetylen, polytetrafluoretylen, polyvinylklorid, polypropylen, polyolefiner, polyestere, polyamider, polyakrylater (innbefattet polymetakrylater); mineraler eller keramiske materialer så som hydroksyapatitt; humant vev så som ben, hud og tenner,- organisk materiale så som tre, cellulose og komprimert karbon; og andre naturlige og syntetiske materialer så som glass, gummi, tre o.l. Eksempler på anordninger som kan tilveiebringes med biokompatible overflater i samsvar med denne oppfinnelse, innbefatter slanger for vaskulære implantater, dialyseslanger eller membraner, slanger eller membraner for oksygenering av blod, ultrafiltrerings-membraner, intra-aorta-ballonger, blodposer, katetere, suturer, myke eller harde vevs-proteser, kunstige organer, og øyelinser så som kontakt- og intraokulære linser.

En biokompatibel "effektiv" overflate blir definert som dannet av en mengde separate biomolekyler som alle er kovalent bundet, gjennom en spacer som definert ovenfor, til underlagsoverflaten av et biomateriale, for å gi denne overflaten i alt vesentlig de samme biokompatible egenskapene som innehas av biomolekylet selv. Biomolekylene kan ikke tett omgi eller ligge over underlagsoverflaten, slik at det dannes en kryssbundet duk, men kan dekke overflaten i flere begrensede punkter (selvom dette er ønskelig og kanskje kan oppnås), slik at biomolekylene er tilstrekkelig nær hverandre til å gi overflaten de ønskede biomolekylære egenskapene. For eksempel kan bestemte steder langs overflaten av vaskulære implantater bli dekket med biomolekyler som er celletilknytningsfaktorer så som fibronektin. Den biokompatibelt effektive overflaten som dannes i disse punktene, virker da som brennpunkt for tilknytning av celler til den således modifiserte overflaten.

De reaktive gruppene som bæres av spacerne med kjemiske kjeder ifølge oppfinnelsen, er vanligvis spesielle grupper som adskiller seg kjemisk fra de bestanddelene som utgjør ryggraden i spacerens kjemiske kjede, og er forskjellige fra hverandre. I det minste én av de reaktive gruppene er helst en latent reaktiv gruppe som reagerer på en forutbestemt stimulus, slik at spaceren bindes kovalent til en underlagsoverflate. Slike reaktive grupper er helst fotokjemiske grupper, hvor den kovalente bindingen blir aktivert ved aktinisk eller spesielt synlig eller ultrafiolett lysstråling. Typisk for disse gruppene er aryl-, alkyl- og acylazider, oksazidiner, isocyanater (nitren-dannere), alkyl- og 2-ketodiazo-derivater og diaziriner (karben-dannere), aromatiske ketoner (triplett oksygen-dannere), aromatiske diazoniumderivater og flere typer av karboniumion og radikaldannere. Det refereres til Frederick J. Darfler og Andrew M. Tometsko, kapittel 2 i Chemistrv and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins (Boris Weinstein, utg.) vol. 5, Marcel Dekker, Inc. New York, 1978, for videre beskrivelse av fotokjemisk reaktive grupper. Azido-nitrofenyler så som fluorazidonitrobenzener, og aromatiske ketoner danner en foretrukket gruppe på grunn av sin stabilitet mot kjemiske reaksjonsbetingelser i mørke, og deres følsomhet for aktivering med lys av bølgelengder som er ufarlige for de fleste biomaterialer, til å danne kortlivede reaktive mellomprodukter som er i stand til å danne kovalente bindinger i brukbart utbytte med de fleste setene på biomaterialet.

Nitrofenylazidderivater som egner seg som anvendelse som fotokjemisk reaktive grupper, kan for det meste avledes fra fluor-2-nitro-4-azidobenzen, og omfatter 4-azido-2-nitrofenyl ("ANP")-4-amino-butyryl, ANP-6-aminokaproyl, ANPll-aminoundekanoyl, ANP-glycyl, ANP-aminopropyl, ANP-merkatoetylamin, ANP-diaminoheksyl,ANP-diaminopropyl, og ANP-polyetylenglykol. ANP-6-aminokaproyl, ANP-ll-aminoundekanoyl, og ANP-polyetylenglykol blir foretrukket. Arylketoner som foretrekkes for anvendelse som fotokjemisk reaktive grupper, omfatter benzoyl-benzoyl og nitrobenzoylbenzoyl-grupper.

Som det vil bemerkes fra foregående beskrivelse, er de fotoreaktive gruppene for det meste aromatiske, og derfor vanligvis hydrofobe heller enn hydrofile av karakter, hvilken fordel vil bli forklart nedenfor.

Reaktive grupper omfatter også termokjemiske grupper (som aktiveres av varmeenergi), og karakteriseres ved og omfatter nitrofenylhalogenider og alkylamino-, alkylkarboksyl-, alkyl-tio-, alkylaldehyd-, alkylmetylimidat-, alkylisocyanat-, alkylisoctiocyanat- og alkylhalogenidgrupper. Andre slike grupper omfatter hydroksylgrupper, primære aminogrupper, tiogrupper og maleimider. N-oksy-ravsyreimidkarboksylestere av slike grupper som 6-aminoheksansyre og aminoundekansyre, alkyltiogrupper så som merkaptoravsyreanhydrid og betamerkapto-propionsyre, homocystein-tiolaktoner og polyetylenglykolderivater blir foretrukket. Det vil bemerkes ut i fra foregående beskrivelse at mange av de termisk kjemiske gruppene, så som karboksyl-, hydroksyl- og amingruppene er hydrofile eller vannelskende grupper.

De fotokjemisk reaktive gruppene og termokjemisk reaktive gruppene er begge latent reaktive grupper, dvs. grupper som blir reaktive som respons på en gitt ytre stimulus, og anvendelse av latent reaktive grupper som grupper som binder seg kovalent til respektive underlagsoverflaten og biomolekylene, blir foretrukket. Slike grupper velges slik at en av gruppene reagerer på en stimulus som den andre gruppen ikke reagerer på.

De kjemiske ryggradkjedene som anvendes som spacere ifølge oppfinnelsen, kan være laget av flere forskjellige kjemiske molekyler, omfattende naturlig forekommende og syntetiske polymerer, spesielt omfattende homopolymerer og kopolymerer, porteinkjeder o.l. Den kjemiske kjeden som danner spacer-ryggraden har fortrinnsvis hydrofile grupper knyttet til seg, så som eter-grupper, ketongrupper o.l. Proteinene kan være polypetider så som polylysin. Polysakkaridspacerkjeder så som chitosan, dekstran, heparin, hyaluronsyre og forskjellige stivelser og celluloser kan anvendes.

Spesielt foretrukket er spacere som har ryggradskjeder omfattende repeterende enheter som kan lages ved polymerisering av forskjellige monomerer og oligomerer. Spesielt foretrukket er kjeder som har repeterende etoksy (-CH2-CH2-0-) eller isopropoksy (-CH2-CH(CH3)-0-) grupper, og av disse blir poly-etylenglykol (PEG) mest foretrukket. Spacerkjeder laget av repeterende enheter kan vanligvis fremstilles i varierende lengder; dette tillater i sin tur et biomolekyl som kan holdes i varierende avstand fra en under-lagsoverf late . I en spesiell og foretrukket utførelse vedrører fremgangsmåten, en fremgangsmåte for kjemisk å feste et biomolekyl til en underlagsoverflate, slik at biomolekylets aktivitet optimaliseres i vesentlig grad. Fremgangsmåten omfatter å binde et biomolekyl til spacere med forskjellige lengder, idet spacerne er av en kjemisk forbindelse som kan fremstilles i varierende lengder uten betydelig forandring i kjemiske egenskaper, mens de andre enhetene av spacerne blir festet ved hjelp av en kovalent binding til et fast underlag. De varierende utstrakte spacerlengdene som adskiller biomolekylet fra underlagsoverflaten, overskrider alle 25 Ångstrøm, og kan variere opp til og ut over flere hundre Ångstrøm. Biomolekylets aktivitet blir målt, og den spacerlengden som gir et biomolekyl med en optimal eller i alt vesentlig optimal aktivitet, blir valgt.

"I alt vesentlig optimal aktivitet", som anvendt heri, betyr aktivitet som er i det minste ca. 50 % så stor som den optimale aktiviteten som måles ved fremgangsmåten ovenfor, idet den optimale aktiviteten er den største aktiviteten som blir målt, eller er aktiviteten i det punktet hvor en ytterligere økning i spacer-lengden vil føre til ubetydelig aktivitetsøkning.

Spacerne ifølge oppfinnelsen har som bemerket en utstrakt lengde mellom reaktive grupper på i det minste 25 Ångstrøm, og fortrinnsvis i det minste 50 Ångstrøm. De reaktive gruppene for tilknytning til et biomolekyl og til en underlagsoverflate, kan være plassert som ønsket langs lengden av spacerkjeden, men blir fortrinnsvis båret som ende- eller terminale grupper i spacerkj eden.

