CN107835871B - 用于肽环化和蛋白酶处理的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肽微阵列、产生肽微阵列的方法和使用微阵列鉴定肽结合剂的方法。更具体地，本发明涉及肽微阵列、产生肽微阵列的方法和使用微阵列鉴定肽结合剂的方法，其中所述微阵列包含环状肽。本发明还涉及通过用蛋白酶处理微阵列上的肽来增加微阵列上环化肽的数量的方法。另外，本发明涉及在微阵列上产生线性和环状肽亚阵列的方法。

Description

用于肽环化和蛋白酶处理的方法和组合物
技术领域
本发明涉及肽微阵列、产生肽微阵列的方法和使用微阵列鉴定肽结合剂的方法。更具体地，本发明涉及肽微阵列、产生肽微阵列的方法和使用微阵列鉴定肽结合剂的方法，其中所述微阵列包含环状肽。在一些方面，本发明涉及通过用蛋白酶处理微阵列上的肽来增加微阵列上的环化肽相对于线性肽的比例的方法。在另外方面，本发明涉及在微阵列上产生线性和环状肽亚阵列的方法。
背景
理解蛋白质-蛋白质相互作用对于基础研究以及各种生物医学和其他实际应用是重要的。这种类型的实例包括肽片段或表位和抗体之间的结合、蛋白质与其他蛋白质的短片段之间的相互作用以及被称为适体的肽与它们的靶分子之间的结合。开发用于鉴定蛋白质肽结合剂的简单可靠的方法将有助于理解蛋白质-蛋白质相互作用的机制和为药物开发开辟新的机会。
鉴定在代谢和疾病进展中起关键作用的细胞通路和靶标的情况下，对疾病状态的理解继续指数扩展。虽然我们对疾病的理解是进步的，但由于现有药物平台固有的局限性，我们处理它们的能力却是落后的。目前，可用的药物平台主要基于小分子和治疗性蛋白质，仅解决鉴定的用于治疗疾病的治疗靶点的约10％至20％。
肽将生物药物的高度特异性与小分子的生物利用度相结合，并且，因此为解决用于疾病治疗的困难靶标提供了令人兴奋的机会。事实上，当用于靶向细胞外受体时，肽已经证明是有效的，但是限制包括体内肽的固有不稳定性和通过循环蛋白酶的快速分解。使用肽调节细胞内过程的概念已经研究了数十年，但因为肽缺乏进入细胞的能力，这些策略在很大程度上已失败。
具有其构象刚性的环状肽相对于其线性肽对应物表现出优异的性质，诸如改善的靶标亲和力和特异性。它们更高的靶标特异性和亲和力以及对蛋白水解的抗性使其成为药物发现的有吸引力的候选者。已经使用文库筛选工具(诸如噬菌体展示和mRNA展示)从大的组合文库中分离出环状肽，但是需要改进的方法来筛选大量的环状肽，使环状肽原位成熟，并鉴定目标环状肽。目前，没有系统的方法来鉴定和成熟环状肽以获得优化的环状肽结合剂。
研究肽-蛋白质相互作用的另一种有力的方法是使用肽微阵列。肽微阵列可以用使用固相肽合成法合成的肽制备，然后固定在固体支持物上，或者可以通过原位合成方法直接制备。尽管肽微阵列是市售的，但其应用受相对低密度的肽和高制造成本的限制。这些问题均都可以通过使用无掩模光引导技术来解决，参见(Pellois, Zhou等人 (2002) Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.)和美国专利号6,375,903。
使用用于无掩模光引导的微阵列合成的仪器，使用软件控制将在肽微阵列上构建的肽序列的选择，使得现在可以基于研究者的特定需求创建个别定制的阵列。通常，无掩模光引导的微阵列合成技术允许在标准显微镜载片的非常小的区域中平行合成数百万个独特的肽特征。通常通过使用光来合成肽微阵列，以指导哪些肽在微阵列上的特定位置上合成。
对于鉴定现有和潜在的新药靶标的治疗性环状肽候选者的更有效和成功的方法存在未满足的需求，部分原因是许多靶标和疾病使用现有的治疗方式是“无成药性的”。
概述
申请人在本文中公开了新颖的肽微阵列、产生肽微阵列的方法和使用本文所述的微阵列鉴定肽结合剂的方法，其中所述微阵列包含环状肽。在本文所述的一个实施方案中，所述环状肽可以用作治疗性肽。本文还公开了通过用蛋白酶处理微阵列上的肽来增加微阵列上的环化肽相对于线性肽的比例的方法。本文还公开了在同一微阵列上产生线性和环状肽亚阵列的方法。
本发明的几个实施方案由以下列举的项目来描述：
1. 一种肽微阵列，其包含至少一种式I的环状肽
Figure 428753DEST_PATH_IMAGE001
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；
且*是连接至少一种环状肽与具有反应性表面的固体支持物的连接点，
其中所述至少一种环状肽被固定至所述反应性表面，且其中所述至少一种环状肽是固定至所述反应性表面的肽群体的一部分，其中所述肽群体包含独立地选择的目标氨基酸序列。
2. 项目1的肽微阵列，其中Z包含选自以下的部分：酰胺键、
Figure 814735DEST_PATH_IMAGE002
其中v是0至6的整数，w是0至6的整数，且y是0至6的整数，且**是与所述环状肽的其余部分的连接点。
3. 项目1或2的肽微阵列，其中Z包含肽键，Q是羰基，q是0，r是1，且u是0。
4. 项目1或2的肽微阵列，其中每个Q和X是半胱氨酸侧链，Z是二硫键，q是1，r是1，t是0，且u是0。
5. 项目1或2的肽微阵列，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 328893DEST_PATH_IMAGE003
，q是1，且u是1。
6. 项目1或2的肽微阵列，其中Z包含
Figure 431759DEST_PATH_IMAGE004
且v是1。
7. 项目1或2的肽微阵列，其中Z包含
Figure 714973DEST_PATH_IMAGE005
且w是1。
8. 项目1或2的肽微阵列，其中Z包含
Figure 271856DEST_PATH_IMAGE006
，r是0，t是0，u是0，且y是1。
9. 项目1或2的肽微阵列，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 7731DEST_PATH_IMAGE007
，u是1，且y是1。
10. 项目1或2的肽微阵列，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 675473DEST_PATH_IMAGE008
，q是0，且u是1。
11. 项目1或2的肽微阵列，其中X是与Z的键，Z包含
Figure 452674DEST_PATH_IMAGE009
，q是1，r是0，t是0，且u是0。
12. 项目1或2的肽微阵列，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 446037DEST_PATH_IMAGE010
，q是1，且u是1。
13. 项目1至12中任一项的肽微阵列，其中每个L'和L''独立地具有式II
Figure 200367DEST_PATH_IMAGE011
其中每个R8和R8’独立地选自H、D、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-OR9、 -OC(O)R9、-NR9R9’、-NR9C(O)R10、-C(O)R9、-C(O)OR9和-C(O)NR9R9’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地被卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-OR11取代；其中每个R9、R9'、R10和R11独立地选自H、D、羟基、C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10 芳基和5-至7-元杂芳基；且a是1至10的整数；或具有式III或IV
Figure 875062DEST_PATH_IMAGE012
其中b是0至30的整数。
14. 项目13的肽微阵列，其中每个R8和R8’是氢。
15. 项目13或14的肽微阵列，其中每个L'和L''独立地是
Figure 398447DEST_PATH_IMAGE013
或
Figure 562712DEST_PATH_IMAGE014
。
16. 项目1至15中任一项的肽微阵列，其中m是0。
17. 项目1至16中任一项的肽微阵列，其中n是0。
18. 项目1至12或16至17中任一项的肽微阵列，其中每个R8和R8’是氢，m是0，n是0，a是5，L'存在，且L''不存在。
19. 项目1至13或16至18中任一项的肽微阵列，其中L'是6-氨基己酸。
20. 项目1至14、16至17或19中任一项的肽微阵列，其中L''是CH2CH2。
21. 项目1至20中任一项的肽微阵列，其中t是0，且p是1至100的整数。
22. 项目1至21中任一项的肽微阵列，其中p是1至20的整数。
23. 项目1至22中任一项的肽微阵列，其中所述固体支持物选自以下材料：塑料、玻璃和碳复合物。
24. 项目1至23中任一项的肽微阵列，其中所述反应性表面包含活化的胺。
25. 项目1至24中任一项的肽微阵列，其中所述肽群体的目标氨基酸序列包含相同数量的氨基酸。
26. 项目1至25中任一项的肽微阵列，其中所述肽群体的目标氨基酸序列包含五个氨基酸。
27. 项目1至26中任一项的肽微阵列，其中所述肽群体的目标氨基酸序列不含有甲硫氨酸氨基酸、半胱氨酸氨基酸、相同氨基酸的氨基酸重复或由组氨酸(H)-脯氨酸(P)-谷氨酰胺(Q)序列组成的氨基酸基序。
28. 项目1至27中任一项的肽微阵列，其中所述肽群体的每个环状肽还包含N末端摆动合成寡肽或C末端摆动合成寡肽中的至少一种。
29. 项目28的肽微阵列，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽包含具有相同数量的氨基酸的氨基酸序列。
30. 项目28或29的肽微阵列，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽随机衍生自具有约相等浓度的20种氨基酸中的每一种或20个氨基酸的子集的氨基酸混合物。
31. 项目28或29的肽微阵列，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽随机衍生自具有约3 (G):1(S)浓度的氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的氨基酸混合物。
32. 项目28至31中任一项的肽微阵列，其中存在C末端和N末端摆动合成寡肽，且C末端和N末端摆动合成寡肽两者包含相同数量的五个或更多个氨基酸。
33. 产生肽微阵列的方法，所述肽微阵列包含至少一种式I的环状肽
Figure 804338DEST_PATH_IMAGE015
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且*是连接至少一种环状肽与具有反应性表面的固体支持物的连接点；
所述方法包括使式II的官能化肽在引起Z形成的条件下反应的步骤
Figure 17144DEST_PATH_IMAGE016
其中R1、R2 R3、R4、R5、R6、Q、L'、L''、m、n、p、q、r、t、u和*如对于式I所定义；
每个R7独立地选自-OH、C末端封端基团和
Figure 660615DEST_PATH_IMAGE017
；
每个R8独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R9独立地是-OH或C末端封端基团；
每个X'独立地选自键、与Z''共价连接的天然氨基酸侧链和与Z''共价连接的非天然氨基酸侧链；
每个Y'独立地选自键、与Z'共价连接的天然氨基酸侧链和与Z'共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z'和Z''各自独立地选自键、-OH、氢、硫醇、胺、羧酸、酰胺、炔、叠氮化物、任选取代的氨基苯酚、天然氨基酸侧链、非天然氨基酸侧链、N末端保护基和C末端保护基，条件是Z'和Z''是组合形成Z的互补基团；
b是0至50的整数；
且***是与所述官能化肽的其余部分的连接点；
其中所述至少一种环状肽被固定至所述反应性表面，且其中所述至少一种环状肽是固定至所述反应性表面的肽群体的一部分，其中所述肽群体包含独立地选择的目标氨基酸序列。
34. 项目33的方法，其中Z包含选自以下的部分：酰胺键、
Figure 995782DEST_PATH_IMAGE018
其中v是0至6的整数，w是0至6的整数，且y是0至6的整数，且**是与所述环状肽的其余部分的连接点。
35. 项目33或34的方法，其中Z包含肽键，Z'包含C末端保护基或Z''包含N末端保护基，Q是羰基，q是0，r是1，且u是0。
36. 项目35的方法，其还包括从所述官能化肽的其余部分除去Z'或Z''以引起形成肽键。
37. 项目33或34的方法，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 459124DEST_PATH_IMAGE019
，X'是与Z''的键，Y'是与Z'的键，Z'和Z''包含半胱氨酸侧链，q是1，且u是1。
38. 项目37的方法，其还包括使所述官能化肽经受氧化条件以引起形成
Figure 6780DEST_PATH_IMAGE020
。
39. 项目33或34的方法，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 973599DEST_PATH_IMAGE021
，Y'是与Z'的键，Z'包含
Figure 853568DEST_PATH_IMAGE022
，Z''包含叠氮化物，u是1，且v是1。
40. 项目39的方法，其还包括使所述官能化肽与铜催化剂接触以引起形成
Figure 804206DEST_PATH_IMAGE023
。
41. 项目33或34的方法，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 624395DEST_PATH_IMAGE024
，Y'是与Z'的键，Z'包含
Figure 976879DEST_PATH_IMAGE025
，Z''包含叠氮化物，u是1，且v是1。
42. 项目41的方法，其还包括使所述官能化肽与铜催化剂接触以引起形成
Figure 919427DEST_PATH_IMAGE026
。
43. 项目33或34的方法，其中Z包含
Figure 793580DEST_PATH_IMAGE027
，Y'是与Z'的键，Z'包含
Figure 214197DEST_PATH_IMAGE028
，r是0，u是1，且y是1。
44. 项目43的方法，其还包括使所述官能化肽与铁氰化钾接触以引起形成
Figure 686767DEST_PATH_IMAGE029
。
45. 项目33或34的方法，其中定义R3和R8，使得所述官能化肽包含butelase 1识别序列，Y是与Z的键，Z包含
Figure 800216DEST_PATH_IMAGE030
，Y'是与Z'的键，Z'是天冬酰胺或天冬氨酸侧链，q是0，且u是1。
46. 项目45的方法，其还包括使所述官能化肽与butelase 1接触以引起形成
Figure 459868DEST_PATH_IMAGE031
。
47. 项目33或34的方法，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 153017DEST_PATH_IMAGE032
，X'是与Z''的键，Y'是与Z'的键，Z'是谷氨酰胺侧链，且Z''是赖氨酸侧链，或Z'是赖氨酸侧链，且Z''是谷氨酰胺侧链，q是1，且u是1。
48. 项目47的方法，其还包括使所述官能化肽与微生物转谷氨酰胺酶接触以引起形成
Figure 948935DEST_PATH_IMAGE033
。
49. 项目33至48中任一项的方法，其中L'是6-氨基己酸。
50. 项目33至49中任一项的方法，其中L''是CH2CH2。
51. 项目33至50中任一项的方法，其中m是0。
52. 项目33至51中任一项的方法，其中n是0。
53. 项目33至52中任一项的方法，其中t是0，且p是1至100的整数。
54. 项目33至53中任一项的方法，其中p是1至20的整数。
55. 项目33或34的方法，其中Q是羰基，Z是酰胺键，r是1，u是0，且q是0。
56. 项目33至55中任一项的方法，其中所述固体支持物选自以下材料：塑料、玻璃和碳复合物。
57. 项目33至56中任一项的方法，其中所述反应性表面包含活化的胺。
58. 项目33至57中任一项的方法，其中所述肽群体的目标氨基酸序列包含相同数量的氨基酸。
59. 项目33至58中任一项的方法，其中所述肽群体的目标氨基酸序列包含五个氨基酸。
60. 项目33至59中任一项的方法，其中所述肽群体的目标氨基酸序列不含有甲硫氨酸氨基酸、半胱氨酸氨基酸、相同氨基酸的氨基酸重复或由组氨酸(H)-脯氨酸(P)-谷氨酰胺(Q)序列组成的氨基酸基序。
61. 项目33至60中任一项的方法，其中所述肽群体的每个环状肽还包含N末端摆动合成寡肽或C末端摆动合成寡肽中的至少一种。
62. 项目61的方法，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽包含具有相同数量的氨基酸的氨基酸序列。
63. 项目61或62的方法，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽随机衍生自具有约相等浓度的20种氨基酸中的每一种或20个氨基酸的子集的氨基酸混合物。
64. 项目61或62的方法，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽随机衍生自具有约3 (G):1(S)浓度的氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的氨基酸混合物。
65. 项目61至64中任一项的方法，其中存在C末端和N末端摆动合成寡肽，且C末端和N末端摆动合成寡肽两者包含相同数量的五个或更多个氨基酸。
66. 一种制备肽微阵列的方法，其包括：
产生至少一个第一线性肽亚阵列，其包含与微阵列表面共价连接的第一多个线性肽；
产生至少一个第二线性肽亚阵列，其包含与微阵列表面共价连接的第二多个线性肽，其中所述第二多个线性肽具有与所述第一多个线性肽相同的氨基酸序列；和
在使第一多个线性肽环化的条件下处理肽微阵列以提供包含多个环化肽的至少一个环化肽亚阵列，其中第二多个线性肽基本上不环化。
67. 项目66的方法，其中所述第一多个线性肽是第一多个受保护线性肽，其中所述第一多个受保护线性肽的C末端受第一保护基保护；且
所述第二多个线性肽是第二多个受保护线性肽，其中所述第二多个受保护线性肽具有与所述第一多个受保护线性肽相同的氨基酸序列，且其中所述第二多个受保护线性肽的C末端受不同于第一保护基的第二保护基保护。
68. 项目67的方法，其还包括使肽微阵列与第一脱保护试剂接触以选择性去除第一保护基以提供包含第一多个脱保护线性肽的至少一个第一脱保护线性肽亚阵列；和
使肽微阵列与第二脱保护试剂接触以去除第二保护基以提供包含第二多个脱保护线性肽的至少一个第二脱保护线性肽亚阵列。
69. 项目66-68中任一项的方法，其中第一多个线性肽和第二多个线性肽各自通过氨基酸侧链共价连接到微阵列表面。
70. 项目69的方法，其中所述氨基酸侧链是羧酸侧链。
71. 项目70的方法，其中所述羧酸侧链是谷氨酸或天冬氨酸侧链。
72. 项目69至71中任一项的方法，其中所述氨基酸侧链是C末端氨基酸的一部分。
73. 项目66至72中任一项的方法，其中所述第一多个线性肽的至少一个分子不能环化。
74. 项目73的方法，其中未能环化的第一多个线性肽中的至少一个不从第一脱保护线性肽亚阵列去除。
75. 项目67至74中任一项的方法，其中第一保护基是OAll。
76. 项目67至75中任一项的方法，其中所述第一脱保护试剂是钯催化剂。
77. 项目76的方法，其中所述钯催化剂是四(三苯基膦)钯(0)。
78. 项目67至77中任一项的方法，其中所述第二保护基是OtBu。
79. 项目67至78中任一项的方法，其中所述第二脱保护试剂是酸。
80. 项目79的方法，其中所述酸是三氟乙酸。
