JP6824903B2 - ペプチド環化およびプロテアーゼ処理のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
1. 式Iの少なくとも1つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイ:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である]
その際、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
4. QおよびXは、それぞれシステイン側鎖であり、Zはジスルフィド結合であり、qは1であり、rは1であり、tは0であり、uは0である、項目1または2に記載のペプチドマイクロアレイ。
6. Zは
7. Zは
8. Zは
9. YはZへの結合であり、Zは
10. YはZへの結合であり、Zは
11. XはZへの結合であり、Zは
12. XおよびYはZへの結合であり、Zは
13. L’およびL”はそれぞれ、独立して、式II:
14. R8およびR8’はそれぞれ水素である、項目13に記載のペプチドマイクロアレイ。
16. mは0である、項目1〜15のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
18. R8およびR8’はそれぞれ水素であり、mは0であり、nは0であり、aは5であり、L’は存在し、L”は存在しない、項目1〜12または16〜17のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
20. L”はCH2CH2である、項目1〜14、16〜17、または19のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
22. pは1〜20の整数である、項目1〜21のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
24. 反応性表面が活性アミンを含む、項目1〜23のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
26. ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が5つのアミノ酸を含む、項目1〜25のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
30. ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、20種類のアミノ酸それぞれまたはほぼ等濃度の20種類のアミノ酸のサブセットを含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目28または29に記載のペプチドマイクロアレイ。
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である]
式IIの官能化ペプチド:
[式中:
R1、R2、R3、R4、R5、R6、Q、L’、L”、m、n、p、q、r、t、u、および*は、式Iについて定めたものであり;
R7はそれぞれ、独立して、−OH、C末端キャッピング基、および
R8はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R9はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
X’はそれぞれ、独立して、結合、Z”に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZ”に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Y’はそれぞれ、独立して、結合、Z’に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZ’に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Z’およびZ”はそれぞれ、独立して、結合、−OH、水素、チオール、アミン、カルボン酸、アミド、アルキン、アジド、場合により置換されたフミノフェノール、天然アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸側鎖、N末端保護基、およびC末端保護基からなる群から選択され、ただし、Z’およびZ”は結合してZを形成する相補基であり;
bは、0から50までの整数であり;
***は、官能化ペプチドの残部への結合点である]
その際、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
37. XおよびYはZへの結合であり、Zは**−S−S−**を含み、X’はZ”への結合であり、Y’はZ’への結合であり、Z’およびZ”はシステイン側鎖を含み、qは1であり、uは1である、項目33または34に記載の方法。
39. YはZへの結合であり、Zは
40. さらに、官能化ペプチドを銅触媒と接触させて
41. YはZへの結合であり、Zは
42. さらに、官能化ペプチドを銅触媒と接触させて
43. Zは
44. さらに、官能化ペプチドをフェリシアン化カリウムと接触させて
45. R3およびR8は官能化ペプチドがブテラーゼ1認識配列を含むように定められ、YはZへの結合であり、Zは
46. さらに、官能化ペプチドをブテラーゼ1と接触させて
47. XおよびYはZへの結合であり、Zは
49. L’は6−アミノヘキサン酸である、項目33〜48のいずれか1つに記載の方法。
51. mは0である、項目33〜50のいずれか1つに記載の方法。
52. nは0である、項目33〜51のいずれか1つに記載の方法。
54. pは1〜20の整数である、項目33〜53のいずれか1つに記載の方法。
56. 固体支持体が、プラスチック、ガラス、および炭素複合材料からなる材料の群から選択される、項目33〜55のいずれか1つに記載の方法。
58. ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が同数のアミノ酸を含む、項目33〜57のいずれか1つに記載の方法。
60. ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が、メチオニンアミノ酸、システインアミノ酸、同一アミノ酸のアミノ酸リピート、またはヒスチジン(H)−プロリン(P)−グルタミン(Q)配列からなるアミノ酸モチーフをいずれも含まない、項目33〜59のいずれか1つに記載の方法。
63. ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、20種類のアミノ酸それぞれまたはほぼ等濃度の20種類のアミノ酸のサブセットを含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目61または62に記載の方法。
マイクロアレイ表面に共有結合した第1の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも1つの第1の直鎖状ペプチドサブアレイを作製する;
マイクロアレイ表面に共有結合した第2の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも1つの第2の直鎖状ペプチドサブアレイを作製し、その際、第2の複数の直鎖状ペプチドは第1の複数の直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有する;そして
第1の複数の直鎖状ペプチドを環化させて複数の環化ペプチドを含む少なくとも1つの環化ペプチドドサブアレイを生成させる条件下でペプチドマイクロアレイを処理し、その際、第2の複数の直鎖状ペプチドは実質的に環化しない。
第2の複数の直鎖状ペプチドは第2の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、その際、第2の複数の保護された直鎖状ペプチドは第1の複数の保護された直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、第2の複数の保護された直鎖状ペプチドのC末端は第1保護基と異なる第2保護基により保護されている;