Selve spacerkjeden er helst solvofil, f.eks. er spacerkjeden vanligvis vannelskende, og vil gjerne folde seg ut i vandig miljø. Langt de fleste biomolekyler er vanligvis hydrofile, ved at de er tilpasset for anvendelse i vandig miljø, da kroppsfluidene med få unntak er vandige av karakter. De kjemiske spacerkjedene, uten endegrupper, er helst i det minst delvis løselige - i en utstrekning på ikke mindre enn 0,5 vekt% - i vann ved 25°C; fortrinnsvis er løseligheten av de kjemiske spacerkjedene i vann ved 25°C i det minste ca. 2 %, og mest fortrinnsvis er de kjemiske spacerkjedene blandbare med vann. Tilstedeværelsen av en spacerkj ede med en forholdsvis hydrofob reaktiv gruppe så som en aromatisk fotoreaktiv gruppe, synes å ha den unike virkningen at den forårsaker at spacer-molekylet orienterer seg i en vandig løsning i forhold til en hydrofob underlagsoverflate, slik at den forholdsvis hydrofobe reaktive gruppen fortrinnsvis blir båret nær underlagsoverflaten, mens resten av spacermolekylet vanligvis står vekk fra den hydrofobe overflaten; det blir postulert at dette trekket setter spacerne i stand til å bli kovalent bundet tett til en forholdsvis hydrofob underlagsoverflate, og dette bidrar i sin tur til dannelse av en biokompatibel "effektiv" overflate som definert ovenfor.

En spesielt foretrukket utførelse av oppfinnelsen omfatter en spacerryggradkjede som i den ene enden bærer en fotoreaktiv gruppe, og i den andre enden et biomolekyl, mens spaceren har en utstrakt lengde på i det minste ca. 25 Ångstrøm, og fortrinnsvis i det minste 50 Ångstrøm, målt langs dens utstrakte lengde mellom den fotoreaktive gruppen og biomolekylet. Spesielt foretrukket i denne utførelsen er PEG spacere.

Fyllingstettheten av biomolekyler på en underlagsoverflate kan økes ved innføring av en ledegruppe i spacerkjeden i nærheten av den latent reaktive gruppen som binder seg kovalent til en under-lagsoverf late . Ledegruppen kan være monofunksjonell, være bundet til spacerkjeden eller den latent reaktive gruppen som en tilknyttet gruppe, eller er fortrinnsvis en dif uriks jonell gruppe helst plassert mellom den latent reaktive gruppen og resten av spacerkjeden. Ledegruppen kan være hydrofob eller hydrofil i hvert enkelt tilfelle, og blir valgt til å være hydrofob når underlags-overf laten er hydrofob, og hydrofil når underlagsoverflaten er hydrofil, hele tiden med den hensikt fortrinnsvis å orientere den latent reaktive gruppen i spaceren i bindingsnærhet med underlags-overf late. Som påpekt ovenfor blir de langkjedede spacerne ifølge oppfinnelsen vanligvis anvendt i form av en løsning som blir tilført til en underlags-overflate, idet den flytende bæreren av løsningen gir den langkjedede spaceren en grad av mobilitet. Ledegruppen kan derfor også defineres som en gruppe som er hydrofob når spacermolekylet anvendes i et hydrofilt flytende medium, eller hydrofil når spaceren anvendes i et hydrofobt flytende medium.

For å forhindre spacerkjeder fra å bli dypt innleiret i en underlagsoverflate kan en annen gruppe, som her betegnes en "stoppe" gruppe, bli tatt inn i spacerkjeden. Stoppegruppen er vanligvis motsatt i forhold til ledegruppen når det gjelder solvofilisitet; og hydrofilisitet; dvs. at stoppegruppen velges slik at den blir relativt hydrofil når underlagsoverflaten (og ledegruppen, dersom den anvendes) er hydrofob, og velges slik at den blir relativt hydrofob når underlagsoverflaten (og ledegruppen, dersom den anvendes) er hydrofil. Sagt på en annen måte er stopp-gruppen en gruppen som er hydrofil når underlagsoverflaten er hydrofob, og hydrofob når underlagsoverflaten er hydrofil.

"Stoppe"gruppen er bifunksjonell, og når den anvendes, blir den alltid plassert slik at den latent reaktive gruppen og ledegruppen er nærmere underlagsoverflaten enn stoppegruppen er det. Stoppegruppen er fortrinnsvis plassert mellom de meste av den langkjedede spaceren og de ledende og latent reaktive gruppene.

Spacerkjeder som anvender lede- og stoppe-grupper kan derfor skjematisk fremstilles som:

(latent reaktiv gruppe) - (ledegruppe)

- (stoppegruppe)- - (spacerkjede)

I et generelt hydrofilt flytende system som anvendes til å binde biomolekyler til en relativt hydrofob overflate, vil eksempler på ledegrupper (hydrofobe grupper i dette eksempelet) , omfatte grupper avledet av epsilonaminokaproinsyre ("EAC"), aminoundekansyre ("AUD") og andre aminoalkylkarboksylsyrer så som gamma-aminosmørsyre og beta-alanin. Stoppegrupper (hydrofile i dette eksempelet) omfatter hundeserumalbumin ("CSA"), mono- og polysakkarider, cysteinsyre, glukonsyre og andre ioniserbare grupper så som sulfonsyrer, som taurin er et eksempel på.

"Hydrofil" og "hydrofob" blir brukt her for å beskrive blandinger generelt som henholdsvis vannelskende og vannhatende, på linje med følgende observasjoner: Hydrofile forbindelser er vanligvis relativt polare og er ofte ioniserbare. Slike forbindelser vil vanligvis binde vannmolekylene sterkt. Hydrofobe forbindelser er vanligvis relativt ikke-polare og ikke-ioniserende. Hydrofobe overflater vil vanligvis forårsake vannmolekylene å strukturere seg i en is-lignende konformasjon ved eller nær overflaten. "Hydrofob" og "hydrofil" er naturligvis relative termer, og anvendes her i den betydningen at forskjellige blandinger, væsker og overflater kan være hydrofobe eller hydrofile i forhold

til hverandre. En diskusjon av dette emne finnes i Hoffman, Letter to the Editor:A general classification scheme for " hydrophilic" and " hydrophobic" biomaterial surfaces. J. Biol. Mat. Res. 20, s. ix-xi (1986).

Oppfinnelsen kan forståes lettere ved referanse til de følgende illustrative eksemplene, hvor deler er uttrykt etter vekt dersom intet annet er sagt.

Eksempel 1

Dette eksempelet beskriver en måte hvorpå lengden av en spacer kan justeres, slik at den gir optimal aktivitet til et tilknyttet biomolekyl. Diaminopolyetylenglykolpolymerer (som selges under varemerket Jaffamine, Jefferson Chemical Co.) ble koblet direkte til Pall membraner (Pall Biosupport Division) via fritt aminkobling av polymerene til membranene. Diamino-polyetylenglykolpolymerene hadde molekylvekter på 600, 900, 2000 og 3500 dalton, og ga kjedelengder på hhv. ca. 60, 90, 190 og 330 Ångstrøm. Alle ikke-kovalent bundne spacere ble vasket ut fra membranene.

Glukoseoksidase ble deretter tilsatt til de aktiverte membranene ved glutaraldehyd-kobling til det gjenværende terminale aminet på spacerarmen. Utgangskonsentrasj onene av enzym ble anslått til 1, 2, 4 og 6 nanogram enzym pr. nanomol immobilisert spacerarm. Tritiert glukoseoksidase ble anvendt, slik at de totale mengdene av immobilisert enzym kunne bestemmes ved væske-scintillasjons-teknikker. Fastpunkt enzymbestemmelser ble gjennom-ført på hver utgangskonsentrasjon av enzym. Utifrå disse analysene ble de spesielle aktivitetene for det immobiliserte enzymet bestemt, og normalisert mot kontroller omfattende enzym som var direkte kovalent bundet til membranene. Den største økningen i enzymaktivitet ble funnet ved en spacer-molekylvekt på 2000, tilsvarende en utstrakt kjedelengde på ca. 190 Ångstrøm. Resultatene av dette eksperimentet er grafisk gjengitt i fig. 1.

Etter dette eksperimentet kan spacerkjeden omfattende diamino PEG med molekylvekt 2000 tilknyttet i den ene enden til en fotogruppe såsom ANP og i den andre enden til glukose-oksidase. Dette produktet kan i vandig løsning bindes kovalent til en passende underlagsoverflate ved eksponering for lys, og kan anvendes ved enzym-immunbestemmelser.

Eksempel 2

Dette eksempelet beskriver tilknytning, via en langkjedet polyetylenglykol-spacer med molekylvekt 2000 og som har en utstrakt lengde på ca. 190 Ångstrøm, av et biomolekyl (urokinase) til en seksjon av polyuretanslange for å redusere de tromogene egenskapene hos slangeoverflaten. Til å begynne med ble hundeserumalbumin (CSA) bundet til den fotoreaktive gruppen azidonitrofenyl-6-amino-kaproyl-N-oksyravsyreimid ("ANP-EAC-NOS"), og det resulterende materialet ble fotokoblet til polyuretanslange via ANP-gruppen. Til CSA-gruppen ble deretter tilsatt polyoksyetylen-kjeden, som i sin tur var utstyrt med en urokinase-endegruppe.

