CN107257802B - 转谷氨酰胺酶底物的鉴别及其用途 - Google Patents

转谷氨酰胺酶底物的鉴别及其用途 Download PDF

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Abstract

根据一个方面，本公开内容提供了一种使用包含多种肽的肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶的底物的方法。所述方法包括以下步骤：使所述肽阵列中的肽与所述转谷氨酰胺酶接触，使所述转谷氨酰胺酶结合所述肽，和鉴别所述转谷氨酰胺酶的底物。

Description

转谷氨酰胺酶底物的鉴别及其用途
背景技术
本发明一般地涉及包含转谷氨酰胺酶底物的肽阵列和使用肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶底物的方法。本发明也涉及转谷氨酰胺酶底物肽以及它们用于交联肽和蛋白的方法。
阐明酶活性和特异性的细节对于理解酶的生理功能而言和对于由酶催化的反应的生物技术应用而言是重要的。例如，转谷氨酰胺酶属于有关酶的大家族，包括微生物和哺乳动物转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶通过形成谷氨酰胺残基的γ-甲酰胺基和赖氨酸残基的ε-氨基之间的异肽键来催化两个多肽或肽链之间的交联。阐明转谷氨酰胺酶活性和特异性的细节对于由转谷氨酰胺酶催化的交联反应的生物技术应用（例如，用于标记、加标签、多蛋白复合物形成等的蛋白的修饰）而言是重要的。
因为它的小尺寸、稳健的性能、稳定性和它的活性的钙独立性，迄今为止微生物转谷氨酰胺酶是研究得最多的转谷氨酰胺酶。几个研究已经证实，多种长烷基胺可以替换转谷氨酰胺酶的赖氨酸底物，并且简单的二肽谷氨酰胺-甘氨酸(QG)可以充当谷氨酰胺底物。转谷氨酰胺酶的赖氨酸和谷氨酰胺底物的这些发现有助于开发关于转谷氨酰胺酶活性的多种测试和关于使用转谷氨酰胺酶修饰蛋白的实用测定。
一个挑战是，作为酶底物的合成肽的鉴别受限于潜在大量的可以测试的分子。该障碍可以通过使用肽文库和选择技术（诸如噬菌体展示或mRNA展示）来克服。通过使用这些方案，已经鉴别出优选的底物序列。但是，序列的宽多样性使得难以发现共同底物基序，例如转谷氨酰胺酶底物基序。因此，需要快速的、廉价的和系统的方法，其可以实现具有许多重要应用的转谷氨酰胺酶底物和共同底物基序的鉴别。
发明概述
本发明通过提供用于鉴别转谷氨酰胺酶底物的系统和方法以及它们的用途克服了前述缺点。
申请人已经发现了快速的、可靠的和系统的方案来鉴别被酶特异性地识别的底物序列和共同底物基序。在一个示例性的方面，在肽阵列上合成了至少100万种5-聚体转谷氨酰胺酶底物肽的文库，例如，使用无掩模的光指导的肽阵列技术。然后针对鉴别优选的酶底物或底物基序的酶活性来筛选所述肽阵列。
在另一个实施方案中，在肽阵列上合成了至少100万种5-聚体转谷氨酰胺酶底物肽的文库，例如，使用无掩模的光指导的肽阵列技术。然后针对鉴别优选的酶底物的酶活性来筛选所述肽阵列。然后在新阵列上合成第二个新设计的聚焦的肽文库，其含有在第一步中鉴别出的序列的延长和突变变体，以选择在鉴别的基序周围的肽空间中具有最佳酶特异性的肽。肽阵列的高密度允许筛选大量肽，从而提供转谷氨酰胺酶底物的综合的和可再现的初步筛选。此外，由于在几天中建立新阵列的技术（例如，使用无掩模的光指导的肽合成），快速地搜索在最初鉴别的底物命中附近的肽空间的能力是可能的。
根据本发明的一个实施方案，使用包括多种肽的肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶的底物的方法包括以下步骤：使所述肽阵列中的肽与所述转谷氨酰胺酶接触，使所述转谷氨酰胺酶结合所述肽，和鉴别所述转谷氨酰胺酶的底物。
在一个方面，所述肽阵列包含固体支持物。
在另一个方面，通过无掩模的光指导的肽阵列合成使所述肽附着于所述固体支持物。
在另一个方面，所述肽阵列具有至少1.2 x 106种附着于所述固体支持物的肽。
在另一个方面，所述肽阵列具有至少1.4 x 106种附着于所述固体支持物的肽。
在另一个方面，所述肽阵列具有至少1.6 x 106种附着于所述固体支持物的肽。
在另一个方面，所述肽阵列具有至少1.8 x 106种附着于所述固体支持物的肽。
在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶。
在另一个方面，所述微生物转谷氨酰胺酶是链轮丝菌属种（Streptoverticillium sp.）转谷氨酰胺酶。
在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶是哺乳动物转谷氨酰胺酶。
在另一个方面，所述哺乳动物转谷氨酰胺酶选自人因子XIII A转谷氨酰胺酶、人因子XIII B转谷氨酰胺酶、因子XIII转谷氨酰胺酶、角质形成细胞转谷氨酰胺酶、组织-型转谷氨酰胺酶、表皮转谷氨酰胺酶、前列腺转谷氨酰胺酶、神经元转谷氨酰胺酶、人转谷氨酰胺酶5和人转谷氨酰胺酶7。
在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶底物是谷氨酰胺底物肽。
在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶底物是赖氨酸底物肽。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽包括选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ IDNO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ(SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
在另一个方面，所述赖氨酸底物肽包括选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ IDNO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK(SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ IDNO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ IDNO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽具有在第五个位置的谷氨酰胺残基。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽具有包括[YF][VA]LQG的序列基序。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽具有包括DYALQ (SEQ ID NO: 1)的序列。
在另一个方面，所述赖氨酸底物肽具有包括SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序。
根据本发明的另一个实施方案，使用一个或多个包括多种肽的肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶的底物的方法包括以下步骤：使第一个肽阵列中的肽与所述转谷氨酰胺酶接触，使所述转谷氨酰胺酶结合所述第一个肽阵列中的肽，选择在结合所述转谷氨酰胺酶后表现出预定特性的所述第一个肽阵列中的一种或多种肽，合成所述在第一个肽阵列中鉴别出的一种或多种肽的变体，使第二个肽阵列中的变体肽与所述转谷氨酰胺酶接触，和选择在所述第二个肽阵列中被鉴别为在结合所述转谷氨酰胺酶后表现出预定特性的一种或多种变体肽。
在一个方面，所述第一个或所述第二个肽阵列中的肽选自：5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体和12-聚体或它们的组合。
在另一个方面，所述第一个肽阵列和所述第二个肽阵列各自包括固体支持物。
在另一个方面，所述肽阵列通过无掩模的光指导的肽阵列合成来制备。
在另一个方面，所述第二个肽阵列具有至少1.0 x 106种附着于所述第二个肽阵列的固体支持物的肽。
在另一个方面，所述第一个肽阵列和/或所述第二个肽阵列具有至少1.2 x 106种附着于所述固体支持物的肽。
在另一个方面，所述第一个肽阵列和/或所述第二个肽阵列具有至少1.4 x 106种附着于所述固体支持物的肽。
在另一个方面，所述第一个肽阵列和/或所述第二个肽阵列具有至少1.6 x 106种附着于所述固体支持物的肽。
在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶。
在另一个方面，所述微生物转谷氨酰胺酶是链轮丝菌属种转谷氨酰胺酶。
在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶是哺乳动物转谷氨酰胺酶。
在另一个方面，所述哺乳动物转谷氨酰胺酶选自人因子XIII A转谷氨酰胺酶、人因子XIII B转谷氨酰胺酶、因子XIII转谷氨酰胺酶、角质形成细胞转谷氨酰胺酶、组织-型转谷氨酰胺酶、表皮转谷氨酰胺酶、前列腺转谷氨酰胺酶、神经元转谷氨酰胺酶、人转谷氨酰胺酶5和人转谷氨酰胺酶7。
在另一个方面，选择的变体肽是转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽包括选自以下的序列：GGGDYALQGGG (SEQ IDNO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG(SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ IDNO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG(SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG(SEQ ID NO: 86)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽包括GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)的序列基序。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽具有包括GGGDYALQGGG (SEQ ID NO: 26)的序列。