81. 项目66至80中任一项的方法，其中在使第一多个线性肽环化的条件下处理肽微阵列包括活化第一多个线性肽的C末端的羧基以与第一多个线性肽的N末端的氨基基团反应以形成酰胺键。
82. 项目66至81中任一项的方法，其中在使第一多个线性肽环化的条件下处理肽微阵列包括使第一多个线性肽与HOBt和HBTU接触。
83. 鉴定活性环状肽的方法，其包括根据项目66至82中任一项的方法产生肽微阵列，使所述肽微阵列与潜在结合基团接触，和在接触步骤之后测量所述肽微阵列上潜在结合基团的存在。
84. 项目83的方法，其中所述测量步骤包括测量荧光活性。
85. 一种产生肽微阵列的方法，所述肽微阵列包含至少一种式III的环状肽
Figure 702127DEST_PATH_IMAGE034
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
Q是羰基；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
t是0至100的整数；且
*是连接至少一种环状肽与具有反应性表面的固体支持物的连接点；
所述方法包括在环状肽亚阵列上产生多个第一肽，其中所述第一肽具有式IV
Figure 583495DEST_PATH_IMAGE035
其中R1、R2、R3、R4、Q、L'、L''、m、n、p、t和*如对于式III所定义；
Z1是第一羧基保护基；且
Z2是氢；
在线性肽亚阵列上产生多个第二肽，其中所述第二肽具有式V
Figure 80336DEST_PATH_IMAGE036
其中R1、R2、R3、R4、Q、L'、L''、Z2、m、n、p、t和*如对于式IV所定义；且
Z3是不同于第一羧基保护基的第二羧基保护基；且
是氢；且
处理所述第一肽以形成第一多个线性脱保护肽，其中所述线性脱保护肽具有式VI
Figure 730760DEST_PATH_IMAGE037
其中R1、R2、R3、R4、Q、L'、L''、Z2、m、n、p、t和*如对于式IV所定义；且
Z1是-OH；随后
处理所述线性脱保护肽以形成环状肽；随后
处理所述第二肽以形成第二多个式VI的线性脱保护肽；
其中所述第一肽和所述第二肽被固定至所述反应性表面，且其中所述至少一种环状肽是固定至所述反应性表面的肽群体的一部分，其中所述肽群体包含独立地选择的目标氨基酸序列。
86. 项目85的方法，其中L'是6-氨基己酸。
87. 项目85或86的方法，其中L''是CH2CH2。
88. 项目85至87中任一项的方法，其中m是0。
89. 项目85至88中任一项的方法，其中n是0。
90. 项目85至89中任一项的方法，其中t是0，且p是1至100的整数。
91. 项目85至90中任一项的方法，其中p是1至20的整数。
92. 项目85至91中任一项的方法，其中所述环状肽亚阵列上的线性脱保护肽的至少一个分子不能环化。
93. 项目85至92中任一项的方法，其中所述环状肽亚阵列上的线性脱保护肽不从所述环状肽亚阵列去除。
94. 项目85至93中任一项的方法，其中第一羧基保护基是OAll。
95. 项目85至94中任一项的方法，其中处理所述第一肽以形成所述第一多个线性脱保护肽包括使所述第一肽与钯接触。
96. 项目85至95中任一项的方法，其中所述羧基第二保护基是OtBu。
97. 项目85至96中任一项的方法，其中处理所述第二肽以形成所述第二多个线性脱保护肽包括使所述第二肽与酸接触。
98. 项目97的方法，其中所述酸是三氟乙酸。
99. 项目85至98中任一项的方法，其中处理所述第一肽以形成所述环状肽包括活化第一肽的羧基以与所述第一肽的游离氨基反应以形成Z。
100. 项目85至99中任一项的方法，其中处理所述第一肽以形成所述环状肽包括使第一肽与HOBt和HBTU接触。
101. 一种鉴定活性环状肽的方法，其包括根据项目85至100中任一项的方法产生肽微阵列，使所述肽微阵列与潜在结合基团接触，和在接触步骤之后测量所述肽微阵列上潜在结合基团的存在。
102. 项目101的方法，其中所述测量步骤包括测量荧光活性。
103. 一种鉴定肽结合剂的方法，其包括以下步骤：
a. 将目标靶标暴露于包含第一肽结合剂群体的肽微阵列，所述第一肽结合剂群体包含式I的环状肽
Figure 389274DEST_PATH_IMAGE038
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且
*是将环状肽固定在具有第一反应表面的第一固体支持物上的共价键，由此目标靶标结合环状肽；
b. 鉴定结合目标靶标的第一肽结合剂群体的肽结合剂序列中的重叠，由此确定核心结合剂序列；
c. 对所述核心结合剂序列的氨基酸进行选自单个氨基酸取代、双氨基酸取代、氨基酸缺失和氨基酸插入的至少一个改变，由此产生第二核心结合剂序列群体；
d. 将第二核心结合剂序列群体暴露于所述目标靶标，由此目标靶标结合第二核心结合剂序列群体的至少一个肽序列，并且其中所述第二核心结合剂序列群体包含式I的环状肽
Figure 274052DEST_PATH_IMAGE039
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且
*是将环状肽固定在具有第二反应表面的第二固体支持物上的共价键；
e. 鉴定表现出与目标靶标的强结合性质的第二核心结合剂序列群体的一个或多个序列，由此确定成熟的核结合剂序列；
f. 进行步骤e中确定的成熟的核心肽结合剂序列的N末端和C末端延伸中的至少一个，由此产生成熟、延长的肽结合剂群体；
g. 将目标靶标暴露于包含步骤f中产生的成熟、延伸的肽结合剂的群体的肽微阵列，其中所述成熟、延伸的肽结合剂的群体包含式I的环状肽
Figure 574584DEST_PATH_IMAGE040
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且
*是将环状肽固定在具有第三反应表面的第三固体支持物上的共价键；且
h. 鉴定包含成熟、延伸的肽结合剂的群体的肽的N末端或C末端肽结合剂序列中的重叠，由此确定成熟、延伸的核心肽结合剂序列。
104. 项目103的方法，其中Z包含选自以下的部分：酰胺键、
Figure 345093DEST_PATH_IMAGE041
其中v是0至6的整数，w是0至6的整数，且y是0至6的整数，且**是与所述环状肽的其余部分的连接点。
105. 项目103或104的方法，其中Z包含肽键，Q是羰基，q是0，r是1，且u是0。
106. 项目103或104的方法，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 174509DEST_PATH_IMAGE042
，q是1，且u是1。
107. 项目103或104的方法，其中Z包含
Figure 905836DEST_PATH_IMAGE043
且v是1。
108. 项目103或104的方法，其中Z包含
Figure 275637DEST_PATH_IMAGE044
且w是1。
109. 项目103或104的方法，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 166233DEST_PATH_IMAGE045
，u是1，且y是1。
110. 项目103或104的方法，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 399506DEST_PATH_IMAGE046
，q是0，且u是1。
111. 项目103或104的方法，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 8342DEST_PATH_IMAGE047
，q是1，且u是1。
112. 项目103至111中任一项的方法，其中L'是6-氨基己酸。
113. 项目103至112中任一项的方法，其中L''是CH2CH2。
114. 项目103至113中任一项的方法，其中m是0。
115. 项目103至114中任一项的方法，其中n是0。
116. 项目103至115中任一项的方法，其中t是0，且p是1至100的整数。
117. 项目103至116中任一项的方法，其中p是1至20的整数。
118. 项目103至117中任一项的方法，其中进行成熟、延伸的核心肽结合剂序列的无标记和亲和力分析中的至少一种。
119. 项目103至118中任一项的方法，其中所述第一、第二和/或第三固体支持物包含玻璃、塑料和碳复合物中的至少一种。
120. 项目103至119中任一项的方法，其中所述第一群体的肽结合剂包含相同数量的氨基酸。
121. 项目103至120中任一项的方法，其中所述第一群体的肽结合剂不包括氨基酸半胱氨酸或甲硫氨酸，或组氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺基序或2个或更多个氨基酸的氨基酸重复。
122. 项目103至121中任一项的方法，其中成熟、延伸的肽结合剂的群体的环状肽结合剂包括N末端摆动合成寡肽和C末端摆动合成寡肽中的至少一种。
123. 项目103至122中任一项的方法，其中所述核心结合剂序列包含比构成所述第一肽结合剂群体的每种肽的氨基酸数目更多的氨基酸。
124. 项目103至123中任一项的方法，其中步骤e.和h.包含原则性聚类分析。
125. 项目103至124中任一项的方法，其中对于成熟、延伸的核心肽结合剂序列重复步骤c.至h.。
126. 项目103至125中任一项的方法，其中所述肽微阵列包含一种或多种线性肽，并且其中所述方法还包括使肽微阵列上的一种或多种线性肽与能够消化一种或多种线性肽的蛋白酶接触的步骤。
127. 项目126的方法，其中所述蛋白酶是氨基蛋白酶或氨基蛋白酶的混合物。
128. 项目127的方法，其中所述蛋白酶是二肽基肽酶IV、氨肽酶m或其组合。
129. 项目45或46的方法，其中所述butelase 1识别序列是NHV。
130. 项目47或48的方法，其中所述谷氨酰胺侧链是序列[WY][DE][DE][YW]ALQ[GST]YD (SEQ ID NO:194)的一部分，且所述赖氨酸侧链是序列RSKLG (SEQ ID NO:195)的一部分。
附图简述
图1 是通过利用光刻掩模的光刻技术的方式的用于阵列合成的微阵列系统的示意图(现有技术)。
图2 是通过利用无掩模光刻的光刻技术的方式的用于阵列合成的微阵列系统的示意图(现有技术)。
图3 是说明根据本发明在其上包含肽探针的阵列的示意图。
图4 是本发明的过程的实施方案的示意图。
图5 是说明根据本发明在其上包含肽探针的阵列的另一个实施方案的示意图。
图6 是描绘图4的过程的实施方案的示意图。
图7 是描绘表面上的肽文库的头至尾(酰胺键形成)环化的反应方案的示意图。
图8A 是各自具有谷氨酸接头氨基酸的肽的亚阵列的插图，其中(下方)在脱保护和生物素标记后从谷氨酸接头氨基酸的OtBu-保护的变体形成肽的线性文库，且(上方)在脱保护和生物素标记后从谷氨酸接头氨基酸的OAll-保护的变体形成肽的环状文库。
图8B 是示意图，其(下方)描绘谷氨酸的OtBu-保护的变体的脱保护，随后生物素标记和(上方)谷氨酸的OAll-保护的变体的脱保护，随后生物素标记。
图9 是示意图，其描绘形成线性和环状肽文库的亚阵列的过程，其中未能环化的环状文库的肽与线性文库的肽相同。
图10 是显示与链霉抗生物素蛋白-Cy5结合的形式XXXXU的肽文库的环状相比于线性荧光强度的图。
图11 是显示头至尾环状NQpWQ (SEQ ID NO:84)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片的表面等离子共振(SPR)结合曲线的图。
图12 是显示头至尾环状NQpWQ (SEQ ID NO:84)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片相比于肽浓度的表面等离子共振(SPR)结合的图。虚线指示结合常数。
图13 是显示与链霉抗生物素蛋白-Cy5结合的形式JXXHPQXXJU (SEQ ID NO:86)的肽文库的环状相比于线性荧光强度的图。
图14 是显示与链霉抗生物素蛋白-Cy5结合的形式JXXHPQXXJU (SEQ ID NO:86)的肽文库的环状荧光强度相比于环状和线性荧光强度之间的对数倍数变化(logFC)的图。较暗的点指示最高的100种JXXHPQXXJU (SEQ ID NO:86)环状肽。
图15 是显示与链霉抗生物素蛋白-Cy5结合的形式JXXHPQXXJU (SEQ ID NO:86)的肽文库的环状荧光强度相比于环状和线性荧光强度之间的对数倍数变化(logFC)的图，其中每种XXHPQXX (SEQ ID NO:187)对应于图14中所示图的前100种环状肽之一，并且J是随机的。图15以出现顺序分别公开了SEQ ID NO 230-231。
图16 是显示头至尾环状LYDHPQNGGQ (SEQ ID NO:190)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片在不同肽浓度下的表面等离子共振(SPR)结合曲线的图。
图17 是显示头至尾环状LYDHPQNGGQ (SEQ ID NO:190)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片相比于肽浓度的表面等离子共振(SPR)结合的图。虚线指示结合常数。
图18 是显示线性NH2-LYDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:191)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片在不同肽浓度下的表面等离子共振(SPR)结合曲线的图。
图19 是显示线性NH2-LYDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:191)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片的表面等离子共振(SPR)结合相比于肽浓度的图。虚线指示结合常数。
图20 是显示头至尾环状QNDHPQNGGQ (SEQ ID NO:192)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片在不同肽浓度下的表面等离子共振(SPR)结合曲线的图。
图21 是显示头至尾环状QNDHPQNGGQ (SEQ ID NO:192)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片相比于肽浓度的表面等离子共振(SPR)结合的图。虚线指示结合常数。
图22 是显示线性NH2-QNDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:193)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片在不同肽浓度下的表面等离子共振(SPR)结合曲线的图。
图23 是显示线性NH2-QNDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:193)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片的表面等离子共振(SPR)结合相比于肽浓度的图。虚线指示结合常数。
说明性实施方案的详述
本发明提供了肽微阵列、产生肽微阵列的方法以及使用微阵列鉴定肽结合剂(例如环状肽)的方法，通过使用所述微阵列可以合成、优化和鉴定新颖的肽结合剂(例如环状肽)。在一些实施方案中，最终优化步骤是在肽微阵列上使肽结合剂成熟并延伸后根据本文所述的方法进行环化。
根据一些实施方案，本文公开的肽微阵列通过如下来鉴定肽结合剂(例如，环状肽)：鉴定目标靶标与构成固定在肽微阵列上的全面肽群体的小肽的重叠结合，然后进行分离的核心结合剂序列的彻底肽成熟，随后进行N末端和C末端延伸程序，并且在一个实施方案中，随后环化。在一些实施方案中，成熟、延伸的核心肽结合剂序列可以进行进一步成熟过程和一系列新的N末端和C末端延伸过程，并且例如随后环化。
本发明的几个实施方案描述于本专利申请的概述部分中，并且本申请的该详述部分中描述的每个实施方案适用于概述中描述的实施方案，包括由以下列举的项目描述的实施方案。
1. 一种肽微阵列，其包含至少一种式I的环状肽
Figure 119517DEST_PATH_IMAGE048
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；
且*是连接至少一种环状肽与具有反应性表面的固体支持物的连接点，
其中所述至少一种环状肽被固定至所述反应性表面，且其中所述至少一种环状肽是固定至所述反应性表面的肽群体的一部分，其中所述肽群体包含独立地选择的目标氨基酸序列。
2. 项目1的肽微阵列，其中Z包含选自以下的部分：酰胺键、
Figure 130199DEST_PATH_IMAGE049
其中v是0至6的整数，w是0至6的整数，且y是0至6的整数，且**是与所述环状肽的其余部分的连接点。
3. 项目1或2的肽微阵列，其中Z包含肽键，Q是羰基，q是0，r是1，且u是0。
4. 项目1或2的肽微阵列，其中每个Q和X是半胱氨酸侧链，Z是二硫键，q是1，r是1，t是0，且u是0。
5. 项目1或2的肽微阵列，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 35838DEST_PATH_IMAGE050
，q是1，且u是1。
6. 项目1或2的肽微阵列，其中Z包含
Figure 131970DEST_PATH_IMAGE051
且v是1。
7. 项目1或2的肽微阵列，其中Z包含
Figure 843574DEST_PATH_IMAGE052
且w是1。
8. 项目1或2的肽微阵列，其中Z包含
Figure 708762DEST_PATH_IMAGE053
，r是0，t是0，u是0，且y是1。
9. 项目1或2的肽微阵列，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 847619DEST_PATH_IMAGE054
，u是1，且y是1。
10. 项目1或2的肽微阵列，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 899889DEST_PATH_IMAGE055
，q是0，且u是1。
11. 项目1或2的肽微阵列，其中X是与Z的键，Z包含
Figure 618446DEST_PATH_IMAGE056
，q是1，r是0，t是0，且u是0。
12. 项目1或2的肽微阵列，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 571096DEST_PATH_IMAGE057
，q是1，且u是1。
13. 项目1至12中任一项的肽微阵列，其中每个L'和L''独立地具有式II
Figure 349696DEST_PATH_IMAGE058
其中每个R8和R8’独立地选自H、D、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基、5-至7-元杂芳基、-OR9、 -OC(O)R9、-NR9R9’、-NR9C(O)R10、-C(O)R9、-C(O)OR9和-C(O)NR9R9’，其中C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10芳基和5-至7-元杂芳基中的每个氢原子独立地任选地被卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-OR11取代；其中每个R9、R9'、R10和R11独立地选自H、D、羟基、C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C6环烷基、3-至7-元杂环烷基、C6-C10 芳基和5-至7-元杂芳基；且a是1至10的整数；或具有式III或IV
Figure 154841DEST_PATH_IMAGE059
其中b是0至30的整数。
14. 项目13的肽微阵列，其中每个R8和R8’是氢。
