ES2638889T3

ES2638889T3 - Procedimientos para la síntesis de una micromatriz de oligopéptidos

Info

Publication number: ES2638889T3
Application number: ES12713624.0T
Authority: ES
Inventors: Thomas Albert; Jochen Buehler; Markus Ott; Todd Richmond; Matthew Rodesch; Klaus-Peter Stengele
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: EP2686351A1; WO2012126788A1; EP2686351B1; US9346892B2; US20120238477A1

Abstract

Un procedimiento para sintetizar una micromatriz de oligopéptidos que contiene tirosina, en el que el procedimiento comprende las etapas de: a) acoplamiento a un grupo amino reactivo unido directamente o indirectamente a una superficie de un soporte sólido de un aminoácido que comprende un grupo amino protegido por un resto fotolábil seleccionado de entre 2-(2- nitrofenil)-propoxicarbonilo (NPPOC) y 2-(2-nitro-4-benzoilfenil)-2'-propil-1'-oxicarbonilo (benzoil-NPPOC) en el que el grupo amino de la tirosina está protegido por benzoil NPPOC; b) opcionalmente, la adición de caperuza a aminoácidos sin reaccionar; c) opcionalmente, el lavado del soporte sólido; d) fotoirradiación del grupo amino protegido de modo que el grupo amino fotoirradiado sea reactivo; y e) repetición de las etapas b) a d) durante un número predeterminado de veces, a través de lo cual se sintetiza un oligopéptido.

Description

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DESCRIPCION

Procedimientos para la sintesis de una micromatriz de oligopeptidos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una micromatriz de oligopeptidos y procedimientos para la sintesis de la misma. La presente invencion se refiere ademas a una micromatriz de oligopeptidos que comprende al menos aproximadamente 10 000 casillas de oligopeptidos por cm2 o al menos aproximadamente 50 000 casillas de oligopeptidos por cm2.

Antecedentes de la invencion

Las micromatrices de oligopeptidos son ampliamente usadas en investigacion y en asistencia sanitaria. Dentro de estas areas, las micromatrices de oligopeptidos son adecuadas para muchas aplicaciones diferentes. Las micromatrices de oligopeptidos por ejemplo, proporcionan una herramienta para la identificacion de motivos biologicamente activos, por ejemplo, las micromatrices de oligopeptidos pueden imitar motivos activos potenciales de ligandos para cribar la union a receptores correspondientes. Ademas, las micromatrices de oligopeptidos podrian reflejar secuencias especificas de antigenos asociados a una enfermedad. Dichas micromatrices de oligopeptidos se pueden utilizar para detectar anticuerpos en muestras de pacientes que sugieren la presencia de ciertas enfermedades inflamatorias e infecciones. Otra aplicacion importante de las micromatrices de oligopeptidos es el descubrimiento de interacciones bioquimicas, incluyendo la union de proteinas o ADN. Las micromatrices de oligopeptidos se pueden usar ademas para crear perfiles de actividad celular, actividad enzimatica, adhesion celular y similares.

En el estado de la tecnica se conocen diferentes procedimientos para la produccion de micromatrices de oligopeptidos. Prevalece la deteccion de peptidos prefabricados o la sintesis in situ mediante deteccion de reactivos, por ejemplo, en las membranas. Uno de los procedimientos mas comunmente usados para generar matrices de peptidos de mayor densidad son las denominadas tecnicas fotolitograficas, en las que el diseno sintetico de los biopolimeros deseados se controla mediante grupos protectores fotolabiles (PLPG) adecuados liberando el sitio de enlace para el componente siguiente respectivo (aminoacido, oligonucleotido) tras la exposicion a radiacion electromagnetica, preferentemente luz (Fodor et al., (1993) Nature 364:555-556; Fodor et al., (1991) Science 251:767-773).

En el estado de la tecnica se conocen dos tecnicas fotolitograficas diferentes: 1) Se usa una mascara fotolitografica para dirigir luz a areas especificas de la superficie de sintesis, provocando la desproteccion localizada del PLPG. El inconveniente de esta tecnica es que se requiere un gran numero de pasos de enmascaramiento, dando como resultado un rendimiento global relativamente bajo y costes elevados, por ejemplo, la sintesis de un peptido de solo seis aminoacidos de longitud puede requerir mas de 100 mascaras. 2) La segunda tecnica es la llamada fotolitografia sin mascara, en la que la luz se dirige a areas especificas de la superficie de sintesis, provocando la desproteccion localizada del PLPG por tecnologias de proyeccion digital, tales como dispositivos de microespejos (Singh-Gasson et al., Nature Biotechn. 17 (1999) 974-978). Asi, se elimina la costosa y lenta produccion de mascaras de exposicion.

El uso de PLPG, que constituye la base para la sintesis basada en fotolitografia de micromatrices de oligopeptidos, es bien conocido en la tecnica. Los PLPG comunmente usados para la sintesis de biopolimeros basada en fotolitografia son, por ejemplo, a-metil-6-nitropiperonil-oxicarbonilo (MeNPOC) (Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:5022-5026), 2-(2-nitrofenil)-propoxicarbonilo (NPPOC) (Hasan et al. (1997) Tetrahedron 53: 42474264), nitroveratriloxicarbonilo (NVOC) (Fodor et al. (1991) Science 251:767-773) y 2-nitrobenciloxicarbonilo (NBOC) (Patchornik et al. (1970) 21:6333-6335).

Los aminoacidos se han introducido en la sintesis fotolitografica de peptidos en fase solida de micromatrices de oligopeptidos, que se protegieron con NPPOC como grupo protector amino fotolabil, en el que se usaron portaobjetos de vidrio como soporte (publicacion de patente de EE. UU. n°. 2005/0101763 A1). El documento US 2010/0137600 A1 divulga NPPOC y derivados del mismo para su uso en sintesis paralela y ensayo de oligopeptidos sobre una superficie de sustrato de acuerdo con un patron de distribucion espacial predeterminado.

El procedimiento que usa aminoacidos protegidos con NPPOC tiene el inconveniente de que la semivida tras la irradiacion con luz de todos los aminoacidos protegidos (excepto uno) esta dentro del intervalo de aproximadamente 2 a 3 minutos en ciertas condiciones. En contraste, en las mismas condiciones, la tirosina protegida con NPPOC exhibe una semivida de casi 10 minutos. Dado que la velocidad de todo el proceso de sintesis depende del subproceso mas lento, este fenomeno aumenta el tiempo del proceso de sintesis en un factor de 3 a 4. Concomitantemente, el grado de dano provocado por los iones radicales fotogenerados a los oligomeros en crecimiento aumenta al incrementar y superar el requerimiento de la dosis de luz.

El objetivo de la presente invencion es, por lo tanto, la provision de una micromatriz de oligopeptidos de alta

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densidad con alta sensibilidad y un procedimiento para su sintesis que no muestre los inconvenientes descritos anteriormente. Por lo tanto, el objetivo de la presente invencion es la provision de una micromatriz de oligopeptidos sensible de alta calidad, que se pueda sintetizar dentro de un periodo de tiempo significativamente mas corto en comparacion con el estado de la tecnica, reduciendo consecuentemente los costes de produccion de micromatrices de oligopeptidos.

Resumen de la invencion

La presente invencion se refiere a una micromatriz y a un procedimiento para la sintesis de la misma.

Un aspecto de la presente invencion es un procedimiento para sintetizar una micromatriz de oligopeptidos, en el que el procedimiento comprende las etapas de:

a) acoplamiento a un grupo amino reactivo unido directamente o indirectamente a una superficie de un soporte solido con un aminoacido que comprende un grupo amino protegido por un resto fotolabil seleccionado de entre 2- (2-nitrofenil)-propoxicarbonilo (NPPOC) y 2-(2-nitro-4-benzoilfenil)-2'-propil-1'-oxicarbonilo (benzoil-NPPOC) con la condicion de que el grupo amino de tirosina este protegido por benzoil-NPPOC;

b) opcionalmente, la adicion de caperuza a aminoacidos sin reaccionar;

c) opcionalmente, el lavado del soporte solido de plastico;

d) fotoirradiacion del grupo amino protegido de modo que el grupo amino fotoirradiado sea reactivo; y

e) repeticion de las etapas b) a d) durante un numero predeterminado de veces, a traves de lo cual se sintetiza un oligopeptido.