項目66に記載の方法。
ペプチドマイクロアレイを第1の脱保護試薬と接触させて第1保護基を選択的に除去して、第1の複数の脱保護された直鎖状ペプチドを含む少なくとも1つの第1の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイを得る;そして
ペプチドマイクロアレイを第2の脱保護試薬と接触させて第2保護基を選択的に除去して、第2の複数の脱保護された直鎖状ペプチドを含む少なくとも1つの第2の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイを得る。
71. カルボン酸側鎖はグルタメートまたはアスパルテート側鎖である、項目70に記載の方法。
73. 第1の複数の直鎖状ペプチドのうち少なくとも1つの分子は環化できない、項目66〜72のいずれか1つに記載の方法。
76. 第1の脱保護試薬がパラジウム触媒である、項目67〜75のいずれか1つに記載の方法。
78. 第2保護基がOtBuである、項目67〜77のいずれか1つに記載の方法。
80. 酸がトリフルオロ酢酸である、項目79に記載の方法。
81. 第1の複数の直鎖状ペプチドを環化させる条件下でのペプチドマイクロアレイの処理が、第1の複数の直鎖状ペプチドのC末端のカルボキシル基を活性化して第1の複数の直鎖状ペプチドのN末端のアミノ基と反応させてアミド結合を形成することを含む、項目66〜80のいずれか1つに記載の方法。
85. 式IIIの少なくとも1つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイの作製方法であって、下記を含む方法:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
Qは、カルボニルであり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
tは、0から100までの整数であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である];
複数の第1ペプチドを環状ペプチドサブアレイ上において作製し、その際、第1ペプチドは式IVのものであり:
R1、R2、R3、R4、Q、L’、L”、m、n、p、t、および*は、式IIIについて定めたものであり;
Z1は、第1カルボキシル保護基であり;
Z2は、水素である];
複数の第2ペプチドを直鎖状ペプチドサブアレイ上において作製し、その際、第2ペプチドは式Vのものであり:
R1、R2、R3、R4、Q、L’、L”、Z2、m、n、p、t、および*は、式IVについて定めたものであり;
Z3は、第1カルボキシル保護基と異なる第2カルボキシル保護基であり;
は、水素である];
第1ペプチドを処理して第1の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させ、その際、直鎖状脱保護ペプチドは式VIのものであり:
R1、R2、R3、R4、Q、L’、L”、Z2、m、n、p、t、および*は、式IVについて定めたものであり;
Z1は、−OHである];
続いて、
直鎖状脱保護ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させ;
続いて、
第2ペプチドを処理して式VIの第2の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させ:
その際、第1ペプチドおよび第2ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
87. L”はCH2CH2である、項目85または86に記載の方法。
88. mは0である、項目85〜87のいずれか1つに記載の方法。
90. tは0であり、pは1〜100の整数である、項目85〜89のいずれか1つに記載の方法。
92. 環状ペプチドサブアレイ上の直鎖状の脱保護ペプチドのうち少なくとも1つの分子は環化できない、項目85〜91のいずれか1つに記載の方法。
94. 第1カルボキシル保護基がOAllである、項目85〜93のいずれか1つに記載の方法。
97. 第2ペプチドを処理して第2の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させることが、第2ペプチドを酸と接触させることを含む、項目85〜96のいずれか1つに記載の方法。
99. 第1ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させることが、第1ペプチドのカルボキシル基を活性化して第1ペプチドの遊離アミノ基と反応させてZを形成することを含む、項目85〜98のいずれか1つに記載の方法。
103. ペプチドバインダーの同定方法であって、下記の工程を含む方法:
a. 着目するターゲットを、式Iの環状ペプチドを含む第1集団のペプチドバインダーを含むペプチドマイクロアレイに曝露する:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、第1の反応性表面を有する第1の固体支持体上に固定する共有結合である];それによって着目するターゲットは環状ペプチドに結合する;
b. 第1集団のペプチドバインダーのうち着目するターゲットを結合するペプチドバインダー配列におけるオーバーラップを同定し、それによってコアバインダー配列を決定する;
c. コアバインダー配列に対するアミノ酸の単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸挿入から選択される少なくとも1つの改変を実施し、それによって第2集団のコアバインダー配列を作製する;
d. 第2集団のコアバインダー配列を着目するターゲットに曝露し、それによって着目するターゲットは第2集団のコアバインダー配列の少なくとも1つのペプチド配列に結合し、その際、第2集団のコアバインダー配列は式Iの環状ペプチドを含む:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、第2の反応性表面を有する第2の固体支持体上に固定する共有結合である];
e. 着目するターゲットに対する強い結合特性を示す第2集団のコアバインダー配列の1以上の配列を同定し、それによって成熟コアバインダー配列を決定する;
f. 工程eにおいて決定した成熟コアペプチドバインダー配列の少なくとも1つのN末端およびC末端伸長を実施し、それによって伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を作製する;
g. 着目するターゲットを、工程fにおいて作製された伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を含むペプチドマイクロアレイに曝露し、その際、伸長した成熟ペプチドバインダーの集団は式Iの環状ペプチドを含む:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、第3の反応性表面を有する第3の固体支持体上に固定する共有結合である];
h. 伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を含むペプチドのN末端またはC末端ペプチドバインダー配列におけるオーバーラップを同定し、それによって伸長した成熟ペプチドバインダー配列を決定する。
106. XおよびYはZへの結合であり、Zは**−S−S−**を含み、qは1であり、uは1である、項目103または104に記載の方法。
108. Zは
109. YはZへの結合であり、Zは
110. YはZへの結合であり、Zは
111. XおよびYはZへの結合であり、Zは
112. L’は6−アミノヘキサン酸である、項目103〜111に記載の方法。
113. L”はCH2CH2である、項目103〜112に記載の方法。
115. nは0である、項目103〜114のいずれか1つに記載の方法。