在另一个方面，来自所述第一个肽阵列的选择的肽包括选自以下的序列：DYALQ(SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ IDNO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ(SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
在另一个方面，来自所述第一个肽阵列的选择的肽包括选自以下的序列：ARSKL(SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ IDNO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK(SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在另一个方面，所述选择的肽具有在第五个位置的谷氨酰胺残基。
在另一个方面，所述选择的肽具有包括[YF][VA]LQG的序列基序。
在另一个方面，所述选择的肽具有包括DYALQ (SEQ ID NO: 1)的序列。
在另一个方面，所述选择的肽具有包括SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序。
根据本发明的另一个实施方案，肽阵列包括固体支持物和多种肽。所述肽是转谷氨酰胺酶底物肽，且所述肽阵列通过无掩模的光指导的肽阵列合成来制备。
根据本发明的另一个实施方案，分离的肽包括GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)的序列基序。
根据本发明的另一个实施方案，分离的肽包括选自以下的序列：GGGDYALQGGG(SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ IDNO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG(SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ IDNO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
在一个方面，所述肽包括序列GGGDYALQGGG (SEQ ID NO: 26)。
在另一个方面，所述肽包括选自以下的序列：CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ IDNO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG(SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ IDNO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
根据本发明的另一个实施方案，蛋白包括包含[YF][VA]LQG的序列基序的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列。
根据本发明的另一个实施方案，蛋白包括包含选自以下的序列的异源转谷氨酰胺酶底物肽：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ(SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ IDNO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ(SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
在一个方面，所述蛋白包括包含选自以下的序列的异源转谷氨酰胺酶底物肽：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ IDNO:10)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ(SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQ ID NO:23)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
根据本发明的另一个实施方案，蛋白包括包含SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序的异源转谷氨酰胺酶底物肽。
根据本发明的另一个实施方案，蛋白包括选自以下的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ IDNO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA(SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO:82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在一个方面，所述蛋白包括包含选自以下的序列的异源转谷氨酰胺酶底物肽：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ IDNO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL(SEQ ID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)或它们的组合。
根据本发明的另一个实施方案，蛋白包括包含GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)的序列基序的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列。
根据本发明的另一个实施方案，蛋白包括包含DYALQ (SEQ ID NO: 1)的序列的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列。
在一个方面，所述蛋白包括选自以下的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列：GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ IDNO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG(SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ IDNO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG(SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
在另一个方面，所述序列包括GGGDYALQGGG (SEQ ID NO: 26)。
在另一个方面，所述蛋白包括包含选自以下的序列的异源转谷氨酰胺酶底物肽：CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ IDNO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG(SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ IDNO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG(SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
根据本发明的另一个实施方案，一种用于交联蛋白的方法包括以下步骤：将至少一种异源转谷氨酰胺酶底物肽序列掺入所述蛋白中，和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白。所述异源转谷氨酰胺酶肽序列包括选自以下的序列：DYALQ (SEQ IDNO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ(SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ IDNO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ(SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ IDNO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG(SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ IDNO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG(SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)、ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL(SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ IDNO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK(SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ IDNO:78)或它们的组合。
