PT820483E - Metodo de imobilizacao fotoquimica de ligandos usando quinonas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO “Método de imobilização fotoquímica de ligandos usando quinonas” 1. Antecedentes do invento O presente invento refere-se a um método para modificar uma superfície de um polímero através da ligação covalente de compostos funcionais, também designados ligandos.

Campo técnico

Os produtos feitos de polímeros sintéticos ou naturais possuindo superfícies modificadas são muito importantes em muitas áreas técnicas. A modificação da superfície de polímeros através da introdução de vários grupos funcionais ou da ligação covalente de moléculas biologicamente activas tem sido o tema de uma investigação crescente em anos recentes, em áreas tão diferentes tal como o desenvolvimentos de novos implantes biocompatíveis, para biossensores e biomateriais, para cromatografia de afinidade, para materiais de superfície resistente, para biossensores, e para imobilização covalente de moléculas de alto ou baixo peso molecular em testes ELISA.

Arte precedente Métodos termoauímicos A maior parte dos métodos envolve o tratamento sequencial da superfície do polímero com reagentes químicos para introduzir grupos funcionais para funcionarem como ganchos de ligação de um composto funcional também designado ligando. Contudo, estes métodos empregam usualmente produtos químicos perigosos e passos morosos. Adicionalmente a isto, apenas um limitado número de métodos é descrito em que as propriedades mecânicas e ópticas do polímero podem ser preservadas. Um método para introduzir grupos amino primários em tubos de poliestireno usando reacções termoquímicas e em placas de microtitulação foi descrito por Alexio, J.A.G.; Swaminathan, B.; Minnich, S.A.; Wallshein, V.A.; J. Immunoassay 1985, 6, 391-407.

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ΕΡ 0 820 483 / PT Métodos radioanalíticos A patente EP-A-0155252 descreve um método para preparar uma fase sólida imunorreactiva em que uma molécula biologicamente activa é ligada covalentemente a grupos funcionais de monómeros vinílicos enxertados por radiação numa superfície de polímero sólida. O enxerto requer uma dose de radiação adequada sob uma atmosfera inerte usando radiação tal como radiação ultravioleta ou ionizante. São dados exemplos específicos usando como fonte de irradiação 60Co a 0,25 MRad/h durante 10-12 horas. O pedido internacional de patente n° WO 91/02768 descreve polímeros rádio-derivatizados produzidos por contacto de conjugandos não polimerizáveis, tais como as quinonas ou compostos a partir das quais as quinonas ou estruturas quinóides são geradas durante a rádio-derivatização, com polímeros radiolizáveis tais como o poliestireno, na presença de raios gama de alta energia. Os polímeros rádio-derivatizados são adequados para introduzir grupos de ancoramento para imobilização covalente ou para fixar moléculas em superfícies de polímeros com ou sem reticuladores ou outros activadores tais como as carbodiimidas.

Uma desvantagem da rádio-derivatização é o uso de raios gama de alta energia ionizantes, o que requer cuidados de protecção da saúde física onerosos quando se usa este método. Métodos fotoauímicos São também conhecidos um determinado número de métodos fotoquímicos para modificação de polímeros. Nestes métodos um ligando desejado (L) - ffequentemente uma biomolécula sensível - é imobilizado na superfície do material polimérico (P) através de um grupo fotoquimicamente reactivo (Q) e de um espaçador (S) e opcionalmente de um grupo termoquimicamente reactivo (T).

Em geral, a ligação covalente da molécula desejada (L) à superfície pode ser efectuada de três maneiras: 1) O grupo fotoquimicamente reactivo (Q) que é ligado - através de um espaçador (S) - a um grupo termoquimicamente reactivo (Q-S-T) é ligado covalentemente à superfície (P) através de uma reacção fotoquímica (P-Q-S-T). Subsequentemente, a molécula desejada (L) é ligada à superfície (P-Q-S-T) através de uma reacção termoquímica (P-Q-S-T-L).

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2) Ο grupo fotoquimicamente reactivo (Q) que é ligado directamente - através de um espaçador (S) - à molécula desejada (Q-S-L) é ligado à superfície (P) através de uma reacção fotoquímica (P-Q-S-L). 3) O grupo fotoquimicamente reactivo (Q) é ligado covalentemente à superfície (P) através de uma reacção termoquímica (P-Q). Subsequentemente, a molécula desejada (L) é ligada à superfície (P-Q) através de uma reacção fotoquímica (P-Q-L).

As primeiras duas estratégias são potencialmente as mais flexíveis e permitem um controlo da orientação do ligando imobilizado. A patente EP-A-0319957 descreve um método fotoquímico para modificar a superfície de um polímero por imobilização de um composto heterocíclico de dois ou três membros opcionalmente substituído na superfície do polímero usando radiação electromagnética com um comprimento de onda mais curto do que 700 nm. Os compostos preferidos são opcionalmente cumarinas, benzofuranos, indóis e angelicina, opcionalmente substituídos. Particularmente, são preferidos os psoralenos optimizadamente substituídos.

Uma desvantagem deste método é que os psoralenos são compostos multifuncionais que não são fáceis de sintetizar. Estes são caros e não são quimicamente estáveis, por exemplo, não podem ser introduzidos na superfície espaçadores contendo aminas primárias (como grupo funcional), porque a amina reagirá com o psoraleno.

Quando se irradia com luz UV possuindo um comprimento de onda curto, uma amina secundária colocada na posição terminal e ligada - através de um espaçador - ao psoraleno pode ser fotoquimicamente ligada a uma superfície de poliestireno. Quando a biotina é ligada ao derivado do espaçador, a biotina pode também ser fotoquimicamente ligada a superfícies de poliestireno e a partículas de poli(metacrilato de metilo). O método não pode ser considerado como sendo de aplicação geral, uma vez que apenas estes dois exemplos dão resultados satisfatórios. O mecanismo fotoquímico não foi totalmente percebido, mas sabe-se que os derivados de psoraleno reagem com ligações duplas numa reacção de cicloadição 2+2 quando irradiados com luz UV.

Um certo número de publicações de patentes, US-A-4722906, US-A-4973493, US 5002582 e PCT/US88/04491, transmitidas a Biometric Systems Inc., descreve métodos para a modificação fotoquímica de superfícies de polímeros. As publicações de patentes descrevem essencialmente métodos envolvendo grupos reactivos latentes de activação,

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EP 0 820 483 / PT 4 seleccionados do grupo consistindo dos que são capazes de gerar radicais livres, carbenos, nitrenos e estados excitados de cetonas, e a ligação covalente destes a uma superfície sólida.

Os grupos reactivos latentes descritos, responsáveis pelas porções ultravioleta, visível ou infravermelho do espectro electromagnético são: azidas, acilazidas, formatos de azida, sulfonilazidas, fosforilazidas; compostos diazo tais como os diazoalcanos, diazocetonas, diazoacetatos, beta-cetona-alfa-diazoacetatos; compostos alifáticos azo, diazirinas, cetona, difenilcetona e cetonas fotoactiváveis tais como a benzofenona e a acetofenona; e compostos peróxidos tais como os dialquil e diacilperóxidos e peroxiésteres.

Os grupos reactivos latentes, que sob irradiação com luz UV de alta energia geram radicais altamente reactivos, carbenos e nitrenos, têm um certo número de desvantagens. Tais espécies são extremamente reactivas e sofrerão um rearranjo ou reagirão imediatamente com a maioria dos compostos orgânicos, solventes orgânicos e água. Quando a irradiação se dá no seio de uma solução, isto resulta na perda de fotorreacção e ineficiência ou reacção com a superfície do polímero. Os precursores simples requerem longos períodos de irradiação (tipicamente 12 horas) o que toma a aplicação destes grupos fotorreactivos muito consumidora de tempo, ineficaz e não adequada para a imobilização de biomoléculas sensíveis.

Nada é indicado ou sugerido acerca da ligação fotoquímica usando quinonas como grupo fotorreactivo. 2. Descrição do invento É um objecto do presente invento proporcionar um método fotoquímico para imobilizar um desejado ligando sobre uma superfície sólida de um material contendo carbono, método esse que não sofre das desvantagens descritas atrás.

Um objecto particular do invento é o de proporcionar um método fotoquímico que pode ser usado na generalidade para imobilizar ligandos em superfícies de materiais contendo carbono.

Outro objecto particular é o de proporcionar um método fotoquímico para imobilizar um ligando numa superfície sólida de um material contendo carbono método esse que é mais fácil e menos caro de realizar e controlar, e método esse que optimamente é mais rápido do que os métodos conhecidos.

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Ainda um outro objecto do presente invento é o proporcionar um método fotoquímico para imobilizar ligandos em superfícies de materiais contendo carbono, em que os ligandos não estão sujeitos a tratamentos danificantes e por isso mantêm praticamente as suas funções, mesmo quando os ligandos são biomoléculas sensíveis.

Este objecto é conseguido proporcionado um método de imobilização de um ligando (L) à superfície (P) de uma superfície sólida de um material contendo carbono; compreendendo o referido método: um passo fotoquímico de ligação do ligando (L) através de uma quinona (Q) à superfície sólida de um material contendo carbono, em que a quinona é utilizada como um composto de ligação fotoquimicamente reactivo, sendo a quinona (Q) seleccionada do grupo constituído de compostos de quinona monoméricos, compostos de quinona diméricos, e compostos de quinona oligoméricos, simétricos ou assimétricos; contendo a referida quinona (Q) um hidrocarboneto cíclico, ou de 2 a 10 hidrocarbonetos cíclicos fundidos, tendo o referido composto de quinona pelo menos dois grupos carbonilo conjugados, cujo número não excede duas vezes o número de hidrocarbonetos cíclicos fundidos.

Mais especificamente, o referido método compreende: um passo fotoquímico de ligação do ligando (L) através de uma ou mais quinonas (Q) à superfície sólida de um material contendo carbono (P); em que a referida superfície de um material contendo carbono (P) é ligada a uma quinona (Q) quer directamente ou através de um ou mais espaçadores (S,); e a referida quinona (Q) é ligada ao ligando (L) quer directamente ou através de um ou mais espaçadores (S) e/ou compostos termoquimicamente reactivos (T); sendo os referidos espaçadores (S,) e (S) iguais ou diferentes, espaçadores termoquimicamente ou fotoquimicamente reactivos ou não reactivos; em que a quinona (Q) é seleccionada do grupo constituído por compostos de quinona monoméricos, compostos de quinona diméricos e compostos de quinona oligoméricos simétricos ou assimétricos;

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contendo os referidos compostos de quinona (Q) um hidrocarboneto cíclico, ou de 2 a 10 hidrocarbonetos cíclicos fundidos, possuindo o composto de quinona referido pelo menos dois grupos carbonilo conjugados, cujo número não excede duas vezes o número dos hidrocarbonetos cíclicos fundidos; sendo o referido composto de quinona (Q) opcionalmente substituído com substituintes (R) que não resultam em impedimentos estereoquímicos para a imobilização do ligando (L) ou não estorvem o passo fotoquímico; e em que o passo fotoquímico compreende a irradiação da quinona (Q) com radiação electromagnética não ionizante possuindo um comprimento de onda na gama da luz UV à visível. O invento é baseado na surpreendente verificação de que os referidos compostos de quinona tal como definidos na reivindicação 1 podem ser usados como composto fotoquimicamente reactivo com muito bons resultados.

Os composto de quinona são conhecidos como sendo compostos fotoquimicamente reactivos, mas o seu uso como compostos de ligação fotoquimicamente reactivos nunca foi sugerido, mesmo tendo havido uma grande procura relativamente ao desenvolvimento de novos métodos para a imobilização de ligandos em superfícies de polímeros.

Compostos de quinona

Os compostos de quinona são definidos como compostos que compreendem pelo menos 2 grupos carbonilo conjugados colocados em pelo menos uma estrutura cíclica de hidrocarboneto. Tais compostos são bem conhecidos dos peritos na matéria.

As quinonas adequadas para serem usadas no método de acordo com o presente invento são a quinona, dímeros de quinona ou oligómeros de quinona, tendo estes últimos quinonas ligadas simétrica ou assimetricamente. O composto de quinona contém um hidrocarboneto cíclico, ou de 2 a 10 hidrocarbonetos cíclicos fundidos, possuindo pelo menos dois grupos carbonilo conjugados. O número de grupos carbonilo não excede duas vezes o número de hidrocarbonetos cíclicos fundidos.

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Os hidrocarbonetos cíclicos podem ser fundidos em qualquer posição isomérica. O composto de quinona é opcionalmente substituído com substituintes (R) que não resultem num impedimento estereoquímico para a imobilização do ligando (L) ou não perturbem a fotoquímica, por exemplo em que o substituinte possua um cromóforo que iniba a activação da quinona, por exemplo, por fluorescência, fosforescência, transição de menor radiação, etc.

Os hidrocarbonetos cíclicos podem, independentemente uns dos outros, ter qualquer dimensão de anel mas são preferencialmente anéis aromáticos com 5, 6, 10, 14, 18 membros de átomos de carbono que, independentemente uns dos outros, podem compreender um ou vários heteroátomos seleccionados de entre -N-, -NH-, e -0-. Os grupos carbonilo conjugados podem estar localizados em qualquer posição desde que a estrutura quinóide seja mantida.

Compostos de quinona básicos aplicáveis

As ilustrações de compostos de quinona básicos aplicáveis são mostrados na Fig. 1, em que os compostos I-XXXVI podem ser substituídos com um ou mais substituintes R definidos abaixo.

Quinonas particularmente preferidas

As quinonas particularmente preferidas são reivindicadas nas reivindicações 3 e 4.

Na concretização preferida, possuindo as fórmulas gerais (XXXVII), (XXXVIII) e (XXXIX), também mostrada na Fig. 2, as letras m, n e o designam 0 ou números de 1-8, sendo a soma de m, n e o igual a 8 ou inferior; 1 indica 0 ou um número de 1 a 2 vezes n; r e q indicam 0, 1 ou 2; k indica 0 ou um número de 1 a 2 vezes m; e t indica 0 ou um número de 1 a 2 vezes o. É preferido que a soma de m, n e o seja 8 ou inferior. R designa substituintes tal como definido a seguir.