116. tは0であり、pは1〜100の整数である、項目103〜115のいずれか1つに記載の方法。
118. 伸長した成熟ペプチドバインダー配列のラベルフリーおよびアフィニティー分析のうち少なくとも1つを実施する、項目103〜117のいずれか1つに記載の方法。
121. 第1集団のペプチドバインダーが、アミノ酸システインもしくはメチオニン、またはヒスチジン−プロリン−グルタミンモチーフ、または2以上のアミノ酸のアミノ酸リピートを含まない、項目103〜120のいずれか1つに記載の方法。
125. 伸長した成熟ペプチドバインダー配列について工程c〜hを繰り返す、項目103〜124のいずれか1つに記載の方法。
128. プロテアーゼがジペプチジルペプチダーゼIV、アミノペプチダーゼm、またはその組合わせである、項目127に記載の方法。
130. グルタミン側鎖が配列[WY][DE][DE][YW]ALQ[GST]YD(SEQ ID NO:194)の一部であり、リジン側鎖が配列RSKLG(SEQ ID NO:195)の一部である、項目47または48に記載の方法。
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である]
その際、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
4. QおよびXは、それぞれシステイン側鎖であり、Zはジスルフィド結合であり、qは1であり、rは1であり、tは0であり、uは0である、項目1または2に記載のペプチドマイクロアレイ。
6. Zは
7. Zは
8. Zは
9. YはZへの結合であり、Zは
10. YはZへの結合であり、Zは
11. XはZへの結合であり、Zは
12. XおよびYはZへの結合であり、Zは
13. L’およびL”はそれぞれ、独立して、式II:
14. R8およびR8’はそれぞれ水素である、項目13に記載のペプチドマイクロアレイ。
16. mは0である、項目1〜15のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
18. R8およびR8’はそれぞれ水素であり、mは0であり、nは0であり、aは5であり、L’は存在し、L”は存在しない、項目1〜12または16〜17のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
20. L”はCH2CH2である、項目1〜14、16〜17、または19のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
22. pは1〜20の整数である、項目1〜21のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
24. 反応性表面が活性アミンを含む、項目1〜23のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
26. ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が5つのアミノ酸を含む、項目1〜25のいずれか1つに記載のペプチドマイクロアレイ。
30. ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、20種類のアミノ酸それぞれまたはほぼ等濃度の20種類のアミノ酸のサブセットを含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目28または29に記載のペプチドマイクロアレイ。
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である]
式IIの官能化ペプチド:
[式中:
R1、R2、R3、R4、R5、R6、Q、L’、L”、m、n、p、q、r、t、u、および*は、式Iについて定めたものであり;
R7はそれぞれ、独立して、−OH、C末端キャッピング基、および
R8はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R9はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
X’はそれぞれ、独立して、結合、Z”に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZ”に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Y’はそれぞれ、独立して、結合、Z’に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZ’に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Z’およびZ”はそれぞれ、独立して、結合、−OH、水素、チオール、アミン、カルボン酸、アミド、アルキン、アジド、場合により置換されたフミノフェノール、天然アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸側鎖、N末端保護基、およびC末端保護基からなる群から選択され、ただし、Z’およびZ”は結合してZを形成する相補基であり;
bは、0から50までの整数であり;
***は、官能化ペプチドの残部への結合点である]
その際、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
37. XおよびYはZへの結合であり、Zは**−S−S−**を含み、X’はZ”への結合であり、Y’はZ’への結合であり、Z’およびZ”はシステイン側鎖を含み、qは1であり、uは1である、項目33または34に記載の方法。
39. YはZへの結合であり、Zは
40. さらに、官能化ペプチドを銅触媒と接触させて
41. YはZへの結合であり、Zは
42. さらに、官能化ペプチドを銅触媒と接触させて
43. Zは
44. さらに、官能化ペプチドをフェリシアン化カリウムと接触させて
45. R3およびR8は官能化ペプチドがブテラーゼ1認識配列を含むように定められ、YはZへの結合であり、Zは
46. さらに、官能化ペプチドをブテラーゼ1と接触させて
47. XおよびYはZへの結合であり、Zは
49. L’は6−アミノヘキサン酸である、項目33〜48のいずれか1つに記載の方法。
51. mは0である、項目33〜50のいずれか1つに記載の方法。
52. nは0である、項目33〜51のいずれか1つに記載の方法。
54. pは1〜20の整数である、項目33〜53のいずれか1つに記載の方法。
56. 固体支持体が、プラスチック、ガラス、および炭素複合材料からなる材料の群から選択される、項目33〜55のいずれか1つに記載の方法。
58. ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が同数のアミノ酸を含む、項目33〜57のいずれか1つに記載の方法。
60. ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が、メチオニンアミノ酸、システインアミノ酸、同一アミノ酸のアミノ酸リピート、またはヒスチジン(H)−プロリン(P)−グルタミン(Q)配列からなるアミノ酸モチーフをいずれも含まない、項目33〜59のいずれか1つに記載の方法。
63. ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、20種類のアミノ酸それぞれまたはほぼ等濃度の20種類のアミノ酸のサブセットを含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目61または62に記載の方法。
マイクロアレイ表面に共有結合した第1の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも1つの第1の直鎖状ペプチドサブアレイを作製する;
マイクロアレイ表面に共有結合した第2の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも1つの第2の直鎖状ペプチドサブアレイを作製し、その際、第2の複数の直鎖状ペプチドは第1の複数の直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有する;そして