在一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶肽序列包括序列DYALQ (SEQ ID NO: 1)。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶肽序列包括序列GGGDYALQGGG (SEQ IDNO: 26)。
根据本发明的另一个实施方案，一种用于交联蛋白的方法包括以下步骤：将至少一种异源转谷氨酰胺酶底物肽序列掺入所述蛋白中，和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白。所述异源转谷氨酰胺酶肽序列包括选自以下的序列基序：SK[LS]K、[KR][ST]KL、[YF][VA]LQG和GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)或它们的组合。
在一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽包括选自以下的序列：ARSKL (SEQ IDNO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG(SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQID NO:71)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)或它们的组合。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽包括选自以下的序列：DYALQ (SEQID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ(SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ IDNO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ(SEQ ID NO:23)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽包括选自以下的序列：CGGDYALQGPG(SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ IDNO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG(SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ IDNO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG(SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
根据本发明的另一个实施方案，一种用于交联至少两种化合物的方法包括以下步骤：将具有[YF][VA]LQG或GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)的序列基序的异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述至少两种化合物之一中，和
通过使所述化合物与转谷氨酰胺酶接触来交联所述化合物。
在一个方面，所述方法还包括将异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述蛋白中的步骤。
在另一个方面，所述赖氨酸底物肽包括SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽包括选自以下的序列：ARSKL(SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ IDNO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)或它们的组合。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽包括选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ IDNO:10)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ(SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQ ID NO:23)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽包括选自以下的序列：CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ IDNO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG(SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ IDNO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG(SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
根据本发明的另一个实施方案，一种用于交联至少两种化合物的方法包括以下步骤：将异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述至少两种化合物之一中，和通过使所述化合物与转谷氨酰胺酶接触来交联所述化合物，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽包含选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ IDNO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ(SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ IDNO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG(SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ IDNO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG(SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)和GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)或它们的组合。
在一个方面，所述方法还包括将异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述至少两种化合物中的另一种中的步骤。
在另一个方面，所述赖氨酸底物肽包括选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ IDNO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK(SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ IDNO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ IDNO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在另一个方面，所述化合物选自：蛋白、肽和小有机分子或它们的组合。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽具有包括DYALQ (SEQ ID NO: 1)的序列。
根据本发明的另一个实施方案，一种用于交联蛋白的方法包括以下步骤：将具有[YF][VA]LQG或GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)的序列基序的异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述蛋白中，将转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述蛋白中，和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白。
在一个方面，所述赖氨酸底物肽包括SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽包括选自以下的序列：ARSKL(SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ IDNO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)或它们的组合。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽包括选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ IDNO:10)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ(SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQ ID NO:23)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽包括选自以下的序列：CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ IDNO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG(SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ IDNO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG(SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽包括序列DYALQ (SEQ ID NO: 1)。