En un modo de realizacion, la fotoirradiacion se realiza a 350 a 410 nm. En otro modo de realizacion, la fotoirradiacion se resuelve espacialmente. La superficie del soporte solido de plastico puede comprender acido s- amino-hexanoico que lleva los grupos amino reactivos. En algunos casos, el soporte solido de plastico comprende una superficie y un cuerpo, donde el cuerpo comprende poliolefina. En algunos casos, la superficie del soporte solido de plastico tiene al menos un 50 % de transmision de luz a 350 a 410 nm. En algunos casos, la fotoirradiacion se realiza a 350 a 375 nm. En algunos casos, la fotoirradiacion se realiza a 360 a 370 nm, a 363 a 367 nm, o a 365 nm. La sintesis se realiza usando fotolitografia sin mascara usando, por ejemplo, un dispositivo digital de microespejos.

En otro modo de realizacion mas, los residuos de aminoacidos estan protegidos con diferentes NPPOC y/o derivados de NPPOC. En algunos casos, los derivados del NPPOC son benzoil-NPPOC. En algunos casos, el benzoil-NPPOC es benzoil-NPPOC-tirosina. En algunos casos, sustancialmente todos los oligopeptidos tienen una longitud de 6 a 24 aminoacidos y, en otros casos, sustancialmente todos los oligopeptidos tienen una longitud de 9 a 18 aminoacidos.

En otro modo de realizacion, la fotoirradiacion se lleva a cabo en presencia de un disolvente organico polar seleccionado de un grupo que consiste en dimetilsulfoxido, N-metil-2-pirrolidona, dimetilformamida, acetonitrilo, metanol, etanol y propanol. La fotoirradiacion se realiza en presencia de una base seleccionada entre hidrazina, hidroxilamina e imidazol. En algunos casos, la fotoirradiacion se realiza en presencia de una base reductora debil o nucleofilica debil.

En otro modo de realizacion, el acoplamiento se produce en menos de 15 minutos, menos de 10 minutos y menos de 5 minutos. El posicionamiento de los haces de fotoirradiacion sobre el soporte solido se controla y se ajusta a lo largo del tiempo, preferentemente antes de al menos cada 4a etapa de fotoirradiacion (por ejemplo, antes de al menos cada 3a etapa de fotoirradiacion, antes de al menos cada 2a etapa de fotoirradiacion, antes de al menos cada etapa de fotoirradiacion). Los procedimientos para sintetizar una micromatriz de oligopeptidos pueden comprender ademas el ajuste de la posicion del soporte solido. El ajuste puede comprender ajustar la posicion del dispositivo de microespejos o ajustar las posiciones tanto del dispositivo de microespejos como del soporte solido.

En otro modo de realizacion, la micromatriz sobre el soporte solido comprende al menos aproximadamente 10.000 casillas de oligopeptidos por cm2 y, en algunos casos, al menos aproximadamente 50.000 casillas de oligopeptidos por cm2.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una micromatriz de oligopeptidos sintetizada de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento. En un modo de realizacion, una micromatriz proporcionada en el presente documento comprende al menos aproximadamente 10 000 casillas de oligopeptidos por cm2 y, en algunos casos, al menos aproximadamente 50 000 casillas de oligopeptidos por cm2. En otro modo de realizacion, una micromatriz proporcionada en el presente documento comprende residuos de aminoacidos C- terminales de los oligopeptidos unidos a una superficie del soporte solido a traves de enlaces peptidicos. En algunos casos, los residuos de aminoacidos C-terminales de los oligopeptidos se acoplan a la superficie del soporte solido mediante acido s-amino-hexanoico.

Breve descripcion de los dibujos

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La figura 1 ilustra la sintesis de los siguientes aminoacidos protegidos con NPPOC:

a) NPPOC-L-fenilalanina

b) NPPOC-L-leucina

c) NPPOC-L-valina

La figura 2 ilustra la sintesis de los siguientes aminoacidos protegidos con NPPOC:

a) NPPOC-L-Glicina

b) Acido NPPOC-L-glutamico

c) NPPOC-(1-tritil)-L-histidina

La figura 3 ilustra la sintesis de los siguientes aminoacidos protegidos con benzoil-NPPOC:

a) Benzoil-NPPOC-L-fenilalanina

b) Benzoil-NPPOC-L-metionina

c) Benzoil-NPPOC-(t-Bu)-L-tirosina

La figura 4 presenta periodos de tiempo de semivida tras la exposicion a la luz para diferentes aminoacidos protegidos con NPPOC a una longitud de onda de 365 nm. La exposicion a la luz se llevo a cabo durante periodos de tiempo en los que la potencia de la lampara usada permitio semividas de desproteccion dentro de estos periodos de tiempo.

La figura 5 presenta periodos de tiempo de semivida tras la exposicion a la luz para diferentes aminoacidos protegidos con benzoil-NPPOC a una longitud de onda de 365 nm. La exposicion a la luz se llevo a cabo durante periodos de tiempo en los que la potencia de la lampara usada permitio semividas de desproteccion dentro de estos periodos de tiempo.

La figura 6 presenta informacion de secuencia: epitopos de 52 anticuerpos seleccionados de la base de datos del Atlas de proteinas humanas en una matriz de peptidos.

La figura 7 presenta la titulacion de sensibilidad de anti-PAPOLA sobre una matriz de peptidos.

Descripcion detallada de la invencion

Las siguientes definiciones se exponen para ilustrar y definir el significado y alcance de varios terminos usados para describir la invencion del presente documento.

El termino "soporte solido o semisolido", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier material solido que tiene un area superficial a la que se pueden unir moleculas organicas a traves de la formacion de enlaces o en la que se pueden absorber moleculas organicas mediante interacciones electronicas o estaticas tales como enlace covalente o formacion de complejos a traves de un grupo funcional especifico. El soporte puede ser una combinacion de materiales tales como plastico sobre vidrio, carbono sobre vidrio y similares. La superficie funcional puede ser moleculas organicas simples, pero tambien puede comprender copolimeros, dendrimeros, cepillos moleculares y similares.

El termino "plastico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a materiales sinteticos, tales como homo- o hetero-copolimeros de bloques de construccion organicos (monomeros) con una superficie funcionalizada, de modo que las moleculas organicas se pueden unir mediante formacion de enlaces covalentes o mediante absorcion por interacciones electronicas o estaticas, tales como la formacion de enlaces a traves de un grupo funcional. Preferentemente, el termino "plastico" se refiere a poliolefina, que es un polimero derivado de la polimerizacion de una olefina (por ejemplo, polimero de monomeros de etileno propileno dieno, poliisobutileno). Mas preferentemente, el plastico es una poliolefina con propiedades opticas definidas, como TOPAS® o ZEONOR/EX®.

El termino "transmision de luz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la propiedad de la materia por la que la materia es transparente hasta cierto punto de modo que la luz puede pasar a traves de la materia. La cantidad de luz que pasa es dependiente del grado de transparencia o transmitancia.

El termino "fotoirradiacion resuelta espacialmente", tal como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que la luz es dirigida de manera precisa sobre areas definidas de una superficie (casillas), preferentemente la superficie de una micromatriz, mediante un dispositivo, tal como una matriz de microespejos de aluminio direccionables individualmente. El dispositivo controla el patron global de luz proyectada sobre la superficie, preparando de este modo las areas para la siguiente reaccion de acoplamiento. Preferentemente, la exposicion a la luz conduce a la escision de grupos protectores fotolabiles y al desenmascaramiento de grupos funcionales dentro de las areas donde se va a acoplar el componente siguiente, por ejemplo, un aminoacido o un nucleotido. Este sistema para la exposicion controlada de la luz se puede combinar con un sintetizador para producir micromatrices. Este procedimiento de dirigir la luz a microespejos de aluminio direccionables individualmente permite la sintesis de 385 000 a 4,2 millones de casillas de sonda unicas en una unica micromatriz de tamano portaobjetos de microscopio de 75 x 25 mm.

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El termino "fotolitograffa sin mascara", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una tecnica para la sintesis de micromatrices de ADN u oligopeptidos sin el uso de foto-mascaras. En la fotolitograffa sin mascara se usa un dispositivo para dirigir la luz sobre un area definida de una superficie, preferentemente la superficie de una micromatriz, con el fin de inducir fotorreacciones, preferentemente la liberacion de grupos protectores fotolabiles. Ejemplos de dicho dispositivo pueden ser un dispositivo de microespejos, una pantalla LCD transmisora de luz o un divisor de haz. En algunos casos, el dispositivo es una matriz de elementos de espejo de aluminio direccionables individualmente que se pueden accionar bajo control de programas informaticos. Dichos elementos de espejo dirigen individualmente la luz sobre un area definida de una superficie, tal como la superficie de una micromatriz. Un ejemplo de dispositivo de microespejos es el Digital Light Processor (DLP) de Texas Instruments, Inc.