第1の複数の直鎖状ペプチドを環化させて複数の環化ペプチドを含む少なくとも1つの環化ペプチドドサブアレイを生成させる条件下でペプチドマイクロアレイを処理し、その際、第2の複数の直鎖状ペプチドは実質的に環化しない。
第2の複数の直鎖状ペプチドは第2の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、その際、第2の複数の保護された直鎖状ペプチドは第1の複数の保護された直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、第2の複数の保護された直鎖状ペプチドのC末端は第1保護基と異なる第2保護基により保護されている;
項目66に記載の方法。
ペプチドマイクロアレイを第1の脱保護試薬と接触させて第1保護基を選択的に除去して、第1の複数の脱保護された直鎖状ペプチドを含む少なくとも1つの第1の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイを得る;そして
ペプチドマイクロアレイを第2の脱保護試薬と接触させて第2保護基を選択的に除去して、第2の複数の脱保護された直鎖状ペプチドを含む少なくとも1つの第2の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイを得る。
71. カルボン酸側鎖はグルタメートまたはアスパルテート側鎖である、項目70に記載の方法。
73. 第1の複数の直鎖状ペプチドのうち少なくとも1つの分子は環化できない、項目66〜72のいずれか1つに記載の方法。
76. 第1の脱保護試薬がパラジウム触媒である、項目67〜75のいずれか1つに記載の方法。
78. 第2保護基がOtBuである、項目67〜77のいずれか1つに記載の方法。
80. 酸がトリフルオロ酢酸である、項目79に記載の方法。
81. 第1の複数の直鎖状ペプチドを環化させる条件下でのペプチドマイクロアレイの処理が、第1の複数の直鎖状ペプチドのC末端のカルボキシル基を活性化して第1の複数の直鎖状ペプチドのN末端のアミノ基と反応させてアミド結合を形成することを含む、項目66〜80のいずれか1つに記載の方法。
85. 式IIIの少なくとも1つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイの作製方法であって、下記を含む方法:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
Qは、カルボニルであり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
tは、0から100までの整数であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である];
複数の第1ペプチドを環状ペプチドサブアレイ上において作製し、その際、第1ペプチドは式IVのものであり:
R1、R2、R3、R4、Q、L’、L”、m、n、p、t、および*は、式IIIについて定めたものであり;
Z1は、第1カルボキシル保護基であり;
Z2は、水素である];
複数の第2ペプチドを直鎖状ペプチドサブアレイ上において作製し、その際、第2ペプチドは式Vのものであり:
R1、R2、R3、R4、Q、L’、L”、Z2、m、n、p、t、および*は、式IVについて定めたものであり;
Z3は、第1カルボキシル保護基と異なる第2カルボキシル保護基であり;
は、水素である];
第1ペプチドを処理して第1の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させ、その際、直鎖状脱保護ペプチドは式VIのものであり:
R1、R2、R3、R4、Q、L’、L”、Z2、m、n、p、t、および*は、式IVについて定めたものであり;
Z1は、−OHである];
続いて、
直鎖状脱保護ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させ;
続いて、
第2ペプチドを処理して式VIの第2の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させ:
その際、第1ペプチドおよび第2ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも1つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
87. L”はCH2CH2である、項目85または86に記載の方法。
88. mは0である、項目85〜87のいずれか1つに記載の方法。
90. tは0であり、pは1〜100の整数である、項目85〜89のいずれか1つに記載の方法。
92. 環状ペプチドサブアレイ上の直鎖状の脱保護ペプチドのうち少なくとも1つの分子は環化できない、項目85〜91のいずれか1つに記載の方法。
94. 第1カルボキシル保護基がOAllである、項目85〜93のいずれか1つに記載の方法。
97. 第2ペプチドを処理して第2の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させることが、第2ペプチドを酸と接触させることを含む、項目85〜96のいずれか1つに記載の方法。
99. 第1ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させることが、第1ペプチドのカルボキシル基を活性化して第1ペプチドの遊離アミノ基と反応させてZを形成することを含む、項目85〜98のいずれか1つに記載の方法。
103. ペプチドバインダーの同定方法であって、下記の工程を含む方法:
a. 着目するターゲットを、式Iの環状ペプチドを含む第1集団のペプチドバインダーを含むペプチドマイクロアレイに曝露する:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、第1の反応性表面を有する第1の固体支持体上に固定する共有結合である];それによって着目するターゲットは環状ペプチドに結合する;
b. 第1集団のペプチドバインダーのうち着目するターゲットを結合するペプチドバインダー配列におけるオーバーラップを同定し、それによってコアバインダー配列を決定する;
c. コアバインダー配列に対するアミノ酸の単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸挿入から選択される少なくとも1つの改変を実施し、それによって第2集団のコアバインダー配列を作製する;
d. 第2集団のコアバインダー配列を着目するターゲットに曝露し、それによって着目するターゲットは第2集団のコアバインダー配列の少なくとも1つのペプチド配列に結合し、その際、第2集団のコアバインダー配列は式Iの環状ペプチドを含む:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、第2の反応性表面を有する第2の固体支持体上に固定する共有結合である];
e. 着目するターゲットに対する強い結合特性を示す第2集団のコアバインダー配列の1以上の配列を同定し、それによって成熟コアバインダー配列を決定する;
f. 工程eにおいて決定した成熟コアペプチドバインダー配列の少なくとも1つのN末端およびC末端伸長を実施し、それによって伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を作製する;
g. 着目するターゲットを、工程fにおいて作製された伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を含むペプチドマイクロアレイに曝露し、その際、伸長した成熟ペプチドバインダーの集団は式Iの環状ペプチドを含む:
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、1,2,3−トリアゾール、および場合により置換された1,2−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、0から100までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、0または1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、第3の反応性表面を有する第3の固体支持体上に固定する共有結合である];