15. 项目13或14的肽微阵列，其中每个L'和L''独立地是
Figure 677089DEST_PATH_IMAGE060
或
Figure 985711DEST_PATH_IMAGE061
。
16. 项目1至15中任一项的肽微阵列，其中m是0。
17. 项目1至16中任一项的肽微阵列，其中n是0。
18. 项目1至12或16至17中任一项的肽微阵列，其中每个R8和R8’是氢，m是0，n是0，a是5，L'存在，且L''不存在。
19. 项目1至13或16至18中任一项的肽微阵列，其中L'是6-氨基己酸。
20. 项目1至14、16至17或19中任一项的肽微阵列，其中L''是CH2CH2。
21. 项目1至20中任一项的肽微阵列，其中t是0，且p是1至100的整数。
22. 项目1至21中任一项的肽微阵列，其中p是1至20的整数。
23. 项目1至22中任一项的肽微阵列，其中所述固体支持物选自以下材料：塑料、玻璃和碳复合物。
24. 项目1至23中任一项的肽微阵列，其中所述反应性表面包含活化的胺。
25. 项目1至24中任一项的肽微阵列，其中所述肽群体的目标氨基酸序列包含相同数量的氨基酸。
26. 项目1至25中任一项的肽微阵列，其中所述肽群体的目标氨基酸序列包含五个氨基酸。
27. 项目1至26中任一项的肽微阵列，其中所述肽群体的目标氨基酸序列不含有甲硫氨酸氨基酸、半胱氨酸氨基酸、相同氨基酸的氨基酸重复或由组氨酸(H)-脯氨酸(P)-谷氨酰胺(Q)序列组成的氨基酸基序。
28. 项目1至27中任一项的肽微阵列，其中所述肽群体的每个环状肽还包含N末端摆动合成寡肽或C末端摆动合成寡肽中的至少一种。
29. 项目28的肽微阵列，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽包含具有相同数量的氨基酸的氨基酸序列。
30. 项目28或29的肽微阵列，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽随机衍生自具有约相等浓度的20种氨基酸中的每一种或20个氨基酸的子集的氨基酸混合物。
31. 项目28或29的肽微阵列，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽随机衍生自具有约3 (G):1(S)浓度的氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的氨基酸混合物。
32. 项目28至31中任一项的肽微阵列，其中存在C末端和N末端摆动合成寡肽，且C末端和N末端摆动合成寡肽两者包含相同数量的五个或更多个氨基酸。
33. 产生肽微阵列的方法，所述肽微阵列包含至少一种式I的环状肽
Figure 935212DEST_PATH_IMAGE062
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且*是连接至少一种环状肽与具有反应性表面的固体支持物的连接点；
所述方法包括使式II的官能化肽在引起Z形成的条件下反应的步骤
Figure 696495DEST_PATH_IMAGE063
其中R1、R2 R3、R4、R5、R6、Q、L'、L''、m、n、p、q、r、t、u和*如对于式I所定义；
每个R7独立地选自-OH、C末端封端基团和
Figure 22434DEST_PATH_IMAGE064
；
每个R8独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R9独立地是-OH或C末端封端基团；
每个X'独立地选自键、与Z''共价连接的天然氨基酸侧链和与Z''共价连接的非天然氨基酸侧链；
每个Y'独立地选自键、与Z'共价连接的天然氨基酸侧链和与Z'共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z'和Z''各自独立地选自键、-OH、氢、硫醇、胺、羧酸、酰胺、炔、叠氮化物、任选取代的氨基苯酚、天然氨基酸侧链、非天然氨基酸侧链、N末端保护基和C末端保护基，条件是Z'和Z''是组合形成Z的互补基团；
b是0至50的整数；
且***是与所述官能化肽的其余部分的连接点；
其中所述至少一种环状肽被固定至所述反应性表面，且其中所述至少一种环状肽是固定至所述反应性表面的肽群体的一部分，其中所述肽群体包含独立地选择的目标氨基酸序列。
34. 项目33的方法，其中Z包含选自以下的部分：酰胺键、
Figure 684097DEST_PATH_IMAGE065
其中v是0至6的整数，w是0至6的整数，且y是0至6的整数，且**是与所述环状肽的其余部分的连接点。
35. 项目33或34的方法，其中Z包含肽键，Z'包含C末端保护基或Z''包含N末端保护基，Q是羰基，q是0，r是1，且u是0。
36. 项目35的方法，其还包括从所述官能化肽的其余部分除去Z'或Z''以引起形成肽键。
37. 项目33或34的方法，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 211025DEST_PATH_IMAGE066
，X'是与Z''的键，Y'是与Z'的键，Z'和Z''包含半胱氨酸侧链，q是1，且u是1。
38. 项目37的方法，其还包括使所述官能化肽经受氧化条件以引起形成
Figure 194024DEST_PATH_IMAGE067
。
39. 项目33或34的方法，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 589234DEST_PATH_IMAGE068
，Y'是与Z'的键，Z'包含
Figure 580104DEST_PATH_IMAGE069
，Z''包含叠氮化物，u是1，且v是1。
40. 项目39的方法，其还包括使所述官能化肽与铜催化剂接触以引起形成
Figure 668146DEST_PATH_IMAGE070
。
41. 项目33或34的方法，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 872862DEST_PATH_IMAGE071
，Y'是与Z'的键，Z'包含
Figure 71763DEST_PATH_IMAGE072
，Z''包含叠氮化物，u是1，且v是1。
42. 项目41的方法，其还包括使所述官能化肽与铜催化剂接触以引起形成
Figure 475062DEST_PATH_IMAGE073
。
43. 项目33或34的方法，其中Z包含
Figure 734005DEST_PATH_IMAGE074
，Y'是与Z'的键，Z'包含
Figure 363701DEST_PATH_IMAGE075
，r是0，u是1，且y是1。
44. 项目43的方法，其还包括使所述官能化肽与铁氰化钾接触以引起形成
Figure 100713DEST_PATH_IMAGE076
。
45. 项目33或34的方法，其中定义R3和R8，使得所述官能化肽包含butelase 1识别序列，Y是与Z的键，Z包含
Figure 624098DEST_PATH_IMAGE077
，Y'是与Z'的键，Z'是天冬酰胺或天冬氨酸侧链，q是0，且u是1。
46. 项目45的方法，其还包括使所述官能化肽与butelase 1接触以引起形成
Figure 490160DEST_PATH_IMAGE078
。
47. 项目33或34的方法，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 466207DEST_PATH_IMAGE079
，X'是与Z''的键，Y'是与Z'的键，Z'是谷氨酰胺侧链，且Z''是赖氨酸侧链，或Z'是赖氨酸侧链，且Z''是谷氨酰胺侧链，q是1，且u是1。
48. 项目47的方法，其还包括使所述官能化肽与微生物转谷氨酰胺酶接触以引起形成
Figure 6909DEST_PATH_IMAGE080
。
49. 项目33至48中任一项的方法，其中L'是6-氨基己酸。
50. 项目33至49中任一项的方法，其中L''是CH2CH2。
51. 项目33至50中任一项的方法，其中m是0。
52. 项目33至51中任一项的方法，其中n是0。
53. 项目33至52中任一项的方法，其中t是0，且p是1至100的整数。
54. 项目33至53中任一项的方法，其中p是1至20的整数。
55. 项目33或34的方法，其中Q是羰基，Z是酰胺键，r是1，u是0，且q是0。
56. 项目33至55中任一项的方法，其中所述固体支持物选自以下材料：塑料、玻璃和碳复合物。
57. 项目33至56中任一项的方法，其中所述反应性表面包含活化的胺。
58. 项目33至57中任一项的方法，其中所述肽群体的目标氨基酸序列包含相同数量的氨基酸。
59. 项目33至58中任一项的方法，其中所述肽群体的目标氨基酸序列包含五个氨基酸。
60. 项目33至59中任一项的方法，其中所述肽群体的目标氨基酸序列不含有甲硫氨酸氨基酸、半胱氨酸氨基酸、相同氨基酸的氨基酸重复或由组氨酸(H)-脯氨酸(P)-谷氨酰胺(Q)序列组成的氨基酸基序。
61. 项目33至60中任一项的方法，其中所述肽群体的每个环状肽还包含N末端摆动合成寡肽或C末端摆动合成寡肽中的至少一种。
62. 项目61的方法，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽包含具有相同数量的氨基酸的氨基酸序列。
63. 项目61或62的方法，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽随机衍生自具有约相等浓度的20种氨基酸中的每一种或20个氨基酸的子集的氨基酸混合物。
64. 项目61或62的方法，其中所述肽群体的每个环状肽的摆动合成寡肽随机衍生自具有约3 (G):1(S)浓度的氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的氨基酸混合物。
65. 项目61至64中任一项的方法，其中存在C末端和N末端摆动合成寡肽，且C末端和N末端摆动合成寡肽两者包含相同数量的五个或更多个氨基酸。
66. 一种制备肽微阵列的方法，其包括：
产生至少一个第一线性肽亚阵列，其包含与微阵列表面共价连接的第一多个线性肽；
产生至少一个第二线性肽亚阵列，其包含与微阵列表面共价连接的第二多个线性肽，其中所述第二多个线性肽具有与所述第一多个线性肽相同的氨基酸序列；和
在使第一多个线性肽环化的条件下处理肽微阵列以提供包含多个环化肽的至少一个环化肽亚阵列，其中第二多个线性肽基本上不环化。
67. 项目66的方法，其中所述第一多个线性肽是第一多个受保护线性肽，其中所述第一多个受保护线性肽的C末端受第一保护基保护；且
所述第二多个线性肽是第二多个受保护线性肽，其中所述第二多个受保护线性肽具有与所述第一多个受保护线性肽相同的氨基酸序列，且其中所述第二多个受保护线性肽的C末端受不同于第一保护基的第二保护基保护。
68. 项目67的方法，其还包括使肽微阵列与第一脱保护试剂接触以选择性去除第一保护基以提供包含第一多个脱保护线性肽的至少一个第一脱保护线性肽亚阵列；和
使肽微阵列与第二脱保护试剂接触以去除第二保护基以提供包含第二多个脱保护线性肽的至少一个第二脱保护线性肽亚阵列。
69. 项目66-68中任一项的方法，其中第一多个线性肽和第二多个线性肽各自通过氨基酸侧链共价连接到微阵列表面。
70. 项目69的方法，其中所述氨基酸侧链是羧酸侧链。
71. 项目70的方法，其中所述羧酸侧链是谷氨酸或天冬氨酸侧链。
72. 项目69至71中任一项的方法，其中所述氨基酸侧链是C末端氨基酸的一部分。
73. 项目66至72中任一项的方法，其中所述第一多个线性肽的至少一个分子不能环化。
74. 项目73的方法，其中未能环化的第一多个线性肽中的至少一个不从第一脱保护线性肽亚阵列去除。
75. 项目67至74中任一项的方法，其中第一保护基是OAll。
76. 项目67至75中任一项的方法，其中所述第一脱保护试剂是钯催化剂。
77. 项目76的方法，其中所述钯催化剂是四(三苯基膦)钯(0)。
78. 项目67至77中任一项的方法，其中所述第二保护基是OtBu。
79. 项目67至78中任一项的方法，其中所述第二脱保护试剂是酸。
80. 项目79的方法，其中所述酸是三氟乙酸。
81. 项目66至80中任一项的方法，其中在使第一多个线性肽环化的条件下处理肽微阵列包括活化第一多个线性肽的C末端的羧基以与第一多个线性肽的N末端的氨基基团反应以形成酰胺键。
82. 项目66至81中任一项的方法，其中在使第一多个线性肽环化的条件下处理肽微阵列包括使第一多个线性肽与HOBt和HBTU接触。
83. 鉴定活性环状肽的方法，其包括根据项目66至82中任一项的方法产生肽微阵列，使所述肽微阵列与潜在结合基团接触，和在接触步骤之后测量所述肽微阵列上潜在结合基团的存在。
84. 项目83的方法，其中所述测量步骤包括测量荧光活性。
85. 一种产生肽微阵列的方法，所述肽微阵列包含至少一种式III的环状肽
Figure 650380DEST_PATH_IMAGE081
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
Q是羰基；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
t是0至100的整数；且
*是连接至少一种环状肽与具有反应性表面的固体支持物的连接点；
所述方法包括在环状肽亚阵列上产生多个第一肽，其中所述第一肽具有式IV
Figure 454388DEST_PATH_IMAGE082
其中R1、R2、R3、R4、Q、L'、L''、m、n、p、t和*如对于式III所定义；
Z1是第一羧基保护基；且
Z2是氢；
在线性肽亚阵列上产生多个第二肽，其中所述第二肽具有式V
Figure 917731DEST_PATH_IMAGE083
其中R1、R2、R3、R4、Q、L'、L''、Z2、m、n、p、t和*如对于式IV所定义；且
Z3是不同于第一羧基保护基的第二羧基保护基；且
是氢；且
处理所述第一肽以形成第一多个线性脱保护肽，其中所述线性脱保护肽具有式VI
Figure 465387DEST_PATH_IMAGE084
其中R1、R2、R3、R4、Q、L'、L''、Z2、m、n、p、t和*如对于式IV所定义；且
Z1是-OH；随后
处理所述线性脱保护肽以形成环状肽；随后
处理所述第二肽以形成第二多个式VI的线性脱保护肽；
其中所述第一肽和所述第二肽被固定至所述反应性表面，且其中所述至少一种环状肽是固定至所述反应性表面的肽群体的一部分，其中所述肽群体包含独立地选择的目标氨基酸序列。
86. 项目85的方法，其中L'是6-氨基己酸。
87. 项目85或86的方法，其中L''是CH2CH2。
88. 项目85至87中任一项的方法，其中m是0。
89. 项目85至88中任一项的方法，其中n是0。
90. 项目85至89中任一项的方法，其中t是0，且p是1至100的整数。
91. 项目85至90中任一项的方法，其中p是1至20的整数。
92. 项目85至91中任一项的方法，其中所述环状肽亚阵列上的线性脱保护肽的至少一个分子不能环化。
93. 项目85至92中任一项的方法，其中所述环状肽亚阵列上的线性脱保护肽不从所述环状肽亚阵列去除。
94. 项目85至93中任一项的方法，其中第一羧基保护基是OAll。
95. 项目85至94中任一项的方法，其中处理所述第一肽以形成所述第一多个线性脱保护肽包括使所述第一肽与钯接触。
96. 项目85至95中任一项的方法，其中所述羧基第二保护基是OtBu。
97. 项目85至96中任一项的方法，其中处理所述第二肽以形成所述第二多个线性脱保护肽包括使所述第二肽与酸接触。
98. 项目97的方法，其中所述酸是三氟乙酸。
99. 项目85至98中任一项的方法，其中处理所述第一肽以形成所述环状肽包括活化第一肽的羧基以与所述第一肽的游离氨基反应以形成Z。
100. 项目85至99中任一项的方法，其中处理所述第一肽以形成所述环状肽包括使第一肽与HOBt和HBTU接触。
101. 一种鉴定活性环状肽的方法，其包括根据项目85至100中任一项的方法产生肽微阵列，使所述肽微阵列与潜在结合基团接触，和在接触步骤之后测量所述肽微阵列上潜在结合基团的存在。
102. 项目101的方法，其中所述测量步骤包括测量荧光活性。
103. 一种鉴定肽结合剂的方法，其包括以下步骤：
a. 将目标靶标暴露于包含第一肽结合剂群体的肽微阵列，所述第一肽结合剂群体包含式I的环状肽
Figure 166626DEST_PATH_IMAGE085
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且
*是将环状肽固定在具有第一反应表面的第一固体支持物上的共价键，由此目标靶标结合环状肽；
b. 鉴定结合目标靶标的第一肽结合剂群体的肽结合剂序列中的重叠，由此确定核心结合剂序列；
c. 对所述核心结合剂序列的氨基酸进行选自单个氨基酸取代、双氨基酸取代、氨基酸缺失和氨基酸插入的至少一个改变，由此产生第二核心结合剂序列群体；
d. 将第二核心结合剂序列群体暴露于所述目标靶标，由此目标靶标结合第二核心结合剂序列群体的至少一个肽序列，并且其中所述第二核心结合剂序列群体包含式I的环状肽
Figure 407115DEST_PATH_IMAGE086
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且
*是将环状肽固定在具有第二反应表面的第二固体支持物上的共价键；
e. 鉴定表现出与目标靶标的强结合性质的第二核心结合剂序列群体的一个或多个序列，由此确定成熟的核结合剂序列；
f. 进行步骤e中确定的成熟的核心肽结合剂序列的N末端和C末端延伸中的至少一个，由此产生成熟、延长的肽结合剂群体；
g. 将目标靶标暴露于包含步骤f中产生的成熟、延伸的肽结合剂的群体的肽微阵列，其中所述成熟、延伸的肽结合剂的群体包含式I的环状肽
Figure 92174DEST_PATH_IMAGE087
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是0至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且
*是将环状肽固定在具有第三反应表面的第三固体支持物上的共价键；且
h. 鉴定包含成熟、延伸的肽结合剂的群体的肽的N末端或C末端肽结合剂序列中的重叠，由此确定成熟、延伸的核心肽结合剂序列。
104. 项目103的方法，其中Z包含选自以下的部分：酰胺键、
Figure 443521DEST_PATH_IMAGE088
其中v是0至6的整数，w是0至6的整数，且y是0至6的整数，且**是与所述环状肽的其余部分的连接点。
105. 项目103或104的方法，其中Z包含肽键，Q是羰基，q是0，r是1，且u是0。
106. 项目103或104的方法，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 264847DEST_PATH_IMAGE089
，q是1，且u是1。
107. 项目103或104的方法，其中Z包含
Figure 174771DEST_PATH_IMAGE090
且v是1。
108. 项目103或104的方法，其中Z包含
Figure 81548DEST_PATH_IMAGE091
且w是1。
109. 项目103或104的方法，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 377531DEST_PATH_IMAGE092
，u是1，且y是1。
110. 项目103或104的方法，其中Y是与Z的键，Z包含
Figure 850100DEST_PATH_IMAGE093
，q是0，且u是1。
111. 项目103或104的方法，其中X和Y是与Z的键，Z包含
Figure 635654DEST_PATH_IMAGE094
，q是1，且u是1。
112. 项目103至111中任一项的方法，其中L'是6-氨基己酸。
113. 项目103至112中任一项的方法，其中L''是CH2CH2。
114. 项目103至113中任一项的方法，其中m是0。
115. 项目103至114中任一项的方法，其中n是0。