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Os substituintes são seleccionados independentemente uns dos outros. Preferencialmente a soma total do número de substituintes (l + r + k + q + t)é inferior ao número de compostos hidrocarbonetos cíclicos fundidos.

Especificamente as quinonas preferidas são seleccionadas do grupo constituído por: antraquinonas (V, VI, VII, X, XI, XIII, XXVIII), fenantrenoquinonas (VIII, IX, ΧΠ), benzoquinonas (I, II), naftoquinonas (III, IV, XXVII) e o composto (XXVI, XXIX), particularmente antraquinonas, fenantrenoquinonas, e o composto (XXVI).

Substituintes R A escolha dos substituintes é importante para controlar a solubilidade da quinona e a afinidade global da quinona ao longo da superfície do material; por exemplo, a introdução de substituintes carregados melhorará a solubilidade em água e também aumentará ou diminuirá a afinidade nas superfícies de materiais carregadas através de interacções iónicas atractivas ou repulsivas. Deste modo, os substituintes R podem ser seleccionados em relação ao carácter hidrófobo/hidrófílo óptimo que depende do sistema e do solvente em que o passo fotorreactivo tem lugar. Optimizadamente, o composto de quinona é parcialmente solúvel no solvente.

As quinonas são preferencialmente substituídas com um certo número de substituintes que são em número inferior a três vezes o número de hidrocarbonetos cíclicos fundidos, mas estas podem, contudo, ser completamente saturadas com substituintes, desde que a estrutura quinóide seja mantida.

Especificamente os substituintes (R) podem eles próprios ser quinonas.

Os substituintes R úteis podem, independentemente uns dos outros, ser seleccionados do grupo constituído por: grupos funcionais compreendendo -NO,, -S03\ -SO,\ -CN, -P032', -PO,', -COOH, halogéneo, ou seja -F, -Cl, -Br, -I, aminas primárias, aminas secundárias e aminas terciárias, ou derivados destes; e hidrocarbilos que podem ser substituídos com: -NO,, -S03~, -CN, -P032', -P02\ -COOH, halogéneo, ou seja -F, -Cl, -Br, -I, epóxido, e -H;

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ΕΡ 0 820 483 / PT os referidos hidrocarbilos compreendendo alquilos tendo de 1-30 átomos de C, alcenilo tendo de 1-30 átomos de C, alcinilo tendo de 1-30 átomos de C, arilo tendo de 6-50 átomos de C, preferencialmente 6-18 átomos de C, e derivados destes compreendendo combinações destes com substituintes iguais ou diferentes dos grupos funcionais definidos atrás; e o referido hidrocarbilo tendo, uma cadeia linear ou ramificada, simétrica/assimétrica, quiral/aquiral; contendo um ou mais heteroátomos seleccionados do grupo consistindo de -N-, -NH-, e -O-; ou sendo sistemas aromáticos fundidos; os referidos sistemas aromáticos fundidos contendo um ou mais heteroátomos sendo heterocíclicos seleccionados do grupo consistindo de piridilo, imidazoílo, pirimidinilo, piridazinilo, quinolilo, acridinilo, imidazolilo, pirrolilo, furilo, isoxazolilo, oxazolilo, que pode ser ligado e/ou fundido em qualquer posição, e derivados destes compreendendo combinações destes com substituintes iguais ou diferentes tal como para os grupos funcionais definidos acima.

Os substituintes R preferidos são seleccionados do grupo consistindo de: grupos funcionais compreendendo -NO;, -S03\ -S02‘, -CN, -P03:\ -P02\ -COOH, halogéneo, ou seja -F, -Cl, -Br, -I, aminas primárias, aminas secundárias e aminas terciárias, ou derivados destes; e hidrocarbilos que podem ser substituídos com: -N02, -S03\ -CN, -P032‘, -P02\ -COOH, halogéneo, ou seja -F, -Cl, -Br, -I, epóxido, e -H.

Os alquilos preferidos são o metilo, o etilo, o propilo, o butilo, o pentilo, o hexilo, o heptilo, o octilo, o nonilo, o decanilo, o undecanilo, o dodecanilo, o tridecanilo, o tetradecanilo, o pentadecanilo, o hexadenanilo, o heptadecanilo, o octadecanilo, o nonadecanilo, o eicocanilo, lineares ou ramificados, com uma ou mais ligações duplas ou triplas.

Os arilos preferidos são o fenilo, o naftilo, o bifenilo, o tolilo, o benzilo, o cumenilo, o mesitilo, o xililo, o pentalenilo, o indenilo.

Radiação electromagnética não-ionizante A radiação electromagnética é escolhida de modo a activar as quinonas. E uma radiação electromagnética não ionizante possuindo um comprimento de onda na gama do UV ao visível, preferencialmente mais curto do que 700 nm.

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Normalmente, a radiação electromagnética é seleccionada com uma banda de comprimentos de onda na gama de 15 a 50 nm à volta de um comprimento de onda central. Esta banda de comprimentos de onda é escolhida de modo a ser capaz de activar as quinonas com a radiação electromagnética proporcionado uma absorção máxima dos cromóforos das quinonas. A luz UV possui um comprimento de onda do UV ao visível de modo a minimizar a interacção da luz com grupos funcionais e ligandos sensíveis ou biomoléculas covalentemente ligadas às quinonas, sendo tais grupos tipicamente sensíveis à radiação electromagnética possuindo comprimentos de onda mais curtos do que os UV, com o que são destruídos. É deste modo possível seleccionar uma radiação electromagnética possuindo um comprimento de onda na gama larga dos comprimentos de onda em que as quinonas absorvem radiação electromagnética cuja radiação seleccionada activa especificamente o grupo de interesse fotoquimicamente activo.

Além disto, as propriedades especiais de absorção das quinonas atrás mencionadas, a alta eficiência na imobilização fotoinduzida dos ligandos observada com este invento, podem em parte ser explicados pelo facto de o estado reactivo da quinona (ηπ*) ser obtido com um rendimento muito elevado sob excitação em toda a gama de absorção.

Normalmente, a luz contínua incoerente será escolhida para activar as fotossondas. Mas a aplicação de fontes de luz mais complicadas como a luz monocromática, polarizada, pulsada ou coerente pode ser usada.

Nos exemplos descritos mais adiante, foi usada uma lâmpada HPA da Philips como fonte emissora de luz. Tais lâmpadas HPA são lâmpadas de halogeneto metálico tubulares de média pressão com aditivos de ferro e cobalto.

As lâmpadas emitem luz UV não ionizante de 250 a 400 nm (correspondente aos UV-A e UV-B de grande comprimento de onda, principalmente 300-400 nm), e a luz visível de 400 a 700 nm, o que toma as lâmpadas adequadas para serem usadas no presente método.

Os tempos de irradiação são seleccionados de modo a obter um rendimento suficiente sem se degradar o ligando (L) imobilizado ou a superfície do material contendo carbono (P). O tempo de irradiação é geralmente mais curto do que 12 horas, preferencialmente menos de 200 minutos, mais preferencialmente menos de 60 minutos, o mais preferível menos de 30 minutos.

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Lisandos Ο ligando (L) é definido como um composto de modificação de superfície que após a imobilização na superfície do polímero proporciona à superfície do polímero uma nova característica de superfície. O ligando (L) pode ser um grupo funcional tal como: -COOH (ácidos carboxílicos), derivados do ácido sulfónico, -COOR’ (ésteres, incluindo ésteres activos), -COX’ (halogenetos ácidos, fluoretos ácidos e cloretos ácidos, azidas ácidas ou derivados de ácidos carboxílicos activos semelhantes), -CONHNH, (hidrazidas ácidas), -NHCONHNH, (semicarbazidas), -NHCSNHNH, (tiosemicarbazidas), -CN (nitrilos), -CHO (aldeídos), R’R”CO (cetonas), -OH (álcoois), -SH (tióis), -SSR’ (dissulfuretos), -NH2, =NH, sNH (aminas, incluindo aminas primárias, secundárias e terciárias), -ΝΗΝΉ, (hidrazinas), -OR’ (éteres), epóxidos, -SR’ (sulfuretos), -X (halogenetos: fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto), -NO;, -CH3. O ligando pode também ser uma molécula biologicamente activa tal como a biotina, toxinas, herbicidas, pesticidas, hidratos de carbono, antibióticos (por exemplo, penicilinas e outras drogas, por exemplo venenos celulares), esteróides, péptidos, nucleótidos, péptidos de ácidos nucleicos (PNA) e parceiros de ligação de ácidos nucleicos, proteínas e haptenos, grupos funcionais (ou derivados destes) ou grupos não funcionais, tais como o metilo, o etilo, o isobutilo, o terc-butilo, ou aromatos. Estes grupos não funcionais podem por exemplo ser usados para melhorar a biocompatibilidade de lentes de contacto, implantes, etc.

Esvacador

Os espaçadores (S,) ou (S) são geralmente escolhidos no que respeita ao comprimento, flexibilidade, carácter hidrófobo/hidrófilo para cada característica específica da nova superfície. O espaçador (S,) ou (S) é um composto para conferir distância, termoquimicamente ou fotoquimicamente não activo.

Opcionalmente, o ligando é ligado às superfícies de polímero através de um espaçador, cuja única função é a de dar espaço entre os dois e deste modo tomar a imobilização mais fácil, particularmente quando o ligando é uma molécula grande. O

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ΕΡ 0 820 483 / PT 12 espaçador também proporciona que mais ligandos sejam imobilizados na superfície do polímero. O comprimento do espaçador é seleccionado com um propósito específico. Geralmente, o comprimento é inferior a ou cerca de 400 À. Nalgumas aplicações, é preferencialmente menos a cerca de 100 Â. No caso de comprimentos maiores do espaçador é preferível ligar mais ligandos a cada unidade de espaçador. O espaçador é também seleccionado no que respeita ao seu carácter hidrófobo/hidrófilo. Se por exemplo, o espaçador liga a quinona ao ligando antes da fotorreacção do polímero, é muito importante optimizar o carácter hidrófobo/hidrófilo da molécula total Q-S-L de modo a obterem-se condições óptimas de reacção dependendo também do solvente no passo fotorreactivo.

Exemplos de espaçadores são os grupos alquilo C,-C20, por exemplo polimetileno, opcionalmente contendo aromáticos ou hidrocarbonetos mono ou poliinsaturados, polioxietileno tal como o polietilenoglicol, oligo/poliamidas tais como a ροΐί-β-alanina, poliglicina, polilisina, péptidos em geral, etc., oligosacáridos, oligo/polifosfatos, tais como os fosfo-mono/diéesteres, mono/diaminas etc., amidas/ésteres oligo/polisulfónicos. Além disso, o espaçador pode consistir em unidades combinadas das unidades atrás mencionadas ou unidades combinadas destes. A importância da optimização do comprimento do espaçador e outras propriedades são claramente ilustradas no Exemplo 3 em que o enxerto fotoquímico de grupos amino primários é detectado pela ligação termoquímica de biotina seguinte e a detecção de biotina imobilizada com avidina. Neste exemplo, foi usado um alongamento passo a passo do espaçador com unidades de β-alanina. A natureza de oligoamida do espaçador permitiu uma síntese fácil de cada composto usando reacções de formação de ligação amida padrão e esquemas de protecção e de desprotecção de grupos correntes. Em contraste a, por exemplo, um espaçador simples de carbono alifático, o espaçador de oligoamida é bastante rígido devido à rotação impedida à volta das ligações amida e bastante hidrofílico - mas neutro -devido à capacidade de cada ligação amida de actuar quer como dadora quer como receptora de ligações de hidrogénio. O comprimento de espaçador óptimo para este fim particular verificou-se que era o da amida do composto antraquinona 9. O aumento do comprimento do espaçador com uma ou mais unidades de β-alanina não aumentou o sinal, mas indicavam um pequeno decréscimo do sinal (dados não mostrados). Esta optimização do comprimento do espaçador para o sistema biotina-avidina é consistente com os relatos da literatura (ver

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ΕΡ 0 820 483 / PT 13 por exemplo F. Kohnen et al., Complementary Imunnoassays, página 62 (W.P. Collins ed.) John Wiley & Sons, New York, 1988).

Grupos reactivos termoquímicos

Os grupos reactivos termoquímicos (T) são bem conhecidos na arte e são definidos como grupos funcionais, que são capazes de formar ligações covalentes com as superfícies dos polímeros (P) ou ligandos (L) sob condições em que o grupo fotoquimicamente reactivo é não reactivo.

Os grupos termoquimicamente reactivos podem ser -COOH (ácidos carboxílicos), derivados do ácido sulfónico, -COOR’ (ésteres, incluindo ésteres activos), -COX’ (halogenetos ácidos, fluoretos ácidos e cloretos ácidos, azidas ácidas ou derivados de ácidos carboxílicos activos semelhantes), -CONHNH-. (hidrazidas ácidas), -NHCONHNH, (semicarbazidas), -NHCSNHNH, (tiosemicarbazidas), -CHO (aldeídos), R’R”CO (cetonas), -OH (álcoois), -X (halogenetos: fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto), -SH (tióis), -SSR’ (dissulfuretos), -ΝΉ,, =NH, =NH (aminas, incluindo aminas primárias, secundárias e terciárias), -NHNH, (hidrazinas), epóxidos, maleimidas.

Uma das maiores vantagens neste invento é a estabilidade química dos compostos de quinona. Deste modo, os grupos termoquimicamente reactivos não reagirão com as quinonas.

Isto é ilustrado na síntese da hidrazida ácida de antraquinona (composto 12, Exemplo l) e da tiosemicarbazida de antraquinona (composto 15, Exemplo 1). Usando as benzofenonas como grupo termoquimicamente reactivo, a síntese de tais compostos seria impossível, porque a hidrazida ácida ou a tiosemicarbazida condensariam com o grupo carbonilo na benzofenona, originando quer compostos cíclicos quer oligómeros.