h. 伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を含むペプチドのN末端またはC末端ペプチドバインダー配列におけるオーバーラップを同定し、それによって伸長した成熟ペプチドバインダー配列を決定する。
106. XおよびYはZへの結合であり、Zは**−S−S−**を含み、qは1であり、uは1である、項目103または104に記載の方法。
108. Zは
109. YはZへの結合であり、Zは
110. YはZへの結合であり、Zは
111. XおよびYはZへの結合であり、Zは
112. L’は6−アミノヘキサン酸である、項目103〜111に記載の方法。
113. L”はCH2CH2である、項目103〜112に記載の方法。
115. nは0である、項目103〜114のいずれか1つに記載の方法。
116. tは0であり、pは1〜100の整数である、項目103〜115のいずれか1つに記載の方法。
118. 伸長した成熟ペプチドバインダー配列のラベルフリーおよびアフィニティー分析のうち少なくとも1つを実施する、項目103〜117のいずれか1つに記載の方法。
121. 第1集団のペプチドバインダーが、アミノ酸システインもしくはメチオニン、またはヒスチジン−プロリン−グルタミンモチーフ、または2以上のアミノ酸のアミノ酸リピートを含まない、項目103〜120のいずれか1つに記載の方法。
125. 伸長した成熟ペプチドバインダー配列について工程c〜hを繰り返す、項目103〜124のいずれか1つに記載の方法。
128. プロテアーゼがジペプチジルペプチダーゼIV、アミノペプチダーゼm、またはその組合わせである、項目127に記載の方法。
130. グルタミン側鎖が配列[WY][DE][DE][YW]ALQ[GST]YD(SEQ ID NO:194)の一部であり、リジン側鎖が配列RSKLG(SEQ ID NO:195)の一部である、項目47または48に記載の方法。
他の態様において、ペプチドのグルタミン含有部分はGGGDYALQGGG(SEQ ID NO:29)、WDGDYALQGGG(SEQ ID NO:30)、GGGGDYALQGGGG(SEQ ID NO:31)、およびGGGDYALQGGGG(SEQ ID NO:32)、またはその組合わせからなる群から選択される配列を含むことができる。他の態様において、ペプチドのグルタミン含有部分は配列GGGDYALQGGG(SEQ ID NO:29)を含むことができる。
さらに他の具体的側面において、ペプチドのグルタミン含有部分はDYFLQ(SEQ ID NO:51)、EYVAQ(SEQ ID NO:52)、DYVAQ(SEQ ID NO:53)、DFYLQ(SEQ ID NO:54)、EYFLQ(SEQ ID NO:55)、またはその組合わせからなる群から選択される配列を含むことができる。
他の具体的態様において、ペプチドはリジンを含有することができ、ペプチドのリジン含有部分はRGTKL(SEQ ID NO:196)、FPKLK(SEQ ID NO:197)、KLKYK(SEQ ID NO:198)、RAKYK(SEQ ID NO:199)、KTKYK(SEQ ID NO:200)、およびGYKLK(SEQ ID NO:201)、またはその組合わせからなる群から選択される配列を含むことができる。
本明細書に開示および記載するペプチドはライフサイエンスおよびヘルスケアの分野において多数の用途をもつ一群の分子を構成する。本明細書に開示および記載するように、本明細書に記載するペプチド(または“ペプチドバインダー”(たとえば、環状ペプチド))は環状もしくは構造規制(constrained)(マクロサイクル)形態、または環化前には直鎖状である可能性がある。
一態様において、研究およびヘルスケアに使用できるペプチドマイクロアレイを記載する。たとえば、本明細書に記載するペプチドマイクロアレイは生物活性モチーフの同定に利用できる(たとえば、マイクロアレイ上のペプチド(たとえば、環状ペプチド)は対応する受容体への結合をスクリーニングするためのリガンドの潜在活性モチーフを模倣してもよい)。一側面において、本明細書に開示するペプチドマイクロアレイは疾患関連抗原の特異的配列を反映してもよい(よって、診断またはモニタリングの目的で、たとえば患者試料から特定疾患の存在を示唆する抗体を検出するために利用できる)。ペプチドマイクロアレイの他の用途は生化学的相互作用の探索であり、それにはマイクロアレイ上に固定されたペプチド(たとえば、環状ペプチド)へのタンパク質またはDNAの結合、または細胞活性、酵素活性、細胞接着などのプロファイリングが含まれる。
当業者が理解するように、ペプチドマイクロアレイは数千(または本開示の場合は数百万)のペプチド(ある態様においては多重コピーで提示される)を固体支持体(ある態様においては、ガラス、炭素複合材料またはプラスチックのチップまたはスライドを含む)の表面に連結または固定するアッセイ原理を含む。本開示の態様によれば、精製した酵素または抗体、患者または動物の血清、細胞溶解物、受容体に対するリガンド、受容体、酵素に対する基質などを含む着目する多種多様なターゲットと共に、ペプチドマイクロアレイをインキュベートすることができる。
新規ペプチドバインダー(たとえば環状ペプチド;たとえば図4,本方法を一般的に400として表わす)の探索は、本開示に従って達成できる。本明細書中に説明するように、新規ペプチドバインダーは多数の用途に利用でき、それには療法、診断用途および全般的な研究室用途が含まれるが、それらに限定されない。本開示のある特定の態様によれば、数百、数千、数万、数十万、さらには数百万のペプチドの集団を含むペプチドマイクロアレイを設計できる。図3を参照すると、ある態様において、ペプチドの集団310は着目するタンパク質、遺伝子、染色体、分子の全体、またはさらには生物全体(たとえば、ヒト)をそれらのペプチドが表わすように構成できる。ある態様において、ペプチドを特定の基準に従って構成し、それによって特定のアミノ酸またはモチーフを除外することができる。他の態様において、各ペプチドが同一長さを含むようにペプチドを構成することができる。たとえば、ある態様において、ペプチドマイクロアレイ312上に固定されたペプチド310の集団はすべて、3−、4−、5−、6−、7−、8−、9−、10−、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17−、18−、19−、20−mer、またはそれ以上の308を含むことができる。ある態様において、ペプチドはそれぞれN末端またはC末端配列(たとえば、306および306’)を含むこともでき、その際、各ペプチドは両方が特定の同一長さ(たとえば、3−、4−、5−、6−、7−またはさらには8−、またはそれ以上のペプチド)であるN末端およびC末端ペプチド配列を含む。ある態様において、N末端またはC末端配列(306および306’)は存在せず、ペプチドマイクロアレイ312上に固定されたペプチド310は3−、4−、5−、6−、7−、8−、9−、10−、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17−、18−、19−、または20−merの308を含むにすぎない。ある態様において、ペプチドマイクロアレイ312上に固定されたペプチド310は本明細書に記載する方法に従って環化された環状ペプチドを含む。
図4に図示するプロセス400の工程404について以下に述べると、コアヒットペプチド配列またはコアバインダー配列が同定されると(本明細書に開示、記載および例示するペプチドバインダー探索402のプロセスにより)、“ペプチド成熟化”404のプロセスを実施し、それによって、適正なコアヒット配列またはコアバインダー配列をさらに最適化/保証するためにコアヒットペプチドまたはコアバインダー配列の各位置においてコアヒットペプチド配列またはコアバインダー配列を種々の方法で変化させる(アミノ酸の置換、欠失および挿入による)。たとえば、ある態様(たとえば、コアヒットペプチド配列(コアバインダー配列)が、ある数の、たとえば7個のアミノ酸を含む場合)に従って、成熟アレイを作製する。本開示によれば、成熟アレイは、それに固定された状態で、コアヒットペプチド(コアバインダー配列)中の各アミノ酸が各位置でアミノ酸置換を受けたコアヒットペプチド(コアバインダー配列)集団を含むことができる。