116. 项目103至115中任一项的方法，其中t是0，且p是1至100的整数。
117. 项目103至116中任一项的方法，其中p是1至20的整数。
118. 项目103至117中任一项的方法，其中进行成熟、延伸的核心肽结合剂序列的无标记和亲和力分析中的至少一种。
119. 项目103至118中任一项的方法，其中所述第一、第二和/或第三固体支持物包含玻璃、塑料和碳复合物中的至少一种。
120. 项目103至119中任一项的方法，其中所述第一群体的肽结合剂包含相同数量的氨基酸。
121. 项目103至120中任一项的方法，其中所述第一群体的肽结合剂不包括氨基酸半胱氨酸或甲硫氨酸，或组氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺基序或2个或更多个氨基酸的氨基酸重复。
122. 项目103至121中任一项的方法，其中成熟、延伸的肽结合剂的群体的环状肽结合剂包括N末端摆动合成寡肽和C末端摆动合成寡肽中的至少一种。
123. 项目103至122中任一项的方法，其中所述核心结合剂序列包含比构成所述第一肽结合剂群体的每种肽的氨基酸数目更多的氨基酸。
124. 项目103至123中任一项的方法，其中步骤e.和h.包含原则性聚类分析。
125. 项目103至124中任一项的方法，其中对于成熟、延伸的核心肽结合剂序列重复步骤c.至h.。
126. 项目103至125中任一项的方法，其中所述肽微阵列包含一种或多种线性肽，并且其中所述方法还包括使肽微阵列上的一种或多种线性肽与能够消化一种或多种线性肽的蛋白酶接触的步骤。
127. 项目126的方法，其中所述蛋白酶是氨基蛋白酶或氨基蛋白酶的混合物。
128. 项目127的方法，其中所述蛋白酶是二肽基肽酶IV、氨肽酶m或其组合。
129. 项目45或46的方法，其中所述butelase 1识别序列是NHV。
130. 项目47或48的方法，其中所述谷氨酰胺侧链是序列[WY][DE][DE][YW]ALQ[GST]YD (SEQ ID NO:194)的一部分，且所述赖氨酸侧链是序列RSKLG (SEQ ID NO:195)的一部分。
在本文所述的各种实施方案中，目标靶标可以是任何分子，包括但不限于生物大分子诸如蛋白质、肽、核酸(例如DNA或RNA)，多碳水化合物或小分子分子诸如有机化合物或有机金属配合物，或任何其他有助于疾病，诸如下列疾病的分子(例如，治疗性肽的受体，被治疗性肽抑制或激活的酶或任何其他其中分子的活性被治疗性肽改变的分子)。在一个实施方案中，目标靶标可以是涉及疾病状态的分子，并且环状肽可以是治疗性肽。
在所述环状肽是治疗性肽的实施方案中，治疗的疾病可以选自癌症、传染病、心脏病(例如动脉粥样硬化)和其他胆固醇相关疾病、中风、创伤、疼痛、炎性疾病、诸如关节炎(例如类风湿性关节炎)、炎性肠病、牛皮癣、糖尿病或自身免疫性疾病、呼吸疾病诸如哮喘或慢性阻塞性肺病、腹泻病、遗传病、神经病症诸如阿尔茨海默氏病、肌营养不良或帕金森病、精神病症或能够用治疗性肽(例如环状肽)治疗的任何其他类型的疾病。
在其他实施方案中，所述疾病可以是选自癌、肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、鼻咽癌、白血病、腺癌和骨髓瘤的癌症。在其他实施方案中，所述疾病可以是选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈部癌、黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、霍奇金氏病、食管癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、肾癌和脑癌或可以用治疗性肽(例如环状肽)治疗的任何其他类型的癌症。
在一些情况下，当前体线性肽具有无法完成的低效环化反应、产生线性和环状肽的混合物时，在微阵列上产生环状肽文库可能是有挑战性的。可能难以解释低效环化，因为环化反应可能是序列特异性的。在环化未完成的情况下，所得混合物包含线性和环状肽，其中环状与线性肽的比率基于本领域已知的方法不是恒定的或无法简单预测。通过将环状肽从其线性对应物中纯化来解决这些挑战是非常困难的。
在一个实施方案中，可以进行步骤以增加微阵列上的环化肽相对于肽微阵列上的线性肽的比率。在这方面，由于环化效率低，所以肽微阵列包含一种或多种线性肽以及环状肽。因此，在这方面，环化方法可以还包括使肽微阵列上的一种或多种线性肽与能够消化一种或多种线性肽的蛋白酶接触的步骤。在该实施方案中，可以重复本文所述的成熟/延伸/环化方法的步骤以增加肽微阵列上环状肽的产量。
在一些实施方案中，不是增加环化的产率或从其线性前体纯化环状肽，而是与线性标准品一起形成环状肽。如下文更详细描述，通过产生与未能环化的肽相同的线性肽，可以测量线性肽与靶蛋白的相互作用。因此，可以测量相同序列的线性和环状肽之间的差异以鉴定具有高环状活性的肽。
在一个说明性实施方案中，蛋白酶可以是氨基蛋白酶，诸如氨肽酶m、胱氨酰氨肽酶、谷氨酰氨肽酶、亮氨酰氨肽酶或焦谷氨酰肽酶或氨基蛋白酶的混合物。在另一个说明性方面，蛋白酶可以是二肽酶，诸如二肽基肽酶IV、羧肽酶、三肽基肽酶、金属肽酶或其组合。
在本文所述的成熟/延伸/环化方法的一个实施方案中，可以形成异肽键以使肽微阵列上的肽环化。在一个方面，可以连接的氨基酸可以是同一肽中的谷氨酰胺残基和赖氨酸残基，并且可以使用转谷氨酰胺酶形成连接。
在该实施方案中，肽的含谷氨酰胺部分可以包含GDYALQGPG (SEQ ID NO:1)的序列基序。在其中序列基序是GDYALQGPG (SEQ ID NO:1)的实施方案中，肽的含谷氨酰胺部分可以包含选自如下的序列：CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:2)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:3)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:4)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:5)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:6)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:7)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:8)、EGGDYALQGPG (SEQ IDNO:9)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:10)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:11)、QGGDYALQGPG (SEQID NO:12)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:13)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:14)、HGGDYALQGPG(SEQ ID NO:15)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:16)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:17)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:18)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:19)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:20)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:21)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:22)、GYGDYALQGPG (SEQ IDNO:23)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:24)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:25)、GHGDYALQGPG (SEQID NO:26)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)或其组合。在另一个实施方案中，肽的含谷氨酰胺部分可以包含序列DYALQ (SEQ ID NO:28)。
在另一个实施方案中，肽的含谷氨酰胺部分可以包含选自如下的序列：GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:29)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:30)、GGGGDYALQGGGG (SEQ IDNO:31)和GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO:32)或其组合. 在另一个实施方案中，肽的含谷氨酰胺部分可以包含序列GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:29)。
在又一个实施方案中，肽的含谷氨酰胺部分可以包含[YF][VA]LQG (SEQ ID NO:33)的序列基序。在该实施方案中，肽的含谷氨酰胺部分可以包含选自如下的序列：DYALQ(SEQ ID NO:34)、DYVLQ (SEQ ID NO:35)、NYALQ (SEQ ID NO:36)、EYALQ (SEQ ID NO:37)、PYALQ (SEQ ID NO:38)、EYVLQ (SEQ ID NO:39)、DFALQ (SEQ ID NO:40)、FYALQ (SEQID NO:41)、NYVLQ (SEQ ID NO:42)、RYALQ (SEQ ID NO:43)、YFALQ (SEQ ID NO:44)、PYVLQ (SEQ ID NO:45)、WYALQ (SEQ ID NO:46)、SYALQ (SEQ ID NO:47)、HYALQ (SEQ IDNO:48)、EFALQ (SEQ ID NO:49)和NFVLQ (SEQ ID NO:50)或其组合。
在另一个说明性方面，肽的含谷氨酰胺部分可以包含选自如下的序列：DYFLQ(SEQ ID NO:51)、EYVAQ (SEQ ID NO:52)、DYVAQ (SEQ ID NO:53)、DFYLQ (SEQ ID NO:54)、EYFLQ (SEQ ID NO:55)或其组合。
在又一个实施方案中，所述肽可以含有赖氨酸，并且所述肽的含赖氨酸部分可以包含SK[LS]K (SEQ ID NO:56)或[KR][ST]KL (SEQ ID NO:57)的序列基序。在该实施方案中，肽的含赖氨酸部分可以包含选自如下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:58)、KSKLA (SEQ IDNO:59)、TKSKL (SEQ ID NO:60)、KLSKL (SEQ ID NO:61)、RSKLG (SEQ ID NO:62)、RGSKL(SEQ ID NO:63)、RSKSK (SEQ ID NO:64)、SKSKL (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:67)、GRSKL (SEQ ID NO:68)、SKLSK (SEQ ID NO:69)、FTKSK (SEQID NO:70)、RLKSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、LSKLK (SEQ ID NO:74)、NRTKL (SEQ ID NO:75)、QRTKL (SEQ ID NO:76)、GGGRSKLAGGG(SEQ ID NO:77)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO:78)或其组合。
在另一个说明性的实施方案中，所述肽可以含有赖氨酸，并且所述肽的含赖氨酸部分可以包含选自如下的序列：RGTKL (SEQ ID NO:196)、FPKLK (SEQ ID NO:197)、KLKYK(SEQ ID NO:198)、RAKYK (SEQ ID NO:199)、KTKYK (SEQ ID NO:200)和GYKLK (SEQ IDNO:201)或其组合。
在又一个实施方案中，所述肽可以包含转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽和转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽。在又一个实施方案中，转谷氨酰胺酶谷氨酰胺和/或赖氨酸底物肽可包含DYALQ (SEQ ID NO:34)的序列或可具有包含[FY][FYT]LQ (SEQ ID NO:79)、[YF]VAQ(SEQ ID NO:80)、K[YLS]K (SEQ ID NO:81)或TKL (SEQ ID NO:82)的序列基序。
在另一个实施方案中，转谷氨酰胺酶底物肽被视为与SEQ ID NO:4至82的任一个具有约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性。可以例如通过使用GAP程序(Genetics Computer Group，软件；在http://www.accelrys.com通过Accelrys可得)，并且可以使用例如ClustalW算法(VNTI软件，InforMax Inc.)来完成比对。可以使用待比较的肽序列来搜索序列数据库。数据库搜索的算法通常基于BLAST软件(Altschul等人，1990)。
在一个说明性实施方案中，可以使用转谷氨酰胺酶进行将转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽和转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽连接以形成导致肽环化的异肽键。在另一个实施方案中，可以使用微生物转谷氨酰胺酶(例如链轮链霉菌种(Streptoverticillium sp.)转谷氨酰胺酶)或哺乳动物转谷氨酰胺酶。在酶是哺乳动物转谷氨酰胺酶的实施方案中，哺乳动物转谷氨酰胺酶可以例如选自人因子XIII A转谷氨酰胺酶、人因子XIII B转谷氨酰胺酶、因子XIII转谷氨酰胺酶、角质形成细胞转谷氨酰胺酶、组织型转谷氨酰胺酶、表皮转谷氨酰胺酶、前列腺转谷氨酰胺酶、神经转谷氨酰胺酶、人转谷氨酰胺酶5和人转谷氨酰胺酶7。
I. 肽：
本文公开和描述的肽构成一类在生命科学和健康护理领域中具有广泛应用的分子。如本文所公开和描述，本文所述的肽(或“肽结合剂”(例如环状肽))可以是环化或受约束的(大环)形式，或者在环化之前为线性形式。
如本文所用，术语“肽”、“寡肽”或“肽结合剂”是指由氨基酸组成的有机化合物，其可以在环化前以线性链(通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键)，或以环化形式或受约束形式(例如“大环”形式)排列。如本文所用的大环(或受约束的肽)以其常规含义使用，用于描述环状小分子，诸如约500道尔顿至约2,000道尔顿的肽。
术语“天然氨基酸”是指通常在蛋白质中发现并用于蛋白质生物合成的20种氨基酸之一以及可以在翻译过程中掺入蛋白质的其他氨基酸(包括吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)。20种天然氨基酸包括组氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。
术语“非天然氨基酸”是指不在由标准遗传密码编码的那些中或不在翻译过程中掺入蛋白质中的有机化合物。因此，非天然氨基酸包括氨基酸或氨基酸类似物，但不限于，氨基酸的D-同分立体异构体(isostereomer)、氨基酸的β-氨基类似物、瓜氨酸、高瓜氨酸、高精氨酸、羟脯氨酸、高脯氨酸、鸟氨酸、4-氨基-苯丙氨酸、环己基丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基-丙氨酸、N-甲基-甘氨酸、正亮氨酸、N-甲基-谷氨酸、叔丁基甘氨酸、α-氨基丁酸、叔丁基丙氨酸、2-氨基异丁酸、α-氨基异丁酸、2-氨基茚满-2-羧酸、硒代甲硫氨酸、脱氢丙氨酸、羊毛硫氨酸、γ-氨基丁酸及其其中胺氮已被单烷基或二烷基化的衍生物。
根据本发明的实施方案，描述了固定在固体支持物(例如微阵列)上的新颖的环状肽。如下文更详细描述，肽结合剂(例如环状肽)可以实现发现技术，诸如抗体概况分析、表位鉴定、样品概况分析、抗体分离、蛋白质鉴定以及诊断和治疗应用。在一些实施方案中，可以在环化之前将肽结合剂延伸并成熟(例如，用天然或非天然氨基酸)以制备潜在的药物候选。
在本发明的一个方面，产生同一阵列上的相邻特征中的线性和环状肽，而不需要纯化。首先，在用于形成环状肽的亚阵列上产生肽。如本文所用，术语“亚阵列”是指微阵列的一部分或一部份。微阵列可以具有一个或多个亚阵列。在一些实施方案中，微阵列上的不同分子可位于不同的亚阵列上以促进分子的比较。每种肽都具有游离氨基和被保护的羧基。如本文所用，“羧基”可以是质子化的(羧酸)或去质子化的(羧酸根)。除了用于形成线性肽的亚阵列上的肽的羧基具有与环状肽亚阵列上的肽的羧基不同的保护基之外，也在用于形成线性肽的亚阵列上产生相同的肽。在一些实施方案中，羧基是主体肽的C末端羧基，并且氨基是主体肽的N末端氨基。在合成过程中，C末端和氨基酸侧链可以被保护。
如本文所用，术语“保护基”是指本领域中通常已知的改变官能团的反应性、通常改善或掩盖官能团的反应性的任何基团。与本发明有关的有用的保护基包括但不限于羧基保护基，诸如在Greene's Protective Groups in Organic Synthesis，第四版，Copyright© 2007 John Wiley & Sons, Inc.(通过引用并入本文)中所述的那些。与本发明有关的有用的示例性羧基保护基包括但不限于酯，诸如烷基、烯丙基、苄基、苯基、芳基和甲硅烷基酯；噁唑；原酸酯；和有机金属配合物，诸如钴和锡配合物。羧基保护基的非限制性列表包括庚基、2-N-(吗啉代)乙基、胆碱、(甲氧基乙氧基)乙基、甲氧基乙基、甲基、9-芴基甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、甲基硫基甲基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、苄基氧基甲基、三异丙基甲硅烷氧基甲基、新戊酰基氧基甲基、苯基乙酰氧基甲基、三异丙基甲硅烷基甲基、氰基甲基、丙酮醇、苯甲酰甲基、二苯乙酮基、甲酰胺基甲基、对偶氮苯甲酰胺基甲基、6-溴-7-羟基香豆素-4-基甲基、N-苯二甲酰亚氨基甲基、2,2,2-三氯乙基、2-卤代乙基、ω-氯烷基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、(2-甲基-2-三甲基甲硅烷基)乙基、(2-苯基-2-三甲基甲硅烷基)乙基、2-甲基硫基乙基、1,3-二噻烷基-2-甲基、2-(对硝基苯基亚磺酰基)乙基、2-(对甲苯磺酰基)乙基、2-(2'-吡啶基)乙基、2-(二苯基膦基)乙基、(对甲氧基苯基)乙基、1-甲基-1-苯基乙基、2-(4-乙酰基-2-硝基苯基)乙基、1-[2-(2-羟基烷基)苯基] 乙酮、2-氰基乙基、叔丁基、3-甲基-3-戊基、二环丙基甲基、2,4-二甲基-3-戊基、环戊基、环己基、烯丙基、甲代烯丙基、2-甲基丁-3-烯-2-基、3-甲基丁-2-烯基、3-丁烯-1-基、4-(三甲基甲硅烷基)-2-丁烯-l-基、肉桂基、α-甲基肉桂基、丙-2-炔基(炔丙基)、苯基、2,6-二甲基苯基、2,6-二异丙基苯基、2,6-二-叔丁基-4-甲基苯基、2,6-二-叔丁基-4-甲氧基苯基、对(甲基硫基)苯基、五氟苯基、2-(二甲基氨基)-5-硝基苯基、苄基、三苯基甲基、2-氯苯基二苯基甲基、2,3,4,4',4",5,6-七氟三苯基甲基、二苯基甲基、双(邻硝基苯基)甲基、9-蒽基甲基、2-(9, 10-二氧代)蒽基甲基、5-二苯并环庚基、1-芘基甲基、2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基、2,4,6-三甲基苄基、对溴苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对甲氧基苄基、2,6-二甲氧基苄基、4-(甲基亚磺酰基) 苄基、4-磺基苄基、4-叠氮基甲氧基苄基、4-{N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基] 氨基} 苄基、胡椒基、4-皮考基、对聚合物-苄基、2-萘基甲基、3-硝基-2-萘基甲基、4-喹啉基甲基、8-溴-7-羟基喹啉-2-基甲基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄基、1,2,3,4-四氢-1-萘基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丙基二甲基甲硅烷基、苯基二甲基甲硅烷基、二-叔丁基甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和三(2,6-二苯基苄基)甲硅烷基。