Superfície de material contendo carbono É preferido que a superfície de material contendo carbono seja a superfície de um polímero. O polímero pode ser qualquer tipo de polímero. Os polímeros particularmente preferidos são seleccionados do grupo constituído por: polímeros sintéticos e naturais tais como o poliestireno, o polietileno, o poli(acetato de vinilo), o poli(cloreto de vinilo), a

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ΕΡ 0 820 483 / PT polivinilpirrolidona, o poliacrilonitrilo, o poli(metacrilato de metilo), o politetrafluoroetileno, o policarbonato, o poli-4-metilpentileno, o poliéster, o polipropileno, a celulose, a nitrocelulose, o amido, os polissacáridos, a borracha natural, a borracha butílica, a borracha de estireno-butadieno, a borracha de sílicone. O material contendo carbono pode também ser seleccionado do grupo consistindo de; materiais pré-modificados, a sílica, o vidro, o vidro poroso controlado, a sílica gel, ou metal, materiais esses que tenham sido pré-modificados para conter carbono; os filmes monocamada ou multicamada; os filmes de Langmuir-Blodgett; as membranas biológicas; os polímeros naturais ou sintéticos revestidos com material biológico ou orgânico.

As superfícies dos polímeros podem, por exemplo, ser pré-modificadas através de, por exemplo, um tratamento de coroa, um tratamento de iluminação-γ e sililação. Tal tratamento pode aumentar a reactividade do polímero e/ou modificar o carácter hidrófobo ou hidrófilo da superfície. O material contendo carbono pode também ser uma sílica, um vidro, um vidro poroso controlado, ou um metal que tenha sido pré-modifícado para conter carbono, por exemplo, por sililação de modo a tomar a superfície capaz de formas ligações covalentes com outros compostos, ou seja, um composto de quinona ou um composto termoquimicamente reactivo. A seguir, a superfície de material sólido contendo carbono é descrita como a “superfície do polímero” ou “substrato”. Contudo, é entendido que as superfícies de não polímero atrás mencionadas podem também ser tratadas. Métodos de preparação preferidos

Os métodos de preparação preferidos para levar a cabo o invento são definidos nas reivindicações 11-16, em que os compostos respectivos estão ligados uns aos outros num certo número de maneiras.

Um perito na arte saberá que o método poderá ser efectuado por muitos outras maneiras dentro do domínio do invento.

As concretizações preferidas e ilustrativas (a)-(f) do invento compreendem os seguintes passos de reacção: 15 85 700

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a) Passo 1: Q + L —» Q-L (Passo fotorreactivo) (Passo fotorreactivo) (Passo fotorreactivo) (Passo fotorreactivo)

Passo 2: Q-L + P -> P-Q-L

b) Passo 1: Q + S —» Q-S

Passo 2: Q-S + L —> Q-S-L Passo 3: Q-S-L τ P -> P-Q-S-L

c) Passo 1: P + Q —> P-Q

Passo 2: P-Q + L -» P-Q-L d) Passo 1: P-r S,-> P-S,

Passo 2: P-S, + Q -> P-S,-Q Passo 3: P-S,-Q + L -»· P-S,-Q-L

e) Passo 1: Q + T —» Q-T

Passo 2: Q-T + P -> P-Q-T (Passo fotorreactivo)

Passo 3: P-Q-T + L P-Q-T-L

f) Passo 1: Q + S —> Q-S Passo 2: Q-S + T Q-S-T Passo 3: Q-S-T + P -> P-Q-S-T

Passo 4: P-Q-S-T + L -> P-Q-S-T-L (Passo fotorreactivo)

Na concretização (f) a ordem da reacção de S e T pode ser invertida nos passos 1 e 2.

Passo fotorreactivo O passo fotorreactivo pode ser efectuado tal como descrito nos Exemplos, e as reacções termoquímicas podem ser efectuadas usando procedimentos sintéticos correntes tal como é sabido pelos peritos na matéria.

Lisacão auinona-lizando Q pode ser ligada ao L através de quaisquer métodos sintéticos de ligação de compostos semelhantes. A ligação obtida é preferencialmente uma ligação covalente tal como uma ligação C-C, uma ligação através derivados ácidos (por exemplo, éster, amida, etc.), uma ligação éter, uma amina, um sulfureto ou uma ligação dissulfureto. A reacção é

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efectuada no seio de um solvente adequado. Após se ter terminado a reacção, o solvente pode ser removido, por exemplo por evaporação, decantação e filtração, ou o solvente pode ser substituído por outro solvente que seja mais adequado para a fotorreacçào seguinte, em que Q-L é ligado a P. Esta reacção é preferencialmente efectuada no seio de um solvente aquoso, em que Q-L é levado a contacto com P. O ligando L pode ser protegido com um ou mais grupos protectores durante a fotorreacçào. Os grupos de protecção podem ser seleccionados de modo a mascarar as funcionalidades sensíveis do ligando durante o passo fotoquímico, e deste modo o ligando pode tomar-se não mascarado num passo subsequente após a foto imobilização. O solvente é, de modo optimizado, o mesmo em todos os passos de ligação dos compostos.

Lieacão covalente A reacção envolvida na formação de ligações covalentes pode ser seleccionada de entre os procedimentos padrão sintéticos conhecidos dos peritos na arte, por exemplo síntese orgânica corrente, síntese de péptidos, síntese de oligonucleótidos e áreas afins. Quando se usam intermediários possuindo múltiplos grupos funcionais, grupos de protecção semipermanentes e/ou transientes adequados podem ser escolhidos para mascarar grupos funcionais seleccionados, permitindo deste modo uma síntese regiosselectiva da molécula Q-L e Q-S-L. Para técnicas bem conhecidas de protecção de funcionalidades ver T. W. Greene e P. G. M. Wuts, “Protective Groups in Organic Svnthesis ”, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1991.

Uma síntese ilustrativa de molécula Q-L e Q-S-L incluindo a selecção de reacções de formação de ligações e a selecção de grupos protectores adequados são ilustrados no Exemplo 1.

Solvente O solvente usado no passo fotoquímico é preferencialmente um meio aquoso ou um meio aquoso contendo até 10% v/v de solvente orgânico, preferencialmente até 5% v/v de solvente orgânico. Pode ser usado um solvente orgânico tal como o tetraclorometano e o benzeno. Contudo, alguns solventes orgânicos podem causar problemas devido à sua reactividade com, por exemplo, a quinona excitada. Também, os solventes orgânicos são mais caros e podem resultar em problemas ambientais.

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ΕΡ 0 820 483 / PT A solução em contacto com o polímero é então exposta à luz e faz-se a irradiação, opcionalmente durante um período até 200 minutos, tipicamente durante menos de 60 minutos, preferencialmente menos de 30 minutos. Esta modificação não altera as propriedades físicas do polímeros (estabilidade, resistência, transparência, etc.). A solução, preferencialmente uma solução aquosa, em que se dá lugar a uma ligação covalente, é frequentemente tamponada. Isto é efectuado para se manter um pH definido durante a reacção e para se assegurar que certos grupos são iónicos. O valor de pH está preferencialmente na gama de 0-7 ou na gama de 7-12. O valor óptimo de pH é altamente dependente da reacção específica e dos compostos envolvidos. Quando são ligadas aminas, o pH é preferencialmente inferior a 8 para protonar a funcionalidade amino. Ao fazer isto, o reagente será facilmente solubilizado em água em conjunto com a quinona na outra parte do composto, e o reagente como um todo reage como um sabão. Isto significa que a parte quinona lipofílica adere ao polímero, e o grupo amino polar apontará para o solvente. Quando, por exemplo, são imobilizados grupos carboxi, o pH será preferencialmente superior a 6 para se obter o mesmo efeito. Quando se usam sistemas aquosos, esta polaridade diferencial do reagente como um todo é importante para a imobilização fotoquímica.

Outras vantagens

Ao contrário das benzofenonas, as propriedades redox especiais das quinonas permitem quinonas reduzidas globais que se podem formar durante a fotólise e que não estão covalentemente ligadas à superfície a ser “reciclada” tal como ilustrado na Fig. 3.

Este sistema de reciclagem aumenta a eficiência da ligação fotoquímica global. A elevada eficiência do método de acordo com o invento e as descobertas surpreendentes de que os conjugados quinonas-ligando podem ser fotoquimicamente imobilizados em diferentes polímeros pode ser parcialmente explicada por esta interessante reciclagem e “conservação” das fotossondas (os compostos fotoquímicos que vão ser sujeitos a uma reacção fotoquímica).

Tal como mencionado atrás, as quinonas excitadas reagem em reacções de radicais. O passo inicial é em geral a abstracção de um átomo de hidrogénio e a velocidade da reacção é determinada pela energia de ligação da ligação covalente entre o hidrogénio e o carbono ao qual está ligado. Este mecanismo da reacção tem como consequência que as quinonas excitadas não são capazes de reagir com água o que o que tem a ver com a forte ligação dos átomos de hidrogénio. Em consequência, ao usar água como solvente é possível gerar espécies extremamente reactivas que não são capazes de reagir com o solvente.

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Utilizações preferidas

Os usos preferidos para o material contendo carbono de acordo com o método deste invento compreende o uso num sistema de detecção, usado como portador para os ensaios imunológicos de fase sólida, particularmente assim como placas, partículas de teste tais como leitos e microesferas, tubos de ensaio, varetas de teste, fitas de teste, e o uso como portador para a síntese em fase sólida de péptidos, oligonucleótidos, hidratos de carbono e pequenas moléculas orgânicas. 3. Breve descrição dos desenhos A Fig. 1 mostra ilustrações de compostos básicos de quinona (I)-(XXXVI) de acordo com o invento. A Fig. 2 mostra quinonas (XXXVII)-(XXXIX) particularmente preferidas de acordo com o invento. A Fig. 3 mostra uma ilustração da reciclagem das quinonas reduzidas. A Fig. 4 ilustra a reacção fotoquímica das arilazidas. A Fig. 5 ilustra a reacção fotoquímica da benzofenona. A Fig. 6 ilustra as propriedades fotoquímicas das quinonas deste invento. A Fig. 7 mostra os compostos quinona-ligando, quinona-espaçador-ligando n°s 1-22 preparados no Exemplo 1. A Fig. 8a mostra um enxerto por UV do composto de fenantrenoquinonamina n° 3 em superfícies de poliestireno (Polysorp®). Efeitos da concentração de fotossondas e tempo de irradiação. 0 n° irradiação UV (controlo); 5 min. irradiação; Δ 7 min.; O 10 min. A Fig. 8b amostra um enxerto por UV do composto de fenantrenoquinonamina n° 3 em superfícies de poliestireno (Nunclon® Delta tratado). Efeitos da concentração de fotossondas e tempo de irradiação. 0 n° irradiação UV (controlo); 5 min. irradiação; Δ 7 min.; O 10 min.

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ΕΡ 0 820 483 / PT 19 A Fig. 9a mostra um enxerto por UV do composto de antraquinonamina n° 5 em superfícies de poliestireno (Polysorp®). Efeitos da concentração de fotossondas e tempo de irradiação. 0 n° irradiação UV (controlo); 5 min. irradiação; Δ 7 min.; O 10 min. A Fig. 9b amostra um enxerto por UV do composto de antraquinonamina n° 5 em superfícies de poliestireno (Nunclon® Delta tratado). Efeitos da concentração de fotossondas e tempo de irradiação. 0 n° irradiação UV (controlo); 5 min. irradiação; Δ 7 min.; O 10 min. A Fig. 10 amostra um enxerto por UV do composto de antraquinonaminas n° 5, 7 e 9 em superfícies de poliestireno. Efeitos do comprimento do espaçador na força do sinal. Símbolos não cheios: resultados em superfícies de Nucleon'® Delta tratadas; símbolos cheios: resultados em placas de Polysorb. O/· Amina 5, □/ Amina 7; Δ/A Amina 9. A Fig. 11 mostra a estabilidade ao armazenamento do composto de antraquinonamina n°9 enxertado por UV em superfícies de Nucleon® Delta tratadas. Os valores são dados em relação ao dia zero. O, temperatura de armazenamento de 4°C; Δ, 20°C;, 37°C; 0, 60°C. A Fig. 12 mostra a estabilidade ao armazenamento do composto de antraquinonamina n°9 enxertado por UV em superfícies de poliestireno PolySorp®. Os valores são dados em relação ao dia zero. O temperatura de armazenamento 4°C; Δ 20°C; 37°C; 0 60°C. A Fig. 13 mostra um enxerto por UV do composto de derivado de ácido carboxílico de antraquinona n° 13 em superfícies de poliestireno. Símbolos cheios: resultados sem irradiação UV (controlo); símbolos não cheios: resultados após 10 minutos de irradiação UV. O/· placas de PolySorp®; Δ/A placas tratadas de Nunclon® Delta. A Fig. 14 mostra um enxerto por UV do composto de péptido n° 19, antraquinona substituída terminada em N, em superfícies de poliestireno; Efeito do tempo de irradiação e da concentração de anticorpo Hyb 161-2 de antipéptido monoclonal. O 2 min de irradiação; ® 5 min.; Δ 10 min.; A 15 min.; 30 min.; 60 min. A Fig. 15 mostra um enxerto por UV do composto de péptido de antraquinona n° 19, em superfícies de poliestireno. Efeito do tempo de irradiação com uma concentração constante de anticorpo Hyb 161-2 de antipéptido monoclonal. O, ligação não específica com Hyb 161-2 adicionado; ·, Hyb 161-2 adicionado (1 mg/ml). 85 700

EP 0 820 483 / PT 20 A Fig. 16 mostra um enxerto por UV do composto de péptido n° 19, antraquinona substituída terminada em N, em superfícies de poliestireno; Efeito da concentração de péptido. Símbolos fechados: tempo de irradiação de 10 min; símbolos abertos: sem irradiação. O/· antraquinona-péptido 9; Δ/A péptido não substituído. A Fig. 17 mostra a estabilidade ao armazenamento do composto de péptido n°19 enxertado por UV. O, temperatura de armazenamento 37°C; ·, 4°C. A Fig. 18a mostra um enxerto por UV do derivado NTA de antraquinona 20 em superfícies de poliestireno. Efeito da concentração de fotossondas. Símbolos não cheios: resultados sem irradiação UV (controlo); símbolos cheios: resultados após 5 min de irradiação UV. I i

A Fig. 18b mostra um péptido biotinilado marcado com histidina em superfícies de poliestireno modificadas com NTA. 1: nenhum péptido adicionado (controlo); 2: ligação de péptido biotinilado não marcado com histidina biotina-sAhx-Leu-Lys-Leu-Lys-Trp-Lys-OH (controlo); 3: ligação de péptido biotinilado marcado com histidina biotina-eAhx-Leu-Lys-Leu-Lvs-Trp-Lvs-His-His-His-His-His-His-QH: 4: ligação de péptido biotinilado não marcado com histidina biotina-sAhx-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Lys-Asn-Ile-Vai-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-OH (controlo). A Fig. 19 mostra um enxerto por UV do derivado PEG2000 de antraquinona 22 em superfícies de poliestireno. PS063: 0,3 mM de fotossonda, 5 min de irradiação UV; PS064: 0,3 mM de fotossonda, sem irradiação de UV (controlo); PS065: 0,3 mM de fotossonda, 5 min de irradiação UV (controlo); PS066: 0,3 mM de PEG2000, sem irradiação de UV (controlo); PS067: H:0 só, 5 min de irradiação UV (controlo); PS068: H20 só, sem irradiação de UV (controlo). A Fig. 20 mostra um enxerto por UV do derivado PEG2000 de antraquinona 22 em superfícies de polipropileno. PP011: 0,3 mM de fotossonda, 5 min de irradiação UV; PP012 0,3 mM de fotossonda, sem irradiação de UV (controlo); PP013 H,0 só, sem irradiação de UV (controlo).