Los terminos "micromatriz" o "micromatriz de oligopeptidos", tal como se usan en el presente documento, se refieren a una disposicion bidimensional de casillas sobre la superficie de un soporte solido o semisolido. Una sola micromatriz o, en algunos casos, multiples micromatrices (por ejemplo, 3, 4, 5 o mas micromatrices) se puede localizar en un soporte solido. El tamano de las micromatrices depende del numero de micromatrices en un soporte solido. Cuanto mayor sea el numero de micromatrices por soporte solido, mas pequenas tienen que ser las matrices para encajar en el soporte solido. Las matrices se pueden disenar en cualquier forma, pero preferentemente se disenan como cuadrados o rectangulos. El producto listo para usar es la micromatriz de oligopeptidos sobre el soporte solido o semisolido (portaobjetos de micromatrices).

El termino "casilla", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un area definida en la superficie de una micromatriz. La casilla comprende biomoleculas, tales como peptidos, acidos nucleicos, carbohidratos y similares. Una casilla puede contener biomoleculas con diferentes propiedades, como diferentes secuencias u orientaciones, en comparacion con otras casillas. El tamano de una casilla viene determinado por dos factores: i) el numero de casillas de una matriz, cuanto mayor sea el numero de casillas de una matriz, menor sera cada casilla individual, ii) el numero de elementos de espejo de aluminio direccionables individualmente que se usan para la irradiacion de una casilla. Cuanto mayor sea el numero de elementos de espejo usados para la irradiacion de una casilla, mayor sera cada casilla. El numero de casillas de una matriz esta limitado por el numero de elementos de espejo (pixeles) presentes en el dispositivo de microespejos. El dispositivo de microespejos de Texas Instruments, Inc. contiene actualmente 4,2 millones de elementos de espejo (pixeles). Por lo tanto, el numero de casillas de una unica micromatriz esta limitado actualmente por este numero.

El termino "densidad", tal como se usa en el presente documento, se refiere al numero de casillas con respecto a toda la superficie del soporte solido o semisolido. A modo de ejemplo, el area completa de un soporte solido o semi- solido con un tamano de 75 x 25 mm es 18,75 cm2. La micromatriz de acuerdo con la invencion puede tener una densidad de al menos aproximadamente 10.000 casillas de oligopeptidos y preferentemente de al menos aproximadamente 50.000 casillas de oligopeptidos por cm2 con respecto a toda el area de 18,75 cm2 del soporte solido o semisolido. En este sentido, la densidad correspondiente al area de una micromatriz en si es mayor. A modo de ejemplo, la densidad de al menos aproximadamente 10 000 casillas de oligopeptidos y preferentemente de al menos 50 000 casillas de oligopeptidos con respecto a toda el area de 18,75 cm2 de la micromatriz transportada a un tamano de ejemplo de 19 x 14 mm (2,66 cm2) de la propia micromatriz da como resultado una densidad de al menos aproximadamente 70 000 casillas de oligopeptidos y preferentemente de al menos aproximadamente 350 000 casillas de oligopeptidos por cm2. Teoricamente, la densidad esta limitada por dos factores: (1) el numero de elementos de espejo (pixeles) y (2) la longitud de onda de luz usada para la desproteccion.

El termino "grupo protector", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sustituyente, grupo funcional, ligando o similar, que esta unido de forma escindible (por ejemplo, a traves de enlace covalente, enlace ionico o complejo) a un grupo funcional potencialmente reactivo e impide que el grupo funcional potencialmente reactivo reaccione de una manera no controlada. Preferentemente, el grupo protector esta enlazado de forma escindible a traves de un enlace covalente. El grupo protector se puede escindir del grupo funcional reactivo respectivo de cualquier modo, tal como por la accion de acidos, bases, fluoruro, enzimas, reduccion u oxidacion. Preferentemente, el grupo protector se escinde por exposicion a la luz. Los grupos protectores de acuerdo con la invencion son grupos protectores fotolabiles, que incluyen, pero no se limitan a, o-nitrobenciloxicarbonilo (NBOC), o-nitrofenil- etoxicarbonilo (NPEOC), 2-(3,4-metilendioxi-2-nitrofenil)-propiloxicarbonilo (MeNPPOC), 2-(3,4-metilendioxi-2- nitrofenil)-oxicarbonilo (MeNPOC), 2-(2-nitrofenil)-propoxicarbonilo (NPPOC), 2-(2-nitro-4-benzoilfenil)-2'-propil-1'- oxicarbonilo (benzoil-NPPOC), dimetoxi-benzo-inilil-oxicarbonilo (DMBOC), 2-(2-nitrofenil)-etilsulfonilo (NPES), (2- nitrofenil)-propilsulfonilo (NPPS) y similares.

El termino "grupo funcional", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquiera de numerosas combinaciones de atomos que forman partes de las moleculas quimicas, que experimentan reacciones caracteristicas propias y que influyen en la reactividad del resto de la molecula. Los grupos funcionales tipicos incluyen, pero no se limitan a, hidroxilo, carboxilo, aldehido, carbonilo, amino, azida, alquinilo, tiol y nitrilo. Los grupos funcionales potencialmente reactivos incluyen, por ejemplo, aminas, acidos carboxilicos, alcoholes, dobles enlaces y similares. Los grupos funcionales preferentes son grupos funcionales potencialmente reactivos de aminoacidos tales como grupos amino o grupos carboxilo.

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El termino "molecula antioxidante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un agente reactivo con radicales libres. En algunos casos, una molecula antioxidante reacciona con olefinas por medio de una reaccion de adicion. Una molecula antioxidante puede estar contenida en disolventes organicos polares para reaccionar con productos secundarios de la etapa de desproteccion. Las moleculas antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, aminas nucleofilicas fuertes como piperidina, piperazina, imidazol y similares, asi como inactivadores de radicales, tales como hidroxilamina, TEMPO, Oxo-TEMPO, fenoles estericamente impedidos y tiofenoles.

El termino "aminoacido natural", tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno de los 20 aminoacidos usadospara la biosintesis de proteinas, asi como a otros aminoacidos que se pueden incorporar a proteinas durante la traduccion (incluyendo pirrolisina y selenocisteina). Los 20 aminoacidos naturales incluyen histidina, alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina, acido aspartico, acido glutamico, serina, glutamina, asparagina, treonina, arginina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano, cisteina, metionina y lisina.

El termino "aminoacido no natural", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto organico que no esta entre los codificados por el codigo genetico estandar, o que no se incorpora a proteinas durante la traduccion. Por lo tanto, los aminoacidos no naturales incluyen aminoacidos o analogos de aminoacidos, pero no estan limitados a, los isoestereomeros D de aminoacidos, los analogos beta-amino de aminoacidos, citrulina, homocitrulina, homoarginina, hidroxiprolina, homoprolina, ornitina, 4-amino-fenilalanina, ciclohexilalanina, acido a- aminoisobutirico, N-metil-alanina, N-metil-glicina, norleucina, acido N-metil-glutamico, terc-butilglicina, acido a- aminobutirico, terc-butilalanina, acido 2-aminoisobutirico, acido a-aminoisobutirico acido 2-aminoindano-2- carboxilico, selenometionina, deshidroalanina, lantionina, acido Y-aminobutirico y derivados de los mismos en los que el nitrogeno aminico ha sido mono- o di-alquilado.

Los terminos "peptido" u "oligopeptido", tal como se usan en el presente documento, se refieren a compuestos organicos compuestos de aminoacidos, que estan dispuestos en una cadena lineal y unidos entre si por enlaces peptidicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos aminoacidos adyacentes. Los terminos "peptido" u "oligopeptido" tambien se refieren a compuestos organicos compuestos de menos de 70 residuos de aminoacidos, menos de 35 residuos de aminoacidos y menos de 25 residuos de aminoacidos.

El termino "grupo amino", tal como se usa en el presente documento, se refiere a grupos amino primarios (-NH2) o secundarios (-NHR1). Ejemplos de grupos amino incluyen, pero no se limitan a, -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2. Ejemplos de grupos amino ciclicos incluyen, pero no se limitan a, aziridino, azetidino, pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino y tiomorfolino.

El termino "grupo amino reactivo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una amina que puede reaccionar con un grupo funcional para formar un enlace covalente entre el nitrogeno del grupo amino y el electrofilo del grupo funcional, tal como un enlace peptidico.

El termino "disolvente organico polar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a disolventes que son solubles en agua en el sentido de que es posible obtener una mezcla homogenea del disolvente en agua a temperatura ambiente en condiciones ambientales. Los disolventes organicos polares preferentes son metanol, etanol, propanol, metiletilcetona, acetonitrilo, acetona, tetrahidrofurano (THF), dioxano, dimetilsulfoxido (DMSO), n- metil-2-pirrolidona (NMP), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA).