示例性的氨基保护基包括在Greene's Protective Groups in OrganicSynthesis，第四版，Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Inc.(通过引用并入本文)中描述的那些。与本发明有关的有用的示例性氨基保护基包括但不限于氨基甲酸酯、脲型衍生物、酰胺、N-亚磺酰基衍生物和N-磺酰基衍生物。氨基保护基的非限制性列表包括9-芴基甲基、2,6-二-叔丁基-9-芴基甲基、2,7-双(三甲基甲硅烷基)芴基甲基、9-(2-磺基)芴基甲基、9-(2,7-二溴)芴基甲基、17-四苯并[a,c,g,i]芴基甲基、2-氯-3-茚基甲基、苯并[f]茚-3-基甲基、1,1-二氧代苯并[b]噻吩-2-基甲基、2-甲基磺酰基-3-苯基-1-丙-2-烯基氧基、2,7-二-叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢硫代呫吨基)] 甲基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、(2-苯基-2-三甲基甲硅烷基)乙基、2-苯基乙基、2-氯乙基、1,1-二甲基-2-卤代乙基、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基、2-(2'-和4'-吡啶基)乙基、2,2-双(4'-硝基苯基)乙基、2-[(2-硝基苯基)二硫代]-1-苯基乙基、2-(N,N- 二环己基甲酰胺基)乙基、叔丁基、1-金刚烷基、2-金刚烷基、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基、1-(3,5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙基、三异丙基甲硅烷氧基l、乙烯基、烯丙基、异戊二烯基、1-异丙基烯丙基、肉桂基、4-硝基肉桂基、3-(3'-吡啶基)丙-2-烯基、己二烯基氧基、炔丙基氧基、丁-2-炔基双氧基、8-喹啉基、N-羟基哌啶基、烷基二硫代、苄基、3,5-二-叔丁基苄基、对甲氧基苄基、对甲氧基苄基、对甲氧基苄基、对氯苄基、2,4-二氯苄基、4-甲基亚磺酰基苄基、4-三氟甲基苄基、氟苄基、2-萘基甲基、9-蒽基甲基、二苯基甲基、4-苯基乙酰氧基苄基、4-叠氮基苄基、4-叠氮基甲氧基苄基、间氯-对酰基氧基苄基、对(二羟基氧硼基) 苄基、5-苯并异噁唑基甲基、2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基、2-甲基硫基乙基、2-甲基磺酰基乙基、2-(对甲苯磺酰基) 乙基、2-(4-硝基苯基磺酰基)乙基、2-(2,4-二硝基苯基磺酰基)乙氧基、2-(4-三氟甲基苯基磺酰基) 乙基、[2-(1,3-二噻烷基)]甲基、2-磷基乙基、2-[苯基(甲基)磺基]乙基、1-甲基-1-(三苯基磷基)乙基、1,1-二甲基-2-氰基乙基、2-丹酰基乙基、2-(4-硝基苯基)乙基、4-甲基噻吩基、2,4-二甲基噻吩基、间硝基苯基、3,5-二甲氧基苄基、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基、α-甲基硝基胡椒基、邻硝基苄基、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基、3,4-二取代的-6-硝基苄基、苯基(邻硝基苯基)甲基、2-硝基苯基乙基、6-硝基藜芦基、4-甲氧基苯甲酰甲基、3',5'-二甲氧基苯偶姻、9-呫吨基甲基、N-甲基-N-(邻硝基苯基)、N-(2-乙酰氧基乙基)胺、叔戊基、1-甲基环丁基、1-甲基环己基、1-甲基-1-环丙基甲基、环丁基、环戊基、环己基、异丁基、异冰片基、环丙基甲基、对癸基氧基苄基、二异丙基甲基、2,2-二甲氧基羰基乙烯基、邻(N,N-二甲基甲酰胺基)苄基、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基、丁炔基、1,1-二甲基丙炔基、2-碘乙基、1-甲基-1-(4'-吡啶基)乙基、1-甲基-1-(对苯基偶氮苯基)乙基、p-(p'-甲氧基苯基偶氮) 苄基、p-(苯基偶氮) 苄基、2,4,6-三甲基苄基、异烟碱基、4-(三甲基铵)苄基、对氰基苄基、二(2-吡啶基)甲基、2-呋喃基甲基、苯基、2,4,6-三-叔丁基苯基、1-甲基-1-苯基乙基、S-硫代氨基甲酸苄酯、脲、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N'-对甲苯磺酰基氨基羰基、N'-苯基氨基硫代羰基、4-羟基苯基氨基羰基、3-羟基色氨酰基羰基、N'-苯基氨基硫代羰基、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、戊-4-烯酰胺、吡啶甲酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、2,2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、邻硝基苯甲酰胺、3-(4-叔丁基-2,6-二硝基苯基)-2,2-二甲基丙酰胺、邻(苯甲酰基氧基甲基) 苯甲酰胺、2-(乙酰氧基甲基) 苯甲酰胺、2-[(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)甲基]苯甲酰基、3-(3',6'-二氧代-2',4',5-三甲基环己-1',4'-二烯)-3,3-二甲基丙酰胺、邻羟基-反-肉桂酰胺、 2-甲基-2-(邻苯基偶氮苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、乙酰基乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、(N'-二硫基苄基氧基羰基氨基) 乙酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二氯邻苯二甲酰亚胺、N-四氯邻苯二甲酰亚胺、N-4-硝基邻苯二甲酰亚胺、N-硫代二乙醇酰基、N-二硫杂琥珀酰亚胺、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,3-二甲基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-2,5-双(三异丙基甲硅烷氧基)吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物、N-1,1,3,3-四甲基-l,3-二硅烷异吲哚啉、N-二苯基甲硅烷基二亚乙基基团、N-5-取代的l,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、N-5-取代的l,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、1,3,5-二噁嗪、苯磺酰胺、2-硝基苯磺酰胺、2,4-二硝基苯磺酰胺、五氯苯磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯磺酰胺、三苯基甲基磺酰胺、1-(2,2,2-三氟-1,1-二苯基)乙基磺酰胺、N-3-硝基-2-吡啶磺酰胺、甲磺酰胺、三氟甲磺酰胺、叔丁基磺酰胺、苄基磺酰胺、2-(三甲基甲硅烷基) 乙磺酰胺、对甲苯磺酰胺、苯磺酰胺、茴香基磺酰胺、2-或4-硝基苯磺酰胺、2,4-二硝基苯磺酰胺、2-萘磺酰胺、4-(4',8’-二甲氧基萘基甲基) 苯磺酰胺、2-(4-甲基苯基)-6-甲氧基-4-甲基磺酰胺、9-蒽磺酰胺、吡啶-2-磺酰胺、苯并噻唑-2-磺酰胺、苯甲酰甲基磺酰胺、2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺、五甲基苯磺酰胺、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺、4-甲氧基苯磺酰胺、2,4,6-三甲基苯磺酰胺、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺、3-甲氧基-4-叔丁基苯磺酰胺、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰胺。
在产生微阵列后，将用于形成环状肽的亚阵列上的肽的被保护的羧基脱保护。作为脱保护的结果，用于形成环状肽的亚阵列上的每个肽现在具有游离的羧基。尽管用于形成环状肽的亚阵列上的肽在该步骤中被脱保护，但用于形成线性肽的亚阵列上的肽的羧基不被去除。因此，线性肽亚阵列上的肽在该步骤中保持保护。
保护基可以根据本领域已知的多种方法除去(也称为脱保护)。羧基保护基的脱保护(或去除)的示例性方法包括但不限于在Greene's Protective Groups in OrganicSynthesis，第四版，Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Inc.(通过引用并入本文)中描述的那些方法。与本发明有关的有用的羧基保护基的脱保护的示例性方法包括但不限于水解，诸如通过使羧酸酯与氢氧化物碱诸如NaOH、KOH、LiOH、CsOH、Ca(OH)2、Ba(OH)2等接触来水解，羧基保护基的亲核替代，诸如通过与LiS-n-Pr、NaSePh、LiCl、KO-t-Bu、NaCN、NaTeH、KO2、LiI和PhSH接触。在一些实施方案中，特别是在烯丙基保护基的情况下，除去保护基可以包括添加钯源，诸如Pd/C、Pd(0)、Pd(II)等。Pd(0)的一个实例是Pd(PPh3)4。Pd(II)的实例包括PdCl2和Pd(OAc)2。进一步考虑，可以通过添加酸诸如三氟乙酸(TFA)、盐酸、对甲苯磺酸等来除去羧基保护基。
接下来，将用于形成环状肽的亚阵列上的肽暴露于促进其游离氨基和羧基之间的酰胺键形成的条件。由于这种酰胺键形成，用于形成环状肽的亚阵列上的肽被环化以形成环状肽。在环化步骤期间，预期一些低效率，并且不是所有的肽都环化。不环化的肽维持为脱保护的线性形式。因为用于形成线性肽的亚阵列上的肽具有保护的羧基，所以在这个步骤过程中，对于这些保持为受保护的线性形式的肽，没有发生酰胺键形成。
在一些实施方案中，本文所述的线性肽通过在线性肽的C末端羧基和N末端氨基之间形成酰胺键而环化以形成环状肽。这样的反应可以通过本领域公知的酰胺键形成条件(包括但不限于活化C末端羧基的条件)来促进。与本发明有关的有用的示例性酰胺键形成条件包括但不限于碳二亚胺类，诸如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺和(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺·HCl；加合物类，诸如1-羟基苯并三唑、羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基-7-氮杂-1H-苯并三唑、2-氰基-2-(羟亚氨基)乙酸乙酯和4-(N,N-二甲基氨基)吡啶；鏻试剂，诸如苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷子基-鏻六氟磷酸盐、溴-三吡咯烷子基-鏻六氟磷酸盐、7-氮杂-苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐、乙基氰基(羟基亚氨基)乙酸合-O2)-三-(1-吡咯烷基)-鏻六氟磷酸盐和3-(二乙氧基-磷酰基氧基)-1,2,3-苯并[d]三嗪-4(3H)-酮; 铵/脲鎓-亚铵试剂，诸如2-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基铵四氟硼酸盐/六氟磷酸盐、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)- N,N,N’,N’-四甲基铵六氟磷酸盐、(N-[(5-氯-1H-苯并三唑-1-基)-二甲基氨基-吗啉代]-脲鎓六氟磷酸盐 N-氧化物、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基铵六氟磷酸盐、(1-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代]-脲鎓六氟磷酸盐、(2-(1-氧基-吡啶-2-基)-1,1,3,3-四甲基异硫代脲鎓四氟硼酸盐和四甲基氟甲脒鎓六氟磷酸盐；和其他偶联剂，诸如N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉、2-丙烷膦酸酐、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)- 4-甲基吗啉鎓盐、三光气和1,1’-羰基二咪唑。
在环化步骤之后，用于形成线性肽的亚阵列上的肽被脱保护。作为这种脱保护步骤的结果，用于形成线性肽的亚阵列上的肽与用于形成环状肽的亚阵列上的在环化步骤过程中不能环化的肽在结构上相同。线性肽亚阵列上的肽的结合特性和环状肽亚阵列上的肽可以进行比较以确定针对给定靶标的环状相比于线性结合偏好。这样做有可能确定线性序列是否有助于在循环特征中的结合。可以在微阵列上形成几对线性和环状肽亚阵列以鉴定目标肽序列。
参考图9，在一些实施方案中，通过将主体肽通过接头氨基酸的侧链连接至微阵列，在微阵列上合成线性肽文库。虽然在图9中显示谷氨酸，但是其他氨基酸侧链(诸如天冬氨酸侧链)可以与微阵列表面活性基团偶联以连接主体肽。本文考虑其他氨基酸侧链(天然的或非天然的)，诸如醇、胺、硫醇、酰基、膦酰基、磺酰基和其他可与微阵列表面上的活性基团形成共价键的官能团。进一步考虑，接头氨基酸的C末端羧基可以与反应性表面偶联，并且接头氨基的侧链可以是能够与氨基形成酰胺键的羧基侧链基团。羧基保护基可以是任何两个不同的羧基保护基，其允许一组肽的选择性脱保护和环化，而不允许第二组肽环化。
II. 微阵列：
在一个实施方案中，描述了可用于研究和健康护理中的肽微阵列。例如，本文所述的肽微阵列可以用于鉴定生物活性基序(例如，微阵列上的肽(例如环状肽)可以模拟潜在的配体的活性基序用于筛选与相应受体的结合)。在一个方面，本文公开的肽微阵列可以反映疾病相关抗原的特定序列(并因此用于诊断或监测目的，例如检测来自表明存在某些疾病的患者样品的抗体)。肽微阵列的另一种应用是发现生物化学相互作用，包括蛋白质或DNA与固定在肽微阵列上的肽(例如环状肽)的结合，或用于分析细胞活性、酶活性、细胞粘附等的概况。
生产肽微阵列的各种方法是本领域已知的。例如，点样预制肽或通过点样试剂例如在膜上原位合成，举例说明了已知的方法。用于产生更高密度的肽微阵列的其他已知方法是所谓的光刻技术，其中所需生物聚合物的合成设计由合适的光不稳定保护基(PLPG)控制，所述光不稳定保护基(PLPG)在暴露于电磁辐射(诸如光)后释放各下一组分(氨基酸)的连接位点(Fodor等人, (1993) Nature 364:555-556; Fodor等人, (1991) Science 251:767-773)。现有技术中已知两种不同的光刻技术。第一种是光刻掩模，其用于将光引导到合成表面的特定区域，实现PLPG的局部脱保护(参见例如图1)。“掩模的”方法包括利用接合基底的底座(mount)(例如“掩模”)并在基底和支架之间提供反应器空间的聚合物的合成。这种“掩模”阵列合成的示例性实施方案描述于例如美国专利号5,143,854和5,445,934，其公开内容通过引用并入本文。然而，该技术的潜在缺陷包括需要大量掩模步骤，导致总产率相对较低且成本高，例如合成长度仅为六个氨基酸的肽可能需要超过100个掩模。
第二种光刻技术是所谓的无掩模光刻法，其中光被引导至合成表面的特定区域，通过数字投射技术(诸如微镜装置)实现PLPG的局部脱保护(Singh-Gasson等人, Nature Biotechn.17 (1999) 974-978)。这样的“无掩模”微阵列合成因此消除了对暴露掩模的耗时和昂贵的生产的需要。应当理解的是，使用本文公开的微阵列的肽微阵列、产生肽微阵列的方法以及鉴定肽结合剂(例如环状肽)的方法的实施方案可以利用上述各种肽微阵列合成技术中的任一种。
为肽微阵列的基于光刻的合成提供基础的PLPG(光不稳定的保护基)的使用在本领域是公知的。用于基于光刻的生物聚合物合成的通常使用的PLPG是例如α-甲基-6-硝基胡椒基-氧基羰基(MeNPOC)(Pease等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:5022-5026)、2-(2-硝基苯基)-丙氧基羰基(NPPOC)(Hasan等人(1997) Tetrahedron 53:4247-4264)、硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)(Fodor等人(1991) Science 251:767-773)和2-硝基苄氧基羰基(NBOC)(Patchornik等人(1970) 21:6333-6335)。
已经在肽微阵列的光刻固相肽合成中引入氨基酸，其用NPPOC作为光不稳定氨基保护基进行保护，其中载玻片用作固体支持物(美国申请公开号2005/0101763 A1)。使用NPPOC保护的氨基酸的方法具有如下缺点：在某些条件下，所有(除一种)被保护的氨基酸在用光照射后的半衰期在约2至3分钟的范围内。相反，在相同的条件下，NPPOC保护的酪氨酸显示出几乎10分钟的半衰期。由于整个合成过程的速度取决于最慢的子过程，这种现象使合成过程的时间增加3到4倍。伴随地，光产生的自由基离子对生长肽的破坏程度随着增加和过量的光剂量要求而增加。
如本文所用，术语“肽微阵列”是指固体支持物的表面上的特征的二维排列。单个肽微阵列，或者在一些情况下，多个肽微阵列(例如，3、4、5或更多个肽微阵列)可以位于一个固体支持物上。肽微阵列的大小取决于一个固体支持物上的肽微阵列的数量。每个固体支持物的肽微阵列的数目越高，肽微阵列必须越小以配合在固体支持物上。阵列可以设计成任何形状，但优选地，它们被设计成正方形或矩形。即用型产品是固体支持物上的肽微阵列(例如，肽微阵列载片)。
术语“肽微阵列”(或肽芯片或肽表位微阵列)包括展示在固体支持物(例如玻璃、碳复合物或塑料阵列、载片或芯片)上的肽的群体或集合。肽微阵列的示例性用途包括生物学、医学和药理学的领域，包括蛋白质-蛋白质相互作用的结合性质、功能性和动力学的研究。基础研究用途可以包括分析酶(例如激酶、磷酸酶、蛋白酶、乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰酶)的概况，并绘制抗体表位以找出蛋白质结合的关键残基。其他应用包括血清标志物发现，在疾病进展过程中改变个体患者的体液免疫应答的概况分析，监测治疗干预，患者分层和开发诊断和治疗工具以及疫苗。