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ΕΡ 0 820 483 / PT 21 4, Descrição detalhada

Reaccão fotoauímica de arilazidas da arte precedente A reacção fotoquímica das arilazidas e dos derivados destes é ilustrada na Fig. 4. Nu-H é por exemplo H20, R-OH, R-SH, R-NH: ou “polímero”. Quando irradiado com luz ultra-violeta de alta energia, ou seja, tal como na Tabela 1 no Exemplo 2, é formado um nitreno muito reactivo e é rapidamente rearranjado numa desidroazepina. Esta última é extremamente instável e reagirá imediatamente com o primeiro composto nucleofílico que encontrar. Se este é o solvente, por exemplo água, o foto-reagente é perdido e não se dá a reacção com o polímero. Quando se usam tais reagentes, é deste modo necessário que a superfície seja pré-incubada com o foto-reagente, após o que o reagente em excesso é removido e a superfície é seca antes da fotólise. Quando se introduzem grupos receptores de electrões fortes o mecanismo fotoquímico pode ser modificado numa reacção fotoquímica de nitreno, mas o composto de nitreno também reagirá com o solvente, incluindo água. Combinado com tempos de irradiação longos (tipicamente 12 horas), isto toma a aplicação deste grupo foto-reactivo consumidora de tempo e ineficaz.

Reaccão fotoquímica de cetonas da arte precedente A maior desvantagem das cetonas reactivas fotoquímicas é a sua redução fotoquímica no correspondente álcool, resultando numa perda de reagente fotoquímico. Estas também requerem longos tempos de irradiação, tipicamente de 12 horas, o que as toma inadequadas para imobilização de biomoléculas sensíveis.

Reaccão fotoauímica de benzofenona da arte precedente A fotoquímica das benzofenonas resulta na formação de uma ligação C-C ao contrário das quinonas que podem formar uma ligação éter. Ambos os grupos possuem a vantagem de não serem reactivos com a água. Por isso, a água pode ser usada como solvente. A reacção fotoquímica da benzofenona e derivados desta é ilustrado na Fig. 5, em que R designa o polímero.

Tal grupo fotorreactivo com base na benzofenona forma um radical por excitação com luz UV de alta energia seguindo-se a abstracção de um átomo de hidrogénio de um substrato, radical que se combina quer com o radical do substrato formado do produto ou o

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ΕΡ 0 820 483 / PT 22 radical que abstrai outro átomo de hidrogénio do substrato, o que resulta numa redução fotoquímica no álcool correspondente com uma consequente perda de fotorreagente. Os substratos para estas reacções são moléculas orgânicas, incluindo polímeros sintéticos, mas também solventes orgânicos tais como por exemplo álcoois. A ligação fotoquímica requer tipicamente uma irradiação a 320 nm durante 12 horas para se obter uma ligação eficaz ao polímero.

Propriedades fotoauímicas das quinonas deste invento A quinona excitada reage em geral como um radical livre e resulta na adição a ligações duplas/triplas, abstracção de átomos de hidrogénio, iniciação de reacções em cadeia, etc. Devido à configuração de ressonância da quinona, a reacção do radical pode ocorrer em ambos ou todos os grupos carbonilo da quinona tal como ilustrado na Fig. 6.

Estes padrões de reacção são as propriedades fotoquímicas fundamentais das quinonas deste invento. Devido ao seu comportamento em geral a maioria das quinonas será capaz de executar este tipo de química. 5. Exemplos A seguir o invento é ainda descrito com referência a um número específico de exemplos. AQ: antraquinona BOP: hexafluorofosfato de benzotriazolo- l-il-N-oxitris-(dimetilamino)fosfónio But: terc-butilo DCC: diciclo-hexilcarbodiimida DCU: diciclo-hexilureia DIEA: diisopropiletilamina DMF: dimetilformamida DMSO: sulfóxido de dimetilo EI: ionização de electrões ELISA: ensaio imunossorvente de enzima ligada FAB: bombardeamento rápido de átomos Fmoc: fluorenilmetoxicarbonilo HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência

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Pf: ponto de fusão MS: espectrometria de massa NMR: ressonância magnética nuclear NTA: ácido N-nitrilotriacético OPD: dicloridrato de fenileno-l,2-diamina PEG: polietilenoglicol

Pmc: 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo TFA: ácido trifluoroacético THF: tetra-hidrofurano TLC: cromatografía em camada fina

Exemplo 1 A Fig. 7 mostra os compostos quinona-ligando, quinona-espaçador-ligando n° 1-22 que foram sintetizados tal como descrito a seguir.

As diaminas mono-Boc-protegidas foram preparadas tal como descrito por Krapcho e Kuell, Synthetic Communications 1990, 20, 2559-2564. 3-Carboxifenantrenoquinona (Composto n°l) O 3-acilfenantreno (5 g, 0,23 mmol) foi dissolvido em ácido acético quente (100 ml, 60°C) e foi adicionado óxido de crómio (VI) (30 g, 0,6 mol) em pequenas porções. Durante isto a temperatura foi elevada até ao ponto de ebulição. Após adição de todo o óxido de crómio (VI) a solução foi diluída com água (500 ml) e o precipitado foi retirado por filtração, lavou-se com ácido acético/H,0 (1:1), ácido acético frio e finalmente com éter dietílico. Rendimento: 2,1 g (37% de 3-acetilfenantreno); Pf: 280°C. MS (EI): 252 (M+). Ή NMR (d6-DMSO): 8,70 ppm (s, 1H), 8,34 (d, 1H), 8,08 (m, 3H), 7,80 (t, 1H), 7,57 (t, 1H). N-G-Boc-aminopropilVfenantrenoauinona-3-carboxamida (Composto n° 2) O Composto n°l (250 mg, 1,0 mmol), DCC (245 mg, 1,2 mmol) e HODhbt (178 mg, 1,1 mmol) foram dissolvidos em dioxano (50 ml), e a mistura foi deixada a reagir durante a noite. O dioxano foi evaporado sob vácuo, e o resíduo foi suspenso em DMF (25 ml). Mono-Boc-l,3-propanodiamina.HCl (333 mg, 1,2 mmol) foi adicionado à suspensão seguido de um

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excesso de trietilamina (1 ml). Após 1 hora a DCU foi filtrada e adicionou-se água (150 ml). O precipitado amarelo foi recolhido por filtração e o produto foi recristalizado a partir de acetato de etilo. Rendimento: 0,235 mg (56% a partir do Composto n°l); Pf: 195°C (dec.). Ή NMR (d6-DMSO): 8,02 ppm (t, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,51-7,45 (m, 2H), 7,33 (d, 1H), 7,14 (t, 1H), 6,89 (t, 1H), 5,62 (b, 1H), 2,89-2,71 (m, 2H), 2,44-2,41 (m, 2H), 1,11-0,75 (m, 11H). N-íS-aminopropill-fenentrenoquinona-S-carboxamida.HCl (Composto n° 3) O Composto n°2 (100 mg, 0,24 mmol) foi dissolvido em ácido acético ligeiramente aquecido (2,5 ml, 50°C), e foi adicionado HC11M em ácido acético (2,5 ml). Após 5 minutos adicionou-se éter (10 ml), e o precipitado foi recolhido por filtração e foi lavado várias vezes com éter. Rendimento: 81 mg (95% a partir do Composto n°2). Ή NMR (d6-DMSO): 9,20 ppm (b, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,54 (d, 1H), 8,14-7,99 (m, 6H), 7,86 (t, 1H), 7,60 (t, 1H), 3,38 (-CH2-N-R), 2,88 (b, 2H), 1,69 (s, 2H). UV (etanol/éter): λ!ΐωχ = 266 nm (ε = 39000), 330 (5700), 424 (1400). N-(3-Boc-aminopropilVantraauinona-2-carboxamida (Composto n°41 O ácido antraquinona-2-carboxílico (2,52 g, 10 mmol) foi suspenso em THF seco (100 ml). A suspensão foi arrefecida até 0°C, e adicionou-se DCC (2,06 g, 10 mmol), e a mistura foi agitada durante 5 minutos. HODhbt sólido (1,63 g, 10 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante 10 minutos a 0°C e então à temperatura ambiente durante a noite. O THF foi removido sob vácuo (40°C), e o resíduo sólido foi ressuspenso em DMF (100 ml). Mono-Boc-l,3-propanodiamina.HCl (4,21 g, 20 mmol) foi adicionado à suspensão seguido de um excesso de trietilamina (7 ml). Após 2 h, a DCU foi removida por filtração e adicionou-se água (200 ml). O precipitado amarelo foi recolhido por filtração e o produto foi recristalizado a partir de acetato de etilo (200 ml). Rendimento: 3,53 g (87% a partir do ácido antraquinona-2-carboxílico); Pf: 173-175°C; TLC (acetato de etilo): 1^= 0,61. MS (FABT): 409,1 (MH+). Ή NMR (d6-DMSO): 9,00 ppm (t, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,40 (dd, 1H), 8,30 (m, 3H), 8,05 (m, 2H), 6,90 (t, 1H), 3,40 (q, 2H), 3,10 (q, 2H), 1,80 (qn, 2H), 1,45 (s, 9H). N-(3-AminopropiP-antraauinona-2-carboxamida.HCl (Composto n°5~)

O Composto n°4 (5,92 g, 14,5 mmol) foi suspenso em metanol (200 ml). HC1 6M em metanol foi adicionado (15 ml), e a mistura foi aquecida sob refluxo durante 1 hora. A

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ΕΡ 0 820 483 / PT 25 mistura foi arrefecida a 0°C, e adicionou-se éter dietílico (200 ml). O produto precipitado foi recolhido por filtração e lavado várias vezes com éter. Rendimento: 3,98 g (80% a partir do Composto n°4); Pf: 250°C (dec.); TLC (1-butanol/ácido acético/água4:1:1): Rf- 0,43. MS (FABT): 309,1 (MH"). Ή NMR (d6-DMSO): 9,00 ppm (t, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,50 (dd, 1H), 8,30 (m, 3H), 8.15 (s, 3H), 8,10 (m, 2H), 3,50 (q, 2H), 2,95 (t, 2H), 1,95 (qn. 2H). UV (etanol/éter): λη,3Χ = 256 nm (ε = 49000), 332 (4700), 390 (310).

Boc-BAla-NH-fCHA-NHCO-AO (Composto n°6)

Boc-P-Ala-OH (0,605 g, 3,20 mmol) e BOP (1283 g, 2,9 mmol) foram dissolvidos em DMF (50 ml), e foi adicionada trietilamina (4 ml, 30 mmol). A mistura foi deixada a ser pré-activada durante 5 minutos antes do Composto n°5 (1,00 g, 2,90 mmol) ser adicionado numa porção. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, e o produto foi precipitado por adição de água (50 ml). O produto em bruto foi filtrado, lavado uma série de vezes com água, e finalmente recristalizado partir de etanol/água. Rendimento: 1,0 g (92% a partir do Composto n°5); Pf: 178-179°C, TLC (acetato de etilo/metanol/ácido acético 85:10:5): Rf = 0,73. MS (FAB+): 480,2 (MH"). Ή NMR (d6-DMSO): 9,00 ppm (t, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,40 (dd, 1H), 8,35 (m, 3H), 8,05 (m, 2H), 7,90 (t, 1H), 6,80 (t, 1H), 3,40 (q, 2H), 3,20 (q, 4H), 2,30 (t, 2H), 1,75 (qn, 2H), 1,45 (s, 9H).

Boc-6Ala-NH-ÍCHA:-NHCO-AO.HCl (Composto n°7) O Composto n°6 (0,220 g, 2,54 mmol) foi suspenso em metanol (40 ml). Foi adicionado HC1 6M em metanol (5 ml), e a mistura foi aquecida sob refluxo durante 1 hora. A mistura foi arrefecida a 0°C, e adicionou-se éter dietílico (40 ml). O produto precipitado foi recolhido por filtração e lavado várias vezes com éter. Rendimento: 0,970 g (92% a partir do Composto n°6); Pf: 219°C (dec.), TLC (1-butanol/ácido acético/água 4:1:1): R^: 0,40. MS (FAB+): 380,1 (MH"). Ή NMR (d6-DMSO): 9,10 ppm (t, IH), 8,75 (s, 1H), 8,45 (dd, 1H), 8,35 (m, 4H), 8.15 (s, 3H), 8,10 (m, 2H), 3,45 (m, 4H), 3,25 (q, 2H), 3,10 (t, 2H), 1,80 (q, 2H).