根据本发明的另一个实施方案，一种用于交联蛋白的方法包括将异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入蛋白中的步骤，其中所述肽包括选自以下的序列：DYALQ (SEQ IDNO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ(SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ IDNO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ(SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ IDNO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG(SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ IDNO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG(SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)和GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)或它们的组合。所述方法还包括以下步骤：将转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述蛋白中，和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白。
在一个方面，所述转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽包括选自以下的序列：ARSKL (SEQID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ IDNO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK(SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在另一个方面，所述交联方法用于将靶向配体缀合至药物。
在另一个方面，所述交联方法用于缀合亲和标签。
在另一个方面，所述交联方法用于缀合标记。
在另一个方面，所述交联方法用于聚乙二醇化。
在另一个方面，所述交联方法用于生物素化或钌化。
在另一个方面，所述蛋白是维生素D结合蛋白。
在另一个方面，所述化合物之一是维生素D结合蛋白。
在另一个方面，所述其它化合物是标记，其中所述标记是Cy5、钌或生物素。
在另一个方面，所述标记是Cy5。
在另一个方面，所述标记是钌。
在另一个方面，所述标记是生物素。
在另一个方面，将所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述维生素D结合蛋白中，且所述肽包括序列GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)。
在另一个方面，将所述异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述标记中。
在另一个方面，所述掺入标记中的异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽包括序列RSKLG (SEQ ID NO:58)。
在另一个方面，所述具有掺入的异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽的标记是下式的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
在另一个方面，所述具有掺入的异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽的标记是下式的化合物：
Figure 231152DEST_PATH_IMAGE002
。
在另一个方面，所述具有掺入的异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽的标记是下式的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
根据本发明的另一个实施方案，维生素D结合蛋白包括异源转谷氨酰胺酶底物肽序列。
在一个方面，所述转谷氨酰胺酶底物肽包括选自以下的序列基序：[YF][VA]LQG、GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)、SK[LS]K和[KR][ST]KL或它们的组合。
在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽包括选自以下的序列：ARSKL (SEQID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ IDNO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK(SEQ ID NO:71)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)、DYALQ (SEQ IDNO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、NYVLQ(SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQID NO:23)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ IDNO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG(SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ IDNO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG(SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶底物肽包括序列DYALQ (SEQ ID NO: 1)。
根据本发明的另一个实施方案，维生素D结合蛋白包括异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽，其中所述肽包括选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ IDNO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ IDNO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ(SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ IDNO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG(SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ IDNO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG(SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ IDNO: 86)、ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL(SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ IDNO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK(SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ IDNO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在一个方面，所述肽包括序列GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)。
在另一个方面，所述肽阵列中的肽选自：5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体和12-聚体或它们的组合。
在另一个方面，所述肽缺乏半胱氨酸。
在另一个方面，所述肽缺乏氨基酸重复。
在另一个方面，所述肽代表具有选自以下长度的所有转谷氨酰胺酶底物：5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体和12-聚体或它们的组合。
根据本发明的另一个实施方案，维生素D结合蛋白具有序列：
Figure 741768DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
在一个方面，所述肽阵列包括选自以下的肽数目：至少1.6 x 105个肽、至少2.0 x105个肽、至少3.0 x 105个肽、至少4.0 x 105个肽、至少5.0 x 105个肽、至少6.0 x 105个肽、至少7.0 x 105个肽、至少8.0 x 105个肽、至少9.0 x 105个肽、至少1.0 x 106个肽、至少1.2 x 106个肽、至少1.4 x 106个肽、至少1.6 x 106个肽、至少1.8 x 106个肽、至少1.0x 107个肽和至少1.0 x 108个肽，所述肽附着于所述肽阵列的固体支持物。