术语“特征”是指肽微阵列表面上的限定区域。该特征包含生物分子，诸如肽。与其他特征相比，一种特征可以含有具有不同性质(诸如不同的序列或取向)的生物分子。特征的大小由两个因素确定：i)肽微阵列上的特征的数量，肽微阵列上的特征的数目越高，每个单个特征越小，和ii)用于照射一种特征的可单独寻址的铝镜元件的数目。用于照射一种特征的镜元件的数目越高，每个单个特征越大。肽微阵列上的特征的数目可能受限于微镜器件中存在的镜元件(像素)的数目。例如，来自Texas Instruments, Inc.的现有技术的微镜器件当前含有420万个镜元件(像素)，因此这种示例性肽微阵列内的特征的数目因此受到这个数目的限制。然而，应当理解，来自Texas Instruments, Inc.的微镜器件仅出于示例性的目的而提供，并且更高密度的肽微阵列是可能的。
术语“固体支持物”是指具有表面区域的任何固体材料，有机分子可以通过键形成结合至所述表面区域，或者通过电子或静电相互作用诸如共价键或通过特定官能团形成复合物来吸附至所述表面区域。固体支持物可以是材料诸如玻璃上的塑料、玻璃上的碳等的组合。功能表面可以是简单的有机分子，但也可以包含共聚物、树枝状聚合物、分子刷等。
术语“塑料”是指合成材料，诸如具有官能化表面的有机构建嵌段(单体)的均-或异-共聚物，使得有机分子可以通过共价键形成来连接或通过电子或静电相互作用诸如通过官能团形成键来吸附。优选地，术语“塑料”是指聚烯烃，其是通过烯烃(例如，乙烯丙烯二烯单体聚合物、聚异丁烯)的聚合而衍生的聚合物。最优选地，塑料是具有限定的光学特性的聚烯烃，诸如TOPAS®或ZEONOR/EX®。
术语“官能团”是指形成化学分子的一部分的许多原子组合中的任一种，其自身经历特征性反应并且影响分子的其余部分的反应性。典型的官能团包括但不限于羟基、羧基、醛、羰基、氨基、叠氮化物、炔基、硫醇和腈。潜在反应性官能团包括例如胺、羧酸、醇、双键等。优选的官能团是氨基酸的潜在反应性官能团，诸如氨基或羧基。官能化的肽含有反应性官能团。
如本文所用，“基本上不环化”是指少于5％环化。
如本领域技术人员所理解，肽微阵列包含测定原理，由此数千个(或在本发明的情况下为数百万个)肽(在一些实施方案中以多个拷贝呈现)连接或固定至固体支持物的表面(在一些实施方案中其包含玻璃、碳复合物或塑料片或载片)。根据本发明的实施方案，可以将肽微阵列与多种不同的目标靶标(包括纯化的酶或抗体、患者或动物血清、细胞裂解物、受体的配体、受体、酶的底物等)一起温育。
在一些实施方案中，肽微阵列在与目标靶标温育后经历一个或多个洗涤步骤，然后暴露于具有所需特异性的二抗(例如抗IgG人/小鼠或抗磷酸酪氨酸或抗myc)。通常，二抗通过可由荧光扫描仪检测的荧光标记进行标记。其他检测方法是化学发光、比色法或放射自显影。
在一些实施方案中，在扫描肽微阵列载片之后，扫描仪以标记的图像文件格式(*.tif)记录20位、16位或8位数字图像。.tif图像能够对扫描的肽微阵列载片上的每个荧光点进行解释和定量。该定量数据是对肽微阵列载片上的测量的结合事件或肽修饰进行统计学分析的基础。为了评估和解释检测到的信号，必须进行肽斑点(在图像中可见)和相应的肽序列的分配。
在一个实施方案中，肽微阵列可以是具有点在其上或通过原位合成直接组装在表面上的肽的载片。肽理想地通过化学选择性键共价连接，导致具有相同取向的肽用于相互作用分析。替代程序包括非特异性共价结合和结合剂固定。
参考图1和2，提供了各种肽微阵列合成仪(分别用于掩模和无掩模光刻技术)的实施方案。现在具体参考图1，显示用于执行掩模光刻技术的示例性系统100(诸如美国专利号5,445,934中教导)，说明具有限定在其表面的腔体104的系统主体102。在腔体104的上方安装具有沿着其底部表面108具有光可移除的保护基(例如，诸如具有或不具有居间接头分子的NVOC)的基底(固体支持物)106。基底(固体支持物)106对于宽谱的光可以是透明的，或者在一些实施方案中，仅在可以去除保护基的波长处(诸如在NVOC的情况下，UV)是透明的。基底(固体支持物)106和主体102密封腔体104(除了入口和出口端口)，并且可以例如通过垫圈或真空来匹配。
透镜118，并且在一些实施方案中，反射镜116被提供用于将来自光源112(诸如Xe(Hg)光源)的光聚焦并引导到支持物(固体支持物)106上。在图1的说明性实施方案中，显示第二透镜114(并且在一些实施方案中可以被提供)，用于结合透镜118(也称为“投射印刷”)将掩模图像投射到基底(固体支持物)上。在接触基底(固体支持物)106前，光(来自光源112)接触掩模110，由此允许这种光仅到达基底(固体支持物)106上的选定位置。掩模110可以是例如具有蚀刻在其上的铬的载玻片。在一些实施方案中，可以为掩模110提供例如透明位置和不透明位置的网格。如本领域技术人员所理解，在掩模阵列合成中，光自由地穿过掩模110的“透明”区域，但从掩模110的其他(例如“非透明”)区域反射或被其吸收。因此，只有支持物(固体支持物)106的选定区域被暴露于光。
而且，光阀(LCD)可以用作常规掩模的替代物(以选择性暴露支持物的区域)；可以使用光纤面板(用于掩模的对比度增强或者作为限制施加光的区域的唯一手段)；和蝇眼透镜、锥形光纤面板等也可用于对比度增强。而且，应当理解的是，可以用本领域已知的更精细的技术来实现小于光波长的区域的照射(例如，通过例如微量移液器的尖端上的分子微晶体的方式将光引导到基底上)。示例性装置公开于Lieberman等人, "A Light SourceSmaller than the Optical Wavelength," Science (1990) 247:59-61中。
现在具体参考图2，提供了可以根据本发明利用的示例性“无掩模”肽微阵列系统(如例如美国专利号6,375,903中所述)，用于说明“无掩模”肽微阵列合成。总体显示为200的说明性系统被描绘为包括二维阵列图像形成器202和阵列图像投射到其上的支持物(固体支持物)204。在图2所示的说明性实施方案中，基底(固体支持物)具有暴露的入口表面206和相对的活性表面208，肽210的二维阵列将在活性表面208上制造。然而，在一些实施方案中，基底(固体支持物)204可以具有面向图像形成器202并且封闭在具有透明窗口(允许光被投射到活性表面208上)的反应室流通室内的活性表面208。(固体支持物) 实施方案也可以包括不透明或多孔基底(固体支持物)204。
在根据本发明的无掩模肽微阵列的一些实施方案中，图像形成器202可以包括光源212(例如紫外或近紫外光源，诸如汞弧灯)，任选的滤光器214(以接收来自源212的输出光束216并且选择性地仅通过期望的波长，例如365nm Hg线)和聚光透镜218(用于形成准直光束220)。也可以使用用于对源光进行滤光或单色处理的其他器件，例如衍射光栅、二色镜和棱镜，而不是透射滤光器，并且在本文中统称为“滤光器”。
如所示，光束220被投射到具有单独微镜226的二维阵列的二维微镜阵列器件224，每个微镜226响应于提供给阵列装置224的控制信号(由计算机控制器228提供)以倾斜至少两个方向之一。在一些实施方案中，微镜226被构建为使得：A.)在第一位置，撞击单个微镜226的光束220可以在与光束220倾斜的方向上偏转(如箭头230所示)；且B.)在第二位置，撞击这样的镜的光束220被反射回平行于光束220，如箭头232所示。如应当理解，从每个镜226反射的光构成单独的光束232。光束232入射在投射光学器件234(包含例如透镜236、238和可调节的虹膜240)上。投射光学器件234用于在基底204的活性表面208上形成由单独的光束232(以及这些光束之间的黑暗区域)表示的微镜阵列224的图案的图像。如上所述并且贯穿本发明中，基底支持物204可以是透明的，并且可以例如由熔融二氧化硅或钠钙玻璃或石英形成，使得投射在其上的光(由线242示出)穿过基底204而基本上不衰减或扩散。
根据本发明的示例性微镜阵列224包括能够通过电子寻址阵列中的微镜来形成图案化的光束的数字微镜器件(DMD)(可得自Texas Instruments, Inc.)。这样的阵列例如讨论于：Larry J. Hornbeck, “Digital Light Processing and MEMs: Reflecting theDigital Display Needs of the Networked Society,” SPIE/EOS European Symposiumon Lasers, Optics, and Vision for Productivity and Manufacturing I, Besancon,France, Jun. 10-14, 1996; 和美国专利号5,096,279、5,535,047、5,583,688、5,600,383和6.375,903。这样的器件的微镜226能够以有效的方式反射正常可用波长的光(包括紫外和近紫外光)，而本身不会损坏镜。
在一些肽微阵列实施方案中，投射光学器件234可以是标准设计的。透镜236、238将光束232中的光聚焦(穿过可调节的虹膜240)到基底204的活性表面208上。虹膜240帮助控制有效数值孔径并确保不需要的光(特别是离轴光束230)不被传输到基底(固体支持物)204。用这样的光学器件系统可以获得小至几微米的尺寸的分辨率。根据本申请，也可以利用本领域已知的各种替代构型(例如，如制造应用中所优选)。
应当理解的是，尽管本文提供了示例性实施方案，但是可以在基底(固体支持物)204上制造肽210中使用各种方法，并且包括微光刻技术的调整。例如，在“直接光制造方法”中，可以用能够结合氨基酸(例如胺)的化学品的层涂覆基底(固体支持体)204，所述氨基酸(例如胺)例如可以用能够与光反应并通过光去除的化学基团。因此光可以由投射系统202施加，将基底204上的胺基团脱保护并使其可用于结合氨基酸(其被流至基底(固体支持物)204的活性表面208上以结合选择的使用普通化学品的位点)。该过程重复多次，从而将另一个氨基酸结合至不同的位置集合。该过程是简单的，并且如果使用组合方法，排列的数量指数增加。
根据本发明的一些实施方案，在基底(固体支持物)204上制造肽210中使用无掩模阵列合成。根据这样的实施方案，所使用的无掩模阵列合成允许超高密度肽合成，其合成最多达2.9M独特的肽。每个2.9M合成特征/区域具有最多达107个可得到全长肽的反应性位点。也可以设计更小的肽微阵列。例如，使用除半胱氨酸以外的所有天然氨基酸的代表所有可能的5聚体肽的综合列表的肽微阵列将具有2,476,099个肽。还可以使用通过使用除半胱氨酸和甲硫氨酸以外的18种天然氨基酸的所有组合的5聚体肽的肽微阵列。另外，肽微阵列可排除其他氨基酸或氨基酸二聚体。例如，上文例举的18聚体阵列可被设计成排除相同氨基酸的任何二聚体或更长的重复，以及任何含有HR、RH、HK、KH、RK、KR、HP和PQ序列的肽以创建1,360,732个独特肽的文库。较小的肽微阵列可以在相同的肽微阵列上具有每种肽的复制以增加从肽微阵列数据得出的结论的置信度。
在各种实施方案中，本文所述的肽微阵列可具有结合至肽微阵列的固体支持物的至少1.6 x 105个肽、至少2.0 x 105个肽、至少3.0 x 105个肽、至少4.0 x 105个肽、至少5.0 x 105个肽、至少6.0 x 105个肽、至少7.0 x 105个肽、至少8.0 x 105个肽、至少9.0 x105个肽、至少1.0 x 106个肽、至少1.2 x 106个肽、至少1.4 x 106个肽、至少1.6 x 106个肽、至少1.8 x 106个肽、至少1.0 x 107个肽或至少1.0 x 108个肽。在其他实施方案中，本文所述的肽微阵列可具有结合至肽微阵列的固体支持物的约1.6 x 105个肽、约2.0 x 105个肽、约3.0 x 105个肽、约4.0 x 105个肽、约5.0 x 105个肽、约6.0 x 105个肽、约7.0 x105个肽、约8.0 x 105个肽、约9.0 x 105个肽、约1.0 x 106个肽、约1.2 x 106个肽、约1.4 x106个肽、约1.6 x 106个肽、约1.8 x 106个肽、约1.0 x 107个肽或约1.0 x 108个肽。如本文所述，包含特定数目的肽的肽微阵列可以指在单个固体支持物上的单个肽微阵列，或者肽可以被分开和连接到多于一个固体支持物上以获得本文所述的肽的数目。
根据这样的实施方案合成的肽微阵列可以被设计用于发现呈环状形式(如本文所述)和有和没有修饰(诸如N-甲基或其他PTM)的肽结合剂。也可以通过在潜在命中的N末端和C末端进行迭代筛选(如本文中进一步描述)使用嵌段方法来设计肽微阵列以进一步延伸潜在的结合剂。一旦已发现理想亲和力的命中，其可以使用成熟阵列的组合(本文进一步描述)来进一步成熟，其允许各种氨基酸(天然的和非天然的)的组合插入、缺失和替代分析。在一个实施方案中，成熟和/或延伸过程随后可以进行环化。
本发明的肽微阵列可用于单克隆抗体交叉反应性概况分析、多克隆血清概况分析、表位鉴定(针对目标抗体)、狼疮免疫反应性概况分析、肠道概况分析；癌症生物标志物概况分析、假单克隆抗体分离(来自多克隆抗体的分离物)、肽与蛋白质相互作用表征、亲和纯化以及用于诊断或治疗应用的特异性和敏感性结合分析。在一个实施方案中，可以将本文鉴定和公开的肽结合剂成熟和/或延伸(包括用非天然氨基酸)和形成的环状肽，使得这种结合剂成为潜在的药物候选。
III. 肽结合剂发现：
根据本发明，可以完成新颖的肽结合剂(例如，环状肽；参见例如图4，通常表示为400的方法)的发现。如本文所解释，这种新颖的肽结合剂可用于多种应用，包括但不限于治疗剂、诊断应用和一般实验室应用。根据本发明的一些具体实施方案，可以设计包含数百、数千、数万、数十万和甚至数百万个肽的群体的肽微阵列。参考图3，在一些实施方案中，可以配置肽群体310，使得肽代表整个蛋白质、基因、染色体、分子或甚至整个目标生物体(例如人)。在一些实施方案中，肽可根据特定标准配置，由此排除特定的氨基酸或基序。在其他实施方案中，可以配置肽，使得每个肽包含相同的长度。例如，在一些实施方案中，固定在肽微阵列312上的肽群体310可以全部包含3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-或20-聚体308或更多。在一些实施方案中，所述肽还可以各自包含N末端或C末端序列(例如，306和306’)，其中每种肽包含特定和相同长度的N和C末端肽序列(例如，3-、4-、5-、6-、7-或甚至8个或更多个肽)。在一些实施方案中，N末端或C末端序列(306，306’)不存在，并且固定在肽微阵列312上的肽310仅包含3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-或20-聚体308。在一些实施方案中，固定在肽微阵列312上的肽310包含已根据本文所述的方法环化的环状肽。
根据一些实施方案，设计肽微阵列300，包括最多达290万个肽的群体310，其被配置为使得290万个肽代表固定在肽微阵列312上的基因组的所有可能的5聚体肽308的综合列表。在一些这样的实施方案中，5聚体肽308(包含肽微阵列的290万个肽)可以排除氨基酸半胱氨酸(C)(以帮助控制肽的异常折叠)；或氨基酸甲硫氨酸(M)(因为M被认为是蛋白质组内的稀有氨基酸)；和/或2个或更多个相同氨基酸的所有氨基酸重复(以帮助控制非特异性相互作用诸如电荷和疏水性相互作用)；或由组氨酸(H)-脯氨酸(P)-谷氨酰胺(Q)序列组成的氨基酸基序。在一些说明性实施方案(诸如在图3中提供)中，5聚体肽308可以排除上面列出的一种或多于一种排除。本发明的一个实施方案包括包含代表整个人类基因组的最多达290万个5聚体肽的群体310的肽微阵列，其中5聚体肽308不包括任何氨基酸C和M，不包括2个或更多个氨基酸的氨基酸重复，并且不包括氨基酸基序HPQ。本发明的另一个实施方案包括包含代表由整个人类基因组编码的蛋白质含量的最多达290万个5聚体肽的肽微阵列，其中5聚体肽不包括任何氨基酸C和M，不包括2个或更多个氨基酸的氨基酸重复。应当理解，肽微阵列上特定位置的肽的序列是已知的。如本段和本发明中所提及，肽微阵列上的肽可以是环状肽。
根据进一步实施方案，包含肽微阵列300的最多达290万个肽310的群体的每个5聚体肽308可以在N末端和C末端中的每一个中用5个循环的摆动合成来合成(参见，例如，图3的306和306’)。如本文所用，“摆动合成”是指位于目标5聚体肽308的N末端或C末端的肽序列(恒定的或随机的；例如环状肽)的合成(通过本文公开的任何方式)。如图3中所示，在N末端或C末端包含摆动合成的特定氨基酸由“Z”表示。根据各种实施方案，摆动合成可包括在N末端或C末端的任何数目的肽，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，甚至例如15或20个肽(例如环状肽)。此外，摆动合成可以包含具有相同或不同数目的摆动合成肽(例如环状肽)的N末端和C末端。
根据各种实施方案，摆动肽组合物306、306’在氨基酸组成和氨基酸比率/浓度方面是柔性的。例如，摆动肽组合物可以包含2种或更多种氨基酸的混合物。这种柔性摆动混合物的说明性实施方案包括比率为3:1的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的摆动肽组合物306、306’。柔性摆动混合物的其他实例包括相等浓度(例如，相等比率)的氨基酸G、S、腺嘌呤(A)、缬氨酸(V)、天冬氨酸(D)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)和/或相等浓度(例如，相等比率)的氨基酸L、A、D、赖氨酸(K)、T、谷氨酰胺(Q)、P、F、V、酪氨酸(Y)。其他实例包括相等浓度的包含20种已知氨基酸中的任一种的摆动肽组合物306、306’。
如本文所公开，各种实施方案的摆动肽合成允许在具有随机和定向合成氨基酸的组合的肽微阵列上产生肽。例如，肽微阵列上的肽可以包含具有以下格式的肽序列的组合的15聚体肽：ZZZZZ – 5聚体– ZZZZZ，其中Z是来自特定摆动寡肽混合物的氨基酸。
在一些实施方案中，特征可以含有107个肽。在一些这样的实施方案中，每种特征的种群复杂度可以根据摆动混合物的复杂度而变化。如本文所公开，使用半定向合成中的摆动合成来产生这样的复杂度使得能够使用多样性最高达每个阵列1012的肽来筛选阵列上的肽结合剂。
在一个实施方案中，参考图3，提供包含具有反应性表面304(例如，反应性胺层)的固体支持物302的肽微阵列300，所述反应性表面304具有固定在其上的肽群体310(诸如代表整个人类蛋白质组的5聚体的群体)。根据这样的实施方案的包含肽群体310的示例性5聚体肽不包括任何氨基酸C和M，不包括2个或更多个氨基酸的氨基酸重复，并且不包括氨基酸基序HPQ。根据这样的说明性实施方案，表示整个人类蛋白质组的这种肽群体310将包含构成群体310的1,360,732个个别肽。在一些实施方案中，可以在相同的肽微阵列上放置复制或重复。例如，包含单个复制的群体310将包含2,721,464个个别肽。另外，肽群体310各自包含N末端和C末端摆动合成寡肽306、306'，其例如由5个氨基酸组成，所述5个氨基酸各自分别由氨基酸甘氨酸和丝氨酸以3:1比率组成。这样的肽可以如本文所述进行环化。