Boc-BAla-BAla -NH-(CHA,-NHCO-AO (Composto n°8) O Composto n°7 (0,492 g, 2,60 mmol) e BOP (0,955 g, 2,16 mmol) foram dissolvidos em DMF (80 ml), e foi adicionada trietilamina (1,5 ml, 10,8 mmol). A mistura 26 85 700

ΕΡ 0 820 483 / PT foi deixada a ser pré-activada durante 5 minutos antes do Composto n°7 (0,900 g, 2,16 mmol) ser adicionado numa porção. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, e o produto foi precipitado por adição de água (80 ml). O produto em bruto foi filtrado, lavado uma série de vezes com água, e finalmente recristalizado a partir de etanol/água. Rendimento: 0,740 g (62% a partir do Composto n°7); Pf: 183-184°C, TLC (acetato de etilo/metanol/ácido acético 85:10:5): R,·= 0,45. MS (FAB+): 551,3 (MH'). Ή NMR (d6-DMSO): 9.05 ppm (t, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,30 (m, 4H), 8,10 (m, 2H), 7.90 (dt, 2H), 6,75 (t, 1H), 3,40 (q, 2H), 3,35 (q, 2H), 3,20 (dq, 4H), 2,30 (dt, 4H), 1,80 (qn, 2H), 1,45 (s, 9H).

Boc-BAla-BAla -NH-(CHO,-NHCO-AO.HC1 íComposto n°9) O Composto n°8 (0,740 g, 1,35 mmol) foi suspenso em metanol (15 ml). Foi adicionado HC1 6M em metanol (1 ml), e a mistura foi aquecida sob refluxo durante 1 hora. A mistura foi arrefecida a 0°C, e adicionou-se éter dietílico (15 ml). O produto precipitado foi recolhido por filtração e lavado várias vezes com éter. Rendimento: 0,591 g (90% a partir do Composto n°6); Pf: 216-219°C, TLC (1-butanol/ácido acético/água 4:1:1): R/. 0,26. MS (FAB'): 451,1 (MH'). 'H NMR (d6-DMSO): 9,00 ppm (t, 1H), 8,60 (d, 1H), 8,35 (dd, 4H), 8,30 (d, 1H), 8,25 (m, 2H), 8,15 (t, 1H), 7,95 (m, 3H), 7,S0 (s, 3H), 3,30 (m, 6H), 3,15 (q, 2H), 2,50 (t, 2H), 2,30 (t, 2H), 1,75 (qn, 2H).

Boc-BAla-BAla -BAla -NH-ÍCH:):-NHCO-AO (Composto n°10) O Composto n°9 (0,263 g, 1,39 mmol) e BOP (0,513 g, 1,16 mmol) foram dissolvidos em DMF (50 ml), e foi adicionada diisopropilamina (2 ml, 12 mmol). A mistura foi deixada a ser pré-activada durante 5 minutos antes do Composto n°9 (0,564 g, 1,16 mmol) ser adicionado numa porção. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, e o produto foi precipitado por adição de água (50 ml). O produto em bmto foi filtrado, lavado uma série de vezes com água, e finalmente recristalizado partir de etanol/água. Rendimento: 0,654 g (91% a partir do Composto n°9); Pf: 209-213°C, TLC (metanol): Rf = 0,60. MS (FAB"): 622,2 (MH"). Ή NMR (ds-DMSO): 9,05 ppm (t, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,30 (m, 4H), 8,10 (m, 2H), 8,00 (dt, 2H), 7,90 (t, 1H), 6,80 (t, 1H), 3,30 (dq, 6H), 3,20 (dq, 4H), 2,30 (tt, 6H), 1,80 (qn, 2H), 1,45 (s, 9H).

85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT 27

H-BAla-BAla-BAla-NH-fCH.L-NHCO-AO.HCl (Composto n0ll) O Composto n°10 (0,500 g, 0,800 mmol) foi suspenso em metanol (15 ml). Foi adicionado HC1 6M em metanol (1 ml), e a mistura foi aquecida sob refluxo durante 1 hora. A mistura foi arrefecida a 0°C, e adicionou-se éter dietílico (15 ml). O produto precipitado foi recolhido por filtração e lavado várias vezes com éter. Rendimento: 0,400 g (89% a partir do composto n" 10); Pf: 235-237°C (dec.); TLC: (1-butanol/ácido acético/água 4:1:1): Rf = 0,14. MS (FAB"): 522,1 (MHr). Ή NMR (d6-DMSO): 9,00 ppm (t, 1H), 8,65 (d. 1H), 8,30 (d, 1H), 8,25 (m, 2H),

2,50 (t, 2H), 2,30 (dt, 4H), 1,70 (qn, 2H). N-(5-carboximetilpentil)antraauinona-2-carboxamida (Composto n°12) O ácido antraquinona-2-carboxílico (2,52 g, 10 mmol) foi suspenso em THF seco (100 ml) e arrefeceu-se a 0°C. Então, foi adicionada DCC (2,26 g, 11 mmol), e a mistura foi agitada durante 5 minutos. HODhbt sólido (1,63 g, 10 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante 10 minutos a 0°C e então à temperatura ambiente durante a noite. O THF foi removido sob vácuo, e o resíduo sólido foi ressuspenso em DMF (100 ml). Ester metílico do ácido 6-amino-hexanóico.HCl (1,99 g, 11 mmol) seguido de trietilamina (7 ml, 50 mmol) foi adicionado à mistura, agitada à temperatura ambiente durante a noite. A DCU foi removida por filtração e o produto foi precipitado por adição de água (200 ml). O produto em bruto foi recolhido por filtração e o produto foi recristalizado a partir de acetato de etilo. Rendimento: 3,09 g (73% a partir do ácido antraquinona-2-carboxílico); Pf: 144-145°C; TLC (acetato de etilo): Rf = 0,68. MS (FAB+): 380,1 (MH"). Ή NMR (d6-DMSO): 9,00 ppm (t, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,40 (dd, 1H), 8,30 (m, 3H), 8,05 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,40 (q, 2H), 2,40 (t, 2H), 1,70 (qn, 6H), 1,40 (qn, 4H). N-(5-carboxipentil')antraQuinona-2-carboxamida (Composto n°13) O Composto n°12 (0,949 g, 2,5 mmol) foi suspenso em THF (15 ml). Foi adicionado LiOH 0,5M (15 ml), e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. O THF foi removido sob vácuo e o produto foi precipitado por adição de HC1 2M (6 ml). O produto em bruto foi recolhido por filtração, lavado com água e seco sob vácuo. Rendimento: 0,822 g (90% a partir do Composto n°12); Pf: 198-199°C; TLC (éter de petróleo/acetato de etilo/ácido acético 5:5:1): Rf = 0,43. MS (FAB"): 366,2 (MH+).

85 700 ΕΡ 0 820483 /PT 28

Ή NMR (d6-DMSO): 12,00 ppm (s, 1H), 9,00 (t, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,40 (dd, 1H), 8,35 (m, 3H), 8,00 (m, 2H), 2,30 (t, 2H), 1,60 (qn, 6H), 1.40 (qn, 4H). N-(6-hidrazido-hexil)-antraquinona-2-carboxamida (Composto n°14) O Composto n°12 (0,5 g, 1,32 mmol) foi suspenso em metanol (5 ml). Foi adicionado hidrato de hidrazina (1 ml, 20 mmol) numa porção, e a mistura reaccional foi refluxada durante 6 horas e então arrefecida até à temperatura ambiente. O solvente foi removido sob vácuo, e o remanescente foi suspenso em água com gelo (20 ml). O produto precipitado foi recolhido por filtração e lavado com água e seco sob vácuo. Rendimento: 0,373 g (75% a partir do Composto n°12); Pf: 181°C (dec.); TLC (acetato de etilo/metanol 6:4): Rf = 0,48. MS (FAB+): 380,24 (MH*). l-(3-(carboxamidoantraauinona.2.il)-proDÍl)-tiosemicarbazida íComposto n°15) BOP (0,257 g, 0,58 mmol) e dissulfureto de carbono (0,35 ml, 5,8 mmol) foram dissolvidos em DMF. Então foram adicionados trietilamina (0,24 ml, 1,74 mmol) seguida do Composto sólido nu5 (0,2 g, 0,58 mmol). A mistura foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. O excesso de dissulfureto de carbono foi removido sob vácuo, e a solução foi adicionada gota a gota à solução de hidrato de hidrazina agitada arrefecida com gelo (0,5 ml, 7,8 mmol) em DMF (0,5 ml). A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, e o produto foi precipitado por adição de água com gelo (25 ml). O produto precipitado foi recolhido por filtração e lavado com água e seco sob vácuo. Rendimento: 0,164 g (74% a partir do Composto n°5); Pf: 202-205°C (dec.); TLC (acetato de etilo/metanol 6:4): Rf = 0,48. MS (FAB+): 383,1 (MH"). HOX-iCHA, CONH-(CH:):-NHCO-AO (Composto n°16) O Composto n°12 (0,45 g, 1,31 mmol) e anidrido maleico (0,19 g, 1,9 mmol) foram dissolvidos em DMF (30 ml). Foi adicionada trietilamina (1,8 ml, 13,1 mmol), e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. O produto foi precipitado por adição de HC1 0,5M em gelo (30 ml), recolhido por filtração e recristalizado a partir de etanol/água. Rendimento: 0,374 g (79% a partir do Composto n°12); TLC (acetato de etilo/metanol 6:4): Rf = 0,33. MS (FAB+): 409,1 (MH').

85 700

ΕΡ 0 820 483 / PT 29 nt-D-Glcn-Π -qo4VB-D-Glcp-1 -NtAcVtCHA-NHCQ-AO í Composto n°l 7) O Composto n°5 (0,103 g, 0,300 mmol) e mono-hidrato de maltose (0,324 mg, 0,900 mmol) foram dissolvidos em metanol seco. DIEA (70 μΐ, 0,400 mmol) foi adicionada e a mistura foi aquecida sob uma atmosfera de azoto durante a noite. A mistura foi arrefecida a 0°C, e adicionou-se anidrido acético (1 ml). Após se ter deixado em repouso durante a noite, à temperatura ambiente, o metanol foi removido sob vácuo, e o resíduo foi dissolvido em água e filtrado através de um filtro de 0,2 pm e seco por congelação. O sólido resultante foi redissolvido em água e colocado em dois cartuchos Sep-Pak Vac (C,8, 100 mg de adsorvente). A maltose livre residual foi eluída com água (2x10 ml) e o conjugado quinona-maltose foi eluído com 50% acetonitrilo/água. As ffacções combinadas acetonitrilo/água foram secas por congelação para originarem o Composto n°17 sob a forma de um pó volumoso ligeiramente amarelo. Rendimento: 0,203 g (100% a partir do composto n° 5); TLC: R,· = 0,32 (mancha maior, composto n° 17); Rt = 0,66 (mancha menor, CH3-CONH-(CH,)3-NHCO-AQ); HPLC (Delta Pak 5 μ CIS 3,9x150 mm; tampão A: 0,1% TFA em H20; tampão B: 0,1% TFA em acetonitrilo/água 9:1; gradiente; 100% A durante 2 minutos, e então um gradiente linear de 100% de A a 100% de B durante 20 minutos, e então 100% de B durante 5 minutos); Rt = 12,07 minutos (77%, 332 nm), 12,29 (5%), 12,67 (14%), 13,35 (4%, CH3-CONH-(CH2)3-NHCO-AQ). MS (FAB+): 675,25 (MH'); 717,48 (MH" + CH3-CO); 759,58 (MH" + 2 CH3-CO); 351,16 (CH3-CONH-(CH3)3-NHCO-AQ.H~). AO-CO-(CH,),-NH-6-cetoestradiol-6-(o-carboximetil)-oxima (Composto ^181 O Composto n°5 (48 mg, 0,139 mmol), 6-cetoestradiol-6-(o-carboximetil)-oxima (50 mg, 0,139 mmol) e BOP (65 mg, 0,139 mmol) foram suspensos em DMF. Foi adicionada disopropilamina (49 μΐ, 0,278 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. Foi adicionada água (3 ml), e o produto precipitado foi retirado por filtração, lavado com 10% Na,C03 (três vezes), 10% KHS04 (três vezes), várias vezes com água e finalmente seco sob vácuo. Rendimento: 90 mg (100%); TLC (acetato de etilo/ácido acético 95:5): Rf = 0,27. MS (FAB+): 650,26 (MH"); 672,28 (M+Na").

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AO-CO-sAhx-Gln-Glu-Ser-Glv-Val-Ser-Glv-Arg-OH (Composto η0!*?1)

Sintetizou-se H-Gln-Glu(OBu1)-Ser(buT)-Gly-Val-Ser(bu‘)-Gly-Arg(Pmc)-PepSyn-KA usando um protocolo Fmoc corrente, num sintetizador de péptidos de fluxo contínuo, completamente automático, feito a pedido, com uma monitorização em tempo real da fase sólida das reacções de ligação. Uma resina Fmoc-Arg(Pmc)-PepSyn-KA (750 mg, 0,09 mmol/g) foi carregada para uma coluna e cada ligação individual foi realizada com os correspondentes éster Fmoc-aminoácido-OPfp (3 equivalentes) e HODhbt (1 equivalente) adicionado como catalisador/indicador excepto a serina que foi ligada como o éster Dhbt. No final da síntese a resina peptidílica foi transferida para um dispositivo de borbulhação e adicionou-se N-(5-carboxipentil)-antraquinona-2-carboxamida (Composto n°13) (3 equivalentes) e BOP (3 equivalentes) seguido de DIEA (9 equivalentes) à resina. A ligação foi deixada a prosseguir durante a noite. O péptido substituído com quinona terminado em N foi separado da resina com o Reagente K (TFA/H20/tioanisolo/fenol/etanodietol 82,5:5:5:2,5). A resina foi removida por filtração num filtro de vidro sinterizado, lavado várias vezes com TF A, e a mistura separada foi concentrada numa corrente de azoto. O péptido foi precipitado com éter dietílico arrefecido com gelo, e o pelete de péptido foi redissolvido em 2% de ácido acético/água, filtrado através de um filtro de 0,2 μπι e finalmente seco por congelação. HPLC (Delta Pak 5 μ C,s 3,9x150 mm; tampão A: 0,1% TFA em H:0; tampão B: 0,1% TFA em acetonitrilo/água 9:1; gradiente: 100% A durante 2 minutos, e então um gradiente linear de 100% de A a 100% de B durante 20 minutos, e então 100% de B durante 5 minutos); Rt = 13,64 minutos; pureza > 90% (220 nm). MS (FAB1'): 1166,35 (ΜΕΓ). NTA-Bala-Bala-NH-fCHO,-NHCO-AO (Composto n°20) O éster glicerina-terc-butílico.HCl (3,34 g, 20 mmol) foi dissolvido em carbonato de sódio aquoso. O éster terc-butílico livre foi extractado com diclorometano (3x100 ml) e seco com carbonato de sódio. O solvente foi removido in vacuo dando origem a 2,44 g (92%) do éster terc-butílico livre. DIEA (20 ml) foi adicionada seguido de 2-bromoacetato de benzilo (8 ml). A mistura foi aquecida sob refluxo durante 45 min, então arrefecida à temperatura ambiente, diluída com acetato de etilo e lavado com carbonato de sódio aquoso seguido de água. O solvente foi removido in vacuo e o éster NTA-terc-butildibenzílico foi purificado com uma coluna de sílica-gel usando um gradiente de 10-30% de acetato de etilo em hexano como eluente. Rendimento (83%). O éster terc-butílico foi separado por refluxo durante duas horas com uma mistura 1:1 de TFA e diclorometano originando o éster NTA-dibenzílico como trifluoroacetato.