El termino "base", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia capaz de aceptar un proton en disolventes polares o no polares. La base de eleccion para una reaccion particular depende de los materiales de partida, del disolvente y de la temperatura usada para una reaccion especifica. Ejemplos de bases incluyen sales de carbonato, fosfatos, haluros, hidroxidos, hidruros, aminas heterociclicas, disililamidas, trialquilaminas, aminas biciclicas, hidruros de metales alcalinos, bases que contienen nitrogeno.

El termino "ciclo de sintesis", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un numero predeterminado de etapas de reaccion sucesivas que se realizan para llevar a cabo una sintesis de oligopeptidos. Mas particularmente, el termino "ciclo de sintesis" se refiere a un numero predeterminado de etapas de reaccion sucesivas que se realizan usando sintesis en fase solida de oligopeptidos con el fin de unir el respectivo aminoacido siguiente al grupo funcional anterior. Una sintesis de oligopeptidos comprende un numero predeterminado de ciclos de sintesis, en el que en cada ciclo se une un aminoacido especifico al grupo funcional anterior. Por lo tanto, el numero de ciclos depende del numero de aminoacidos del oligopeptido. Por ejemplo, para la sintesis de una micromatriz de peptidos que contiene 20 bloques de construccion de aminoacidos, se requieren 20 ciclos para alargar cada casilla de la micromatriz de peptidos en un residuo de aminoacido. La combinacion de residuos de aminoacidos dentro de un oligopeptido depende de los aminoacidos especificos, que se unen uno tras otro al respectivo grupo funcional anterior durante los sucesivos ciclos de sintesis.

a) acoplamiento a un grupo amino reactivo unido directamente o indirectamente a una superficie de un soporte solido con un aminoacido que comprende un grupo amino protegido por un resto fotolabil seleccionado de entre 2-

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(2-nitrofenil)-propoxicarbonilo (NPPOC) y 2-(2-nitro-4-benzoilfenil)-2'-propil-1'-oxicarbonilo (benzoil-NPPOC) con la condicion de que el grupo amino de tirosina este protegido por benzoil-NPPOC;

b) opcionalmente, la adicion de caperuza a aminoacidos sin reaccionar;

c) opcionalmente, el lavado del soporte solido de plastico;

En otro modo de realizacion, un procedimiento para sintetizar una micromatriz de oligopeptidos comprende las etapas de:

b) opcionalmente, la adicion de caperuza a aminoacidos sin reaccionar;

c) opcionalmente, el lavado del soporte solido;

d) fotoirradiacion selectiva del lugar del grupo amino protegido a 350 a 410 nm usando una mascara o un dispositivo sin mascara, preferentemente en un disolvente organico polar, lo mas preferentemente conteniendo una molecula antioxidante que reacciona con productos secundarios de la etapa de fotoirradiacion; y

e) repeticion de las etapas b) a d) durante un numero predeterminado de veces.

b) opcionalmente, la adicion de caperuza a aminoacidos sin reaccionar;

c) opcionalmente, el lavado del soporte solido;

d) fotoirradiacion selectiva del lugar del grupo amino protegido a 350 a 410 nm usando una mascara o un dispositivo sin mascara, preferentemente en un disolvente organico polar, lo mas preferentemente conteniendo una molecula antioxidante que reacciona con productos secundarios de la etapa de fotoirradiacion;

e) repeticion de las etapas b) a d) durante un numero predeterminado de veces.

f) fotoirradiacion de todos los "grupos de proteccion permanente" situados en las cadenas laterales de aminoacidos, por ejemplo, lisina (e-amino-BOC)-; y

g) opcionalmente, revertir el dano oxidativo que se produce en el azufre de cisteina o metionina mediante el tratamiento de la micromatriz de oligopeptidos con un agente reductor.

La evidencia experimental de los inventores ha demostrado que el plastico proporciona ventajas sobre el vidrio en la tecnologia de matriz de peptidos. Los soportes derivados de plastico muestran una reduccion significativa de la union no especifica de proteinas dentro de una muestra. La union no especifica, especialmente de proteinas de baja abundancia, puede conducir a la perdida de informacion importante, en el caso de que dichas proteinas desempenen un papel en el fenomeno que se analiza en la matriz de peptidos.

El soporte de acuerdo con la invencion es un soporte solido de plastico. En un modo de realizacion, el soporte comprende una superficie y un cuerpo, en el que el cuerpo consiste en poliolefina. La superficie del soporte puede comprender grupos amino reactivos. En algunos casos, la superficie comprende acido s-amino-hexanoico. El soporte se puede proporcionar en cualquier forma, tal como perlas, geles, placas, membranas, portaobjetos o, preferentemente, chips. En un modo de realizacion, los residuos de aminoacidos C-terminales estan unidos a la superficie del soporte (por ejemplo, un soporte solido plastico) a traves de enlaces peptidicos. En otro modo de realizacion, los aminoacidos C-terminales de los oligopeptidos se acoplan a la superficie del soporte usando acido s- amino-hexanoico.

La superficie del soporte comprende grupos funcionales capaces de formar enlaces tales como enlaces peptidicos. Preferentemente, la superficie del soporte se puede recubrir con un compuesto respectivo que proporciona posteriormente los grupos funcionales capaces de formar los enlaces. En otro modo de realizacion mas, la superficie comprende acido s-amino-hexanoico.

El primer aminoacido, que esta acoplado al soporte, y los siguientes aminoacidos acoplados al mismo estan protegidos por cualquier grupo protector capaz de impedir que el grupo funcional potencialmente reactivo del aminoacido reaccione en ciertas condiciones de reaccion. Los grupos protectores preferentes son o- nitrobenciloxicarbonilo (NBOC), o-nitrofenil-etoxicarbonilo (NPEOC), 2-(3,4-metilendioxi-2-nitrofenil)- propiloxicarbonilo (MeNPPOC), 2-(3,4-metilenodioxi-2-nitrofenil)-oxicarbonilo (MeNPOC), dimetoxi-benzo-inilil- oxicarbonilo (DMBOC), 2-(2-nitrofenil)-etilsulfonilo (NPES) y (2-nitrofenil)-propilsulfonilo (NPPS). Ejemplos de grupos protectores son 2-(2-nitrofenil)-propoxicarbonilo (NPPOC), o derivados del mismo tales como 2-(2-nitro-4- benzoilfenil)-2'-propil-1'-oxicarbonilo (benzoil-NPPOC). En algunos modos de realizacion, los grupos protectores son

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NPPOC y/o derivados de NPPOC. En algunos casos, los derivados son 2-(2-nitro-4-benzoil-fenil)-propoxicarbonilo (benzoil-NPPOC).

En un modo de realizacion, cualquier aminoacido natural o no natural protegido por los grupos protectores antes mencionados se puede usar para la sintesis de micromatrices de peptidos. Preferentemente, se usan aminoacidos naturales para la sintesis de micromatrices de oligopeptidos. En un modo de realizacion especifico, los aminoacidos estan protegidos por NPPOC y/o derivados de NPPOC, tales como benzoil-NPPOC. Los aminoacidos, incluyendo la tirosina protegida con benzoil-NPPOC, que estan protegidos con benzoil-NPPOC, muestran una semivida de aproximadamente 2 a 3 minutos. El inconveniente de usar exclusivamente aminoacidos protegidos con benzoil- NPPOC es que los grupos protectores disociados se adhieren al soporte solido, inhibiendo asi el proceso de sintesis de los oligopeptidos. Este fenomeno es desconocido para las matrices de ADN y se ha atribuido a la adicion inducida por luz del resto de benzofenona liberado a la cadena peptidica en crecimiento o al propio soporte solido. En la tecnologia de matrices de peptidos, son preferentes los soportes derivados de plastico debido a su baja union no especifica a las muestras de proteinas. Sin embargo, se sabe que los restos de benzofenona se unen a los hidrocarburos presentes en las superficies de plastico mediante un mecanismo radical que inhibe por tanto el proceso de sintesis, lo que da como resultado una baja calidad de los oligopeptidos sintetizados.

Se usan 16-19 aminoacidos diferentes, tales como histidina, alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina, acido aspartico, acido glutamico, serina, glutamina, asparagina, treonina, arginina, prolina, fenilalanina, triptofano, cisteina, tirosina, metionina y lisina, que estan protegidos con NPPOC y/o derivados de NPPOC. En un modo de realizacion especifico, los grupos amino de algunos aminoacidos estan protegidos con benzoil-NPPOC. Por ejemplo, el grupo amino de la tirosina se puede proteger con benzoil-NPPOC.