200 mg CSA (hundeserumalbumin) ble løst i 10 ml av 0,1 M boratbuffer, pH 9,0. Azidonitrofenyl-6-aminokaproyl-N-oksyravsyreimid (ANP-EAC-NOS) ble løst i dimetylformamid i 20 mg/ml, og 567 mikroliter av ANP-EAC-NOS-løsningen ble tilsatt til CSA-løsningen ved romtemperatur under mørkerombetingelser. Etter konstant omrøring i 8 timer, ble løsningen inngående dialysert ved 4°C. Basert på absorbansen ved 460 nm, ble det beregnet at 8,64ANP-grupper ble koblet pr. CSA molekyl.

Stykker av polyuretanslange ("PUT"), med endene gjenplugget med små biter av glasstav for å hindre væske for å komme innenfor, ble neddykket i løsningen ovenfor i 2 timer i mørke. Disse stykkene ble deretter fjernet og utsatt for synlig lys i 1 time. Denne fremgangsmåten ble gjentatt en gang til for hvert stykke. PUT-stykkene ble deretter neddykket i ANP-EAC-CSA-løsningen over natten, etterfulgt av 1 times eksponering for synlig lys. 30 mg polyoksyetylenbisamin (PEG-diamin, "Jeffamine<®>ED 2001" fra Texaco, med en molekylvekt på ca. 2000) ble løst i 1 ml vann, og pH ble justert til 4,0 med 1 N HC1. For seg ble 200 mg av l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)-karboddiimid (EDC) løst i 5 ml vann. PUT-prøvene ble neddykket i EDC-løsningen, deretter ble PEG-diamin-løsningen tilsatt. Reaksjonen fikk deretter foregå i 2 timer ved romtemperatur, hvoretter 200 mg EDC ble tilsatt og reaksjonsblandingen fikk stå over natten.

PUT-stykkene ble omsatt med 1,25 % glutaraldehyd ved pH 6,8 over natten ved romtemperatur, skyllet og neddykket i en løsning av urokinase (8,3 enheter/ml, ca. 2-3 mg/ml) og fikk reagere over natten ved 4°C. Slangene ble vasket for å fjerne ukoblet urokinase, og ble deretter analysert for urokinase-aktivitet ved aktivering av plasminogen og spalting av azokasein. Målingene viste at 0,188 mikrogram urokinase var blitt immobilisert pr. stykke av polyuretanslange.

Eksempel 3

Tilknytning/ vekst av endoteliale celler

Forskjellige cellefaktorer ble koblet til polymere overflater testet in vitro for å bestemme virkningen av disse faktorene på celletilknytning og flatevekst. De polymere overflatene innbefattet polyvinylklorid (PVC), polyetylen (PE), polypropylen (PP) og polytetrafluoretylen (PTFE) GORE-TEX (6 mm forsterket ekspandert PTFE, et varemerkeprodukt fra W. L. Gore and Associates, Inc.). Testet kommersiell slange innbefattet polyester (Dacron, D, 6 mm rettstrikket dakronvelur, et varemerket produkt fra Dupont), silikonelastomer (Silastic', "S", 0,03-tommers indre diameter slange, et varemerket produkt fra Dow Corning) og polyuretan. Polystyrenplater ble brukt som kontroller.

Kjemiske bindingsgrupper

De kjemiske bindingsgruppene som ble anvendt i disse eksemplene, var N-oksyravsyreimid (NOS) esterne av 4-azido-2-nitrofenyl-epsilonaminokaproinsyre (ANP-EAC), 4-azido-2-nitro-fenylaminoundekansyre (ANP-AUDA) og benzoylbenzo-syre (BBA).

Kovalent binding av kollagen til spacere

Kollagen ble fortynnet til 2,0 mg/ml i 0,1 M MES, pH 5,0. ANP-PEG-NH2eller BBA-PEG-NH2(molekylvekt 1450) ble tilsatt i et 10 X molart overskudd i forhold til kollagenet. Deretter ble tilsatt tre 10 X molare overskudd av EDC med en halv times mellomrom. Etter fire timers omrøring ved romtemperatur, ble produktet dialysert mot PBS for å fjerne ikke-kovalente bundede fortoreagenser og PEG-NH2spacere. Produktet ble analysert ved UV-spektroskopi og proteinanalyse for å bestemme forholdet fotogruppe :protein. Vanligvis ble observert et forhold på 11.

Kovalent binding av biokompatible agenser til plastoverflater

Forskjellige folier, slanger og flate stykker av polyetylen, polyvinylklorid, polypropylen, polyuretan, Dacron<R>(velur), Silastic<R>(medisinsk kvalitet), og polytetrafluoretylen ovenfor ble anvendt. En 0,05 ml alikvot av løsninger som inenholdt 0 til 500/xg/ml av det fotomerkede biokompatible agenset fremstilt som ovenfor, ble tilsatt til hver 0,5 cm<2>seksjon av plastover-flate. Løsningene fikk absorberes på hvert stykke i 3 timer ved romtemperatur i mørke. Overskudd av væske ble fjernet, og de biokompatible agensene ble kovalent bundet til overflatene ved fotolyse i 12 timer ved den riktige bølgelengden (Wolfram spotlite for ANP, og UV med lange bølgelengder for BBA). Etter fotolyse ble prøvestykkene vasket med en 4 sekunders strøm av PBS for å fjerne ikke-kovalent bundede molekyler av fotomerket biokompatibelt agens. Stykkene ble deretter plassert i vevs-kultur for å bestemme endotelial cellereaksjon på cellefaktorene, rapportert nedenfor.

In vitro tester g- jennomført med modifiserte overflater

A. Radiomerkede biokompatible agenser

Radiomerket [<3>H] kollagen ble fotomerket som beskrevet ovenfor for å gi ANP-EAC-PEG-kollagen, og sistnevnte ble fotokoblet til plastoverflater. Plastoverflatene ble inngående vasket med PBS, deretter løst i organisk løsningsmiddel, og tellet ved væske-scintillasjons-spektrometri. Noen representative resultater er gitt i tabell 1, som åpenbarer kovalent kobling til overflatene.

B. Tilknytning av bovine endoteliale celler til modifiserte plastoverflater

Bovine endoteliale celler ble oppsamlet fra 8-24" lange dyre-fostre. Endoteliale celler ble høstet aseptisk fra cornea, aorta og navlestreng. Cellene ble dyrket i en 5 % C02inkubator ved 3 7°C i et kjent cellevekst-medium med høy glukose så som Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (beskrevet i R. Dulbecco og G. Freeman, Virolo<g>y, Vol. 8:396 (1959) og J.D. Smith, G. Freeman, M.. Vogt og R. Dulbecco, Virology. Vol. 12:185-196 (1960) med 25 mmol HEPES buffer, 10 % bovint kalveserum, og 2,5/zg amfotericin B/ml ("vekstmediet"). Når platene, slangene eller foliene var ferdige, ble cellekulturer fremstilt fra primære cellelinjer. Cellene ble frigjort fra cellelinjene med en 0,25 % løsning av trypsin, og slemmet opp igjen i vekstmediet. Cellene ble deretter tellet ved bruk av trypanblått (0,4 %) løsning, og et hemocytorneter. Forskjellige cellekonsentrasjoner ble lagt i sjikt på de ferdig-gjorte materialene. Celletilknytningen ble regulert i forskjellige tidsperioder fra 5 minutter til 14 døgn. Tilknytningen ble bestemt ved i det minste to metoder. I en ble prøvematerialer fjernet fra kulturmediet og vasket to ganger med steril saltløsning. Celle-farge ble deretter påført, og totale celler på overflten ble telt. En andre metode var å trypsinere cellene fra overflaten med en trypsinløsning, og telle ved bruk av trypanblått-metoden.

Representative resultater fra tilknytningen og flateveksten av endoteliale celler på forbelagte polyvinylklorid-plaststykker er gjengitt i tabell 2. Antalle levedyktige celler tilknyttet til hvert stykke ble bestemt ved trypanblått fargemetoden.

C. Tilknytning av humane endoteliale celler fra navlestrengen

Primære humane endoteliale celler ble høstet fra friske (mindre enn 4 døgn gamle) humane navlestrenger. Strengene ble skyllet med 20 ml strengebuffer (0,144 M NaCl, 0,004 M KC1 og 0,001 M P04) to ganger for å fjerne blod og levret blod. Kollagenase ble tvunget inn i strengen, og etterlatt i 20 minutter ved romtemperatur. Ved bruk av 10 ml varm strengebuffer ble kollagenasen og frigjorte celler spylt inn i slanger. Oppslemmingen i slangene ble slått sammen og sentrifugert ved 1500 rpm i 5-10 minutter. Supernatanten ble heilt av, og cellene slemmet opp igjen i 10 ml strengebuffer. Etter den andre sentrifugeringen ble cellene slemmet opp igjen i strengebuffer, og utplatet på vevskulturdisker, Alle cellene ble inkubert i 37°C inkubator med 5 % C02. Cellene ble radiomerket ved bruk av<sl>Cr i strengemedium uten kalveserum.