在另一个方面，所述方法用于缀合任一个下式的标记和附带的转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽：
Figure 255925DEST_PATH_IMAGE006
，
Figure DEST_PATH_IMAGE007
，
Figure 572506DEST_PATH_IMAGE008
，
Figure DEST_PATH_IMAGE009
，
Figure 980354DEST_PATH_IMAGE010
, 和
Figure DEST_PATH_IMAGE011
。
本发明的前述和其它方面和优点将从以下描述显现。在描述中，参考附图，其形成本发明的一部分，且其中通过举例说明显示了本发明的优选实施方案。这样的实施方案不一定代表本发明的整个范围，但是，因此参考权利要求和本文来解释本发明的范围。
附图说明
图1的log-log散布图显示了在有生物素化的胺-供体底物存在下针对被MTG标记的5-聚体肽阵列上的重复部件收集的荧光信号数据之间的关联。每个点代表来自一式两份地合成的140万独特肽部件的文库的280万肽部件之一。低和高信号的区域分别用在图的左下区域和右上区域中的圆圈指示。
图2A-2H是两个发现的基序A和B的四个最保守位置的氨基酸频率图。图2A-2D分别对应于基序A的位置1-4。图2E-2H分别对应于基序B的位置1-4。使用最佳肽序列（其通过使用生物素化的胺供体底物的阵列MTG测定发现）的Peplib分析来鉴别基序。基序A: [Y][A][L][Q]。基序B: [Y][VF][L][Q]。以下述次序沿着水平轴从左至右列出氨基酸(单字母代码)：A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。在垂直轴上指出每个氨基酸的频率。
图3是在GLDH偶联的测定中使用不同浓度的二肽QG (1-20 mM)和肽GGGDYALQGGGG(SEQ ID NO: 86)(0.2-5 mM)在340 nm和37℃测量NADH氧化速率得到的MTG活性的图。使用Michaelis-Menten方程式使双曲线拟合至数据点，从而给出Km和Vmax参数并允许计算周转率(kcat)和催化效率(kcat/KM)。相对于标准QG-底物(实心正方形)观察到阵列选择的GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86) (空心正方形)底物的性能改善。‘Z’代表羧基苄基保护基。
图4显示了在GLDH偶联的测定中使用不同浓度的肽GGGDEKPDGGGG (SEQ ID NO:81) (0-500µM)和肽GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80) (0-500µM)在340 nm和37℃测量NADH氧化速率得到的MTG活性的图。使用Michaelis-Menten方程式使双曲线拟合至数据点，从而给出Km和Vmax参数以及允许计算周转率(kcat)和催化效率(kcat/KM)。相对于GGGDEKPDGGGG(SEQ ID NO: 81)底物(实心圆形)观察到阵列选择的GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80) (实心正方形)底物的性能改善。‘Z-’代表羧基苄基保护基。
图5的log-log散布图显示了在有生物素化的Gln-供体底物存在下针对被MTG标记的5-聚体肽阵列上的重复肽部件收集的荧光信号数据之间的关联。每个点代表来自一式两份地合成的140万独特肽部件的文库的280万肽部件之一。低和高信号的区域分别用在图的左下区域和右上区域中的圆圈指示。
图6是GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)肽的单突变扫描氨基酸置换图。每个条代表20种天然氨基酸之一，且条的高度对应于MTG产生的信号强度。对于每个肽位置，以下述次序从左至右按种类(非极性的、极性的、碱性的或酸性的)排列氨基酸：A、F、I、L、M、V、W、P、G、S、Y、C、Q、T、N、R、K、H、D、E。在每个位置的最右侧条对应于在该位置的氨基酸缺失。用位于对应条上面的字母指示RSKLA基序的氨基酸的数据。
图7显示了化学合成的Lys-肽-Cy5荧光标记。
图8A是SDS-PAGE凝胶的光学图像，其使用阵列选择的基序分析图7的荧光标记对维生素D结合蛋白的位点特异性Cy5标记。泳道1：分子量阶梯(以kDa为单位显示值)；泳道2：不含转谷氨酰胺酶肽的wt-VitDBP-His8；泳道3：含有转谷氨酰胺酶肽的wt-VitDBP-His8-Q2；泳道4：在有荧光标记和MTG存在下不含转谷氨酰胺酶肽的wt-VDBP-His8；泳道5：在有荧光标记和MTG存在下含有转谷氨酰胺酶肽的wt-VDBP-His8-Q2。关于缩写参见详细描述。
图8B是在配备Cy5 LED和显示Cy5荧光的滤片设置的ChemiDoc CCD成像仪上分析的图8A的SDS-PAGE凝胶的图像。
图9显示了化学合成的Lys-肽-钌标记。
图10A是SDS-PAGE凝胶的光学图像，其用于分析图9的荧光标记对维生素D结合蛋白的位点特异性钌标记。泳道1：分子量阶梯(以kDa为单位显示值)；泳道2：不含转谷氨酰胺酶肽的wt-VDBP-His8；泳道3：含有转谷氨酰胺酶肽的wt-VDBP-His8-Q2；泳道4：在有荧光标记和MTG存在下不含转谷氨酰胺酶肽的wt-VDBP-His8；泳道5：在有荧光标记和MTG存在下含有转谷氨酰胺酶肽的wt-VDBP-His8-Q2。关于缩写参见详细描述。
图10B是在配备Cy5 LED和显示Cy5荧光的滤片设置的ChemiDoc CCD成像仪上分析的图10A的SDS-PAGE凝胶的图像。
图11显示了具有8X组氨酸标签的野生型维生素D结合蛋白(wt-VDBP-His8)对生物素修饰的天然维生素D配体的动力学。BIACORE 3000；配体：VitD2-25OH-生物素(300 nM)；wt-VDBP-His8浓度，上至下迹线：600 nM、200 nM、67 nM、22.2 nM、7.4 nM、0 nM；KD= 95nM。
图12显示了具有8X组氨酸标签和Q2标签的野生型维生素D结合蛋白(wt-VDBP-His8-Q2)对生物素修饰的天然维生素D配体的动力学。BIACORE 3000；配体：VitD2-25OH-生物素(300 nM)；wt-VDBP-His8-Q2浓度，上至下迹线：600 nM、200 nM、67 nM、22.2 nM、7.4nM、0 nM；KD= 93 nM。
发明详述
I. 概述
如以上所讨论的，在不同的情形下，可能有用的是，阐明酶活性和特异性的细节来提供那些酶的基础理解，以及用于开发包括那些酶的生物技术应用。例如，转谷氨酰胺酶是一类负责催化肽链之间的交联反应的酶。所述反应通常将谷氨酰胺残基的羧酰胺基团与赖氨酸残基的氨基基团连接。因此，在多种生物技术应用中蛋白的位点特异性标记经常依赖于转谷氨酰胺酶。但是，一般而言，鉴别用于与转谷氨酰胺酶或其它酶一起使用的底物受限于高通量且灵敏的系统和方法的缺乏。在一个方面，噬菌体展示系统可能遭受表现出与选择靶标的非特异性结合的噬菌体的繁殖。在另一个方面，mRNA展示系统的一个缺点是，共价地连接的mRNA的存在可能遮蔽所述酶和有关的肽序列之间的相互作用。此外，可能的肽序列的多样性(例如，对于5-聚体肽，>106个序列)使得难以发现共同底物基序。其它挑战可能产生，取决于为肽合成选择的方法、合成的肽部件的大小或复杂性、所述酶和肽序列之间的相互作用的性质等，和它们的组合。
用于鉴别转谷氨酰胺酶底物的系统和方法可以克服这些和其它挑战。在一个实施方案中，开发并优化了一种测定来测量来自茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）的微生物转谷氨酰胺酶(MTG)的标记阵列上的肽的能力，所述阵列具有大于100万个使用无掩模的光指导的合成所合成的独特部件。所述经优化的测定能够鉴别特定肽序列基序，其中MTG表现出高度的标记活性和特异性。使用用于测量体外酶活性的标准生化测定，进一步验证了指示阵列上的MTG对肽的标记的结果。因此，开发了一种用于鉴别MTG底物的系统和方法，其可以放大以鉴别与替代性转谷氨酰胺酶有关的底物和一般的其它酶的底物。
II. 详细描述
在本专利申请的发明内容部分中描述了本发明的几个实施方案，且在本申请的该详细描述部分中描述的每个实施方案适用于在发明内容中描述的实施方案，包括由列举的子句描述的实施方案。在本文描述的多个实施方案中的任一个中，下述特征在适用时可能存在，从而提供本发明的另外实施方案。对于所有实施方案，也预见到实施方案的任何适用组合。
在一个实施方案中，提供了分离的包含GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)的序列基序的肽。在该实施方案中，所述分离的肽可以包含选自以下的序列：CGGDYALQGPG (SEQ IDNO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG(SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ IDNO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG(SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG (SEQ IDNO: 53)或它们的组合。在该实施方案中，所述肽包含序列DYALQ (SEQ ID NO: 1)。
在另一个实施方案中，提供了一种分离的肽，其可以包含选自以下的序列：GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ IDNO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG(SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ IDNO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG(SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。在另一个实施方案中，所述肽包含序列GGGDYALQGGG (SEQ ID NO: 26)。在另一个实施方案中，所述肽可以包含序列DYALQ (SEQ ID NO: 1)。