Los grupos protectores estan unidos de forma escindible a grupos funcionales potencialmente reactivos de aminoacidos con el fin de evitar que los grupos funcionales potencialmente reactivos reaccionen de manera no controlada. Los grupos protectores se unen preferentemente a los aminoacidos mediante una union covalente. Los grupos protectores se pueden escindir del grupo funcional respectivo de cualquier modo, tal como por la accion de acidos, bases, fluoruro, enzimas, reduccion u oxidacion. Es preferente el uso de grupos protectores fotolabiles, que se escinden por exposicion a la luz o irradiacion, respectivamente.

En un modo de realizacion, se puede usar la irradiacion para escindir los grupos protectores fotolabiles, que abarca todo el espectro de radiacion electromagnetica. Para escindir el grupo protector fotolabil se usa preferentemente el intervalo desde luz UV a luz IR, que oscila aproximadamente entre 200 nm y 700 nm. En algunos casos, la desproteccion se realiza entre 200 nm y 400 nm. En un modo de realizacion especifico, la desproteccion se realiza a 350 a 410 nm, a 350 a 375 nm, a 360 a 370 nm, o a aproximadamente 365 nm.

El soporte puede ser no transparente o transparente para la luz en el intervalo de luz UV a luz IR. En algunos casos, el soporte tiene al menos un 50 % de transmision de luz, al menos un 60 % de transmision de luz y al menos un 75 % de transmision de luz en el intervalo de UV a IR. En otro modo de realizacion, el soporte tiene al menos un 50 % de transmision de luz, al menos un 60 % de transmision de luz y al menos un 75 % de transmision de luz a una longitud de onda de 350 a 410 nm. En algunos casos, el soporte tiene al menos un 50 % de transmision de luz, al menos un 60 % de transmision de luz y al menos un 75 % de transmision de luz a longitudes de onda de 350 a 375 nm, 360 a 370 nm o aproximadamente 365 nm.

En un modo de realizacion no hay ninguna etapa de lavado del soporte entre la etapa de adicion de caperuza y la etapa de desproteccion del procedimiento para la sintesis de una micromatriz de oligopeptidos. En algunos casos, hay una o mas etapas de lavado entre la etapa de adicion de caperuza y la etapa de desproteccion del procedimiento para la sintesis de una micromatriz de oligopeptidos. El lavado del soporte se puede realizar mediante un disolvente organico polar o una mezcla de disolventes organicos.

En otro modo de realizacion, la sintesis de las micromatrices de oligopeptidos se realiza usando tecnicas basadas en fotolitografia. En tales casos, se usa una mascara fotolitografica para exponer las casillas respectivas a la luz con el fin de desproteger los grupos funcionales, preferentemente los grupos alfa-amino de los peptidos, para el acoplamiento del siguiente aminoacido. Preferentemente, se usa fotolitografia sin mascara para dirigir la luz hacia las respectivas casillas en una micromatriz de oligopeptidos. Para este proposito, la fotolitografia sin mascara usa dispositivos controlables, por ejemplo, dispositivos controlados por ordenador, que tienen elementos direccionables individualmente para dirigir luz hacia las casillas respectivas. Dichos dispositivos controlables se seleccionan entre, pero no se limitan a, pantallas LCD transmisoras de luz y divisores de haz. Preferentemente, se usa un dispositivo digital de microespejos como un dispositivo controlable, que es una matriz de elementos de espejo de aluminio direccionables individualmente que son operables bajo control de programas informaticos. Dichos elementos redirigen la luz hacia las respectivas casillas de una micromatriz. En modos de realizacion especificos, un dispositivo de microespejos es el Digital Light Processor (DLP) de Texas Instruments, Inc.

La fotoirradiacion se puede limitar espectralmente a longitudes de onda de 350 a 410 nm, 350 a 375 nm, 360 a 370 nm, 363 a 367 nm o 365 nm.

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La resolucion espacial dirigiendo la luz hacia las respectivas casillas a traves de los microespejos de aluminio direccionables individualmente puede conducir a muchas densidades de oligopeptidos de eleccion por area de superficie. En un modo de realizacion la micromatriz tiene una densidad de al menos aproximadamente 10 000 casillas de oligopeptidos y preferentemente de al menos aproximadamente 50 000 casillas de oligopeptidos por cm2 con respecto a toda el area del soporte solido. El soporte solido de acuerdo con la invencion puede tener cualquier tamano adecuado para los portaobjetos de micromatrices, preferentemente el tamano del soporte solido es de 75 x 25 mm (18,75 cm2). Una unica micromatriz puede contener al menos aproximadamente 385 000 casillas de oligopeptidos unicas, al menos aproximadamente 720 000 casillas de oligopeptidos unicas, o al menos aproximadamente 2,1 millones de casillas de oligopeptidos unicas. El dispositivo de microespejos de Texas Instruments, Inc. contiene actualmente 4,2 millones de elementos de espejo (pixeles). Por lo tanto, el numero de casillas de oligopeptidos de una unica micromatriz esta limitado actualmente a 4,2 millones de casillas de oligopeptidos unicas.

Las micromatrices de la presente invencion son micromatrices de alta densidad que tienen un extenso numero de casillas en un area compacta. Los modos de realizacion de las presentes micromatrices pueden tener una variedad de densidades de casillas. Por ejemplo, las micromatrices de la presente invencion pueden tener una densidad de al menos 10 000 casillas de oligopeptidos/cm2, al menos 50 000 casillas de oligopeptidos/cm2, al menos 100 000 casillas de oligopeptidos/cm2, al menos 200 000 casillas de oligopeptidos/cm2, al menos 300 000 casillas de oligopeptidos/cm2, al menos 400 000 casillas de oligopeptidos/cm2, al menos 500 000 casillas de oligopeptidos/cm2 o al menos 1 000 000 de casillas de oligopeptidos/cm2. Ademas, ciertos modos de realizacion de micromatrices tienen la densidad de casillas dentro de una variedad de intervalos de densidades de casillas. Por ejemplo, la densidad puede comprender un intervalo de aproximadamente 10 000 a 1 000 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de aproximadamente 50 000 a 1 000 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de aproximadamente 100 000 a

1 000 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de aproximadamente 200 000 a 1 000 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de aproximadamente 300 000 a 1 000 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de aproximadamente 400 000 a

1 000 000 casillas/cm2, de aproximadamente 500 000 a 1 000 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de

aproximadamente de 10 000 a 500 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de aproximadamente 50 000 a

500 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de aproximadamente 100 000 a 500 000 casillas de oligopeptidos/cm2, de aproximadamente 200 000 a 500 000 casillas de oligopeptidos/cm2 o cualquier intervalo que se encuentre dentro de un nivel inferior a 10 000 y un nivel superior a 1 000 000 casillas de oligopeptidos/cm2.

Los oligopeptidos sintetizados en la micromatriz pueden tener cualquier longitud y pueden contener cualquier numero del mismo o de diferentes residuos de aminoacidos. Preferentemente, los oligopeptidos sintetizados en la micromatriz tienen al menos 25 o al menos 35 residuos de aminoacidos. En algunos casos, sustancialmente todos los oligopeptidos sintetizados en la micromatriz son de entre 6 y 24 aminoacidos o de entre 9 y 18 aminoacidos de longitud. Por ejemplo, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100 % de las casillas de

oligopeptidos de una micromatriz proporcionada en el presente documento puede comprender entre 6 y

24 aminoacidos o entre 9 y 18 aminoacidos.

En otro modo de realizacion, la fotoirradiacion se lleva a cabo en presencia de un disolvente organico, preferentemente un disolvente organico polar. En algunos casos, la fotoirradiacion se realiza en presencia de un disolvente organico polar o una mezcla de disolventes incluyendo, sin limitarse a, dimetilsulfoxido, n-metil-2- pirrolidona, dimetilformamida, acetonitrilo, metanol, etanol y propanol.

La desproteccion, especialmente por fotoirradiacion, se puede realizar en ausencia y en presencia de una base. Las bases adecuadas incluyen sales de carbonato, sales de amonio, fosfatos, sales de tiolatos, hidroxidos, hidruros, aminas heterociclicas, disilamidas, trialquilaminas, aminas biciclicas, sales de acidos organicos y bases que contienen nitrogeno. En un modo de realizacion especifico, la base en la que se lleva a cabo la fotoirradiacion se selecciona entre hidrazina, hidroxilamina o imidazol. Mas preferentes son basicas debiles, especialmente nucleofilicas, y bases reductoras debiles.