5−merアレイ実験において同定したモチーフが最適タンパク質バインダーの短いバージョンであるにすぎない可能性がある。5−merアレイ実験から選択された配列のN末端およびC末端の一方または両方から1以上のアミノ酸を伸長することによってより長いモチーフを同定する戦略を本明細書に記載する。選択されたペプチドから出発し、各末端に1以上のアミノ酸を付加することにより、さらなる選択のための伸長ライブラリーを作製できる。たとえば、単一ペプチドから出発し、20種類の天然アミノ酸すべてを用いて、160,000のユニークペプチドの伸長ライブラリーを作製できる。ある態様において、伸長ペプチドそれぞれが複製体で合成される。
伸長した成熟コアヒットペプチドバインダー配列を同定した後、ペプチドのアフィニティーおよび特異性を測定するいずれか当技術分野で得られる方法により特異性分析を実施することができる。特異性分析の一例には、着目するターゲットとの分子相互作用、反応速度(“オン”、結合、および“オフ”、解離の)およびアフィニティー(結合強度)に関して分子を特性分析するために用いられる“BIACORE(商標)”システム分析が含まれる。BIACORE(商標)はGeneral Electric Companyの商標であり、企業ウェブサイトを介して入手できる。
ペプチドライブラリーのN末端とC末端の間の環化
マスクレス光指向性ペプチドアレイ合成を用いてペプチドアレイを作製した;その際、US 20120238477 A1(本明細書に援用する)の方法に基づいてすべての反応性アミノ酸側鎖を酸分解性(acid labile)基で保護する。この例において、マイクロアレイ表面は三次元アミン層でコートされたスライドガラスからなっていた。ペプチドライブラリーフレームワークは(C−末端からN末端へ)、リンカー分子(たとえば、6−アミノヘキサン酸)、Glu(OtBu)またはGlu(OAll)、およびライブラリーデザインに記載する可変ペプチド配列を含んでいた(後記)。Glu(OtBu)およびGlu(OAll)は、C末端がそれぞれt−ブチルエステルまたはアリルエステルで保護されたグルタメートの側鎖のガンマカルボン酸によりリンカー分子に連結していた。代表的なペプチドライブラリーフレームワークを図7に示す。ある態様において、可変ペプチド配列は3〜15のアミノ酸からなる。ペプチドライブラリーのN末端は遊離アミンであった。直鎖状ペプチドライブラリーを環化するために、アレイをまずTHF中のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(2mM)で室温において3時間処理して、OAll基をペプチドライブラリーのC末端から除去した。アレイから残留パラジウムを除去するために、スライドをDMF中の5% DIPEAおよび5%ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで5分間洗浄した。スライドを水で1分間洗浄し、環化前に遠心乾固させた。次いで標準的カップリング法を用いてN末端をC末端にカップリングさせることによりアレイを環化した:スライドを活性化剤(HOBtおよびHBTU,それぞれ20mM)および塩基(DIPEA,2M)で室温において3時間処理した。環化したアレイを次いでトリフルオロ酢酸(47.5mL)、トリイソプロピルシラン(0.25mL)、および水(2.25mL)中、室温で30分間、側鎖脱保護した。側鎖脱保護の後、スライドをメタノール中で30秒間の2回、水中で10秒間の4回、0.05% tween−20を含む1×TBS中で2分間、次いで1×TBS中で1分間、洗浄した。最後にスライドを遠心乾固させた。
2つのシステイン残基を用いたペプチドライブラリーの環化
マスクレス光指向性ペプチドアレイ合成を用いてペプチドアレイを作製し、その際、すべての反応性アミノ酸側鎖を酸分解性基で保護する。この例において、マイクロアレイ表面は三次元アミン層でコートされたプラスチックスライドからなる。ペプチドライブラリーフレームワークは(C−末端からN末端へ)、リンカー分子(たとえば、6−アミノヘキサン酸)、システイン、可変ペプチド配列、およびシステインからなる。可変ペプチド配列は3〜15のアミノ酸からなる。ペプチドライブラリーのN末端は遊離アミンである。マイクロアレイをトリフルオロ酢酸(47.5mL)、トリイソプロピルシラン(0.25)、および水(2.25mL)中、室温で30分間、側鎖脱保護する。次いでスライドをメタノール中で30秒間の2回、水中で10秒間の4回、1×TBS/0.05% tween−20中で2分間、次いで1×TBS中で1分間、洗浄する。次いでスライドを遠心乾固させる。きわめて緩和な条件下で2つのシステイン間にジスルフィド橋を形成させる。10% DMSOを含有する100mM NH4Ac緩衝液(pH8.0)で室温において24時間、アレイを処理する。次いでスライドを水溶液で洗浄し、遠心乾固させる。
グルタメート脱保護
マイクロアレイ表面は三次元アミン層でコートされたスライドガラスからなっていた。図8Bを参照すると、アミン基材に、(C−末端からN末端へ)6−アミノヘキサン酸リンカー分子、可変グルタメート誘導体、およびグリシンがカップリングしていた。ペプチドのN末端は遊離していた。グルタメート誘導体はC末端においてOAll保護されたグルタメート(その際、側鎖のガンマカルボン酸をリンカーに反応させる,上サブアレイ)、または側鎖カルボン酸においてOtBu保護されたグルタメート(C末端をリンカーと反応させる,下サブアレイ)のいずれかを含んでいた。次いでトリフルオロ酢酸(47.5mL)、トリイソプロピルシラン(0.25mL)、および水(2.25mL)に室温で30分間浸漬することにより、OtBu基を除去した。痕跡量のTFAをすべて除去するために、スライドをメタノール中で30秒間の2回、水中で10秒間の4回、0.05% tween−20を含む1×TBS中で2分間、次いで1×TBS中で1分間、洗浄した。最後にスライドを遠心乾固させた。次いでスライドをTHF中のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(2mM)で、室温において3時間処理してOAll基を除去した。アレイから残留パラジウムを除去するために、スライドをDMF中の5% DIPEAおよび5%ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで5分間洗浄した。スライドを水で1分間洗浄し、遠心乾固させた。グルタメート脱保護の後、スライドを0.1M MES緩衝液中100mMのEDCで活性化された50mMのアミン−PEG2−ビオチンと室温で2時間反応させた。スライドを洗浄液1および水で洗浄した後、以下に詳述するようにストレプトアビジン−Cy5で染色した。
環状/直鎖状ペプチドライブラリー合成
本明細書に記載するペプチドライブラリーを、図9に記載する方法に従って作製した。直鎖状ペプチドサブアレイおよび環状ペプチドサブアレイを含むペプチドライブラリーを同じマイクロアレイスライド上に作製した。両サブアレイ中の各ペプチドはC末端グルタメートおよび遊離N末端アミノ基を含んでいた。実施例3に記載したように、各グルタメート側鎖をアレイ表面に6−アミノヘキサン酸リンカー分子により付着させた。直鎖状ペプチドサブアレイ中の各ペプチドは、それのC末端においてOtBu保護基により保護されていた。環状ペプチドサブアレイ中の各ペプチドは、それのC末端においてOAll保護基により保護されていた。それ以外は、各サブアレイ中のペプチドは同一であった。すべてのペプチドについて、すべての側鎖がC末端の2段階脱保護に基づいて酸分解性基で保護されていた。
ペプチド合成