Merkede celler ble deretter anvendt for celletilknytnings-studier. Plater, folier og slanger av de plastene som er beskrevet ovenfor, ble fremstilt som gjengitt ovenfor. Cellene ble trypsinert og tellet med trypanblått-metoden. Cellene fikk feste seg til den preparerte plasten i 3 timer til 7 døgn. Cellene ble skyllet av, og det totale antallet tilknyttede celler ble sammenlignet med antallet ikke-tilknyttede celler. Det ble oppnådd resultater som er sammenlignbare med dem som er gjengitt i tabell 2 ovenfor.

D. Måling av flatevekst ved bruk av endoteliale celler.

Følgende teknikker ble anvendt for å styre flateveksten av celler fra et utgangspunkt, ettersom cellene vokser for å dekke overflatene av de plastene som er oppført ovenfor. Løsninger av biokompatible agenser omfattende fra 0 til 500 fig celle-faktorer ble belagt på overflater fra 1 til 6 cm lange for å etablere en gradient. Cellene ble ikke frigjort fra vevet med trypsin eller noen proteinase. Vevet ble plassert på et utgangspunkt ved den nedre enden av gradienten, og merket. Vevet fikk sitte i 15 min. ved romtemperatur. Vekstmedium ble tilsatt for å gi et fuktig belegg over plasten. Alle protokoller ble utført ved bruk av aseptiske betingelser. Platene ble deretter inkubert ved 37°C i en 5 % C02 inkubator. Flateveksten ble målt daglig i opptil 2 uker, eller inntil hele plastlengden var fullstendig dekket. Flateveksten på de behandlede overflatene ble sammenlignet med ikke-behandlede kontrolloverflater som gjengitt i tabell 2 ovenfor.

Alle materialer ble skyllet og farget for permanent skanderende elektronmikroskopi.

Disse resultatene viste at den kovalente tilknytningen av vekstfaktorene fibronektin (FN) og kollagen (COL) til plastoverflaten, forbedret biokompatibiliteten for plasten med bovine endoteliale celler. Cellene knyttet seg fortrinnsvis til de modifiserte overflatene versus kontrolloverflåtene, som vist ved den avstanden de vokste ut over plastoverflaten.

Eksempel 4

Modifisering av overflatene av kontaktlinser

og intraokulare linseimplantater

Eksperimentene beskrevet i dette eksempelet medførte måling

av in vitro proteinavsetningen fra kunstige tåreløsninger på preparerte linser, sammenlignet med ikke-behandlede linser.

Binding av biokompatible agenser til den kjemiske forbindelses-gruppen

A. Fremstillin<g>av fotomerkede polyetylen<g>lykoler

Polyetylenglykoler med molekylvekter på 1000 (PEG-1000) og 4000 (PEG-4000) ble merket med fluornitroazidobenzen (FNAB) med modifisering av faseoverføringsmetoden til Kimura, og S. Regen, Journal of Organic Chemistry 48; 195 (1983), hvilke teknikker er inkorporert ved referanse heri. Kort fortalt medførte fase-overf øringssyntesen av 4-azido-2-nitrofenylpolyetylenglykol (ANP-PEG) blanding av 60 % vandig kaliumhydroksytoluen med FNAB og PEG, etterfulgt av ekstraksjon og tynnsjikt-kromato-grafisk (TLC) rensing som beskrevet nedenfor.

ANP- PEG- 1000. ANP-PEG-1000 ble fremstilt ved å tilsette 0,05 mmol PEG-1000 til 5 ml 60 % KOH og 0,5 mmol FNAB til 10 ml toluen. Denne reaksjonsblandingen ble raskt omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Produktet ble isolert fra det organiske løsningsmiddel-sjiktet. Tynnsjikt-kromatografi ("TLC") i 85/15/1/1 kloroform/ metanol/H20/eddiksyre eller ammoniumhydroksyd separerte mono- og di- substituerte derivater av ANP-PEG-1000 fra umerket PEG. Båndet tilsvarende ANP-PEG-1000 (lavere Rf verdi) ble ekstrahert fra silicagel med TLC-løsningsmiddel, og azeotropert for å fjerne restsyre eller base. Sluttproduktet var løselig i vann, og resulterte i omdanning av 30-40 % av PEG utgangsmaterialet til ANP-PEG-OH produkt.

ANP- PEG- 4000. ANP-PEG-4000 ble fremstilt ved samme fremgangsmåten som beskrevet ovenfor, untatt at reaksjonsblandingen ble raskt omrørt ved 50°C for å sikre at alle reagensene ble i løsningen i løpet av reaksjonen. Utbyttet av ANP-PEG-4000-0H

var 10 %.

B. Fremstilling av fotomerkede spacere

Polyoksypropylenpolyaminer og polyoksyetylenpolyaminer (referert til som "Jeffamines"<®>et varemerke fra Jefferson Chemical Co., Inc.) ble fotomerket ved kobling av N-oksyravsyreimid ("NOS") estere av ANP-EACA, BBA og nBBA til polymerene. Disse NOS derivatene ble tilsatt i 0,5 X mengder til 1 X Jeffamine<®>i svært tørre (høy renhet) løsningsmidler (ANP-EAC-NOS i tørr tetrahydrofuran, BBA-NOS i tørr dioksan eller dimetylformamid og nitro BBA-NOS i tørr dioksan eller dimetylformamid). Etter 16 timers omsetning i romtemperatur i mørke, ble produktene isolert ved TLC i 85/15/1/1 klorof orm/met anol/H20/eddiksyre. Monosubstituerte Jeffamine<®->derivater ble ekstrahert med TLC-løsningsmiddelet, og azeotropert med vann for å fjerne rest-eddiksyre. De vannløselige produktene ANP-EAC-Jeffamine<®>, BBA-Jeffamine<®>, og nBBA-Jeffamine<®>ble isolert i hhv. 15 %, 10 % og 12 % utbytte.

C. Fremstilling av ANP- hyaluronsyre

Det terminale sukkeret i hyaluronsyre fra human placenta (MWapp100 .000-130 .000) ble aktivert ved periodat fremgangsmåten beskrevet i E. Junowicz og S.E. Charm, "The Derivatization of Ozidized Polysaccarides for Protein Immobiliztion and Affinity Chromatography," Biochimica et Biophysica Acta. Vol. 428: 157-165

(1976), inkorporert heri ved referanse. Denne fremgangsmåten medførte tilsetning av natrium- eller kaliumperiodat til en løsning av hyaluronsyre, for således å aktivere det terminale sukkeret. Hyaluronsyren ble tilsatt til et 10 gangers overskudd av Jeffamine® og fikk omsette seg i 4 timer ved romtemperatur. Bindingene ble stabilisert ved reduksjon med natriumcyanobor-hydrid, etterfulgt av vidtgående dialyse for å fjerne det meste av overskuddet av Jeffamine<®>. Et 10 gangers molart overskudd av ANP-EAC-NOS i DMF ble tilsatt til Jeffamine<®->hyaluronatet i 0,1 M karbonat, pH 9,0, ved sprøytetrykk. Denne tilsetningen krevet 16 timer, og ble gjennomført ved romtemperatur i mørke. Overskuddet av ANP-EAC-NOS og ANP-EAC-Jeffamine<®>ble fjernet ved gelfiltreringskromatografi. Integriteten av azidgruppen, nødvendig for fotokobling av gruppen til polymerryggraden i kontaktlinsen, ble analysert ved infrarød spektroskopi for å påvise ANP gruppen, en polyetylenglykol-undersøkelse for å bestemme Jeffamine<®>spaceren, og en modifisert karbazolanalyse beskrevet i T. Bitter og H. Muir, Analytical Biochemistry Vol. 4: 330-334 (1962) for å bestemme uronsyre-innholdet i derivatet. De fraksjonene som inneholdt et ANP-, et Jeffamine<®->og et hyalyronat-molekyl ble slått sammen og anvendt som et biokompatibelt agens. D. Fremstilling av fotomerket hyaluronsyre. metylcellulose oa kondroitinsulfat. ANP-EAC-Jeffamine<®>, BBA-Jeffamine<®>og nitro-BBA-Jeffamine<®>ble bundet til karboksylgruppene i uronsyrerester av hyaluron-syre og kondroitinsulfat ved ed karbodiimidfremgangsmåte som følger: Et 5 molart overskudd av fotomerket Jeffamine<®>og l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl) karbodiimid med HC1 ble blandet med polysakkarid-polymeren i vann justert til pH 4,5 med 0,1N HC1. Blandingen fikk omsette seg ved romtemperatur i mørke i 24 timer. Produktet ble renset ved gelfiltreringskromatografi, deretter analysert for fotogruppe- og karbohydratinnhold som beskrevet ovenfor.

2. Fotokoblin<g>av biokompatible agenser til linseoverflater

De fotomerkede biokompatible agensene fremstilt ovenfor, ble tilsatt til kontaktlinsematerialer ved en konsentrasjon på 250-1000 pmol agens/kontaktlinse. Løsningen fikk adsorberes på kontakt-linsene ved romtemperatur i mørke i 3 timer. De fotomerkede agensene ble deretter kovalent bundet til plasten ved fotolyse i 12 timer ved den passende bølgelengden (450 nm for ANP og 320 nm for BBA- og nBBA-derivatene). Etter fotolyse ble konaktlinsene vasket med 5x5 ml normal saltløsning (0,85 NaCl) for å fjerne ikke-kovalent bundede grupper.