Los procedimientos usados para la sintesis de oligopeptidos o micromatrices de oligopeptidos estan disenados en ciclos repetitivos, que comprenden las etapas basicas de acoplamiento, opcionalmente adicion de caperuza, opcionalmente lavado y desproteccion. Durante cada ciclo, otro aminoacido se acopla al oligopeptido. Por lo tanto, el numero de ciclos viene determinado por la longitud de los oligopeptidos sintetizados. Cada paso tiene una duracion definida que depende de la velocidad de la reaccion quimica asociada. Un factor limitante con respecto a la sintesis de oligopeptidos o micromatrices de oligopeptidos es la etapa de desproteccion junto con la etapa de acoplamiento. La escision del grupo protector por la exposicion a la luz depende, por una parte, de parametros fisicos, tales como el pH, la temperatura, el contenido de sal, la intensidad de la luz y las longitudes de onda. Por otra parte, la escision del grupo protector mediante la exposicion a la luz depende del aminoacido que se use en el ciclo respectivo junto con el grupo protector. Por ejemplo, el tiempo de desproteccion de la tirosina protegida con NPPOC se incrementa en un factor de 3 a 4 en comparacion con los aminoacidos naturales restantes. De este modo, la tirosina protegida con NPPOC es el principal factor limitante del tiempo de la sintesis de oligopeptidos o micromatrices de oligopeptidos. En contraste, el tiempo de desproteccion de la tirosina protegida con benzoil-NPPOC esta en el mismo nivel que los restantes aminoacidos naturales protegidos con NPPOC. De este modo, el uso de tirosina protegida con benzoil-NPPOC junto con los 19 aminoacidos naturales restantes protegidos con NPPOC conduce a

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la eliminacion del principal factor limitante del tiempo de la sintesis de oligopeptidos o micromatrices de oligopeptidos y, por tanto, a un aumento significativo de la velocidad. En un modo de realizacion, la etapa de acoplamiento de cada ciclo de sintesis tiene lugar en menos de 15 minutos, menos de 10 o menos de 5 minutos.

Es esencial tener una alineacion activa de la micromatriz de oligopeptidos y las casillas, respectivamente, con la parte optica entre los ciclos de sintesis con el fin de garantizar la exposicion a la luz unicamente en las casillas respectivas. Por lo tanto, es necesario ajustar con precision la posicion de la micromatriz de oligopeptidos durante una duracion de mas de 36 horas en una y unica posicion con una tolerancia de aproximadamente 1 pm. Para conseguir este objetivo, la matriz de oligopeptidos y la matriz de microespejos se alinean activamente mediante un sistema de control. En otro modo de realizacion, el posicionamiento de los haces de fotoirradiacion sobre el soporte se controla y se ajusta a lo largo del tiempo. En algunos casos, el posicionamiento de los haces de fotoirradiacion sobre el soporte se controla y se ajusta antes de al menos cada 4a fotoirradiacion (etapa de desproteccion) y, en algunos casos, antes de cada irradiacion.

En un modo de realizacion, el soporte puede estar hecho de cualquier material conocido por el experto usado para la sintesis de una micromatriz de oligopeptidos, preferentemente el soporte esta hecho de plastico, vidrio, carbono sobre vidrio, metal sobre vidrio o plastico sobre vidrio. Preferentemente, se usa plastico como soporte. Mas preferente es un soporte solido plastico. En otro modo de realizacion, el ajuste se realiza mediante el ajuste de la posicion del soporte solido de plastico.

Otro aspecto de la presente invencion es una micromatriz de oligopeptidos sintetizada de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

Otro aspecto mas de la presente invencion es una micromatriz de oligopeptidos, que esta situada sobre un soporte, preferentemente un soporte solido plastico, que comprende una densidad de al menos aproximadamente 10 000 casillas de oligopeptidos y preferentemente al menos aproximadamente 50 000 casillas de oligopeptidos por cm2. Aplicado al area de una micromatriz, una unica micromatriz de oligopeptidos puede contener al menos aproximadamente385 000 casillas de oligopeptidos unicas, preferentemente al menos aproximadamente 720 000 casillas de oligopeptidos unicas, mas preferentemente al menos aproximadamente 2,1 millones de casillas de oligopeptidos unicas.

En un modo de realizacion, los residuos de aminoacidos C-terminales estan unidos covalentemente a la superficie del soporte, preferentemente un soporte solido plastico, a traves de enlaces peptidicos. En otro modo de realizacion, los aminoacidos C-terminales de los oligopeptidos estan acoplados a la superficie del soporte, preferentemente un soporte solido de plastico, con un resto enlazador de acido s-amino-hexanoico.

La micromatriz de oligopeptidos de acuerdo con la invencion se puede usar para cualquier aplicacion conocida por el experto, por ejemplo, la micromatriz de oligopeptidos se puede usar como un inmunoensayo, donde la superficie de la matriz se bloquea en una primera etapa. Es aconsejable el bloqueo para evitar la union no especifica de proteinas o anticuerpos de la muestra a la superficie de la matriz basandose en una simple adsorcion o precipitacion. El bloqueo se puede realizar con albuminas, caseina, leche en polvo o similares. En algunos casos, se pueden usar ciertas fracciones hidrolizadas como la caseina soluble en alcali. Posteriormente, la matriz se puede incubar con una muestra que contiene anticuerpos, los cuales se unen selectivamente a los epitopos representados en la matriz. En un modo de realizacion, la muestra se diluye en un tampon que contiene el reactivo de bloqueo. Los anticuerpos de la muestra se pueden entonces detectar usando anticuerpos secundarios que llevan un marcador conocido por el experto. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, colorantes fluorescentes, tales como (Cy2, Cy3 o Cy5) ™ y enzimas, tales como HRP o fosfatasas alcalinas. Despues de un lavado extensivo con acido diluido, guanidina o detergente, la matriz se puede secar y analizar.

Los siguientes ejemplos 1 a 5 se proporcionan para ayudar a la comprension de la presente invencion, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos establecidos sin apartarse del espiritu de la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Sintesis de aminoacidos protegidos con NPPOC NPPOC-L-fenilalanina

Se anadieron 27,1 g de L-fenilalanina a una solucion de 38,2 g de Na2CO3 en 200 ml de H2O. A la solucion transparente se anadieron 200 ml de tetrahidrofurano (THF). Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 40,0 g de clorocarbonato de 2-nitrofenil-2-propan-1-ol (NPPOC-Cl) en 160 ml de THF. Despues de agitar durante 2 horas a 0 °C, el THF se retiro en un evaporador rotatorio bajo vacio y el residuo se extrajo 4 veces con 200 ml de una mezcla de acetato de etilo-hexanos 1:1. El residuo acuoso se acidifico a pH 2,5 con HCl diluido y se extrajo dos

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veces con aproximadamente 400 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con H2O y se evaporaron a vacfo hasta sequedad. El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna (aproximadamente 120 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio a 52,9 g (87 %) de un aceite denso amorfo incoloro. La pureza se midio por HPLC y es de un 99 %.

NPPOC-L-leucina

Se anadieron 21,5 g de L-leucina a una solucion de 38,2 g de Na2CO3 en 800 ml de H2O. Posteriormente, se anadieron 800 ml de THF a la solucion transparente. Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 40,0 g de NPPOC-Cl en 160 ml de THF. Despues de agitar durante 0,5 horas a 0 °C, el THF se retiro en un evaporador rotatorio bajo vacfo y el residuo se extrajo 3 veces con 200 ml de una mezcla de acetato de etilo-hexanos 1:1. El residuo acuoso se acidifico a pH 2,5 con HCl diluido y se extrajo dos veces con aproximadamente 400 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con H2O y se evaporaron a vacfo hasta sequedad. El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna corta (aproximadamente 50 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio a 53 g (95 %) de un aceite transparente amorfo de color rojo-parduzco. La pureza se midio por HPLC y es de un 97,4 %. El m/z se determino mediante LC/MS y es MH+: 339,4.

NPPOC-L-valina

Se anadieron 100 g de L-valina a una solucion de 199 g de Na2CO3 en 5000 ml de H2O. Se anadieron 2500 ml de THF a la solucion transparente. Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 207,9 g de NPPOC-Cl en 1250 ml de THF. Despues de agitar durante 0,5 horas a 0 °C, se elimino THF en un evaporador rotatorio bajo vacfo y el residuo se extrajo 4 veces con 1000 ml de una mezcla de acetato de etilo-hexanos 1:1. El residuo acuoso se acidifico a pH 2,5 con HCl diluido/acido cftrico 1:1 y se extrajo dos veces con aproximadamente 1500 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con H2O y se evaporaron a vacfo hasta sequedad. El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna corta (aproximadamente 300 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio a 226,8 g (82 %) de un aceite denso amorfo incoloro. La pureza se midio por HPLC y es de un 98,5 %. El m/z se determino mediante LC/MS y es MH+: 325,3.