85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT 31

Ο Composto η°9 (0,394 g, 0,809 mmol), o éster NTA-dibenzílico (0,383 g, 1,03 mmol) e BOP (0,456 g, 1,03 mmol) foram suspensos em DMF (20 ml). A DIEA (0,87 ml, 5 mmol) foi adicionada, e a mistura foi deixada em repouso durante a noite. Foi adicionada água (20 ml), e o produto precipitado foi recolhido por filtração e lavado várias vezes com água. O produto em bruto foi dissolvido em etanol quente (75 ml), e a solução foi descorada com carvão activado. Foi adicionada água (50 ml), e a solução foi concentrada até aproximadamente 60 ml. A mistura foi deixada durante a noite à temperatura ambiente, e o produto precipitado foi retirado por filtração. O sólido foi suspenso em TF1F (10 ml) e adicionou-se LiOH 0,5M (5 ml). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 2,5 horas, e então foi removido o THF sob vácuo e adicionou-se 10% de ácido fosfórico. O produto foi recolhido por filtração, lavado com água e seco sob vácuo. Rendimento: 0,214 g (42% a partir do Composto n°9); Pf: 158-163°C; TLC (metanol/piridina/ácido acético 80:20:6): Rf = 0,42. MS (FAB*): 624,23 (MH*); 624,20 (M-rNa*).

Cloreto do ácido antraciuinona-2-carboxílico (Composto n°21~) O ácido antraquinona-2-carboxílico (2,52 g, 10 mmol) foi suspenso em diclorometano (100 ml). Foi adicionado cloreto de tionilo (50 ml) e a mistura foi aquecida sob refluxo, sob uma atmosfera de azoto, durante várias horas dando origem a uma solução amarela límpida. O diclorometano e o excesso de tionilo foram removidos in vacuo dando origem a um sólido amarelo. O sólido foi filtrado, lavado várias vezes com éter de petróleo e seco in vacuo. Rendimento de 2,69 g (99% a partir do ácido antraquinona-2-carboxílico); Pf: 143-144,5°C; TLC (analisado como éster metílico: uma pequena amostra do cloreto ácido foi dissolvida em metanol seco e analisada imediatamente usando acetato de etilo como eluente); Rf = 0,68. MS (FAB+): 307,1 (MH*). AO-CO-PEG2QOO (Composto n°221

PEG2000 (2,00 g, 1 mmol) foi dissolvido em tolueno (100 ml). 50 ml de tolueno foram retirados por destilação e a solução foi arrefecida até à temperatura ambiente. O cloreto do ácido antraquinona-2-carboxílico (0,271 g, 1 mmol) seguido de piridina (1,6 ml, 20 mmol) foram adicionados e a mistura foi aquecida sob refluxo, sob uma atmosfera de azoto, durante uma hora. Tolueno e um excesso de piridina foram removidos por destilação, e então adicionou-se água (100 ml) e o tolueno residual foi removido por destilação azeotrópica. O composto pretendido foi isolado por secagem por congelação a partir da água. Rendimento 2,28 g (102%). HPLC (Delta Pak 5 μ C,„ 3,9x150 mm; tampão A: 0,1% TFA

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ΕΡ 0 820 483 / PT 32 em água; tampão B: 0,1% TFA em acetonitrilo/água 9:1; gradiente: 25% A + 75% B durante 2 minutos, e então um gradiente linear de 25% de A + 75% de B A 100% de B durante 10 minutos, e então 100% de B durante 10 minutos; Rt = 2,4 minutos (AQ-CO-PEG2000: 78,9% (330 nm)); Rt - 7,08 min (AQ-CO-PEG2000-CO-AQ: 18,5% (330 nm)).

Exemplo 2 O Composto n°5 no Exemplo 1 de antraquinona substituída (VII) (nesta experiência designada por Ql) e o Composto n°3 no Exemplo 1 de fenantrenoquinona substituída (VIII) (nesta experiência designada por Q2) e um número seleccionado de outras fotossondas foram estudados em relação à absorvância no comprimento de onda na gama de 190-820 nanómetros. O composto XXVI corresponde à estrutura mostrada na Fig. 1.

Foram verificados os seguintes valores de absorção máxima e de coeficiente de extinção (ε) (ver Tabela 1).

Tabela 1

Dados de UV de fotossondas (n.a.= não absorção)

Composto ^max (nm) emax (M‘lcm'1) Amax (nm) emax (M'lcm‘l) Amax (nm) smax (M'lcm‘1) Azidobenzeno 247 7900 315 80 (n-a.) benzofenona 260 14000 333 110 (n.a.) Antracenoquinona 252 39000 325 4700 390 110 F enantrenoquinona 266 29000 328 4300 425 1400 Ql 256 49000 332 4700 390 310 Q2 266 39000 330 5700 424 1400 XXVI 253 2500 263 2350 398 69000

Exemplo 3

Introdução de grupos amino primários em superfícies de poliestireno através de enxerto por UV O efeito do tipo quinona assim como o efeito da concentração de fotossondas e do tempo de irradiação na introdução de grupos amino primários foi ensaiado com o composto de fenantrenoquinonamina n°3 e o composto antraquinonamina n°5 em dois tipos de poliestireno: 1) Nunc-Immuno® Módulo F16 PolySorp (poliestireno não tratado, n° 467679

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ΕΡ 0 820 483 / PT do cat. Nunc); 2) placas tratadas não estéreis Nunc F96 Nunclon® Delta). Os compostos quinonamina n°3 e o Composto n°5 foram dissolvidos em água destilada, e adicionou-se 100 μΐ a cada poço das placas ELISA em séries de diluição de cinco vezes com uma concentração de partida das fotossondas de 0,58 μΜ. As placas foram colocadas a uma distância de 14 cm por baixo de uma lâmpada de UV (Philips HPA 400: a lâmpada emite luz UV-A e UV-B de baixa energia especialmente entre 300 e 400 nm), e estas foram irradiadas durante 5. 7 e 10 minutos, respectivamente. Os poços foram enxaguadas três vezes com água desmineralizada e secas durante 50 minutos a 60°C. As placas contendo as fotossondas foram mantidas no escuro durante a fotólíse, como controlos. Foi adicionado éster de biotina-succinimida (n° H 1759 do catálogo Sigma) num tampão de PBS (solução salina tamponada com fosfato: 0,15 M Na", 4,2 mM K7, 7,9 miM em fosfato, pH 7,2) (100 μΐ/poço), e os poços foram deixados a incubar durante a noite à temperatura ambiente. Os poços foram lavados três vezes com CovaBuffer (tampão PBS pH 7,2 + NaCl 2M + MgS04 4,1 mM + 0,5% (v/v) Tween 20®) deixando o CovaBuffer (tampão PBS pH 7,2 + NaCl 2M + MgS04 4,1 mM + 0,5% (v/v) Tween 20®) nos poços durante 10 minutos após a última lavagem. Os poços foram aspirados e foi adicionada uma mistura de avidina (4 pg/ml de avidina (n° A 9390 do cat. Sigma) e 0,13 pg/ml de conjugado de avidina e peroxidase de rábano (n° P 347 do cat. DAKO) num tampão de pH 7,2) a cada poço (100 μΐ/poço). Os poços foram incubados durante 2 horas à temperatura ambiente, e lavados duas vezes com CovaBuffer tal como descrito atrás. A quantidade de proteína ligada foi quantificada por medição da actividade de peroxidase no tampão de citrato (0,1M, pH 5,0) contendo 0,015% (v/v) de H:02 e 0,6 mg/ml de OPD (n° P 8412 do cat. da Sigma) como substrato cromogénico. A reacção enzimática foi terminada após 6 minutos por adição de H2S04 (2M, 100 μΐ/poço), e a reacção de cor foi quantificada por medição da absorção a 490 nm no leitor do ELISA (leitor InterMed Imunno NJ 2000). Os resultados para o composto de fenantrenoquinonamina n° 3 são mostrados nas Fig. 8a e 8b. Nas superfícies PolySorp® (Fig. 8a) não se observou nenhum sinal significativamente mais elevado do que o do nível de controlo, enquanto que nas superfícies tratadas Nuclon® Delta foram observados sinais mais elevados para todos os tempos de irradiação com um máximo para uma concentração de fotossonda de 0,116 mM e 5 minutos de tempo de irradiação. Os resultados para o composto de antraquinonamina n°5 são mostrados nas Fig. 9a e 9b. Nas superfícies PolySorp® (Fig. 9a) observou-se nitidamente um sinal significativamente mais elevado do que o do controlo. O máximo foi obtido para uma concentração de fotossonda de 0,116 mM e 10 minutos de tempo de irradiação. Nas superfícies Nuclon® Delta tratadas foram observados sinais mais elevados do que os do controlo, para todos os tempos de irradiação, com concentrações de fotossonda superiores a 3,72x105 mM.

0 efeito da variação dos braços do espaçador foi testado em compostos de antraquinonaminas n°s 5, 7 e 9. As antraquinonaminas foram dissolvidas em água destilada até uma concentração de 0,lmM de fotossonda, e adicionou-se 100 μΐ a cada poço de um Nunc-Immuno® Module F16 PolySorp e uma placa não estéril Nunc F96 (Ninclon® Delta tratado). As placas foram colocadas 10 cm abaixo de uma lâmpada de UV e irradiadas durante 10 minutos. Os poços foram enxaguadas três vezes com água desmineralizada e secas durante 50 minutos a 60°C. Uma série de diluição em duas vezes do éster de biotina-succinimida em tampão PBS foi adicionada (100 μΐ/poço). e os poços foram deixados a incubar durante a noite à temperatura ambiente. Os poços foram lavados três vezes com CovaBuffer, adicionou-se a mistura de avidina, e a quantidade de proteína ligada foi quantificada tal como descrito atrás. Os resultados foram mostrados na Fig. 10 e mostram claramente o efeito do comprimento do ligador. O composto n° 9, com duas unidades de β-alanina, mostraram o sinal global mais alto quando enxertado em PolySorp®. Os sinais mais fracos verificaram-se quando o Composto n°9 foi enxertado em placas tratadas de Nuclon® Delta. Contudo, o sinal era ainda mais alto do que para o Composto n°5 e o Composto n°7, indicando a vantagem de possuir um comprimento de espaçador óptimo entre a fotossonda e o grupo amino primário. A uniformidade dos grupos amino fotoquimicamente enxertados sobre superfícies de poliestireno foi testada com o composto de antraquinonamina n°9. O Composto n°5 foi dissolvido em água destilada até uma concentração de 0,1 mM de fotossonda. 100 μΐ da solução foi adicionada a cada poço em quatro placas não estéreis Nunc F95 (Nunclon® Delta tratado), colocadas 10 cm abaixo de uma lâmpada de UV e irradiadas durante 10 minutos. Cada poço foi lavado três vezes com água desmineralizada e seco durante 50 minutos a 60°C. O éster de biotina-succinimida em tampão PBS foi adicionado (125 μg/ml, 100 μΐ/poço), e os poços foram deixados a incubar durante a noite à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com CovaBuffer, adicionou-se a mistura de avidina a cada poço, e a quantidade de proteína ligada foi quantificada tal como descrito atrás. Os resultados são mostrados na Tabela 2. 35 85 700

ΕΡ 0 820 483 / PT

Tabela 2

Uniformidade de superfícies de poliestireno com grupos amino primários enxertados por UV. Média de quatro placas Média (Abs. 490 nm) Desvio padrão % CV 1,959 0.063 3,2 A capacidade de armazenamento de grupos amino enxertados fotoquimicamente em superfícies de poliestireno foi testada com o composto de antraquinonamina n° 9. O Composto n°5 foi dissolvido em água destilada até uma concentração de 0,1 mM de fotossonda. 100 μΐ da solução foram adicionados a cada poço em placas não estéreis Nunc F96 (Nunclon® Delta tratado) e placas Nunc-Immuno® Module F8 PolySorp (n° 469078 do cat. da Nunc), colocadas 10 cm abaixo de uma lâmpada de UV e irradiadas durante 10 minutos. Cada poço foi lavado três vezes com água desmineralizada e seca durante 50 minutos a 60°C. Uma placa de cada tipo foi embalada em sacos de plástico selados e armazenada durante até 30 dias a 4°C, 20°C, 37°C, e 60°C. As placas foram retiradas para ensaio com intervalos de 1,2, 6, 13, 20 e 30 dias de armazenamento. Uma placa de cada tipo foi usada para o teste de estabilidade. As placas foram incubadas com o éster de biotina-succinimida seguido da mistura de avidina, e a quantidade de proteína ligada foi quantificada tal como descrito atrás. Todos os dados foram normalizados relativamente ao dia zero (sem armazenamento). Os resultados mostraram que não havia uma redução significativa na actividade para um armazenamento à temperatura de 37°C ou abaixo, enquanto que as placas armazenadas a 60°C apresentavam uma ligeira diminuição de sinal.