在另一个实施方案中，提供了一种蛋白，其包含含有[YF][VA]LQG的序列基序的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列。括号在本文公开的肽序列中的应用指示在所述肽序列内的给定位置处具有一个或多个替代氨基酸的序列或序列基序。例如，[YF][VA]LQG的序列基序可以具有在所述肽序列的第一个位置的氨基酸Y和F中的任一个，和在所述肽序列的第二个位置的氨基酸V和A中的任一个，由此产生四种可能的独特肽序列(即，YVLQG、YALQG、FVLQG和FALQG)。在包含[YF][VA]LQG的序列基序的实施方案中，所述蛋白可以包含含有选自以下的序列的异源转谷氨酰胺酶底物肽：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ(SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ IDNO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ(SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQ ID NO:23)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
在另一个示例性的方面，提供了一种蛋白，其包含含有选自以下的序列的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ IDNO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ(SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)和NFVLQ (SEQ IDNO:25)或它们的组合。
在另一个实施方案中，提供了一种蛋白，其包含含有SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序的异源转谷氨酰胺酶底物肽。在该实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽可以包含选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、RLKSK (SEQ IDNO:67)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL(SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)和GGGARSKLGGGG(SEQ ID NO: 80)或它们的组合。
在另一个示例性实施方案中，提供了一种蛋白，其包含选自以下的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ IDNO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK(SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在另一个示例性实施方案中，提供了一种蛋白，其包含含有GDYALQGPG (SEQ IDNO: 79)的序列基序的异源转谷氨酰胺酶底物肽序列。在该示例性的方面，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽可以包含选自以下的序列：CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG(SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ IDNO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG(SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ IDNO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
在另一个示例性实施方案中，提供了一种蛋白，其包含异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽序列。在该示例性的方面，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽可以包含选自以下的序列：GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ IDNO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG(SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ IDNO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG(SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)和GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)或它们的组合。
如本文中使用的，关于肽的“异源”是指这样的转谷氨酰胺酶底物肽：其源自与其掺入的蛋白不同的蛋白(例如，掺入在维生素D结合蛋白中的转谷氨酰胺酶底物肽)。
在其它实施方案中，本文描述的转谷氨酰胺酶底物肽可以具有在第五个位置的谷氨酰胺残基。在另一个实施方案中，本文描述的肽可以是转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽或转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽。在另一个实施方案中，所述转谷氨酰胺酶底物肽可以包含DYALQ (SEQ ID NO: 1)的序列，或可以具有包含[FY][FYT]LQ、[YF]VAQ、K[YLS]K或TKL的序列基序。
在一个示例性实施方案中，所述肽可以是转谷氨酰胺酶的肽底物。在另一个实施方案中，所述肽可以是微生物转谷氨酰胺酶(例如，链轮丝菌属种转谷氨酰胺酶)或哺乳动物转谷氨酰胺酶的肽底物。在其中所述酶是哺乳动物转谷氨酰胺酶的实施方案中，所述哺乳动物转谷氨酰胺酶可以例如选自：人因子XIII A转谷氨酰胺酶、人因子XIII B转谷氨酰胺酶、因子XIII转谷氨酰胺酶、角质形成细胞转谷氨酰胺酶、组织-型转谷氨酰胺酶、表皮转谷氨酰胺酶、前列腺转谷氨酰胺酶、神经元转谷氨酰胺酶、人转谷氨酰胺酶5和人转谷氨酰胺酶7。
在一个实施方案中，本发明包括分离的或基本上纯化的肽或蛋白。“分离的”肽或蛋白在化学合成时(即，合成肽)基本上不含有化学前体或其它化学物质，或如果通过重组DNA技术来制备则基本上不含有细胞物质。
在另一个实施方案中，本文描述的肽或蛋白可以是“纯化的”。在一个实施方案中，本文描述的经纯化的肽或蛋白可以具有至少约90%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%、或约99.5%的纯度。在另一个实施方案中，本文描述的经纯化的肽或蛋白可以具有至少90%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%、或至少99.5%的纯度。使用任意常规技术，包括各种色谱法或光谱技术，诸如高压或高效液相色谱法、核磁共振光谱法、薄层色谱法(TLC)、紫外(UV)吸光度光谱法、荧光光谱法等，可以测量所述肽或蛋白的纯度。
本文中使用的纯度确定可以基于重量百分比、摩尔百分比等。另外，纯度确定可以基于某些预定组分的缺失或基本缺失。还应该理解，纯度确定适用于通过本文所述的方法制备的肽或蛋白的溶液。在那些情况下，纯度测量（包括重量百分比和摩尔百分比测量）与除了溶剂以外的溶液组分有关。
在另一个实施方案中，在无菌的容器（例如，瓶）或包装（例如，安瓿或密封的瓶）中提供本文描述的肽、蛋白或化合物。在本文描述的不同实施方案中，本文描述的肽和蛋白可以通过置换、缺失、截短、延伸进行修饰，和/或可以与其它肽或蛋白分子融合。还可以使用转谷氨酰胺酶将本文描述的肽或蛋白连接至化合物(例如，小有机分子)用于使所述化合物与另一种肽或蛋白交联。在通过置换修饰的肽的一个实施方案中，所述肽中的氨基酸可以各自被19种其它天然氨基酸中的任一种或被任意合适的非天然氨基酸置换。在另一个实施方案中，本文描述的肽可以包含天然的或非天然的氨基酸。
术语“天然氨基酸”或“规范氨基酸”表示在蛋白中常见且用于蛋白生物合成的20种氨基酸之一以及可以在翻译过程中掺入蛋白中的其它氨基酸(包括吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)。20种天然氨基酸包括组氨酸(His；H)、丙氨酸(Ala；A)、缬氨酸(Val；V)、甘氨酸(Gly；G)、亮氨酸(Leu；L)、异亮氨酸(Ile；I)、天冬氨酸(Asp；D)、谷氨酸(Glu；E)、丝氨酸(Ser；S)、谷氨酰胺(Gln；Q)、天冬酰胺(Asn；N)、苏氨酸(Thr；T)、精氨酸(Arg；R)、脯氨酸(Pro；P)、苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)、色氨酸(Trp；W)、半胱氨酸(Cys；C)、甲硫氨酸(Met；M)和赖氨酸(Lys；K)的L-立体异构体。术语“所有20种氨基酸”表示上面列出的20种天然氨基酸。
术语“非天然氨基酸”表示不属于由标准遗传密码编码的那些或不在翻译过程中掺入蛋白中的有机化合物。因此，非天然氨基酸包括氨基酸或氨基酸的类似物，但不限于：所有20种氨基酸的D-立体异构体、所有20种氨基酸的β-氨基-类似物、瓜氨酸、高瓜氨酸、高精氨酸、羟脯氨酸、高脯氨酸、鸟氨酸、4-氨基-苯丙氨酸、环己基丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基-丙氨酸、N-甲基-甘氨酸、正亮氨酸、N-甲基-谷氨酸、叔丁基甘氨酸、α-氨基丁酸、叔丁基丙氨酸、2-氨基异丁酸、α-氨基异丁酸、2-氨基茚满-2-甲酸、硒代甲硫氨酸、脱氢丙氨酸、羊毛硫氨酸、γ-氨基丁酸、及其衍生物，其中所述胺氮已经被单-或二-烷基化。