NPPOC-L-glicina

Se anadieron 12,3 g de glicina a una solucion de 38,2 g de Na2CO3 en 200 ml de H2O. Se anadieron 800 ml de THF a la solucion transparente. Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 40,0 g de NPPOC-Cl en 160 ml de THF. Despues de agitar durante 0,5 horas a 0 °C, el THF se retiro en un evaporador rotatorio bajo vacfo y el residuo se extrajo 4 veces con 200 ml de acetato de etilo-hexanos 1:1 cada vez. El residuo acuoso se acidifico a pH 2,5 con HCl diluido y se extrajo dos veces con aproximadamente 300 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con H2O y se evaporaron a vacfo hasta sequedad. El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna (aproximadamente 80 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio a 23,7 g (51 %) de un aceite denso amorfo de color rojizo. La pureza se midio por HPLC y es de un 99,1 %.

NPPOC-L-acido glutamico

Se anadieron 24,2 g de acido L-glutamico a una solucion de 55,7 g de Na2CO3 en 800 ml de H2O. Se anadieron 800 ml de THF a la solucion transparente. Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 40,0 g de NPPOC-Cl en 160 ml de THF. Despues de agitar durante 0,5 horas, el THF se elimino en un evaporador rotatorio bajo vacfo y el residuo se extrajo 4 veces con 200 ml de acetato de etilo-hexanos 1:1 cada vez. El residuo acuoso se acidifico a pH

2.5 con HCl diluido y se extrajo dos veces con aproximadamente 400 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con H2O y se evaporaron a vacfo hasta sequedad. El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna corta (aproximadamente 100 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio a

48.5 g (83 %) de una espuma amorfa rosa. La pureza se midio por HPLC y es de un 96,3 %. El m/z se determino mediante LC/MS y es mH+: 3553.

NPPOC-(1 -tritil)-L-histidina

En la primera etapa, se anadieron 140 ml de piperidina a una solucion de 100 g de FMOC-tritil-L-histidina en 2000 ml de THF. Despues de agitar durante 2 horas a TA, se anadieron 2500 ml de H2O y se agito durante 0,5 horas adicionales. El precipitado se elimino por filtracion, se elimino el THF por destilacion en un evaporador rotatorio y la solucion se acidifico a pH 2,5 con HCl diluido. Despues de la incubacion durante la noche, el precipitado se recogio por filtracion, se lavo con pequenas cantidades de agua, se resuspendio en una mezcla de 20 ml de acido acetico en 800 ml de H2O y se agito durante 0,5 horas. La filtracion y el secado al aire proporcionaron 64 g de un polvo incoloro (95 %), que se uso en la siguiente etapa.

En la segunda etapa, se anadieron 64 g de tritil-L-histidina a una solucion de 37,5 g de Na2CO3 en 2000 ml de H2O. Se anadieron 2000 ml de THF a la solucion transparente. Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 39,0 g de NPPOC-Cl en 160 ml de THF. Despues de agitar durante 0,5 horas a 0 °C, se elimino el THF en un evaporador rotatorio bajo vacfo y el residuo se ajusto a pH 10,6 con NaOH, se extrajo 3 veces con 1000 ml de acetato de etilo-

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hexanos 1:1.

El residuo acuoso se acidifico a pH 2,5 con HCl diluido y se extrajo dos veces con aprox. 400 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con agua y se evaporaron a vacfo hasta sequedad.

El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna corta (aproximadamente 120 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio a 132 g (78 %) de una espuma amorfa incolora. La pureza se midio por HPLC y es de un 97 %.

Otros ejemplos de aminoacidos que se pueden proteger con NPPOC usando procesos similares de 1 o 2 pasos como se indica en las figs. 1 y 2 y que se describen anteriormente son alanina, valina, leucina, isoleucina, acido aspartico, serina, glutamina, asparagina, treonina, arginina, prolina, triptofano, cistefna, lisina, norleucina, acetil lisina, hidroxilprolina y acido 6-amino-hexanoico. Sin embargo, otros ejemplos de aminoacidos disponibles a partir de estas secuencias de reaccion incluirfan D-aminoacidos, beta-aminoacidos y otros aminoacidos modificados no naturales.

Ejemplo 2:

Sintesis de aminoacidos protegidos con benzoil-NPPOC Benzoil-NPPOC-L-fenilalanina

Se anadieron 28,1 g de L-fenilalanina a una solucion de 39 g de Na2CO3 en 830 ml de H2O. Se anadieron 830 ml de THF a la solucion transparente. Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 59,1 g de benzoil-NPPOC-Cl en 150 ml de THF bajo agitacion vigorosa. Despues de la adicion, se mantuvo la agitacion durante 0,5 horas a 0 °C, se elimino el THF en un evaporador rotatorio bajo vacfo y el residuo se extrajo 4 veces con 200 ml de eter etflico cada vez. El residuo acuoso se acidifico a pH 4 con HCl diluido y se extrajo dos veces con aproximadamente 400 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con H2O y se evaporaron a vacfo hasta sequedad. El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna corta (aproximadamente 80 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio hasta 55,6 g (68 %) de una espuma amorfa incolora. La pureza se midio por HPLC y es de un 97 %.

Benzoil-NPPOC-L-metionina

Se anadieron 75,9 g de L-metionina a una solucion de 118,7 g de Na2CO3 en 1700 ml de H2O. Se anadieron 1500 ml de THF a la solucion transparente. Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 177 g de benzoil-NPPOC-Cl en 300 ml de THF. Despues de agitar durante 0,5 horas a 0 °C, se elimino el THF en un evaporador rotatorio bajo vacfo y el residuo se extrajo 4 veces con 200 ml de eter etflico cada vez. El residuo acuoso se acidifico a pH 3 con HCl diluido y se extrajo dos veces con aproximadamente 400 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con H2O y se evaporaron a vacfo hasta sequedad. El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna corta con diclorometano y diclorometano/metanol (aproximadamente 100 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio a 132,8 g (57 %) de una espuma amorfa incolora. La pureza se midio por HPLC y es de un 95 %.

Benzoil-NPPOC-(t-Bu)-L-tirosina

En la primera etapa, se anadieron 92,6 g de piperidina a una solucion de 100 g de FMOC-(tBu)-L-tirosina en 1600 ml de THF. Despues de agitar durante 2 horas a TA, se eliminaron los disolventes por destilacion en un evaporador rotatorio y el residuo se recogio en diclorometano y se extrajo dos veces con una solucion de 23 g de Na2CO3 en 600 ml de H2O. Los extractos acuosos combinados se acidificaron a pH 3 con HCl diluido. Despues de la incubacion durante la noche, el precipitado se recogio por filtracion, se lavo con pequenas cantidades de H2O y posteriormente se seco al aire. El licor madre se concentro hasta un pequeno volumen para producir otra fraccion de precipitado. El rendimiento combinado ascendio a 43,9 g de agujas incoloras (85 %), que se usaron en la siguiente etapa.

En la segunda etapa, se anadieron 42,0 g de H-Tyr(t-Bu)-OH a una solucion de 41,3 g de Na2CO3 en 500 ml de H2O. Se anadieron 500 ml de THF a la solucion transparente. Se anadio gota a gota sobre hielo una solucion de 61,6 g de benzoil-NPPOC-Cl en 200 ml de THF. Despues de agitar durante 0,5 horas a TA, el THF se elimino en un evaporador rotatorio bajo vacfo y el residuo se extrajo 4 veces con 200 ml de acetato de etilo-hexanos 1:1 cada vez.

El residuo acuoso se acidifico a pH 3 con HCl diluido y se extrajo dos veces con aproximadamente 400 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con agua y se evaporaron a vacfo hasta sequedad. El residuo se disolvio en diclorometano y se purifico por cromatograffa en columna corta con diclorometano y diclorometano/metanol (aproximadamente 100 g de gel de sflice). El rendimiento ascendio a 83 g (85 %) de una espuma amorfa incolora. La pureza se midio por HPLC y es de un 95 %.