现在总体参考图4的过程400的步骤402，在使用中，示例性肽微阵列300(图3；这样的肽微阵列可包含如本文所述的环状肽)暴露于目标靶标(如标准肽微阵列实践那样)，由此目标靶标可以独立于构成群体310的其他肽结合任何肽群体310(例如环状肽)。在暴露于目标靶标之后，测定目标靶标与肽结合剂(例如环状肽)的结合，例如通过将群体310的个别肽(例如环状肽)和目标靶标的复合物暴露于具有与其连接的可报告标记(例如过氧化物酶)的抗体(对目标靶标特异性)。因为在肽微阵列上的每个位置处的每种5聚体的肽序列是已知的，因此可以绘制/定量/比较/对比目标靶标与特异性5聚体肽序列(例如环状肽)的结合的序列(和结合强度)。比较蛋白质与构成群体310的肽(例如，环状肽)的结合的一种这样的方法是综述基于原则性分析分布的聚类中的结合，诸如描述于Standardizing and Simplifying Analysis of Peptide Library Data, Andrew D White等人, J Chem InfModel, 2013, 53(2), pp 493-499且在本文说明。如本文所例举，目标5聚体结合的靶标的聚类(也称为“命中”)(在基于原理性分析分布的聚类中所示)表示具有重叠肽序列的5聚体。如下文更详细地展示，从(每个聚类的)重叠肽序列，“核心命中”肽序列或核心结合剂序列(例如，由肽微阵列的目标-肽结合事件的突出靶标共享的肽序列)可以被识别，或者至少被假设和构建用于进一步评估。(注意，应当理解的是，如本文所例举的肽微阵列可以鉴定多于一种“核心命中”肽序列(即，核心结合剂序列)。应当进一步理解的是，“核心命中”肽序列可能包含例如包含肽群体的5聚体肽结合剂更多的氨基酸，这是由于在基于原理性分析分布聚类过程中可能鉴定重叠和相邻序列。
IV. 肽成熟：
现在参考图4中图示描述的过程400的步骤404，在鉴定核心命中肽序列或核心结合剂序列(通过本文公开、描述和例示的肽结合剂发现402的过程)后，进行“肽成熟”的过程404，由此在核心命中肽或核心结合剂序列的每个位置以各种方式(通过氨基酸取代、缺失和插入)改变核心命中肽序列或核心结合剂序列，以进一步优化/验证适当的核心命中序列或核心结合剂序列。例如，根据一些实施方案(例如，其中核心命中肽序列(核心结合剂序列)包含给定数目、诸如7个氨基酸)，产生成熟阵列。根据本发明，成熟阵列可以具有固定于其上的核心命中肽(核心结合剂序列)的群体，由此核心命中肽(核心结合剂序列)中的每个氨基酸在每个位置经历氨基酸取代。
为了进一步描述命中成熟404的过程，将实例/假设的核心命中肽或核心结合剂序列被描述为由具有氨基酸序列–M1M2M3M4M5- (SEQ ID NO:202)的5聚体肽组成。根据本发明，命中成熟404可以涉及在位置1、2、3、4和5处的氨基酸取代、缺失和插入中的任何或任何或全部的组合。例如，关于假设的核心命中肽或核心结合剂序列-M1M2M3M4M5- (SEQ IDNO:202)，本发明的实施方案可以包括位置1处的氨基酸M被其他19种氨基酸中的每一种取代(例如A1M2M3M4M5- (SEQ ID NO:203)、P1M2M3M4M5- (SEQ ID NO:204)、V1M2M3M4M5-(SEQ ID NO:205)、Q1M2M3M4M5- (SEQ ID NO:206)等)。每个位置(2、3、4和5)还将具有被其他19种氨基酸中的每一种取代的氨基酸M(例如，对于位置2，取代将类似于M1A2M3M4M5-(SEQ ID NO:207)、M1Q2M3M4M5- (SEQ ID NO:208)、M1P2M3M4M5- (SEQ ID NO:209)、M1N2M3M4M5- (SEQ ID NO:210)等)。应当理解，产生包含核心命中肽或核心结合剂序列的取代和/或缺失和/或插入序列的肽(固定在阵列上)。
在根据本发明的命中成熟404的一些实施方案中，可以进行双氨基酸取代。双氨基酸取代包括改变给定位置的氨基酸(例如M→P取代，例如在位置1)，然后用其他19种氨基酸中每一种取代位置2的氨基酸。重复该过程，直到组合位置1和2的所有可能的组合。通过实例的方式，回头参考具有氨基酸序列为-M1M2M3M4M5– (SEQ ID NO:202)的5聚体肽的假设的核心命中肽或核心结合剂序列，关于位置1和2的双氨基酸取代可以包括例如在位置1的M→P取代，然后在位置2的所有20种氨基酸的取代(例如，–P1A2M3M4M5– (SEQ ID NO:211)、–P 1F2M3M4M5– (SEQ ID NO:212)、–P1V2M3M4M5– (SEQ ID NO:213)、– P 1E2M3M4M5– (SEQID NO:214)，等)，在位置1的M→V取代，然后在位置2的所有20种氨基酸的取代(例如，– V1A2M3M4M5– (SEQ ID NO:215), – V 1F2M3M4M5– (SEQ ID NO:216), –P1V2M3M4M5– (SEQID NO:217), – V 1E2M3M4M5– (SEQ ID NO:218)，等)，在位置1的M→A取代，然后在位置2的所有20种氨基酸的取代(例如，– A 1A2M3M4M5– (SEQ ID NO:219)、–A 1F2M3M4M5– (SEQID NO:220)、– A 1V2M3M4M5– (SEQ ID NO:221)、– A 1E2M3M4M5– (SEQ ID NO:222)，等)。
在根据本发明的命中成熟404的一些实施方案中，可以进行核心命中肽的每个氨基酸位置的氨基酸缺失。氨基酸缺失包括制备包括核心命中肽序列或核心结合剂序列、但从核心命中肽序列或核心结合剂序列中缺失单个氨基酸(使得产生肽，其中每个肽的的氨基酸被缺失)的肽。通过实例的方式，回头参考具有氨基酸序列为-M1M2M3M4M5– (SEQ IDNO:202)的5聚体肽的假设的核心命中肽或核心结合剂序列，氨基酸缺失将包括制备一系列具有以下序列的肽：–M2M3M4M5– (SEQ ID NO:223)；–M1M3M4M5– (SEQ ID NO:223)；–M1M2M4M5– (SEQ ID NO:223)；–M1M2M3M5– (SEQ ID NO:223)；和–M1M2M3M4– (SEQ ID NO:223)。应当注意的是，在假设的5聚体的氨基酸缺失之后，产生5种新的4聚体。根据本发明的一些实施方案，可以对产生的每种新的4-聚体进行氨基酸取代或双氨基酸取代扫描。
类似于上文讨论的氨基酸缺失扫描，本文公开的命中成熟404的一些实施方案可以包括氨基酸插入扫描，由此在核心命中肽或核心结合剂序列的每个位置之前和之后插入20种氨基酸中的每一种。通过实例的方式，回头参考具有氨基酸序列为–M1M2M3M4M5– (SEQID NO:202)的5聚体肽的假设的核心命中肽或核心结合剂序列，氨基酸插入扫描将包括以下序列：–XM1M2M3M4M5– (SEQ ID NO:224)；–M1XM2M3M4M5– (SEQ ID NO:225)；–M1M2XM3M4M5– (SEQ ID NO:226); –M1M2M3XM4M5– (SEQ ID NO:227)；–M1M2M3M4XM5–(SEQ ID NO:228)；和–M1M2M3M4M5X– (SEQ ID NO:229)(其中X表示选自20种已知氨基酸或特定的确定的氨基酸子集的单独的氨基酸，由此将为20种或限定的氨基酸子集的每种产生肽复制品)。
还应当理解的是，上述的氨基酸取代的肽、双氨基酸取代的肽、氨基酸缺失扫描肽和氨基酸插入扫描肽还可以包括N末端和C末端中的一个或两个摆动氨基酸序列(例如类似于图3的306、306’所述)。如同图3中描述的N末端和C末端摆动氨基酸序列一样，N末端和C末端摆动氨基酸序列可以包含少至1个氨基酸或多至15或20个氨基酸，并且N末端摆动氨基酸序列可以与C末端摆动氨基酸序列相比长度相同、更长或更短。此外，N末端和C末端摆动氨基酸序列可以包含任何给定比率的任何确定的氨基酸组(例如，甘氨酸和丝氨酸的比率为3:1)。
在下面描述的命中成熟404的具体示例性实施方案中，7个氨基酸(例如7聚体)的核心命中肽或核心结合剂序列经历穷尽的单和双氨基酸筛选，并且包括N末端和C末端摆动氨基酸序列，其包含三个氨基酸(全部为甘氨酸)。
一旦制备核心命中肽或核心结合剂序列的各种取代、缺失和插入变化(例如，以固定方式在固体支持物诸如肽微阵列上)，测定纯化、浓缩的目标靶标的结合强度。
V. 肽延伸(N末端和C末端)：
在5聚体阵列实验中鉴定的基序可能仅代表最佳肽结合剂的短版本。本文描述了通过将选自5聚体阵列实验的序列从N末端和C末端之一或两者延伸一个或多个氨基酸来鉴定更长基序的策略。从选定的肽开始并在每端添加一个或多个氨基酸，可以产生延伸文库用于进一步选择。例如，从单个肽开始并使用全部20种天然氨基酸，可以创建160,000个独特肽的延伸文库。在一些实施方案中，重复合成每个延伸肽。
现在参考图4中图示描述的过程400的步骤406，在核心命中肽或核心结合剂序列成熟(使得核心命中肽或核心结合剂序列的更选氨基酸序列被鉴定用于结合目标靶标)后，N末端和/末端位置经历延伸步骤，由此成熟的核心命中肽(也称为成熟核心肽结合剂序列)512的长度被进一步延伸以提高对目标靶标的特异性和亲和力。
根据本发明的N末端延伸的各种实施方案，并且参考图5，一旦通过成熟过程(图4的404)鉴定成熟的核心命中肽序列(也称为成熟核心肽结合剂序列)512，则向成熟的核心命中肽512的N末端末端添加(或在其上合成)来自肽结合剂发现步骤(302，图3)的每个特定肽(表示为5聚体的群体，图3的308)。以这种方式，直接邻近于成熟的核心命中肽512的最N末端氨基酸添加(或合成)图3中示例为5聚体的群体的(群体的)每个肽308的最C末端氨基酸。
同样，根据本发明的C末端延伸的各种实施方案，并且参考图5，一旦通过成熟过程(图4的404)鉴定成熟的核心命中肽序列512，则向成熟的核心命中肽512的C末端末端添加(或在其上合成)来自肽结合剂发现步骤(302，图3)的群体的每个特定肽(表示为5聚体的群体，图3的308)。以这种方式，直接邻近于成熟的核心命中肽512的最C末端氨基酸添加(或合成)图3中示例为5聚体的群体的每个肽序列308的最N末端氨基酸。
根据本发明的一些实施方案(图5)，C末端延伸和N末端延伸中使用的成熟的核心命中肽之一或两者还可以包括N末端和C末端中的一个或两个摆动氨基酸序列(类似于图3的306、306’所述)。如同图3中描述的N末端和C末端摆动氨基酸序列一样，N末端和C末端摆动氨基酸序列可以包含少至1个氨基酸或多至15或20个氨基酸(或更多)，并且N末端摆动氨基酸序列可以与C末端摆动氨基酸序列相比长度相同、更长或更短。此外，N末端和C末端摆动氨基酸序列可以包含任何给定比率的任何确定的氨基酸组(例如，甘氨酸和丝氨酸的比率为3:1)。
通过实例的方式，在图5，显示了肽延伸阵列500，其具有用于N末端延伸514的肽群体和用于C末端延伸516的肽群体。每个肽群体514、516可以含有来自肽微阵列300的全部肽群体310(在肽结合剂发现步骤404中使用)。如进一步所示，两个肽群体514、516中的每个肽可以含有相同的成熟的核心命中肽512，每个都具有不同的肽508(来自肽结合剂发现步骤302的肽群体，图3)。还如图5中所示，群体514、516的每个肽包括N末端和C末端摆动氨基酸序列。
在一个实施方案中，将延伸阵列500(包括群体514和516)暴露于浓缩、纯化的目标靶标(如在肽结合剂发现，过程400的步骤401中)，由此目标靶标可以独立于构成群体514、516的其他肽在群体514、516的任何肽(例如环状肽)处结合。在暴露于目标靶标之后，测定目标靶标与群体(例如环状肽)514、516的肽的结合，例如通过将群体(例如环状肽)514的个别肽和目标靶标的复合物暴露于具有与其连接的可报告标记(例如过氧化物酶)的抗体(对目标靶标特异性)(也应当理解，目标靶标可以直接用报道分子标记)。因为阵列上每个位置的(每个5聚体的)肽508是已知的(例如，环状肽)，所以可以绘制/定量/比较/对比目标靶标与包含成熟的核心命中肽512与相应的肽508(例如，环状肽)的特定肽(例如，环状肽)的结合的序列(和结合强度)。比较目标靶标与成熟的核心命中肽512-肽508组合(包含群体514或516)的示例性方法是综述基于原则性分析分布的聚类中的结合强度，诸如描述于Standardizing and Simplifying Analysis of Peptide Library Data, Andrew DWhite et al, J Chem Inf Model, 2013, 53(2), pp 493-499且在本文说明(例如在图3和4)。如本文所例举，在基于原则性分析分布的聚类中显示的蛋白质与(群体514、516)的相应肽(例如环状肽)结合的聚类表明具有重叠肽序列的肽5聚体508。如下面更详细地证明，从(每个聚类的)重叠肽序列，可以鉴定或者至少假设和构建成熟、延伸的核心肽结合剂序列，用于进一步评估。在本申请的一些实施方案中，成熟、延伸的核心肽结合剂序列经历成熟过程(如本文描述和例示并在图4的步骤404说明)。
延伸的肽结合剂的另外轮的优化也是可能的。例如，第三轮结合剂优化可以包括用甘氨酸(G)氨基酸延伸来延伸阵列实验中鉴定的序列。其他优化可以包括产生包括参考序列(即在任何前述步骤中优化和选择的肽结合剂)的所有可能的单和双取代/缺失变体的双取代/缺失文库。在一个实施方案中，在本文所述的任何成熟和/或延伸过程之后或期间，所述肽可以被环化。
VI. 成熟、延伸的核心肽结合剂序列的特异性分析：
鉴定成熟、延伸的核心肽结合剂序列后，可以通过测量本领域可用的肽亲和力和特异性的任何方法进行特异性分析。特异性分析的一个实例包括“Biacore™”系统分析，其用于在分子与目标靶标的相互作用、动力学速率(“结合(on)”，结合(binding)，和“解离(off)”，解离(disassociation))和亲和力(结合强度)方面表征分子。Biacore™是GeneralElectric Company的商标，并且可通过公司网站获得。
图6是新颖的肽结合剂鉴定方法(例如，图4的方法400)的简要示意图。如所示，通过在肽微阵列601上制备(例如，通过无掩模阵列合成)肽群体来进行肽结合剂发现602。如所示，每个肽包括5个“循环”的N末端摆动合成606’和C末端摆动合成606(例如，N和C末端摆动合成包含五个氨基酸)。应当理解的是，C和N末端的摆动合成可以包括如上所示的任何组合物(例如，仅3:1 [G:S]比率的氨基酸G和S。每个肽还显示为包含5聚体肽结合剂604，如上所示，其可以包含最多达290万个不同的肽序列，使得表示完整的人类蛋白质组。此外，应当注意的是，不同的肽结合剂604可以根据特定“规则”合成(例如，没有C或M氨基酸，没有连续顺序的相同氨基酸的重复，并且没有HPQ氨基酸基序)。如上所述，将目标靶标(例如，以纯化和浓缩形式)暴露于肽结合剂604，并对结合进行评分(例如，通过原则性聚类分析的方式)，由此基于重叠的结合基序鉴定“核心命中肽”序列或核心结合剂序列。
在鉴定核心命中肽序列或核心结合剂序列后，可以进行详尽的成熟过程620。在一些实施方案中，在具有N末端和C末端摆动的肽微阵列601上合成核心命中肽或核心结合剂序列(例如7聚体，624)(在步骤620中显示为3个循环的仅G氨基酸的N和C末端摆动，尽管摆动氨基酸可以如上所述变化)。在穷尽性成熟的一些实施方案中，在肽微阵列601上合成肽，其中核心命中肽或核心结合剂序列624的每个氨基酸位置被其他19种氨基酸中的每一种取代，在肽微阵列601上合成双氨基酸取代(如所述)，或在肽微阵列601上合成氨基酸缺失扫描，或在肽微阵列601上合成氨基酸插入扫描。在一些情况下，进行所有上述成熟过程(并如上对于由于氨基酸缺失和插入扫描产生的新肽所述进行重复)。在合成包含各种肽(包括本文所述的取代、缺失和插入)的成熟阵列620之后，将目标靶标暴露于在成熟阵列620上合成的修饰的核心命中肽或核心结合剂序列624，并测定结合强度，由此鉴定“成熟的核心敲击肽”(成熟的核心肽结合剂序列)。
在鉴定“成熟的核心命中肽”序列(成熟核心肽结合剂序列)之后，可以进行N末端和C末端之一或二者的延伸(在630显示为包括N末端延伸632和C末端延伸631)。N末端和C末端延伸涉及合成具有分别在N末端或C末端合成的(例如5聚体)肽结合剂604的群体的成熟的核心命中肽(成熟核心肽结合剂序列)。如在631所示，C末端延伸包括5轮摆动合成(如上所述)636和5聚体肽结合剂的群体634在成熟的核心命中肽638的C末端合成，然后另外5个循环的N末端摆动合成636’。类似地，如在632所示，N末端延伸包括5轮摆动合成(如上所述)636 (其在成熟的核心命中肽(成熟核心肽结合剂序列)638的C末端合成)，然后5聚体肽结合剂的群体634，和另外5个循环的(成熟的核心命中肽(成熟核心肽结合剂序列)638)的N末端合成的摆动合成636’。在合成包含各种延伸肽(包括C末端和N末端延伸肽)的延伸阵列630后，将目标靶标暴露于在延伸阵列630上合成的C末端和N末端延伸肽群体631、632，并且对结合进行评分(例如，通过原则性聚类分析)，由此鉴定C末端、N末端成熟、延伸的核心肽结合剂序列。如箭头640所表示，根据一些实施方案，在鉴定成熟、延伸的核心肽结合剂序列后，可以重复成熟、延伸的核心肽结合剂序列的成熟过程620(以如上所述的任何方式)，然后对由此产生的任何改变的肽重复延伸过程。在一个实施方案中，在本文所述的任何成熟和/或延伸过程之后或期间，所述肽可以如本文所述进行环化。
实施例1
肽文库的N末端和C末端之间的环化
使用无掩模光指导的肽阵列合成产生肽阵列，其中所有反应性氨基酸侧链基于US20120238477 A1(通过引用并入本文)的方法用酸不稳定基团保护。在本实施例中，微阵列表面由涂覆有三维胺层的载玻片构成。肽文库框架(C至N末端)包括文库设计(下文)中描述的接头分子(例如6-氨基己酸)、Glu(OtBu)或Glu(OAll)和可变肽序列。Glu(OtBu)和Glu(OAll)通过谷氨酸的侧链的γ羧酸连接到接头分子，其中C末端分别用叔丁基酯或烯丙基酯保护。示例性肽文库框架显示于图7中。在一些实施方案中，可变肽序列由3至15个氨基酸组成。肽文库的N末端是游离胺。为了环化线性肽文库，首先将该阵列在室温下用四(三苯基膦)钯(0)(2mM)在THF中处理3小时，以从肽文库的C末端除去OAll基团。为了从阵列除去任何残留的钯，将载片用在DMF中的5％ DIPEA和5％二乙基二硫代氨基甲酸钠洗涤5分钟。在环化前将载片用水洗涤1分钟，然后旋转至干燥。然后通过使用标准偶联程序将N末端与C末端偶联来环化阵列：将载片在室温下用活化剂(HOBt和HBTU，各20mM)和碱(DIPEA，2M)处理3小时。然后将环化的阵列在室温下在三氟乙酸(47.5mL)、三异丙基硅烷(0.25mL)和水(2.25mL)中侧链脱保护30分钟。在侧链脱保护之后，将载片在甲醇中洗涤两次30秒，在水中洗涤四次10秒，用含有0.05% tween-20的1xTBS洗涤2分钟，然后在1xTBS中洗涤1分钟。最后，将载片旋转至干燥。
实施例2
使用两个半胱氨酸残基环化肽文库
使用无掩模光指导的肽阵列合成产生肽阵列，其中所有反应性氨基酸侧链都用酸不稳定基团保护。在本实施例中，微阵列表面由涂覆有三维胺层的塑料载片构成。肽文库框架(C至N末端)由接头分子(例如6-氨基己酸)、半胱氨酸、可变肽序列和半胱氨酸组成。可变肽序列由3至15个氨基酸组成。肽文库的N末端是游离胺。将微阵列在室温下在三氟乙酸(47.5mL)、三异丙基硅烷(0.25mL)和水(2.25mL)中侧链脱保护30分钟。然后将载片在甲醇中洗涤两次30秒，在水中洗涤四次10秒，用1xTBS/0.05% tween 20洗涤2分钟，然后在1xTBS中洗涤1分钟。然后将载片旋转至干燥。在非常温和的条件下形成两个半胱氨酸之间的二硫键。将阵列在室温下用含有10％ DMSO的100 mM NH4Ac缓冲液(pH 8.0)处理24小时。然后将载片用水溶液洗涤并旋转至干燥。
实施例3
谷氨酸脱保护
微阵列表面由涂覆有三维胺层的载玻片构成。参考图8B，向胺底物偶联(C至N末端)6-氨基己酸接头分子、可变谷氨酸衍生物和甘氨酸。肽的N末端是游离的。谷氨酸衍生物包括在C末端具有OA11保护的谷氨酸(其中侧链的γ羧酸与接头反应，上方亚阵列)或在侧链羧酸上具有OtBu保护的谷氨酸(C末端与接头反应，下方亚阵列)。然后通过将载片在室温下浸入三氟乙酸(47.5mL)、三异丙基硅烷(0.25mL)和水(2.25mL)的溶液中30分钟来除去OtBu基团。为了除去所有痕量的TFA，将载片在甲醇中洗涤两次30秒，在水中洗涤四次10秒，用含有0.05% tween-20的1xTBS洗涤2分钟，然后在1xTBS中洗涤1分钟。最后，将载片旋转至干燥。然后，将载片在室温下用四(三苯基膦)钯(0)(2mM)/THF处理3小时以除去OAll基团。为了从阵列除去任何残留的钯，将载片用5％ DIPEA和5％二乙基二硫代氨基甲酸钠/DMF洗涤5分钟。将载片用水洗涤1分钟，然后旋转至干燥。在谷氨酸脱保护之后，使载片在室温下在0.1M MES缓冲液中与用100mM EDC活化的50mM胺-PEG2-生物素反应2小时。如下所详述，将载片用洗涤1和水洗涤，然后用链霉抗生物素蛋白-Cy5染色。