環状および直鎖状ペプチドは、GenScript(ニュージャージー州ピスカッタウェイ)により>95%の純度で供給された。Uとアレイ表面の間の連結を最良に複製するために、アミド化されたグルタメート(U)の側鎖を備えたペプチドを注文し、よってそのアミノ酸をグルタミン(Q)にした。GenScriptが提供したペプチド重量を用いて水中に5mM原液を調製した。
ペプチドマイクロアレイへのストレプトアビジン結合
スライドに30mLの結合用緩衝液中150mgのストレプトアビジン−Cy5を室温で30分間結合させた。結合用緩衝液は、1%のアルカリ可溶性カゼインおよび0.05%のtween−20を1×TBS,pH7.4中に含有していた。30分後、スライドを1×TBS緩衝液中で1分間の2回、水中で30秒間、洗浄し、遠心乾固させた。
蛍光スキャン/データ解析
MS200スキャナー(Roche NimbleGen)を用いて解像度2um、波長635nm、利得25%およびレーザー強度100%でアレイのCy5蛍光強度を測定した。Image Extraction Software(イメージ抽出ソフトウェア)(Roche NimbleGen)を用いてCy5信号強度を抽出した。データの予備処理、正規化および統計学的検定をRで行なった。データの視覚化および解析をSpotfire 6.5.0(Tibco,マサチュセッツ週ボストン)ソフトウェアプラットホームで実施した。
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴(SPR)実験をBIAcore X100(GE Healthcare)で実施した。ランニング緩衝液はHBS−EP+であった。ストレプトアビジンコートしたチップを作製するために、Amine Coupling Kit(アミンカップリングキット)(GE Healthcare)を用いてAcetate 5.0固定用緩衝液中100ug/mLのストレプトアビジンをCM5チップのフローセル2にカップリングさせた。水中に0.2MのNaClおよび10mMのNaOHを含有する溶液を、作製したチップ上に60秒間流すことにより、チップを次いでコンディショニングした。多重サイクル実験を用い、各工程間で塩基再生(base regeneration)しながら、作製したストレプトアビジンチップに対する環状および直鎖状ペプチドの結合親和性を測定した。ここでは、HBS−EP+緩衝液中、7種類の調製濃度のペプチドをストレプトアビジンチップ上に30秒間流し、次いで60秒間解離させた。各ペプチド濃度の後、水中0.2MのNaClおよび10mMのNaOHをチップ上に30秒間流し、続いて120秒間の安定化期間をおくことにより、ストレプトアビジンチップを再生した。BIAcore X100 Evaluation Software Version 2.0.1を用いて反応速度パラメーターを決定した。
ランダム4merライブラリー設計
実施例1、3および4に記載した方法に従って環状および直鎖状ペプチドを作製した。ライブラリー中のすべてのペプチドがフォーマットXXXXUのものであり、Xはそれぞれ、独立して選択されたアミノ酸であって特定のセットのL−およびD−アミノ酸から選択され、Uは実施例4に記載したようにC末端がアリルエステル(環状フィーチャー)またはt−ブチルエステル(直鎖状フィーチャー)のいずれかで保護されたグルタメートであった。このデザインに含まれるアミノ酸はL−Ser、L−Thr、L−Asn、L−Gln、L−Gly、L−Pro、L−Ala、L−Ile、L−Phe、L−Trp、L−Tyr、L−Val、D−Ala、D−Asn、D−Leu、D−Phe、D−Pro、D−Ser、D−Trp、およびD−Tyrであった。本明細書中でアミノ酸配列に用いる小文字“p”はD−プロリンを表わす。
NQpWQ(SEQ ID NO:84)のSPR結果
ヘッド−ツゥー−テイル環状NQpWQ(SEQ ID NO:84)ペプチド(実施例5に従って得られたもの)が、実施例8に従った表面プラズモン共鳴(SPR)結合試験の対象であった。図11は、ストレプトアビジンコートしたCM5 BIAcoreチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状NQpWQ(SEQ ID NO:84)ペプチドの表面プラズモン共鳴(SPR)結合曲線を示す。図12は、ストレプトアビジンコートしたCM5 BIAcoreチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状NQpWQ(SEQ ID NO:84)ペプチドの表面プラズモン共鳴(SPR)結合を、ペプチド濃度に対して示す。破線は結合定数を示す。
HPQ特異的デザインのライブラリー設計
実施例1、3および4に記載した方法に従って環状および直鎖状ペプチドを作製した。ライブラリー中のすべてのペプチドがフォーマットJXXHPQXXJU(SEQ ID NO:86)のものであり、Jは20種類すべての標準的アミノ酸の混合物であり、Xはそれぞれ、独立して選択されたアミノ酸であり、Uは実施例4に記載したようにC末端がアリルエステル(環状フィーチャー)またはt−ブチルエステル(直鎖状フィーチャー)のいずれかで保護されたグルタメートであった。
HPQ特異的デザインの伸長
XXHPQXX(SEQ ID NO:187)配列をフランキングするJのいずれの組合わせがストレプトアビジンへの最高結合を与えるかを決定するために、表1に示す配列についてJ位置に標準的な20種類のL−アミノ酸の可能なすべての組合わせをもつ配列を合成した。表1のペプチドについてのストレプトアビジン結合アッセイを実施例6および7に従って実施した。結果を図15に示す;それは環状蛍光強度をlogFCに対して示すチャートである。環状LYDHPQNGGU(SEQ ID NO:188)ペプチドは最高の環状強度をもつものとして同定され、環状QNDHPQNGGU(SEQ ID NO:189)ペプチドは高い環状強度および高いlogFCをもつものとして同定された。
LYDHPQNGGQ(SEQ ID NO:190)のSPR結果
ヘッド−ツゥー−テイル環状LYDHPQNGGQ(SEQ ID NO:190)ペプチド(実施例5に従って得られたもの)が、実施例8に従った表面プラズモン共鳴(SPR)結合試験の対象であった。図16は、ストレプトアビジンコートしたCM5 BIAcoreチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状LYDHPQNGGQ(SEQ ID NO:190)ペプチドの表面プラズモン共鳴(SPR)結合曲線を示す。図17は、ストレプトアビジンコートしたCM5 BIAcoreチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状NQpWQLYDHPQNGGQ(SEQ ID NO:190)ペプチドの表面プラズモン共鳴(SPR)結合を、ペプチド濃度に対して示す。破線は結合定数を示す。
QNDHPQNGGQ(SEQ ID NO:192)のSPR結果
ヘッド−ツゥー−テイル環状QNDHPQNGGQ(SEQ ID NO:192)ペプチド(実施例5に従って得られたもの)が、実施例8に従った表面プラズモン共鳴(SPR)結合試験の対象であった。図20は、ストレプトアビジンコートしたCM5 BIAcoreチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状QNDHPQNGGQ(SEQ ID NO:192)ペプチドの表面プラズモン共鳴(SPR)結合曲線を示す。図21は、ストレプトアビジンコートしたCM5 BIAcoreチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状QNDHPQNGGQ(SEQ ID NO:192)ペプチドの表面プラズモン共鳴(SPR)結合を、ペプチド濃度に対して示す。破線は結合定数を示す。
Claims (12)
- ペプチドマイクロアレイの作製方法であって、
前記ペプチドマイクロアレイが:
(a)式Iの少なくとも1つの環状ペプチドを含む、環状ペプチドの少なくとも1つのサブアレイ
R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R5およびR6はそれぞれ、独立して、水素またはN末端キャッピング基であり;