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Semividas de los aminoacidos protegidos con NPPOC tras la exposicion a la luz

Para evaluar las semividas, se proporcionaron aminoacidos protegidos con NPPOC en una concentracion de c = 0,3 mmol/l disueltos en n-metilpirrolidona (NMP) + 0,5 % de hidroxilamina en UltraVettes®. La exposicion a la luz se realizo a 365 nm durante 2, 4, 6, 8 y 10 minutos para inducir la desproteccion de los respectivos aminoacidos. Posteriormente, la solucion se analizo por HPLC para evaluar el periodo de tiempo necesario para desproteger el 50 % de la cantidad inicial del aminoacido protegido. A continuacion, se extrapolaron las semividas a partir de las duraciones resultantes a partir de los tiempos de exposicion de 2, 4, 6, 8 y 10 minutos. Como se puede deducir de la fig. 4, en el caso de la semivida de NPPOC-Tyr(t-Bu)-OH, se extrapolo un periodo de tiempo de 9,6 minutos. De este modo, el periodo de tiempo de NPPOC-Tyr(t-Bu)-OH se incremento en un factor de 3 a 4 en comparacion con los restantes aminoacidos protegidos con NPPOC.

Ejemplo 4:

Semividas de los aminoacidos protegidos con benzoil-NPPOC tras la exposicion a la luz

Para evaluar las semividas, se proporcionaron aminoacidos protegidos con benzoil-NPPOC en una concentracion de c = 0,3 mmol/l disueltos en nMp + 0,5 % de hidroxilamina en UltraVettes®. La exposicion a la luz se realizo a 365 nm durante 2, 4, 6, 8 y 10 minutos para inducir la desproteccion de los respectivos aminoacidos. Posteriormente, la solucion se analizo por HPLC para evaluar el periodo de tiempo necesario para desproteger el 50 % de la cantidad inicial del aminoacido protegido. A continuacion, se extrapolaron las semividas a partir de las duraciones resultantes a partir de los tiempos de exposicion de 2, 4, 6, 8 y 10 minutos. Como se puede deducir de la fig. 5, en el caso de la semivida de benzoil-NPPOC-Tyr(t-Bu)-OH, se extrapolo un periodo de tiempo de 2,7 minutos. Por lo tanto, el periodo de tiempo de benzoil-NPPOC-Tyr(t-Bu)-OH estaba dentro del mismo intervalo en comparacion con los restantes aminoacidos protegidos con NPPOC descritos en el ejemplo 3.

Ejemplo 5:

Sintesis de una micromatriz de oligopeptidos usando el sintetizador de matrices de peptidos sin mascara (MAS)

Se sintetizaron micromatrices de oligopeptidos de acuerdo con la invencion. La celda de flujo se lavo con NMP (grado de sintesis de peptidos). Posteriormente, se anadieron de 0,5 a 0,7 ml de una solucion 60 mM del a- aminoacido protegido con NPPOC en DMF (grado de sintesis de peptidos) y 0,25 a 0,35 ml de HBTU anhidro (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametiluronio) 0,12 M y HOBt anhidro (N-hidroxibenzotriazol), asi como 0,25 a 0, ml de N,N-diisopropiletilamina 0,12 M en DMF (grado de sintesis de peptidos) en la camara de reaccion respectiva y se mezclaron en ella. La mezcla de reaccion permanecio dentro de la camara de reaccion durante el tiempo de activacion de 5 minutos y se bombeo posteriormente a la celda de flujo para la reaccion de acoplamiento, mientras que la celda de flujo se lleno en un exceso de aproximadamente un 30 a 50 % y otro 10 a 40 % del volumen de la celda de flujo permanecio como tampon en el tubo de entrada de la celda de flujo. Despues de un tiempo de acoplamiento de 2 minutos, la celda de flujo se lavo inicialmente con NMP puro (grado de sintesis de peptidos) y, posteriormente, la celda de flujo se lleno con NMP que contenia un 0,1 % de hidroxilamina y un 0,1 % de H2O. La celda de flujo rellena se irradio con luz de la longitud de onda de 365 nm durante aproximadamente de 40 a 60 segundos; directamente despues de la irradiacion, se lavo de nuevo con NMP puro (grado de sintesis de peptidos) y se preparo asi para la siguiente etapa de acoplamiento. El software del MAS garantizo, durante la sintesis mediante la seleccion apropiada del mapa de bits para la mascara fotolitografica, que el soporte solido se exponia a la luz solo en las casillas, donde se requeria el acoplamiento del siguiente aminoacido.

Ejemplo 6:

Sintesis de las secuencias de antigeno de 52 anticuerpos seleccionados

Cincuenta y dos anticuerpos (vease la fig. 6) se seleccionaron de la base de datos del Atlas de proteinas humanas (proteinatlas.org en la World Wide Web). Las secuencias de antigeno respectivas se generaron de acuerdo con el ejemplo 5 en 164 ciclos de sintesis sucesivos como peptidos 10-mer con una superposicion de 9 aminoacidos. Cada peptido tenia un resto de serina adicional en cada extremo con el fin de mejorar la hidrofilia del peptido unido a soporte y de permitir un facil acceso de anticuerpos. En algunos casos, la superposicion fue mas corta, pero ninguna fue inferior a 6 aminoacidos. Las matrices de oligopeptidos desprotegidas se incubaron con mezclas de anticuerpos con factores de dilucion segun la recomendacion de la hoja de datos para el analisis WESTERN en el tampon recomendado por el fabricante y sus epitopos de union se determinaron como las senales de intensidad mas alta mediante marcado fluorescente con un anticuerpo secundario anti-conejo. En algunos casos, las matrices se lavaron con tampon que contenia SDS al 0,1 % con el fin de eliminar anticuerpos unidos no especificos.

Titulacion de sensibilidad de anti-PAPOLA en tampon

Se incubo una matriz de peptidos fabricada como se describe en el ejemplo 6 anterior con diluciones escalonadas 5 del anticuerpo anti-PAPOLA (PoliA polimerasa alfa, HPA001788), desde 1:10 000 hasta 1:240 000 en submatrices separadas formadas por camaras de muestras Roche Nimblegen 12 plex ensambladas. La tincion y el lavado se realizaron como se describio anteriormente. Como se representa en la fig. 7, los datos sin procesar tras el escaneado fluorescente con un escaner de micromatrices de Roche Nimblegen MS 200 revelaron los epitopos claramente visibles incluso a la dilucion mas alta, comparado con una concentracion de anticuerpo de 10 aproximadamente 200 pg/ml, con una relacion senal/ruido relativa de 4:1.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para sintetizar una micromatriz de oligopeptidos que contiene tirosina, en el que el procedimiento comprende las etapas de:

a) acoplamiento a un grupo amino reactivo unido directamente o indirectamente a una superficie de un soporte solido de un aminoacido que comprende un grupo amino protegido por un resto fotolabil seleccionado de entre 2-(2- nitrofenil)-propoxicarbonilo (NPPOC) y 2-(2-nitro-4-benzoilfenil)-2'-propil-1'-oxicarbonilo (benzoil-NPPOC) en el que el grupo amino de la tirosina esta protegido por benzoil NPPOC;

b) opcionalmente, la adicion de caperuza a aminoacidos sin reaccionar;

c) opcionalmente, el lavado del soporte solido;

d) fotoirradiacion del grupo amino protegido de modo que el grupo amino fotoirradiado sea reactivo; y

e) repeticion de las etapas b) a d) durante un numero predeterminado de veces, a traves de lo cual se sintetiza un oligopeptido.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el soporte solido es plastico.
3. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en el que la fotoirradiacion se resuelve espacialmente.
4. El procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 3, en el que la superficie comprende acido s-amino-hexanoico.
5. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que el soporte solido tiene al menos un 50 % de transmision de luz cuando se realiza fotoirradiacion entre 350 y 410 nm.
6. El procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 5, en el que la fotoirradiacion se realiza a una longitud de onda seleccionada de entre 350 y 410 nm, entre 350 y 375 nm, entre 360 y 370 nm, entre 363 y 367 nm y 365 nm.
7. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que la fotolitografia sin mascara comprende el uso de un dispositivo digital de microespejos.
8. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el que sustancialmente todos los oligopeptidos comprenden de 6 a 24 aminoacidos o de 9 a 18 aminoacidos.
9. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en el que la fotoirradiacion se lleva a cabo en presencia de un disolvente organico polar seleccionado del grupo que consiste en dimetilsulfoxido, N-metil-2- pirrolidona, dimetilformamida, acetonitrilo, metanol, etanol y propanol, o una base seleccionada del grupo que consiste en hidrazina, hidroxilamina e imidazol.
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que comprende ademas la colocacion de haces de fotoirradiacion sobre el soporte solido antes de al menos cada 4a etapa de fotoirradiacion.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la micromatriz de oligopeptidos comprende al menos aproximadamente 10 000 casillas de oligopeptidos por cm2 o al menos aproximadamente 50 000 casillas de oligopeptidos por cm2.