3. Proteinadsorpsjonsstudier in vitro

Kunstige humane tårer ble fremstilt ifølge formelen funnet i B.P. Gloor, "The Lacrimal Apparatus" i Adler' s Physiology of the Eye: Clinical Applications (R.A. Moses, utg.) CV. Mosby Co.,

St. Louis, MO (1981) hvis lære er inkorporert heri. Som vist i denne referansen er de viktigste proteinene som er tilstede i humane tårer, serumalbumin (HSA), gamma-globulin (HGG), og lysozym (LYZ). De viktigste sterolene som er tilstede i humane tårer, er kolesterol og kolesterol-estere.

Fremstilling- av kunstige tårer

De radiomerkede proteinene beskrevet ovenfor ble anvendt til fremstilling av kunstige tårer. Et av de radiomerkede proteinene eller tritiert kolesterol ble innbefattet i alle tåreblandingene. De andre komponentene ble ikke radiomerket. Kontaktlinsematerialene ble inkubert i den kunstige tåreløsningen i en uke ved 37°C under forsiktig omrøring. Ved slutten av denne tiden ble linsematerialene vasket med 5 x 10 ml av 0,85 % NaCl. Protein-mengden adsorbert til linsematerialene ble deretter bestemt ved væskescintillasj onstelling.

Resultatene av proteinavsetningen in vitro viste signifikant reduksjon i proteinavsetningen fra kunstige tårer på visse av kontaktlinsematerialene under en periode på en uke.

Eksempel 5

Kobling av filmer til faste overflater

Fotomerkede derivater av hyaluronsyre (ANP-EAC-Jeffamine<®>, BBA-Jeffamine<®>og nitro-BBA-Jeffamine<®>) blir fremstilt. Filmer lages av det fotoreaktive beleggmaterialet, og plasseres på overflater av kontaktlinser (ved dypping og tørking) i mørke. Kovalent binding til biomaterialoverflaten og styrking av filmen

ved intermolekylær kryssbinding kan gjennomføres ved belysning.

I et annet eksempel blir et kunstig hofteledd gjennomtrukket med ANP-EAC-Jef f amine ®-hyaluronsyre (0,1:1 mg/ml) i tre timer i mørke. Leddet blir deretter fjernet fra løsningen, og får tørke slik at det dannes en tynn film av beleggmaterialet på det kunstige leddet. Filmen blir deretter kovalent bundet til leddet ved belysning ved 400 til 450 nm i 8 timer ved 4°C. Leddet blir deretter skylt i fysiologisk saltløsning for å fjerne ukoblet ANP-EAC-Jeffamine<®->hyaluronat. Den hyaluronsyren som er bundet til benet, reduserer friksjonen og reduserer slitasjen av benet i leddområdet.

Eksempel 6

Dette eksperimentet skriver den kovalente tilknytningen av biomolekyler til kommersielle interokulare linsematerialer (IOL) for å forbedre langtids-biokompatibiliteten for IOL med øyet.

Syntese av fotorea<g>enser

Azido- nitrof enylcrrupper.

Koblingsgruppen fluornitroazidobenzen ("FNAB") ble fremstilt av 4-fluor-3-nitro-anilin. Anilinet (10,0 g) ble tilsatt til 60 ml MCI og 10 ml H20. Blandingen ble oppvarmet til 40-45°C under om-røring. En 5,60 g porsjon av NaN02ble løst i 9,0 ml H20, og 5,60 g NaN3ble løst i 15,0 ml H20. Anilin/HCl blandingen ble avkjølt

til -20°C i tørris/isopropanol-bad, etterfulgt av dråpevis tilsetning av NaN02løsningen i løpet av 15 minutter. Etter full-føring av tilsetningen, ble blandingen omrørt i ytterligere 15 minutter ved -20°C. NaN03løsningen ble tilsatt dråpevis i løpet av 30 minutter, mens reaksjonsblandingen ble holdt ved -20°C til -10°C. En liten mengde eter ble tilsatt for å redusere skummingen. Etter 30 minutters omrøring ved -20°C, ble iskaldt H20 tilsatt for å felle ut produktet, deretter ble FNAB oppsamlet ved filtrering. Etter tørking ble produktet krystallisert fra 30-60°C petroleum eter. Et utbytte på 72,6 % av produktet ble resultatet av denne fremgangsmåten.

4- azido- 3, 5- diklor- 2, 6- difluor- pyridin- gruppen

En porsjon på 1,01 g (5,0 mmol) av 3,5-diklor-2,4,6-trifluorpyridin ble innveiet i en 50 ml rundbundet flaske og fortynnet med 20 ml acetonitril. 5,0 mmol (325 mg) av NaN3ble tilsatt i 10-15 mg porsjoner ved romtemperatur, og omsetningen ble regulert for eksoterm reaksjon. Det faste azidet viste seg å ha begrenset løselighet i acetonitrilen. Omsetningen fikk løpe i tilsammen to timer. Tynnsjikt-kromatografi ("TLC") i et petroleter-løsningsmiddelsystem viste at alle utgangsmaterialene var blitt omsatt. Acetonitrilen ble fjernet under redusert trykk på et avkjølt vannbad, hvilket resulterte i dannelse av et oljeaktig fast stoff. Produktet ble løst i 40 ml eter og 10 ml H20, rystet i en skilletrakt, og det vandige sjiktet ble fjernet. Etersjiktet ble vasket med H20, og de sammenslåtte vannvaskingene ble tilbake-ekstrahert med 10 ml eter. De samlede organiske fraksjonene ble tørket over MgS04. TLC demonstrerte dannelsen av produktet. Et utbytte på 95,7 vekt% av rått produkt i form av en klar olje ble oppnådd.

Syntese av fotomerkede overflatemodifikasions- reagenser

Strukturene for de fotomerkede overflatemodifikasjons-reagensene er gitt i tabell 4. Derivatene av polyetylenglykolene ("PEG") ble fremstilt ved fremgangsmåter refererert til i eksemplene foran. 4-azido-3,5-diklor-2,6-difluor-pyridin-derivatet av PEG'ene ble oppnådd ved tilsetning av denne gruppen til bis-amino-PEG'ene, etterfulgt av rensing ved tynnsjikt-kromatografi på et system av 85:15:1:1 av kloroform:metanol:H20:eddiksyre.

De fotoaktiverbare derivatene av hyaluronsyre og kondroitin-sulf at ble fremstilt ved tilsetning av ANP-PEG-NH2, BBA-PEG-NH2eller N-(4-azido-3,5-diklor-6-fluor-pyridinyl)-PEG-NH2til en løsning av hyaluronsyre-substansen i nærvær av vannløselig karbodiimid l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC). De resulterende derivatene ble renset ved gelfiltrerings-kromatografi på en Bio-Rad P-200 kolonne eller ved dialyse, og ble undersøkt ved uronsyreanalyse, polyetylenglykolbestemmelse, spektrofotometrisk analyse for å bestemme tilstedeværelsen av fotogruppen og ved infra-rød spektroskopi for å bestemme integriteten av azido- eller karbonyl-funksjonene i fotogruppene. Ytterligere forklaringer av syntesen og karakterisering av disse agensene er beskrevet nedenfor.

Fremgangsmåte for kobling av foto<g>rupper til kollagen

Kollagen ble fortynnet til 2,0 mg/ml i 0,1 M MES, pH 5,0. ANP-PEG-NH2(molekylvekt 1450) ble tilsatt i 10 gangers molart overskudd i forhold til kollagen. Deretter ble tre 10 gangers molart overskudd av EDC tilsatt med en halv times mellomrom. Etter 4 timers omrøring ved romtemperatur ble produktet dialysert mot PBS for å fjerne ikke-kovalent-bundede fotoreagenser og PEG-NH2-spacere. Produktet ble analysert ved UV-spektroskopi og protein-analyse for å bestemme forholdet fotogruppe:protein. Et forhold på 11 ble vanligvis observert.

Fremstilling av ANP-PEG-NH2, BBA-PEG-NH2og ADDP-PEG-NH2.

Bis-amino poly(oksyetylen)glykol- og poly(oksypropylen)glykol-polymerene ble merket med de fotoaktiverbare koblings-reagensene på en lignende måte som den beskrevet for proteiner, men både polymerene og fotogruppene var løselige i organisk løsningsmiddel. Et 0,5 ganger molart forhold av fotogruppe til PEG ble tilsatt til den syntetiske polymeren i tørt løsningsmiddel (dioksan, dimetylformamid eller tetrahydrofuran) og ble omrørt ved romtemperatur i mørke i 16 timer. Ved utløpet av denne tiden ble monomerket PEG produkt renset fra utgangsmaterialene ved tynnsjikt-kromatografi i et system av kloroform:metanol:H20: eddiksyre i forholdet 85:15:1:1.