Introdução de ácidos carboxílicos em superfícies de poliestireno com enxerto por UV O composto derivado de ácido antraquinonacarboxílico n°13 foi dissolvido em LiOH 0,1M e diluído com água destilada até uma concentração de 5mM. Uma série de diluição em duas vezes da fotossonda (100 μΐ/poço), foi feita em placas não estéreis Nunc F96 (Nunclon® Delta tratado) e placas Nunc-Immuno® Module F8 PolySorp. As placas foram colocadas num agitador durante uma hora a 50°C, antes da irradiação por UV. Os poços foram aspirados e colocados a 14 cm de uma lâmpada de UV e irradiadas durante 10 minutos. As placas não irradiadas foram usadas como controlo. Os poços foram enxaguados três vezes com água desmineralizada e adicionou-se cristal violeta (n° 1408 do cat. Merck, 15 mg em 100 ml de água destilada). As placas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente, lavadas três vezes com água desmineralizada e secas durante 30 minutos a 60°C. A dissolução do cristal violeta ligado foi efectuada por adição de uma solução de HC1 1M em

85 700

ΕΡ 0 820 483 / PT 36 96% etanol a cada poço. Os resultados foram lidos num leitor InterMed Immuno NJ 2000 a 590 nm e são mostrados na Fig. 13. Como o cristal violeta se liga como um par iónico aos ácidos carboxílicos, um aumento de sinal indicará a presença de grupos ácido carboxílico imobilizados na superfície. Não foi obtido sinal para as placas que não foram irradiadas por LJV, enquanto se verificou um aumento significativo de sinal com a concentração crescente de fotossonda nas superfícies de PolySorp®.

Exemplo 4

Ligação covalente de um péptido em superfícies de poliestireno por enxerto com UV O composto de péptido n° 19, antraquinona substituída terminada em N, foi dissolvido em água destilada (0,1 mg/ml). 100 μΐ foram usados em cada poço de dois Nunc-Immuno® Module F16 PolySorp® -excepto para a fila A - que foi usado como branco de controlo. Uma tira (2x8 poços) foi irradiada de cada vez, respectivamente, 2, 5, 10, 15, 30 e 60 minutos (14 cm abaixo de uma lâmpada de UV). Após irradiação por UV as placas foram enxaguadas três vezes com NaOH 0,4 M contendo 0,25% de Tween 20R, e três vezes com tampão PBS. O péptido imobilizado foi detectado com um anticorpo antipéptido monoclonal (cultura sobrenadante Hyb 161-2 da Statens Serminstitut, Copenhaga, Dinamarca). Foi feita uma série de diluição de duas vezes do anticorpo em tampão PBS-Tween® nos Immuno Modules da fila C e daí em diante (100 μΐ/poço). Na fila A (branco de péptido), foi adicionada cultura sobrenadante não diluída enquanto que a fila B foi usada como controlo sem Hyb 161-2. Os Immuno Modules foram incubados durante duas horas à temperatura ambiente, e então lavados três vezes com tampão PBS contendo 0,05% de Triton X-100®. Uma mistura de anticorpo de coelho anti-ratinho (2 μ§/ηι1 código DAKO Z 259) e anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (1:500, código DAKO P 447) foi adicionado a cada poço (100 μΐ), incubada durante uma hora à temperatura ambiente e lavada três vezes tal como descrito atrás. O substrato de OPD (100 μΐ), foi adicionado a cada poço, e a reacção do substrato foi parada após quatro minutos com H,S04 2M (100 μΐ/poço). Os resultados são mostrados na Fig. 15 e mostram claramente que o tempo de irradiação óptimo foi entre 2 e 15 minutos. O factor óptimo de diluição da cultura sobrenadante de Hyb 161-2 foi de aproximadamente 10 e foi usado nas experiências subsequentes. O efeito do tempo de irradiação foi ainda investigado. A experiência foi efectuada tal como descrito atrás, excepto que foi usada uma concentração constante de Hyb 161-2

85 700

ΕΡ 0 820 483 / PT 37 (cultura sobrenadante diluída 10 vezes). Os resultados sào mostrados na Fig. 15 e mostram claramente que um tempo de irradiação de 10 minutos era o óptimo, mas mesmo após dois minutos era obtida mais de 80% da resposta máxima. A linha de fundo (reacção não específica) em poços sem péptido assim como em poços sem Hyb 161-2 era baixa. A diminuição de sinal para tempos de irradiação mais longos deve ser devida a um aumento da reticulação fotoquímica do esqueleto do péptido e à condução das fotossondas de antraquinona à destruição do reconhecimento do epítopo. O efeito da concentração do péptido foi testado. O composto de péptido substituído com antraquinona terminado em N n°19 e o péptido sem a porção antraquinona (sem N terminal) foram dissolvidas em água (2 mg/ml), e uma série de diluição em duas vezes feita para cada solução de péptido nos Nunc F16 PolySorp® Immuno Modules. Os módulos foram irradiados durante 10 minutos (14 cm abaixo a lâmpada de UV) e lavados tal como descrito atrás. Os imuno-módulos com o antraquinona-péptido e o péptido livre foram mantidos no escuro durante a fotólise, como controlos. A quantidade de péptido imobilizado foi medida tal como descrito atrás, usando uma concentração constante de Hyb 161-2 (cultura sobrenadante diluída 10 vezes). Os resultados são mostrados na Fig. 16. Apenas os poços irradiados contendo o antraquinona-péptido mostravam qualquer sinal detectável. A concentração óptima do antraquinona-péptido era de aproximadamente 4 pg/ml. A diminuição de sinal em concentrações mais elevadas pode, tal como descrito anteriormente, ser atribuída a uma reticulação fotoquímica do esqueleto dos péptidos imobilizados, conduzindo à destruição do reconhecimento do epítopo. Adicionalmente a isto, uma maior concentração do antraquinona-péptido na solução favorece a fotoquímica da solução-fase para a reacção com o polímero conduzindo a agregados de péptidos fotoquimicamente reticulados solúveis, que são posteriormente removidos nos passos de lavagem. A estabilidade ao armazenamento do péptido enxertado fotoquimicamente foi investigada. O péptido antraquinona número 19 foi dissolvido em água destilada (0,1 mM), e a solução foi adicionada a cada poço de Nunc-Immuno® Module F16 PolySorp®. Os poços foram irradiados durante 10 minutos (14 cm abaixo a lâmpada de UV) e fmalmente lavados tal como descrito atrás. Os poços foram revestidos com 1% de sacarose em tampão PBS (300 μΐ/poço), incubados durante uma hora à temperatura ambiente, e então aspirados e secos com ar comprimido. As placas foram embaladas em sacos de plástico selados e armazenadas a 4°C e 37°C. As placas foram retiradas para ensaio a intervalos de 1 a 32 dias. O ELISA foi efectuado tal como descrito anteriormente e os dados são apresentados na Fig. 17. Todos os dados são normalizados relativamente ao dia zero. Não foi detectada uma queda de sinal

85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT 38

durante o período de armazenamento, mas uma temperatura de armazenamento de 37°C deu consistentemente origem a um sinal ligeiramente inferior do que o manifestado a 4°C.

Exemplo 5

Enxerto por UV do derivado de ácido antraauinonanitrolotriacético (ΝΤΑΊ 20 em superfícies de poliestireno O derivado de antraquinona NTA 20 foi dissolvido em tampão fosfato (pH 5,5) com uma concentração de partida de 1 mM. Uma série de diluição em duas vezes da solução foi efectuada em duas placas Nunc-Immuno® Module F16 PolySorp (100 μΐ/poço), e estas foram incubadas durante 1 hora a 50°C. Os poços foram aspirados e uma placa foi colocada 14 cm abaixo de uma lâmpada de UV (Philips HPA 400) e irradiada com luz UV durante 5 minutos, enquanto que a outra placa foi mantida no escuro como controlo. Todos os poços foram lavados com água desmineralizada seguindo-se a adição de uma solução de cristal violeta (15 mg em 100 ml de água desmineralizada; 100 μΐ/poço) e incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. As placas foram lavadas com água e secas a 60°C durante 1 hora. A dissolução do cristal violeta ligado foi efectuada por adição de uma solução 1M de HC1 em etanol a cada poço. Os resultados foram lidos num leitor InterMed Immuno NJ 200 a 590 nm. Os resultados são mostrados na Fig. 11 e mostram um aumento significativo do sinal com o aumento de concentração da fotossonda. Não foi obtido sinal nos poços que não foram irradiados por UV.

Os quelatos de metais, especialmente quelatos de níquel, têm sido relatados como possuindo propriedades de ligação específicas para péptidos e proteínas marcados com histidina (Hochuli et al., J. Chromat. 411, 177-184 (1987)). Para testar a capacidade das novas placas de microtitulação derivatizadas com NTA para se ligarem selectivamente a péptidos marcados com histidina, foram sintetizados três péptido biotinilados, com e sem uma marca de hexa-histidina, através de um síntese corrente Fmoc de péptidos de fase sólida (os três péptidos foram preparados similarmente ao péptido substituído com antraquinona (Composto n°19) no Exemplo 1).

Péptido 1: Biotina-sAhx-Leu-Lys-Leu-Lys-Trp-Lys-OH

Péptido 2: Biotina-sAhx-Leu-Lvs-Leu-Lvs-Trp-Lvs-His-His-His-His-Efis-His-OH Péptido 3: Biotina-sAhx-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-

Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-OH

85 700

ΕΡ 0 820 483 / PT 39 A fotoligação do derivado de NTA substituído com antraquinona foi efectuado tal como descrito atrás excepto que a placa foi irradiada com luz UV durante 10 minutos sem anterior aspiração da solução. A placa foi lavada três vezes com tampão PBS (pH 7,2) e então carregada com níquel por adição de NiS04 (50 mM em água Milli Q, 100 μΐ/poço). Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com água Milli Q. Soluções de cada péptido (23 μΜ, 100 ul/poço) no tampão de teste (tampão PBS (pH 7,2) contendo 0,05% de Tween 20^ e NaCl 500 mM) foram adicionadas para separar as filas da placa. Foi adicionada água ao resto das filas como controlo. Os péptidos foram deixados a incubar durante a noite à temperatura ambiente, e então os poços foram lavados três vezes com o tampão de ensaio, e a mistura de avidina (100 μΐ/poço, para detalhes ver Exemplo 3) no tampão de ensaio foi adicionada aos poços. Após duas horas à temperatura ambiente os poços foram esvaziados, lavados três vezes com o tampão de ensaio, e a quantidade de avidina imobilizada foi quantificada por medição da actividade da peroxidase (para detalhes ver Exemplo 3). Os resultados são mostrados na Fig. 18a e mostram claramente que apenas o péptido marcado com histidina deu origem a uma ligação significativa na placa de quelato de níquel.

Exemplo 6

Enxerto por UV do derivado 22 de polietilenoglicol 2000 substituído com antraquinona (AO-CO-PEG2QOQ) em superfícies de poliestireno O derivado 22 de antraquinona-PEG2000 foi dissolvido em água Milli Q até uma concentração de 0,3 mM. Lamelas de poliestireno (de Nunc, Dinamarca) foram enxaguadas com etanol a 96% (1x5 minutos com ultrassons) e água Milli Q (2x5 minutos com ultrassons) e secas num exsicador sem abertura sobre CaCl2 (água residual na atmosfera acima do CaCl,: 0,14-1,4 mg/1). Antes da fotoimobilização as lamelas foram levadas ao equilíbrio higroscópico com a atmosfera envolvente. Duas lamelas foram colocadas num pequeno recipiente metálico e a solução de fotossonda foi adicionada para cobrir a superfície das lamelas com aproximadamente 2,5 mm da solução acima da superfície. Uma das lamelas foi colocada 10 cm abaixo da lâmpada de UV (Philips HPA 400) e irradiada durante 5 minutos, enquanto que a outra lamela foi mantida no escuro como controlo. Ambas as lamelas foram bem enxaguadas com água Milli Q de uma garrafa e depois três vezes com água Milli Q com ultrassons (3x5 minutos). As lamelas foram secas sobre CaCl2, num exsicador sem abertura. Como outros controlos, duas lamelas foram tratadas tal como descrito atrás com uma solução de PEG2000 (0,3 mM) e outras duas lamelas só com água Milli Q. O efeito do foto-enxerto foi testado por medição dos ângulos de contacto usando um 40 85 700

ΕΡ 0 820 483 / PT instrumento VCA-2000 (AST Products, Inc.). Cinco gotas (1,5-2,5 μΐ) de água Milli Q foram colocadas em cada lamela e o ângulo de contacto foi medido (dois ângulos de contacto por gota dando 10 ângulos de contacto por lamela) usando o programa informático do fabricante. Antes de cada série de medições, as lamelas foram levadas ao equilíbrio higroscópico com a atmosfera envolvente. Os resultados são mostrados na Fig. 12 e mostram claramente uma diminuição no ângulo de contacto das lamelas de poliestireno foto-enxertadas com PEG2000 substituído com antraquinona em relação aos controlos.

Exemplo 7

Enxerto por UV do derivado 22 de polietilenoglicol 2000 substituído com antraquinona (AO-CQ-PEG2000) em superfícies de polipropileno O derivado 22 de antraquinona-PEG2000 foi dissolvido em água Milli Q até uma concentração de 0,3 mM. Lamelas de polipropileno (de Nunc, Dinamarca) foram enxaguadas e secas tal como descrito para as lamelas de poliestireno (Exemplo 6). Duas lamelas foram colocadas num pequeno recipiente metálico e a solução de fotossonda foi adicionada para cobrir a superfície das lamelas com aproximadamente 2,5 mm da solução acima da superfície. Uma das lamelas foi colocada 10 cm abaixo da lâmpada de UV (Philips HPA 400) e irradiada durante 5 minutos, enquanto que a outra lamela foi mantida no escuro como controlo. Ambas as lamelas foram bem enxaguadas com água Milli Q de uma garrafa e então dez vezes com água Milli Q com ultrassons (10x5 minutos). As lamelas foram secas num exsicador sobre CaCL, sem abertura. Como outro controlo uma lamela foi lavada e seca tal como descrito atrás. A medição dos ângulos de contacto foi efectuada tal como descrito para as lamelas de poliestireno. Os resultados são mostrados na Fig. 13 e mostram claramente uma diminuição no ângulo de contacto das lamelas de poliestireno foto-enxertadas com PEG2000 substituído com antraquinona em relação aos controlos.