在不同的示例性方面，本文描述的肽可以是约5至约19个氨基酸、约5至约18个氨基酸、约5至约17个氨基酸、约5至约16个氨基酸、约5至约15个氨基酸、约5至约14个氨基酸、约5至约13个氨基酸、约5至约12个氨基酸、约5至约11个氨基酸、约5至约10个氨基酸、约5至约9个、约5至约8个、约5至约7个、或约5至约6个氨基酸的肽。在其它示例性方面，本文描述的肽可以是5-19个氨基酸、5-18个氨基酸、5-17个氨基酸、5-16个氨基酸、5-15个氨基酸、5-14个氨基酸、5-13个氨基酸、5-12个氨基酸、5-11个氨基酸、5-10个氨基酸、5-9个氨基酸、5-8个氨基酸、5-7个氨基酸或5-6个氨基酸的肽。在另一个示例性实施方案中，所述肽可以选自5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体、12-聚体、13-聚体、14-聚体、15-聚体、16-聚体、17-聚体、18-聚体或19-聚体或它们的组合。
在另一个实施方案中，本文描述的肽可以是合成的。在不同的实施方案中，本文描述的肽可以包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：DYALQ (SEQ IDNO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ(SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ IDNO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ(SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ IDNO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG(SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ IDNO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG(SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)、ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL(SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ IDNO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK(SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ IDNO:78)或它们的组合。
在另一个实施方案中，本文描述的肽可以具有“一个”由选自以下的氨基酸序列组成的序列，或可以具有“所述”由选自以下的氨基酸序列组成的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ IDNO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ(SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ IDNO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG(SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ IDNO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG(SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)、ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL(SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ IDNO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK(SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ IDNO:78)或它们的组合。
在另一个实施方案中本文描述的肽可以包含以下序列基序、由以下序列基序组成、具有一个以下序列基序、或具有所述以下序列基序：GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)、[YF][VA]LQG、SK[LS]K、[KR][ST]KL或它们的组合。
在另一个实施方案中，提供了与SEQ ID NO: 1-93中的任一个具有约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同源性的肽或蛋白。例如，通过使用GAP程序(Genetics Computer Group, 软件；可得自Accelrys)，可以完成序列之间的同一性或相似性百分比的确定；使用例如ClustalW算法(Vector NTI软件, InforMaxInc.)可以完成比对。可以使用目标肽序列检索序列数据库。数据库检索的算法通常基于Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)软件(Altschul等人, 1990)。
在另一个实施方案中，本文描述的肽可以通过包括一个或多个保守氨基酸置换进行修饰。如本领域技术人员众所周知的，通过保守置换改变肽的任何非关键性氨基酸不会显著地改变该肽的活性，因为替换氨基酸的侧链将能够形成类似的键并作为已经被替换的氨基酸的侧链发生接触。
在一个示例性的方面，非保守置换是可能的，前提条件是，这些不会过分地影响所述肽的活性。如本领域众所周知的，氨基酸的“保守置换”或肽的“保守置换变体”表示这样的氨基酸置换，其维持：1)所述肽的二级结构；2)氨基酸的电荷或疏水性；和3)侧链的庞大或这些部件中的任意一个或多个。示例性地，众所周知的术语“亲水残基”涉及丝氨酸或苏氨酸。“疏水残基”表示亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸等。“带正电荷的残基”涉及赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或组氨酸。“带负电荷的残基”表示天冬氨酸或谷氨酸。具有“庞大侧链”的残基表示苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸等。在表1中给出了示例性的保守氨基酸置换的一个示例性列表。
Figure 537237DEST_PATH_IMAGE012
在另一个方面，本文描述的肽(例如，SEQ ID NO: 1-93)是转谷氨酰胺酶的底物且能够结合或特异性地结合转谷氨酰胺酶。本文中使用的“特异性地结合”或“特异性结合”是指受体(例如，底物)与标记的配体(例如，酶)的结合，所述标记的配体在利用标记的配体和未标记的配体的特异性结合测定中不可被过量的未标记的配体替换。在不同的实施方案中，在基于预定特性鉴别转谷氨酰胺酶底物的情况下，结合、特异性结合或酶活性可以是例如预定特性。
在一个实施方案中，根据本领域的技术人员众所周知的固相肽合成方案，可以合成本文描述的肽。在一个这样的实施方案中，将肽前体根据众所周知的Fmoc方案在固体支持物上合成，用三氟乙酸从所述支持物切割，并根据本领域技术人员已知的方法通过色谱法纯化。用于合成本文描述的肽（诸如SEQ ID NO: 1-93）或其片段的技术描述在Sambrook等人, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第3版, Cold Spring HarborLaboratory Press, (2001)（其通过引用并入本文）中。还可以商业地制备用于用在本文所述的方法中的肽。
在另一个实施方案中，利用本领域技术人员众所周知的生物技术方法，可以合成本文描述的肽或蛋白。在一个这样的实施方案中，通过本领域技术人员已知的重组DNA技术将编码期望肽的氨基酸序列信息的DNA序列连接进表达质粒(例如，包含用于所述肽的亲和纯化的亲和标签的质粒)中，将所述质粒转染进宿主生物中进行表达，然后根据本领域技术人员已知的方法(例如，通过亲和纯化)将所述肽从宿主生物或生长培养基分离。重组DNA技术方法描述在Sambrook等人, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)（其通过引用并入本文）中，且是技术人员众所周知的。基于众所周知的分子克隆技术，还可以使用在Sambrook等人中描述的方法将本文描述的肽序列掺入本文描述的蛋白中。在另一个实施方案中，可以使用核糖体翻译系统合成本文描述的肽。还可以通过这样的重组DNA技术制备掺入了异源肽序列的本文描述的蛋白。
用于纯化或分离本文描述的肽的技术也是本领域众所周知的。这样的技术也描述在Sambrook等人, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第3版, Cold SpringHarbor Laboratory Press, (2001)（其通过引用并入本文）中。
在另一个实施方案中，提供了一种使用包含多种肽的肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶的底物的方法。所述方法包括下述步骤：使所述肽阵列中的肽与所述转谷氨酰胺酶接触，使所述转谷氨酰胺酶结合所述肽，和鉴别所述转谷氨酰胺酶的底物。