Fremstilling av ANP- PEG- 1450

ANP-PEG ble fremstilt generelt ved faseoverføringsreaksjon som det tidligere er referert til. Fluornitroazidobenzen og PEG ble løst i toluen, etterfulgt av tilsetning av KOH for å gi en slutt-konsentrasjon på 60 %. Blandingen ble omrørt for å sikre emulsjons-dannelse, og oppvarmet ved 35-40°C i tilsammen 18 timer. Reaksjonen ble styrt ved TLC ved bruk av et 9:1 CH2C12: metanol løsningsmiddel-system. Di-ANP og mono-AMP produktene ble visualisert under UV-lys og alle tre produktene ga en oransje farging med Dragendorff's reagens. En selektiv ekstraksjonsfremgangsmåte ble etablert for blandingen, basert på omhyggelig økning av ionestyrken for det vandige sjiktet for å tvinge PEG produktet inn i toluenen, basert på deres relative polariteter. Etter avkjøling av reaksjonsblandingen, ble KOH-sjiktet fjernet. Omhyggelige tilsetninger av mettet NaCl ble utført, og de resulterende toluensjiktene ble regulert ved TLC for å bestemme fordelingen av de frie PEG, mono-ANP-PEG og di-ANP-PEG produktene. Etter at alt di-produktet var blitt fjernet, ble fast NaCl tilsatt til det vandige sjiktet, og mono-ANP produktet ble ekstrahert fra blandingen med toluen. Ekstraksjonene ble gjentatt til TLC viste intet mere mono-ANP i toluensjiktet. Disse ekstraktene ble slått sammen, tørket over MgS04og inndampet under redusert trykk for å gi det ønskede mono-ANP-PEG produktet.

Fremstilling av hyaluronsyre og kondroitinsulfat. derivatisert med fotoaktiverbare koblin<g>srea<g>enser.

De terminale aminogruppene i ANP-EAC-PEG-NH2eller BBA-PEG-NH2ble koblet til karboksylgruppene i hyaluronsyren eller kondroitin-sulfatet ved bruk av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (EDC). Hyaluronsyren ble løst i 0,1 M MES buffer, pH 5,0. En mengde av ANP-EAC-PEG-NH2eller BBA-PEG-NH2lik et 5 gangers molart overskudd i forhold til karbohydratet ble tilsatt. Deretter ble tilsatt fast EDC i 5,0 ganger molare forhold over polysakkaridet i tre porsjoner i løpet av 1 time. Etter 6-8 timers omrøring ble produktene renset ved dialyse. Produktene ble analysert ved UV-spektroskopi, uronsyreanalyse og PEG analyse for å bestemme forholdet fotogruppe:spacer:polysakkarid. Et typisk forhold på

10 fotogrupper til 1 hyaluronsyre, og 9 fotogrupper til hvert kondroitinsulfat-molekyl ble oppnådd. Noen forbindelser referert til heri er beskrevet i de følgende tabellene 3 og 4.

Tilknytning av biomolekyler til IOL materialer

IOL materialer (PMMA knapper, polypropylen, polyetylen, silikon, dimetyl-siloksan og PMMA linser med polypropylenhaptikk) ble neddykket i en løsning av belegget som var blitt løst i H20. Etter 3 timers neddykking ble linsematerialene fjernet og raskt tørket under en strøm av luft eller nitrogen. Overflate-modifikasjons-reagensene ble deretter kovalent tilknyttet ved fotolyse ved den riktige bølgelengden. Linsedelene ble deretter vasket med avionisert H20. For å bestemme hvorvidt denne belegg-prosedyren påvirket linseoverflåtene, ble scanner elektronmikroskopi (SEM) gjennomført for å evaluere glans og sluttresultat på belagte- sammelignet med kontroll-linser.

Fyllingstettheten for biomolekylene ble bestemt ved bruk av radiomerkede derivater av de syntetiske polymerene og de naturlig avledede biomolekylene. Hver matriks-del ble analysert ved væske-scintillasjonsspektrometri for å bestemme det maksimale antallet mikrogram av overflatemodifikasjonsreagens for hver cm<2>av matriksmaterialet. Effektiviteten ved tellingen ble bestemt ved standard tilsetninger av tritiummerket forbindelser til hver av disse matrisene, slik at det kunne gjøres presise bestemmelser av mengdene.

Resultatene viste den kovalente bindingen av de fotomerkede substansene av syntetiske polymerer, proteiner og langkjedede polysakkarider til polyvinylklorid (PVC), polypropylen (PP), polyetylen (PE), silikon og polymetylmetakrylat (PMMA). Tabell 5 nedenfor illustrerer koblingseffektiviteten til de forskjellige materialene

Måling av fuktbarhet

Fuktbarhetsmålinger av belagte sammenlignet med ikke-belagte IOL'er av kommersiell PMMA- eller silikonfilmer ble utført i alt vesentlig som vist i "Protocol for Contact Angle Measurements at the Polymer-Water Interface", appendix 7 i Guidelines for Blood-Material Interactions: Report of the National Heart. Lung and Blood Institute Working Group. U.S. Department of Health and Human Services, side A30, september 1985. Det var statistisk signifikante forbedringer av fuktbarheten for både PMMA- og silikon-materialer, når de var overflatemodifisert. Dette ble vist ved lavere kontaktvinkelmåling på overflatemodifiserte linser, sammenlignet med kontroll-linser, som vist i tabell 6 nedenfor. Det er en signifikant forbedring av fuktbarheten med beleggene på begge materialer.

Proteinadsorpsi ons- studier

Adsorpsjonen av proteiner til de overflatemodifiserte IOL materialene ble målt, sammenlignet med kontrollen.

Tritiert type IV kollagen, humant serumalbumin og humant plasmafibronektin ble fremstilt og fortynnet i tåre-elektrolytt-løsning. Gloor, B.P., "The Lacrimal Apparatus", i Alder' s Physiology of the Eye: Clinical Applications. (R.A. Moses, utg.), CV. Mosby Co. St. Louis, MO. (1981). De modifiserte PMMA linsene og kontrollene ble deretter tilsatt til disse løsningene, og fikk adsorbere proteiner i 7 døgn. Ved utløpet av denne tiden ble alle linsene vasket med buffret saltløsning, løst i tetrahydrofuran, og analysert ved væske-scintillasjons-spektrometri. Proteinmengdene adsorbert til PMMA kontroll-linser ble sammenlignet med den mengden som var adsorbert til overflatemodifiserte PMMA-linser, og resultatene er gitt i tabell 7 nedenfor.

Måling av biokompatibilitet ved bruk av endoteliale celler fra bovin fetal corneal

Stykker av Dow/Corning silikon, polypropylen, polyetylen, polyvinylklorid og PMMA linse-optikk ble behandlet med forskjellige overflatemodifiserings-reagenser, fotolysert og inngående vasket med fysiologisk saltvannsløsning. 2 mm diameter knapper av cornea ble tatt ut fra fetale dyr som var 8 til 24 tommer lange. Cornea-bitene ble dyrket i en 5 % C02-inkubator i Dulbecco's modifiserte Eagle medium [69,70] med 25 mmol HEPES buffer, 10 % fetalt bovint serum, og 2,5 mikrogram amfotericin B/ml ved 37°C. Cornea-biten ble deretter plassert på den ene enden av de rektangulære stykkene av IOL matriksmaterialet, eller i senteret av PMMA linsene. Celletilknytningen ble regulert i 7 døgn. Flateveksten av celler tvers over stykkene ble bestemt ved måling i mm, og cellenes leve-dyktighet ble bestemt ved farging med en Wright-Geimsa farge eller trypan blått farge. For å unngå uklarhet i IOL'ene ville man ønske å retardere adhesjonen av de endoteliale og epiteliale cellene i cornea til IOL'ene, men ikke ha en toksisk eller ødeleggende virkning på cellene. Ytterligere studier viste at overflate-modif ikas jons -reagensene er ikke cytotoksiske. Resultater er gitt i tabell 8.

G. Bestemmelse av endotelial skade på cornea fra kanin kadaverøve

En abrasjonstest ble utført for å bestemme hvorvidt beleggene kunne redusere mengden av endotelial skade forårsaket av kontakt med IOL. Øyer fra friske kadavere av voksne kaniner ble frem-skaffet i løpet av en-to timer etter avliving. En 7 mm trepan ble brukt til å stanse ut en sentral cornea-knapp som ble plassert på et mikroskop-slide med den endoteliale siden opp. En tørr IOL ble deretter plukket opp med en haptikk og forsiktig plassert på cornea-knappen. Ved bruk av svært forsiktig banking (ingen trekking på haptikken), ble linsen skjøvet tvers over cornea-knappen to ganger i 90 graders vinkel med hverandre. Linsen ble deretter fjernet fra knappen ved omhyggelig å gripe haptikken og forsiktig la den skli vekk fra knappen i diagonal retning. Endoteliet ble deretter farget med 2-3 dråper av en 25 %ig stokk-løsning av trypanblått i 1,5 minutter, skyllet, deretter farget med 2-3 dråper alizarinrød (som ble titrert til en pH på 4,2 med en løsning av 0,1 % NH40H i 9,9 % NaCl) i 3,5 minutter. Alle linsene ble testet på 10 cornea-knapper, og prosenten av endotelial skade ble anslått ved referanse til fotografier som viste varierende grader av endotelial skade. De behandlede linsene forsaket betydelig mindre skade. Resultatene av disse studiene er gitt i tabell 9 nedenfor. I. Evaluering av biokompatibiliteten for overflate- modifiserte IOL' er i katte- modellen.