如图8A中所示，对胺-PEG2-生物素标记的载片进行荧光扫描。上方和下方亚阵列显示一致的荧光强度(对于上方和下方亚阵列，分别为2,500和2,000个荧光单位)，表明OtBu和OAll保护基的成功去除。
实施例4
环状/线性肽文库合成
根据图9中描述的方法产生本文所述的肽文库。在相同的微阵列载片上产生肽文库，其包括线性肽亚阵列和环状肽亚阵列。两个亚阵列中的每种肽都包括C末端谷氨酸和游离的N末端氨基。如实施例3中所述，每个谷氨酸侧链都通过6-氨基己酸接头分子连接至阵列表面。线性肽亚阵列的每种肽在其C末端被OtBu保护基保护。环状肽亚阵列中的每种肽在其C末端被OAll保护基保护。否则，每个亚阵列中的肽是相同的。基于所有肽的C末端的两阶段脱保护，所有侧链都用酸不稳定基团保护。
仍然参考图9，首先，根据实施例3中所述的程序，通过用钯(0)处理载片来进行C末端脱保护步骤以从环状肽亚阵列的肽去除OAll保护基。所得的脱保护的肽具有游离的C末端羧基。脱保护选择性地导致从环状肽亚阵列中除去OAll保护基，并且不从线性肽亚阵列中的肽除去OtBu保护基或侧链保护基。
接下来，进行环化步骤以使环状肽亚阵列中的脱保护肽环化。为了进行环化步骤，根据实施例1中描述的条件处理侧面，导致通过酰胺键形成的头至尾环化。
在环化步骤之后，根据实施例3中所述的程序，通过用TFA处理载片来进行C末端脱保护步骤以从环状肽亚阵列的肽去除OtBu保护基。所得的脱保护的肽具有游离的C末端羧基。
所得的载片包括线性肽的线性肽亚阵列和环化肽和一些线性肽的环状肽亚阵列。基于这种方法，两种亚阵列中的线性肽是结构相同的。通过产生具有与未能在环状肽亚阵列上环化的肽相同的线性肽的线性肽亚阵列，可以检测线性肽与靶蛋白的相互作用。
实施例5
肽合成
由GenScript (Piscataway, NJ)以> 95％的纯度提供环状和线性肽。为了最好地复制U和阵列表面之间的连接，将肽以酰胺化的谷氨酸(U)的侧链排序，使氨基酸成为谷氨酰胺(Q)。使用由GenScript提供的肽重量在水中制备5mM储备溶液。
实施例6
链霉抗生物素蛋白与肽微阵列的结合
将载片在室温下在30mL结合缓冲液中与150mg链霉抗生物素蛋白-Cy5结合30分钟。结合缓冲液含有1 x TBS, pH 7.4中的1％碱溶性酪蛋白和0.05% tween-20。30分钟之后，将载片在1 x TBS缓冲液中洗涤两次1分钟，用水洗涤30秒，并旋转至干燥。
实施例7
荧光扫描/数据分析
用MS200扫描仪(Roche NimbleGen)以分辨率2μm、波长635nm、增益25％和激光强度100％测量阵列的Cy5荧光强度。使用Image Extraction Software (Roche NimbleGen)提取Cy5信号强度。在R中进行数据预处理、归一化和统计学检验。用Spotfire 6.5.0(Tibco, Boston, MA)软件平台进行数据可视化和分析。
实施例8
表面等离子共振
表面等离子共振(SPR)实验在BIAcore X100 (GE Healthcare)上进行。运行缓冲液是HBS-EP+。为了制备链霉抗生物素蛋白涂覆的芯片，使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare)将乙酸酯5.0固定缓冲液中的100μg/mL链霉抗生物素蛋白与CM5芯片的流动室2偶联。然后通过使含有0.2M NaCl和10mM NaOH的水溶液流经制备的芯片60秒钟来调理芯片。使用在每个步骤之间具有碱再生的多循环实验来测量环状和线性肽针对制备的链霉抗生物素蛋白芯片的结合亲和力。此处，将七种制备浓度的HBS-EP+缓冲液中的肽流过链霉抗生物素蛋白芯片30秒，然后使其解离60秒。在每种肽浓度之后，通过使水中的0.2M NaCl和10mM NaOH流过芯片30秒、随后为120秒的稳定时间来再生链霉抗生物素蛋白芯片。使用BIAcore X100评估软件2.0.1版来测定动力学参数。
实施例9
随机4聚体文库设计
根据实施例1、3和4中所述的方法产生环状和线性肽。文库中的所有肽均为形式XXXXU，每个X是选自L-和D-氨基酸的特定集合的独立选择的氨基酸，并且U是在C末端用烯丙基酯(环状特征)或叔丁基酯(线性特征)保护的谷氨酸，如实施例4中所述。该设计中包括的氨基酸是L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Gln、L-Gly、L-Pro、L-Ala、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Tyr、L-Val、D-Ala、D-Asn、D-Leu、D-Phe、D-Pro、D-Ser、D-Trp和D-Tyr。如本文所用，氨基酸序列中的小写字母“p”是指D-脯氨酸。
根据实施例6和7的方法进行形式XXXXU的肽的链霉抗生物素蛋白结合测定。结果显示于图10中，其为显示与链霉抗生物素蛋白-Cy5结合的形式XXXXU的肽文库的环状相比于线性荧光强度的图。图上的每个点代表独特的肽序列。从相关线掉下的所有点都表示相同序列的环状和线性构象之间的差异结合。环状NQpWU (SEQ ID NO:83)肽被鉴定为具有最高的循环荧光强度。
实施例10
NQpWQ (SEQ ID NO:84) SPR结果
头至尾环状NQpWQ (SEQ ID NO:84)肽(根据实施例5获得)是根据实施例8的表面等离子共振(SPR)结合研究的主体。图11显示头至尾环状NQpWQ (SEQ ID NO:84)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片的表面等离子共振(SPR)结合曲线。图12显示头至尾环状NQpWQ (SEQ ID NO:84)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片相比于肽浓度的表面等离子共振(SPR)结合。虚线指示结合常数。
线性NH2-NQpWQ-COOH (SEQ ID NO:85)肽(根据实施例5获得)也是SPR研究的主体。虽然环状NQpWQ (SEQ ID NO:84)肽具有61.3μM的结合常数(KD)，但线性NH2-NQpWQ-COOH(SEQ ID NO:85)肽显示不可测量的结合活性(KD > 2000 µM)。各自根据实施例5制备的环状NQpWQ (SEQ ID NO:84)肽和线性NH2-NQpWQ-COOH (SEQ ID NO:85)肽之间的活性差异与根据实施例4在微阵列上分别产生的线性和环化的NQpWU (SEQ ID NO:83)肽的亚阵列之间的活性差异一致。该结果显示根据实施例4的环化步骤是成功的。
实施例11
HPQ-特异性设计文库设计
根据实施例1、3和4中所述的方法产生环状和线性肽。文库中的所有肽均为形式JXXHPQXXJU (SEQ ID NO:86)，其中J是所有20种标准氨基酸的混合物，每个X是独立选择的氨基酸，并且U是在C末端用烯丙基酯(环状特征)或叔丁基酯(线性特征)保护的谷氨酸，如实施例4中所述。
根据实施例6和7的方法进行形式JXXHPQXXJU (SEQ ID NO:86)的肽的链霉抗生物素蛋白结合测定。结果显示于图13中，其为显示与链霉抗生物素蛋白-Cy5结合的形式JXXHPQXXJU (SEQ ID NO:86)的肽文库的环状相比于线性荧光强度的图。图上的每个点代表独特的肽序列。从相关线掉下的所有点都表示相同序列的环状和线性构象之间的差异结合。
每个序列的数据也可以表示为环状和线性荧光强度之间的对数倍数(logFC)变化。如本文所用，“logFC”是环状和线性荧光强度之间的对数倍数变化，其中正logFC指示优先结合环状肽，而负logFC指示优先结合线性肽。形式JXXHPQXXJU (SEQ ID NO:86)的肽文库的荧光强度数据在图14所示的图中被描绘为环状荧光强度相比于 logFC。环状和线性特征之间没有显示变化的肽未能环化或没有显示构象偏好。该初始的HPQ-特异性设计的前100个命中显示在表1中。
表1. 用于实施例11的HPQ-特异性设计的前100个链霉抗生物素蛋白结合肽。
Figure 560885DEST_PATH_IMAGE095
实施例12
HPQ-特异性设计的扩展
为了确定J的侧接XXHPQXX (SEQ ID NO:187)序列的哪种组合将产生与链霉抗生物素蛋白的最高结合，对于表1中所示的序列合成在J位置中具有标准20种L-氨基酸的所有可能组合的序列。根据实施例6和7的方法进行表1的肽的链霉抗生物素蛋白结合测定。结果显示于图15中，其为显示环状荧光强度相比于 logFC的图。环状LYDHPQNGGU (SEQ ID NO:188)肽被鉴定为具有最高的环状强度，并且环状QNDHPQNGGU (SEQ ID NO:189)肽鉴定为具有最高的环状强度和高logFC的肽。
实施例13
LYDHPQNGGQ (SEQ ID NO:190) SPR结果
头至尾环状LYDHPQNGGQ (SEQ ID NO:190)肽(根据实施例5获得)是根据实施例8的表面等离子共振(SPR)结合研究的主体。图16显示头至尾环状LYDHPQNGGQ (SEQ ID NO:190)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片的表面等离子共振(SPR)结合曲线。图17显示头至尾环状LYDHPQNGGQ (SEQ ID NO:190)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5BIAcore芯片相比于肽浓度的表面等离子共振(SPR)结合。虚线指示结合常数。
线性NH2-LYDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:191)肽(根据实施例5获得)也是SPR研究的主体。图18显示线性NH2-LYDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:191)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片的表面等离子共振(SPR)结合曲线。图19显示线性NH2-LYDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:191)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片相比于肽浓度的表面等离子共振(SPR)结合。虚线指示结合常数。
虽然环状LYDHPQNGGQ (SEQ ID NO:190)肽具有9.4μM的结合常数(KD)，但线性NH2-LYDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:191)肽具有100 µM的结合常数(KD)。各自根据实施例5制备的环状LYDHPQNGGQ (SEQ ID NO:190)肽和线性NH2-LYDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:191)肽之间的活性差异与根据实施例4在微阵列上分别产生的线性和环化的LYDHPQNGGU (SEQ IDNO:188)肽的亚阵列之间的活性差异一致。该结果显示根据实施例4的环化步骤是成功的。
实施例14
QNDHPQNGGQ (SEQ ID NO:192) SPR结果
头至尾环状QNDHPQNGGQ (SEQ ID NO:192)肽(根据实施例5获得)是根据实施例8的表面等离子共振(SPR)结合研究的主体。图20显示头至尾环状QNDHPQNGGQ (SEQ ID NO:192)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片的表面等离子共振(SPR)结合曲线。图21显示头至尾环状QNDHPQNGGQ (SEQ ID NO:192)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5BIAcore芯片相比于肽浓度的表面等离子共振(SPR)结合。虚线指示结合常数。
线性NH2-QNDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:193)肽(根据实施例5获得)也是SPR研究的主体。图22显示线性NH2-QNDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:193)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片的表面等离子共振(SPR)结合曲线。图23显示线性NH2-QNDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:193)肽与链霉抗生物素蛋白涂覆的CM5 BIAcore芯片相比于肽浓度的表面等离子共振(SPR)结合。虚线指示结合常数。
虽然环状QNDHPQNGGQ (SEQ ID NO:192)肽具有10.8μM的结合常数(KD)，但线性NH2-QNDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:193)肽具有320 µM的结合常数(KD)。各自根据实施例5制备的环状QNDHPQNGGQ (SEQ ID NO:192)肽和线性NH2-QNDHPQNGGQ-COOH (SEQ ID NO:193)肽之间的活性差异与根据实施例4在微阵列上分别产生的线性和环化的QNDHPQNGGU(SEQ ID NO:189)肽的亚阵列之间的活性差异一致。该结果显示根据实施例4的环化步骤是成功的。
Figure IDA0001517942830000011
Figure IDA0001517942830000021
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Figure IDA0001517942830000721
Figure IDA0001517942830000731
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Claims (12)

1.一种产生肽微阵列的方法，所述肽微阵列包含：
（a）至少一个包含至少一种式I的环状肽的环状肽亚阵列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中每个R1、R2、R3和R4独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R5和R6独立地是氢或N末端封端基团；
每个R7独立地是-OH或C末端封端基团；
Q选自羰基、天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链；
每个X和Y独立地选自键、与Z共价连接的天然氨基酸侧链和与Z共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z是包含选自酰胺键、二硫键、异肽键、1,2,3-三唑和任选取代的1,2-醌的部分的基团；
L'和L''各自独立地是任选的二价连接基团或键；
m是0至6的整数；
n是0至6的整数；
p是1至100的整数；
q是0或1；
r是0或1；
t是0至100的整数；
u是0或1；且*是连接至少一种环状肽与具有反应性表面的固体支持物的连接点；
（b）至少一个包含至少一种式IIa的线性肽的线性肽亚阵列
Figure DEST_PATH_IMAGE002
IIa
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、Q、L'、L''、m、n、p、q、r、t、u和*如对于式I所定义；
并且X’、Y’、Z'和Z''如对于式II所定义；所述方法包括
（i）使式II的官能化肽在引起Z形成的条件下反应并且在与不能环化的线性肽混合的所述至少一个环状肽亚阵列中提供所述至少一种式I的环状肽，
Figure DEST_PATH_IMAGE003
其中R1、R2 、R3、R4、R5、R6、Q、L'、L''、m、n、p、q、r、t、u和*如对于式I所定义；
每个R7独立地选自-OH、C末端封端基团和
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
每个R8独立地是天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
每个R9独立地是-OH或C末端封端基团；
每个X'独立地选自键、与Z''共价连接的天然氨基酸侧链和与Z''共价连接的非天然氨基酸侧链；
每个Y'独立地选自键、与Z'共价连接的天然氨基酸侧链和与Z'共价连接的非天然氨基酸侧链；
Z'和Z''各自独立地选自键、-OH、氢、硫醇、胺、羧酸、酰胺、炔、叠氮化物、任选取代的氨基苯酚、天然氨基酸侧链、非天然氨基酸侧链、N末端保护基和C末端保护基，条件是Z'和Z''是组合形成Z的互补基团；
b是0至50的整数；
且***是与所述官能化肽的其余部分的连接点；
（ii）将所述肽微阵列与包含靶蛋白的目标靶标温育；
（iii）测量所述至少一个环状肽亚阵列的肽和所述至少一个线性肽亚阵列的肽与所述靶蛋白的结合特性，以测量包含相同氨基酸序列的线性肽和环状肽之间的差异；和
（iv）鉴定不能环化或不具有对相应线性肽的构象偏好的肽;
其中：所述至少一种式I的环状肽和所述至少一种式IIa的线性肽被固定至所述反应性表面，
所示至少一种式II的官能化肽和所述至少一种式IIa的线性肽结构相同。
2.权利要求1的方法，其中Z包含肽键，Z'包含C末端保护基团或Z''包含N末端保护基团，Q是羰基，q是0，r是1，且u是0。
3.权利要求1的方法，其中p是1至20的整数，q是0，r是1，t是0，u是0，Q是羰基，且Z是酰胺键。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肽微阵列使用无掩模光引导的微阵列合成制备。
5.一种制备肽微阵列的方法，其包括：
产生至少一个第一线性肽亚阵列，其包含与微阵列表面共价连接的第一多个线性肽；
产生至少一个第二线性肽亚阵列，其包含与微阵列表面共价连接的第二多个线性肽，其中所述第二多个线性肽具有与所述第一多个线性肽相同的氨基酸序列；
在使第一多个线性肽环化的条件下处理肽微阵列以提供包含与不能环化的线性肽混合的多个环化肽的至少一个环化肽亚阵列，其中第二多个线性肽不环化；
将所述肽微阵列与包含靶蛋白的目标靶标温育；
测量所述至少一个环状肽亚阵列的肽和所述至少一个第二线性肽亚阵列的肽与所述靶蛋白的结合特性，以测量包含相同氨基酸序列的线性肽和环状肽之间的差异；和
鉴定不能环化或不具有对相应线性肽的构象偏好的肽。
6.权利要求5的方法，其中所述第一多个线性肽是第一多个受保护线性肽，其中所述第一多个受保护线性肽的C末端受第一保护基保护；且
所述第二多个线性肽是第二多个受保护线性肽，其中所述第二多个受保护线性肽具有与所述第一多个受保护线性肽相同的氨基酸序列，且其中所述第二多个受保护线性肽的C末端受不同于第一保护基的第二保护基保护。
7.权利要求5的方法，其中第一多个线性肽和第二多个线性肽各自通过羧酸侧链共价连接到微阵列表面。
8.权利要求5的方法，其中在使第一多个线性肽环化的条件下处理肽微阵列包括活化第一多个线性肽的C末端的羧基以与第一多个线性肽的N末端的氨基基团反应以形成酰胺键。
9.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述肽微阵列使用无掩模光引导的微阵列合成制备。
10.权利要求5-8中任一项的方法，其包括使所述肽微阵列经历一个或多个洗涤步骤，并将其暴露于对目标靶标具有期望的特异性的第二抗体。
11.权利要求10的方法，其中所述第二抗体能够通过荧光、化学发光、比色法或放射自显影检测。
12.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述肽微阵列包含至少1.6 x 105个肽。
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