Lisboa,

Por MOGENS HAVSTEEN JAKOBSEN e TROELS KOCH

ENG.· AMTÓNI0 JOÃO BA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. des Flores, 74-4.®

1200 LISBOA

Claims (34)

1. 85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT 1/8 REIVINDICAÇÕES 1. Método de imobilização de um ligando a uma superfície (P) de um substrato de um material contendo carbono, compreendendo o referido método, um passo fotoquímico de ligação do ligando (L) através de uma quinona (Q) à superfície sólida de um material contendo carbono, por irradiação da quinona com radiação electromagnética não-ionizante possuindo um comprimento de onda na gama dos UV até à luz no vísivel, em que a quinona é utilizada como um composto de ligação fotoquimicamente reactivo, sendo a quinona (Q) seleccionada do grupo constituído de compostos de quinona monoméricos, compostos de quinona diméricos, e compostos de quinona oligoméricos simétricos ou assimétricos; a referida quinona (Q) contendo um hidrocarboneto cíclico, ou de 2 a 10 hidrocarbonetos cíclicos fundidos, tendo o referido composto de quinona pelo menos dois grupos carbonilo conjugados, cujo número não excede duas vezes o número de hidrocarbonetos cíclicos fundidos.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quinona é opcionalmente substituída com substituintes (R) que não resultam num impedimento estereoquímicõ para a imobilização do ligando (L) e não perturbem o passo fotoquímico.
3. 3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que o composto de quinona compreende um hidrocarboneto cíclico ou hidrocarbonetos cíclicos 2-4 fundidos de acordo com as fórmulas gerais (XXXVI), (XXXVIII) e (XXXIX), em que as letras m, n e o designam 0-8; a soma de m, n e o é no máximo 8; I indica 0 ou um número de 1 a duas vezes n; r e q indicam 0, 1 ou 2; k indica 0 ou um número de 1 a 2 vezes m; e t indica Ω rm nm mímern de 1 a 2 ve7es n

   i I c

   (XXXIX) o ϋ 85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT 2/8
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o composto de quinona (Q) é seleccionado do grupo consistindo de antraquinonas (V, VI, VII, X, XI, XTTT, XXVIII), fenantrenoquinonas (VIII, IX, XII), benzoquinonas (I, II), naftoquinonas (III, IV, XXVII), e os compostos (XXVI, XXIX). o

   o ° (XXII)
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o composto de quinona (Q) é seleccionado do grupo consistindo de antraquinonas, fenantrenoquinonas, e o composto (XXVI).
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5. em que o composto de quinona (Q) é uma antraquinona.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o composto de quinona (Q) é uma quinona de fórmula (XXVI).
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a imobilização de um ligando (L) consiste na imobilização de um ligando (L) na superfície (P) de um material substrato sólido contendo carbono; e o referido método compreende: um passo fotoquímico de ligação do ligando (L) através de uma ou mais quinonas (Q) à superfície sólida de um material contendo carbono (P); em que a referida superfície de um material contendo carbono (P) é ligada a uma quinona (Q) quer directamente ou através de um ou mais espaçadores (S,); e a referida quinona (Q) é ligada ao ligando (L) quer directamente ou através de um ou mais espaçadores (S) e/ou compostos termoquimicamente reactivos (T); sendo os referidos espaçadores (S,) e (S) iguais ou diferentes, espaçadores termoquimicamente ou fotoquimicamente reactivos ou não reactivos;

   85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT em que a quinona (Q) é seleccionada do grupo constituído por compostos de quinona monoméricos, compostos de quinona diméricos e compostos de quinona oligoméricos simétricos ou assimétricos; contendo os referidos compostos de quinona (Q) um hidrocarboneto cíclico, ou de 2 a 10 hidrocarbonetos cíclicos fundidos, possuindo o composto de quinona referido pelo menos dois grupos carbonilo conjugados, cujo número não excede duas vezes o número dos hidrocarbonetos cíclicos fundidos; sendo o referido composto de quinona (Q) opcionalmente substituído com substituintes (R) que não resultam em impedimentos esteroquímicos para a imobilização do ligando (L) ou não perturbem o passo fotoquímico; e em que o passo fotoquímico compreende a irradiação da quinona (Q) com radiação electromagnética não ionizante possuindo um comprimento de onda na gama da luz UV à visível.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a radiação electromagnética é aplicada durante menos do que 60 minutos.
10. 10. Método de acordo com as reivindicações 8 ou 9, em que o composto de quinona compreende hidrocarbonetos cíclicos 1-4 fundidos, de acordo com as fórmulas gerais (XXXVII), (XXXVIII), e (XXXIX) anteriores, em que as letras m, n e o designam 0 ou números de 1-8; a soma de m, n e o é 8 ou menos; I indica 0 ou um número de 1 a duas vezes n; r e q indicam 0, 1 ou 2; k indica 0 ou um número de 1 a 2 vezes m; e t indica 0 ou um número de 1 a 2 vezes o.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o composto de quinona (Q) é seleccionado do grupo consistindo de antraquinonas (V, VI, VII, X, XI, ΧΠΙ, XXVIII), fenantrenoquinonas (VIII, IX, ΧΠ), benzoquinonas (I, II), naftoquinonas (ΠΙ, IV, XXVII), e os compostos (XXVI, XXIX).
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o composto de quinona (Q) é substituído com substituintes (R) seleccionados do grupo consistindo de: grupos funcionais compreendendo -N02, -S03\ -SO,\ -CN, -P032\ -P02’, -COOH, halogéneo (-F, -Cl, -Br, -I), aminas primárias, aminas secundárias e aminas

    85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT 5/8 terciárias, ou derivados destes; e hidrocarbilos que podem ser substituídos com: -N02, -S03\ -CN, -P032', -P02', -COOH, halogéneo (-F, -Cl, -Br, -I), epóxido, e -H;
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que os referidos hidrocarbilos são seleccionados do grupo de alquilos compreendendo meti lo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decanilo, undecanilo, dodecanilo, tridecanilo, tetradecanilo, pentadecanilo, hexadecanilo, heptadecanilo, octadecanilo, nonadecanilo, eicocanilo, lineares ou ramificados, com uma ou mais ligações duplas ou triplas.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 12, em que os referidos hidrocarbilos são seleccionados do grupo de arilos compreendendo fenilo, naftilo, bifenilo, tolilo, benzilo, cumenilo, mesitilo, xililo, pentalenilo, indenilo.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o substrato contendo carbono é um polímero seleccionado do grupo compreendendo o poliestireno, o polietileno, o poli(acetato de vinilo), o poli(cloreto de vinilo), a polivinilpirrolidona, o poliacrilonitrilo, o poli(metacrilato de metilo), o politetrafluoroetileno, o policarbonato, o poli(4-metilpentileno), o poliéster, o polipropileno, a celulose, a nitrocelulose, o amido, os polissacáridos, a borracha natural, a borracha butílica, a borracha de estireno-butadieno, e a borracha de silicone.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o material contendo carbono (P) pode também ser seleccionado do grupo consistindo de materiais pré-modificados, a sílica, o vidro, o vidro poroso controlado, a sílica gel, ou metal, materiais esses que tenham sido pré-modificados para conter carbono; filmes monocamada ou multicamada; filmes de Langmuir-Blodgett; membranas biológicas; polímeros naturais ou sintéticos revestidos com material biológico ou orgânico.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o ligando (L) é um grupo funcional consistindo de -COOH (ácidos carboxílicos), derivados do ácido sulfónico, -COOR’ (ésteres, incluindo ésteres activos), -COX’ (halogenetos ácidos, fluoretos ácidos e cloretos ácidos, azidas ácidas ou derivados de ácidos carboxílicos activos semelhantes), -CONHNH, (hidrazidas ácidas), -NHCONHNH, (semicarbazidas), -NHCSNHNH, (tiosemicarbazidas), -CN (nitrilos), -CHO (aldeídos), R’R”CO (cetonas), -OH (álcoois), -SH (tióis), -SSR’ (dissulfuretos), -NH,, =NH, =NH (aminas, incluindo aminas primárias, secundárias e terciárias), -NHNH: (hidrazinas), -OR’ (éteres), epóxidos, -

    85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT 6/8 SR’ (sulfuretos), -X (halogenetos), -NO,, -CH3; ou derivados destes; grupos não funcionais; ou o ligando é seleccionado de um grupo constituído por moléculas biologicamente activas.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que os grupos não funcionais são seleccionados de metilo, etilo, isobutilo, terc-butilo ou aromatos.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 17, em que as moléculas biologicamente activas são seleccionadas de biotina, toxinas, herbicidas, pesticidas, hidratos de carbono, antibióticos tais como por exemplo, penicilinas e outras drogas, como por exemplo venenos celulares, esteróides, péptidos, nucleótidos, péptidos de ácidos nucleicos (PNA) e parceiros de ligação de ácidos nucleicos, proteínas e haptenos.
20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-19, em que o espaçador (S) é um grupo formador de distância seleccionado do grupo constituído por grupos alquilo C[-C20; polioxietileno; oligo/poliamidas; oligossacáridos; oligo/polifosfatos; mono/diaminas e amidas/ésteres oligo/polisulfónicos; ou unidades combinadas das unidades atrás mencionadas ou unidades combinadas destes.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-20, em que o composto termoquimicamente reactivo (T) é um composto contendo um grupo reactivo termoquímico seleccionado do grupo constituído de: -COOH (ácidos carboxílicos), derivados do ácido sulfónico, -COOR’ (ésteres, incluindo ésteres activos), -COX’ (halogenetos ácidos, azidas ácidas ou derivados de ácidos carboxílicos semelhantes), -CONHNH, (hidrazidas ácidas), -NHCONHNH, (semicarbazidas), -NHCSNHNH, (tiosemicarbazidas), -CHO (aldeídos), R’R”CO (cetonas), -OH (álcoois), -X (halogenetos: fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto), -SH (tióis), -SSR’ (dissulfuretos), -NH,, =NH, =NH (aminas, incluindo aminas primárias, secundárias e terciárias), -NHNH, (hidrazinas), epóxidos, e maleimidas.
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-21, compreendendo os passos de ligação do composto de quinona (Q) ao ligando (L) para se obter o conjugado quinona-ligando (Q-L), e a fotoimobilização do conjugado quinona-ligando (Q-L) na superfície do material do substrato (P) para se obter o material substrato (P-Q-L).
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-21, compreendendo os passos de ligação do ligando (L) a uma molécula de espaçador (S) através do uso de um composto fotoquímico ou termoquímico, ligando o conjugado espaçador-ligando (S-L) ao

    85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT composto de quinona (Q) para se obter o conjugado quinona-ligando (Q-S-L) possuindo uma molécula espaçadora intermédia, e a fotoimobilização do conjugado quinona-ligando (Q-S-L) na superfície do substrato (P) para se obter o material substrato (P-Q-S-L).
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-21, compreendendo os passos de ligação do composto de quinona (Q) a uma molécula de espaçador (S), ligação do conjugado espaçador-quinona (Q-S) ao ligando (L) para se obter o conjugado quinona-ligando (Q-S-L) possuindo uma molécula espaçadora intermédia, e então fotoimobilização do conjugado quinona-ligando na superfície do substrato (P) para se obter o material substrato (P-Q-S-L).
25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-21, compreendendo os passos de ligação do composto de quinona (Q) à superfície do substrato (P), para se obter um conjugado quinona-superfície do substrato (P-Q), fotoimobilizando um ligando (L) ao conjugado quinona-superfície do substrato (P-Q), para se obter o material substrato (P-Q-L).
26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-21, compreendendo os passos de ligação de uma molécula de espaçador (S,) através do uso de um composto fotoquímico ou termoquímico à superfície do substrato (P), ligação do composto de quinona (Q) ao conjugado espaçador-superfície do substrato (P-S,) para se obter um conjugado quinona-superfície do substrato (P-S,-Q) possuindo uma molécula espaçadora intermédia, e fotoimobilização do ligando (L) a um conjugado quinona-superfície do polímero.
27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-21, compreendendo os passos de ligação do composto de quinona (Q) a uma molécula de espaçador (S), ligação do conjugado espaçador-quinona (Q-S) à superfície do substrato para se obter um conjugado quinona-superfície do substrato (P-Q-S) possuindo uma molécula espaçadora intermédia.
28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o passo fotoquímico se dá em meio aquoso.
29. 29. Utilização de uma quinona (Q) tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1-17 para imobilização de um ligando a uma superfície de um material substrato contendo carbono (P) de acordo com o método tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-28. 85 700 ΕΡ 0 820 483 / PT 8/8
30. 30. Material contendo carbono possuindo um ligando (L) imobilizado na sua superfície (P), preparado de acordo com o método tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-28.
31. 31. Utilização de um material substrato contendo carbono, tal como preparado de acordo com o método reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-28, num sistema de detecção.
32. 32. Utilização de um material substrato contendo carbono, tal como preparado de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-28, como portador para ensaios imunológicos de fase sólida.
33. 33. Utilização tal como reivindicado na reivindicação 32, em que o portador é seleccionado do grupo constituído por placas com poços, partículas de teste, tubos de ensaio, varetas de teste e fitas de teste.
34. 34. Utilização de um material substrato contendo carbono, tal como preparado de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-28, como portador para a síntese em fase sólida de péptidos, oligonucleótidos, hidratos de carbono e pequenas moléculas orgânicas. Lisboa, 13. D' MOGENS HAVSTEEN JAKOBSEN e TROELS KOCH - O AGENTE OFICIAL -

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