Preoperativ evaluering

10 friske, ukondisjonerte hunkatter med en alder fra 1,5 til 2,5 år ble skaffet fra en kommersiell oppdrettskoloni. På dagen for kirurgisk inngrep, ble maksimal pupille-dilatasjon oppnådd med 10 % fenylephedrine dråper lokalt. En ekstrakapsulær katarakt-ekstråksjon ble gjennomført ved bruk av phako-fragmentering og irrigasjon/aspirasjon. Linsene ble nummerert individuelt slik at hver katt fikk en kontroll-linse i et øye og en overflatemodifisert IOL i det andre. Kirurgen visste ikke hvilke linser som var belagt, og hvilke som ikke var belagt. Intraokulære linser ble plassert i posen eller den bakenforliggende sulcus. Når linsen var i posisjon, ble det corneale snittet lukket med 8-9 nylonsuturer. Alle dyrene i studien ble evaluert etter 24 timer, 48 timer, en uke og to uker. Postoperativ evaluering besto av biomikroskopisk evaluering for observasjon av inflammatorisk skade, såvel som endoteliale celle-studier av cornea. Alle dyrene ble gradert for betennelse. Etter at dyrene ble observert i den to ukers postoperative perioden, ble de avlivet og øynene ble utsatt for histologisk studium. Øynene ble fiksert i Zenkers-eddiksyre og vasket og lagret i 70 % alkohol.

Resultater av katte- modellen.

Kattemodellen ble anvendt som implantasjons-system for preliminær bestemmelse av mottageligheten av overflate-modifiserte IOL'er av et verts-system. Resultatene av McDonald-Shadduck (inflammasjons) regnskapet og pachometriske avlesninger er gitt i tabell 10 nedenfor. Som ventet var det en lav grad av uveitis i alle dyrene under studium, hvilket resulterte i transient inflammasjon og cornea-ødem som ikke gikk fullstendig tilbake i løpet av helingsperioden på to uker. Dyrene i studien hadde imidlertid ikke tegn på unormal respons, verken på de linsene som var basert på in vivo eller histologisk studium. Det ble konkludert at signifikante okulære abnormaliteter ikke henger sammen med belagte intraokulære linser, og at de endoteliale cellene i cornea blir beskyttet ved beleggings-prosessen.

Eksempel 7

Dette eksperimentet beskriver tilknytning av flere antistoffer til forskjellige underlagsoverflater ved anvendelse av langkjedede hydrofile spacere. Fotoaktive grupper ble anvendt for å binde spacerne til underlagsoverflåtene, idet de fotoaktive gruppene omfattet 4-fluor-3-nitroanilin, benzoylbenzo-syre og 3,5-diklor-2, 4, 6-trifluorpyridin, alle kommersielt tilgjengelige fra Aldrich Chemical Company. De hydrofile spacerne ble også anskaffet fra kommersielle kilder. Bovint serum albumin (BSA), ribonuklease A (RN) og kylling eggehvitte ovomucoid (0V0) ble levert fra Sigma Chemical Corp. Diamino-polyetylenglykoler ble levert fra Texaco Chemical Corp. under varemerket Jeffaminer<®>("JEFF"). Polyetylenglykol (MW 1450) ble levert fra Sigma Chemical Corp. Underlags-materialene omfattet Sephadex geler (fra Pharmacia), polystyren-perler, og polyvinyl-klorid- og polystyren- mikrotiterplater.

Koblin<g>av foto<g>rupper til proteinspacere

Proteinene ble fortynnet til 1,0-2,0 mg/ml i 0,1 M natrium-karbonat, pH 9,0. Et 100 X overskudd av fotogruppe-NOS ble tilsatt meget langsomt til proteinløsningen ved en 4 mg/ml fortynning i dimetylformamid eller etanol. Koblingsprosedyrene ble utført ved 4°C i løpet av 6 timer ved sprøytetrykk. De koblede proteinene ble dialysert mot buffer for å fjerne ukoblede fotoreaktive grupper. Hvert protein reagerte forskjellig på koblingsprosedyre-betingelsene, så det ble valgt modifikasjoner av forholdet mellom fotogruppe-NOS og protein, og buffersysternene som ga de høyeste koblings-virkningsgradene og stabilitetene for proteinene.

Syntese av fotoaktiverbare polymere spacere

Fotoaktiverbare derivater av hydroksylterminale polyetylenglykoler (PEG) med molekylvekter 1000, 1450 og 3350 ble fremstilt med en modifikasjon av faseoverføringsmetoden til Kimura et al., sitert ovenfor. Faseoverføringsmetoden med ANP-PEG-syntese.består i anvendelse av 60 % vandig KOH/toluen med fluornitroazidobenzen og PEG, etterfulgt av ekstraksjon og tynnsjikt-kromatografisk rensing.

N-oksyravsyreimidesterne av ANP-EAC og BBA ble tilsatt i 0,5 X mengden til 1 X Jeffamine<®>i svært tørre Gold Label løsnings-midler, tørr dimetylformamid eller dioksan. Etter 16 timers omsetning ved romtemperatur i mørke, ble produktene isolert ved TLC i 85:15:1:1 kloroform:metanol:H20:eddiksyre. De monosubstituerte Jeff derivatene ble ekstrahert med tynnsjikt-kromatografiløsningsmiddelet og azeotropert med H20 for å fjerne rest-eddiksyren. De vannløste produktene ANP-EAC-JEFF og BBA-JEFF ble isolert i utbytter på hhv. 15 og 10 %.

Fotokobling av hydrofile spacere til uløselige underlag Mikrotiterplater

Løsninger av derivatiserte hydrofile spacere som inneholdt 100 til 3000 ng spacer, ble tilsatt til brønnene i mikrotiterplater av polyvinylklorid og polystyren med 96 brønner. Løsningene ble overlatt til å adsorbere og inndampe til tørrhet. (En viss hjelp ble gitt ved å plassere platene i en ovn ved 70°C i 1 time, etterfulgt av adsorpsjon under avtrekk med kontinuerlig luftstrøm). De hydrofile spacerne ble deretter kovalent koblet til underlagene ved fotolyse. Underlagene ble plassert 10 cm fra en passende høy-intensitetslampe ved 4°C i 12 timer. De ikke-kovalent koblede spacerne ble deretter vasket vekk med fosfatbuffret saltløsning

(PBS) .

Sephadex- geler.

En 20 mg porsjon av Sephadex G-25-150 (perlestørrelse 50-150 jim) ble plassert i et silikonisert 12 x 75 mm borsilikat glassrør. 100-3000 ng av fotoaktiverbar hydrofil spacer ble tilsatt til hvert rør. Løsningene ble overlatt til å adsorbere til tørrhet. Den tiden som var nødvendig for denne prosessen, ble redusert ved å plassere platene i en ovn ved 70°C i 1 time, etterfulgt av adsorpsjon i avtrekk under en kontinuerlig luftstrøm. De hydrofile spacerne ble kovalent koblet til underlagene ved fotolyse. Rørene som inneholdt gelene, ble plassert 10 cm fra den passende høy-intensitetslampen ved 4°C i 12 timer. De ikke-kovalent koblede spacerne ble deretter vasket vekk med fosfat-buffret saltløsning

(PBS) .

Etter fotokobling av de derivatiserte hydrofile spacerne til uløselige underlag, ble biomolekylene av interesse (polyklonale antistoffer mot åpen-ring penicillin, humant gamma-globulin og monoklonale antistoffer fremstilt mot HGG, og humant alfafeto-protein og monoklonale antistoffer fremstilt mot dette tumor-assosierte antigenet) bundet til spacerne ved protein-protein koblingsfremgangsmåter. To fremgangsmåter ble anvendt. Epsilon aminogrupper i biomolekyler ble koblet til terminale aminogrupper på spacere med glutaraldehyd. Karboksyl-grupper i biomolekyler ble koblet til spaceraminogrupper med et vannløselig karbodiimid, l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid HC1 (EDC).

Bestemmelse av aktivitetene til polyklonale antistoffer

Fraksjonert polyklonalt antiserum fra kanin ble radiomerket. Mengdene av antistoff koblet til matriksene ved passiv adsorpsjon og via glutaraldehyd eller EDC kobling ved hydrofile spacere ble kvantifisert ved væske-scintillasjonsspektrometri. De immobiliserte antistoffenes aktivitet ble bestemt ved tilsetning av t<14>C]-penicillin. De totale (pmol [<14>C] Pen) og de spesifikke aktivitetene (pmol [14C] Pen/pmol immobilisert anti-Pen) ble bestemt ved direkte kobling og immobilisering ved hydrofile spacere.

Bestemmelse av aktivitetene til monoklonale antistoff- modeller

Modellparet av MGG og monoklonalt anti-HGG ble valgt for disse testene. Radiomerket HGG ble koblet direkte og ved hydrofile spacere for å bestemme mengdene av koblet antigen. For å bestemme immunoreaktiviteten ble deretter ikke-radiomerket HGG koblet ved disse metodene. Deretter ble radiomerket anti-HGG tilsatt til det immobiliserte HGG. Immunoreaktivitetene ble bestemt ved væske-scintillasjonsspektrometri. Forholdet pmol anti-HGG/pmol HGG ble sammenlignet for direkte kobling og immobilisering ved hydrofile spacere.