R7はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
Qは、カルボニルであり;
XおよびYはそれぞれ、独立して、結合、Zに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Zは、アミド結合であり;
L’およびL”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり;
mは、0から6までの整数であり;
nは、0から6までの整数であり;
pは、1から20までの整数であり;
qは、0または1であり;
rは、1であり;
tは、0から100までの整数であり;
uは、0または1であり;
*は、その少なくとも1つの環状ペプチドを、反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である];ならびに、
(b)式IIaの少なくとも1つの直鎖状ペプチドを含む、直鎖状ペプチドの少なくとも1つのサブアレイ
R 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 、R 6 、R 7 、Q、L’、L”、m、n、p、q、r、t、u、および*は、式Iについて定めたものであり、X’、Y’、Z’、およびZ”は、後述の式IIについて定めたものである];
を含むものであり、
前記方法が:
(i)式IIの官能化ペプチド:
R1、R2、R3、R4、R5、R6、Q、L’、L”、m、n、p、q、r、t、u、および*は、式Iについて定めたものであり;
R7はそれぞれ、独立して、−OH、C末端キャッピング基、および
R8はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり;
R9はそれぞれ、独立して、−OHまたはC末端キャッピング基であり;
X’はそれぞれ、独立して、結合、Z”に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZ”に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Y’はそれぞれ、独立して、結合、Z’に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびZ’に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され;
Z’およびZ”はそれぞれ、独立して、結合、−OH、水素、チオール、アミン、カルボン酸、アミド、アルキン、アジド、場合により置換されたアミノフェノール、天然アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸側鎖、N末端保護基、およびC末端保護基からなる群から選択され、ただし、Z’およびZ”は結合してZを形成する相補基であり;
bは、0から50までの整数であり;
***は、官能化ペプチドの残部への結合点である]を、Zが形成される条件下で反応させること、ならびに、環化されなかった直鎖状ペプチドが混在した、環状ペプチドの少なくとも1つのサブアレイ内で式Iの少なくとも1つの環状ペプチドを生成させること;
(ii)ターゲットタンパク質を含む目的のターゲットと共に、ペプチドマイクロアレイをインキュベートすること;
(iii)環状ペプチドの少なくとも1つのサブアレイおよび直鎖状ペプチドの少なくとも1つのサブアレイのペプチドの、ターゲットタンパク質との結合特性を測定して、同じアミノ酸配列の直鎖状ペプチドと環状ペプチドとの差を測定すること;ならびに、
(iv)環化されなかったペプチド、または対応する直鎖状ペプチドを超えるコンフォメーション優先性がないペプチドを特定すること;
を含み、
ここで、式Iの少なくとも1つの環状ペプチドおよび式IIaの少なくとも1つの直鎖状ペプチドは、反応性表面に固定化されており、
式IIの少なくとも1つの官能化ペプチドと、式IIaの少なくとも1つの直鎖状ペプチドは、構造的に同一のものである、
前記方法。 - Z’はC末端保護基を含み、またはZ”はN末端保護基を含み、qは0であり、uは0である、請求項1に記載の方法。
- qは0であり、tは0であり、uは0である、請求項1に記載の方法。
- 前記ペプチドマイクロアレイが、マスクレス光指向マイクロアレイ合成を用いて作製されるものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 下記を含む、ペプチドマイクロアレイの作製方法:
マイクロアレイ表面に共有結合した第1の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも1つの第1の直鎖状ペプチドサブアレイを作製すること;
マイクロアレイ表面に共有結合した第2の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも1つの第2の直鎖状ペプチドサブアレイを作製すること、ここで、第2の複数の直鎖状ペプチドは第1の複数の直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有する;
第1の複数の直鎖状ペプチドを環化させて、環化されなかった直鎖状ペプチドが混在した、複数の環化ペプチドを含む少なくとも1つの環化ペプチドドサブアレイを生成させる条件下でペプチドマイクロアレイを処理すること、ここで、第2の複数の直鎖状ペプチドは実質的に環化しないものである;
ターゲットタンパク質を含む目的のターゲットと共に、ペプチドマイクロアレイをインキュベートすること;
環状ペプチドの少なくとも1つのサブアレイおよび直鎖状ペプチドの少なくとも1つのサブアレイのペプチドの、ターゲットタンパク質との結合特性を測定して、同じアミノ酸配列の直鎖状ペプチドと環状ペプチドとの差を測定すること;ならびに、
環化されなかったペプチド、または対応する直鎖状ペプチドを超えるコンフォメーション優先性がないペプチドを特定すること。 - 第1の複数の直鎖状ペプチドは第1の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、ここで、第1の複数の保護された直鎖状ペプチドのC末端は第1保護基により保護されている;
第2の複数の直鎖状ペプチドは第2の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、ここで、第2の複数の保護された直鎖状ペプチドは第1の複数の保護された直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、第2の複数の保護された直鎖状ペプチドのC末端は第1保護基と異なる第2保護基により保護されている;
請求項5に記載の方法。 - 第1の複数の直鎖状ペプチドおよび第2の複数の直鎖状ペプチドはそれぞれ、カルボン酸側鎖によりマイクロアレイ表面に共有結合されている、請求項5に記載の方法。
- 第1の複数の直鎖状ペプチドを環化させる条件下でのペプチドマイクロアレイの処理が、第1の複数の直鎖状ペプチドのC末端のカルボキシル基を活性化して第1の複数の直鎖状ペプチドのN末端のアミノ基と反応させてアミド結合を形成することを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記ペプチドマイクロアレイが、マスクレス光指向マイクロアレイ合成を用いて作製される、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチドマイクロアレイを1回以上の洗浄工程に供し、それを目的のターゲットに対して所望の特異性をもつ二次抗体に曝露することを含む、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記二次抗体が、蛍光、化学発光、比色法、またはオートラジオグラフィーによって検出されうる、請求項10に記載の方法。
- 前記ペプチドアレイが、少なくとも1.6×10 5 のペプチドを含む、請求項5〜11のいずれか1項に記載の方法。
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