Tabellene 11 og 12 illustrerer virkningsgraden ved kobling av fotoreaktive spacere til polystyren mikrotiterplater og til Sephadex-gel.

Aktivitetene av passivt adsorberte biomolekyl ble sammenligne t med aktivitetene av biomolekyler immobilisert ved de hydrofile spacerne, og tabell 13 nedenfor sammenfatter resultatene av kobling av anti-penicillin polyklonale antistoffer til polystyren mikrotiterplater. Anvendelse av de hydrofile spacerne med lange kjemiske kjeder ga antistoffer med i alt vesentlig høyere spesifikke aktiviteter sammenlignet med adsorpsjon av antistoffer til mikrotiterplater, eller den direkte koblingen av antistoffene til platen.

Tabell 14 nedenfor gir data fra sammenligningene av aktivitetene for det immobiliserte modell-antigenet, HGG, på Sephadex gel. De spesifikke aktivitetene for det immunoreaktive paret (ng anti-HGG/ng HGG) ble forbedre betydelig ved anvendelse av spacerne.

Tabell 15 viser den kovalente koblingen av HGG til en polyetylenglykolspacer som i den ene enden bærer en fotogruppe (ANP) og i den andre en termisk gruppe (NOS), med spaceren kovalent bundet til en polyvinylklorid mikrotiterplate ved aktivering av fotogruppen. Det er av interesse at disse data viser at ANP-PEG spacerne selv i høy grad reduserer mengden av ikke-spesifikk adsorpsjon av HGG til mikrotiterplatene, hvilket viser at plater som har spacere kovalent bundet til seg, tillater lett spesifikk kobling av biomolekyler til underlaget, mens ikke-spesifikk adsorpsjon av biomolekylene blir redusert.

Selv om en foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet, skal det forstås at forskjellige forandringer, tilpasninger og modifikasjoner kan gjøres deri uten å avvike fra ånden i oppfinnelsen og rammen for de vedlagte kravene.

Claims (24)

1. Langkjedet spacer for feste av et biologisk molekyl til en bæreroverflate uten foraktivering av bæreroverflaten, karakterisert ved at spaceren har en kjemisk ryggrad som bærer to reaktive grupper, hvilke er atskilt ikke mindre enn 25 Ångstrøm fra hverandre ved ryggradens kjedelengde, og ikke har latente reaktive grupper mellom seg, hvorunder en slik reaktiv gruppe (I) er en latent fotoreaktiv gruppe som kan danne en kovalent binding til bæreroverflaten som respons på aktinisk stråling, og den andre reaktive gruppe (II) er istand til å danne en kovalent binding med et biomolekyl.

2. Spacer ifølge krav 1, karakterisert ved at begge reaktive grupper er latente reaktive grupper, hvorunder en slik gruppe reagerer på en stimulans som den andre ikke reagerer på.

3. Spacer ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den fotoreaktive gruppe er et arylacid- eller arylketon-derivat.

4. Spacer ifølge krav 3, karakterisert ved at den fotoreaktive gruppe er et ANP-4-amino-butyry1-, ANP-6-aminocaproyl-, ANP-ll-aminoundecanoyl-, ANO-gylcyl-, ANP-aminopropyl-, ANP-merkaptoetylamino-, ANP-diaminoheksyl-, ANP-diaminopropyl- eller ANP-poly-etylenglykol.

5. Spacer ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at den omfatter en generelt hydrofil kjemisk ryggradkjede.

6. Spacer ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at den omfatter en generelt hydrofob kjemisk ryggradskjede.

7. Spacer ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at den kjemiske ryggrad omfatter flere etoksygrupper.

8. Spacer ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at den kjemiske ryggrad omfatter flere isopropoksygrupper.

9. Spacer ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at den kjemiske ryggrad er et polypeptid.

10. Spacer ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at den kjemiske ryggrad er et polysakkarid.

11. Spacer ifølge hvert av kravene 1-10, karakterisert ved at lengden av spaceren mellom de reaktive grupper er ikke mindre enn 50 Ångstrøm.

12. Beskiktingsblanding, karakterisert ved at den omfatter spaceren ifølge hvert av kravene 1-11 i en flytende bærer, hvori den kjemiske kjeden til spaceren uten reaktive grupper i den flytende bærer er minst 0,5 vekt% løselig ved 25°C.

13. Blanding for modifisering av overflaten til en bærer for å gjøre overflaten biologisk kompatibel, karakterisert ved at den omfatter en spacer ifølge hvert av kravene 1-11, som er bundet til biomolekylet, idet den latente reaktive gruppe er istand til å binde til bæreroverflaten som respons på en gitt stimulans.

14. Blanding ifølge krav 13 i en flytende bærer, karakterisert ved at den kjemiske kjede av spaceren uten reaktive grupper i den flytende bærer er minst 0,5 vekt% løselig ved 25°C.

15. Anvendelse, av en langkjedet spacer ifølge ethvert av kravene 1-11, for å binde et biomolekyl til en bæreroverflate uten foraktivering av bæreroverflaten, karakterisert ved omsetning av en latent fotoreaktiv gruppe i den langkjedete spaceren med en gitt bæreroverflate, og omsetning av en ytterligere reaktiv gruppe som spaceren bærer med et biomolekyl.

16. Anvendelse ifølge krav 15, karakterisert ved at spaceren er kovalent bundet til biomolekylet før det bindes kovalent til bæreroverflaten.

17. Anvendelse ifølge krav 15, karakterisert ved at spaceren bindes kovalent til bæreroverflaten før den bindes til biomolekylet.

18. Anvendelse ifølge hvert av kravene 15-17, karakterisert ved at den latent reaktive gruppe er en fotoreaktiv gruppe, hvorunder anvendelsen omfatter trinnet å utsette spaceren for aktinisk stråling, på hvilken den fotoreaktive gruppe gir svar ved kovalent binding av spaceren til bæreroverflaten.

19. Anvendelse ifølge et av kravene 15-17, karakterisert ved at spacerkjeden er relativt hydrofil sammenlignet med bæreroverflaten, og at den reaktive gruppe som skal bindes til bæreroverflaten er en fotoreaktiv gruppe som er relativt hydrofob sammenlignet med resten av spacerkjeden, og fremgangsmåten omfatter trinnet å bringe bæreroverflaten i kontakt med en vandig løsning som inneholder spaceren for å mulig-gjøre at de fotoreaktive grupper kommer i bindingsnærhet med bæreroverflaten, og deretter utsettes spaceren for aktinisk stråling for å binde spaceren gjennom den fotoreaktive gruppe til bæreroverf laten.

20. Anvendelse av en blanding ifølge krav 13 eller 14 for modifisering av en bæreroverflate, karakterisert ved at bæreroverflaten bringes i kontakt med nevnte blanding, og omsetning av den reaktive gruppe for å danne en kovalent binding med overflaten.

21. Anvendelse ifølge krav 20, karakterisert ved at bæreroverflaten bringes i kontakt med blandingen ifølge krav 14 i et tidsrom på minst 30 sekunder, og deretter utsettes løsningen for aktinisk stråling, hvorpå den fotoreaktive gruppe reagerer ved å danne en kovalent binding til overflaten.

22. Anvendelse ifølge hvert av kravene 15-21 for binding av et biomolekyl til en bærer med en hydrofob overflate, karakterisert ved a) den hydrofobe overflate bringes i kontakt med en vandig løsning som inneholder en hydrofil spacer, hvilken omfatter en kjemisk kjede som bærer en relativt hydrofob fotoreaktiv gruppe, hvilken er istand til å binde kovalent til bæreroverf laten,- b) stimulering av den fotoreaktive gruppe, hvilket for-anlediger at denne inngår kovalent binding med bæreroverf laten; og c) kovalent binding av et biomolekyl til spaceren, enten før eller etter trinn b), idet spaceren har en utstrakt kjedelengde mellom bæreroverflaten og biomolekylet på minst 25 Ångstrøm.

23. Anvendelse ifølge et av kravene 15-22, karakterisert ved at en kjemisk spacer med en ryggrad av en kjemisk type, som kan fremstilles i varierende lengder uten vesentlig endring av de kjemiske egenskaper, bindes kovalent til en bæreroverflate og til et biomolekyl, hvorunder spaceren gir en avstand mellom overflaten og biomolekylet målt langs den utstrakte spacerlengde på minst 25 Ångstrøm, og måling av aktiviteten til biomolekylet, idet varierende avstander mellom overflaten og biomolekylet målt langs den utstrakte spacerlengde anvendes, hvorunder hver avstand er større enn 25 Ångstrøm, og valg av den utstrakte spacerlengde, som gir biomolekylet den i det vesentlige optimale aktivitet.

24. Biomateriale, karakterisert ved at det omfatter en bæreroverflate, flere biomolekyler og spacere ifølge hvert av kravene 1-11, som gjennom latent fotoreaktive grupper er bundet til bæreroverflaten og kovalent til biomolekylene, idet biomolekylene har en avstand fra bæreroverflaten målt langs spacerens utstrakte lengde på minst 25 Ångstrøm.