在另一个示例性的方面，提供了一种使用一个或多个包含多种肽的肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶的底物的方法。所述方法包括下述步骤：使第一个肽阵列中的肽与所述转谷氨酰胺酶接触，使所述转谷氨酰胺酶结合所述第一个肽阵列中的肽，选择在结合所述转谷氨酰胺酶后表现出预定特性的所述第一个肽阵列中的一种或多种肽，合成所述在第一个肽阵列中鉴别出的一种或多种肽的变体，使第二个肽阵列中的变体肽与所述转谷氨酰胺酶接触，和选择在所述第二个肽阵列中被鉴别为在结合所述转谷氨酰胺酶后表现出预定特性的一种或多种变体肽。
在另一个实施方案中，提供了包含固体支持物和多种肽的肽阵列，其中所述肽是转谷氨酰胺酶底物肽，且其中所述肽阵列通过无掩模的光指导的肽阵列合成来制备。
在一个实施方案中，用于用在本文描述的鉴别方法和肽阵列中的肽阵列上的肽是转谷氨酰胺酶底物肽。在一个示例性实施方案中，所述酶底物肽可以是微生物转谷氨酰胺酶（例如，链轮丝菌属种转谷氨酰胺酶诸如茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraense）或来自另一个细菌种的转谷氨酰胺酶）或哺乳动物转谷氨酰胺酶的底物肽。在其中所述肽是哺乳动物转谷氨酰胺酶的底物肽的实施方案中，所述哺乳动物转谷氨酰胺酶可以例如选自：人因子XIII A转谷氨酰胺酶、人因子XIII B转谷氨酰胺酶、因子XIII转谷氨酰胺酶、角质形成细胞转谷氨酰胺酶、组织-型转谷氨酰胺酶、表皮转谷氨酰胺酶、前列腺转谷氨酰胺酶、神经元转谷氨酰胺酶、人转谷氨酰胺酶5和人转谷氨酰胺酶7。
在其中所述肽是转谷氨酰胺酶底物肽的另一个实施方案中，所述肽可以是转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽。在其中所述肽是转谷氨酰胺酶底物肽的另一个实施方案中，所述肽可以是转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽。
在另一个方面，用于用在本文描述的鉴别方法和肽阵列中的转谷氨酰胺酶底物肽可以具有GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)、[YF][VA]LQG、SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序。在其中所述底物肽是转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽的实施方案中，所述肽可以具有在第五个位置的谷氨酰胺残基。
在本文描述的不同实施方案中，用于用在本文描述的肽阵列中的肽可以通过置换、缺失、截短、延伸进行修饰，和/或可以与其它肽分子融合或附着于其它肽分子，其中所述经修饰的肽可用在本文描述的方法和肽阵列中。在通过置换修饰的肽的一个实施方案中，所述肽中的氨基酸可以各自被19种其它天然氨基酸中的任一种或被任意合适的非天然氨基酸置换。在另一个实施方案中，本文描述的肽可以包含天然的或非天然的氨基酸。
在不同的示例性方面，用于用在本文描述的肽阵列中的肽可以包含约5至约19个氨基酸、约5至约18个氨基酸、约5至约17个氨基酸、约5至约16个氨基酸、约5至约15个氨基酸、约5至约14个氨基酸、约5至约13个氨基酸、约5至约12个氨基酸、约5至约11个氨基酸、约5至约10个氨基酸、约5至约9个、约5至约8个、约5至约7个、或约5至约6个氨基酸的肽。在其它示例性方面，本文描述的肽可以包含5-19个氨基酸、5-18个氨基酸、5-17个氨基酸、5-16个氨基酸、5-15个氨基酸、5-14个氨基酸、5-13个氨基酸、5-12个氨基酸、5-11个氨基酸、5-10个氨基酸、5-9个氨基酸、5-8个氨基酸、5-7个氨基酸或5-6个氨基酸的肽。在另一个示例性实施方案中，所述肽可以选自5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体、12-聚体、13-聚体、14-聚体、15-聚体、16-聚体、17-聚体、18-聚体或19-聚体或它们的组合。
在另一个实施方案中，用于用在本文描述的肽阵列中的肽可以是合成的。在不同的实施方案中，用于用在本文描述的方法和肽阵列中的肽可以具有、包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 93的氨基酸序列或它们的组合或者由其组成。在另一个实施方案中，与SEQID NO: 1-93中的任一个具有约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同源性的肽可以用在本文描述的肽阵列中。
在另一个方面，用于用在本文描述的肽阵列中的肽是转谷氨酰胺酶底物，且能够结合或特异性地结合转谷氨酰胺酶。本文中使用的“特异性地结合”或“特异性结合”是指受体(例如，底物)与标记的配体(例如，酶)的结合，所述标记的配体在利用标记的配体和未标记的配体的特异性结合测定中不可被过量的未标记的配体替换。在不同的实施方案中，在基于预定特性鉴别转谷氨酰胺酶底物的情况下，结合、特异性结合或酶活性可以是例如预定特性。
在一个方面，可以如在实施例12中所述合成本文描述的肽和肽阵列。还可以使用本领域的技术人员众所周知的用于合成用在肽阵列上的肽的任何适当方案。
在不同的实施方案中，本文描述的肽阵列可以具有至少1.6 x 105个肽、至少2.0x 105个肽、至少3.0 x 105个肽、至少4.0 x 105个肽、至少5.0 x 105个肽、至少6.0 x 105个肽、至少7.0 x 105个肽、至少8.0 x 105个肽、至少9.0 x 105个肽、至少1.0 x 106个肽、至少1.2 x 106个肽、至少1.4 x 106个肽、至少1.6 x 106个肽、至少1.8 x 106个肽、至少1.0x 107个肽或至少1.0 x 108个肽，所述肽附着于所述肽阵列的固体支持物。在其它实施方案中，本文描述的肽阵列可以具有约1.6 x 105个肽、约2.0 x 105个肽、约3.0 x 105个肽、约4.0 x 105个肽、约5.0 x 105个肽、约6.0 x 105个肽、约7.0 x 105个肽、约8.0 x 105个肽、约9.0 x 105个肽、约1.0 x 106个肽、约1.2 x 106个肽、约1.4 x 106个肽、约1.6 x 106个肽、约1.8 x 106个肽、约1.0 x 107个肽或约1.0 x 108个肽，所述肽附着于所述肽阵列的固体支持物。如本文中所述的，包含特定数目的肽的肽阵列可以是指在单个固体支持物上的单个肽阵列，或者所述肽可以分开并附着于超过一个固体支持物上以得到本文描述的肽的数目。
在不同的实施方案中，附着于肽阵列的肽可以缺少半胱氨酸，可以缺少氨基酸重复，可以是独特的(即，每个肽不同于阵列上的其它肽)，和/或可以代表具有选自以下长度的所有转谷氨酰胺酶底物：5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体和12-聚体或它们的组合。
如本文中所述的，“肽阵列”是指有意地建立的肽的集合，所述肽可以合成地制备。在一个实施方案中，所述阵列中的肽可以彼此不同。用于合成肽阵列（包括通过无掩模的光指导的肽阵列合成制备的肽阵列）的方法是本领域已知的，且示例性的方法描述在美国专利申请公开号2004/0023367和2009/0176664和美国专利号6,375,903和5,143,854中。另外的方法描述在本文实施例12中。
在一个实施方案中，所述肽阵列中的肽附着于固体支持物。固体支持物表示具有一个或多个刚性或半刚性表面的材料。在某些方面，固体支持物的至少一个表面将是基本上平坦的，尽管在某些方面，区域可以用例如孔、隆起的区域、针、蚀刻的沟等为不同的肽物理上隔开。
在不同的实施方案中，支持物材料可以包括，例如，硅、生物相容的聚合物（例如，例如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚二甲基硅氧烷（PDMS））、玻璃、塑料、SiO2、石英、氮化硅、官能化的玻璃、金、铂、碳复合材料或铝。官能化的表面包括例如，氨基-官能化的玻璃、羧基-官能化的玻璃和羟基-官能化的玻璃。另外，可以任选地给支持物涂布一个或多个层以提供用于分子附着或官能化的表面、增加的或降低的反应性、结合检测等。本领域技术人员可以选择适当的支持物材料。
在一个实施方案中，使用无掩模的光指导的肽阵列合成可以制备所述肽阵列。无掩模的光指导的肽阵列合成可以利用微镜和投射光学部件，所述投射光学部件将所述微镜的图像聚焦在进行反应的支持物上。在一个实施方案中，在计算机的控制下，将每个微镜在第一个位置和第二个位置之间选择性地转换，在所述第一个位置处它通过光学系统将光投射在底物上，在所述第二个位置处它使光转向离开底物。在该实施方案中，可单独控制的镜子可以引导光束以产生图像或光图型。在一个实施方案中，通过使用微镜装置提供不同强度的辐照，可以调节在固体支持物上的不同区域处的反应。这样的装置是可商业得到的。在一个方面，受控制的光辐照允许控制反应以合乎需要的速率进行。
在一个实施方案中，所述肽共价地附着于所述固体支持物。在另一个实施方案中，所述肽非共价地附着于所述固体支持物。在另一个实施方案中，所述肽通过接头（诸如可切割的接头）附着于所述固体支持物。在一个示例性实施方案中，所述接头是约4至约40个原子长。示例性的接头是芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚体(PEG)、二胺、二酸、氨基酸等和它们的组合。本领域技术人员将知道如何设计适当的接头。
在一个实施方案中，附着于所述肽阵列的肽或使用所述肽阵列鉴别的肽可以包含选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ IDNO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ(SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。
在另一个示例性实施方案中，附着于所述肽阵列的肽或使用所述肽阵列鉴别的肽可以包含选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ IDNO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK(SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在另一个实施方案中，附着于所述肽阵列的肽或使用所述肽阵列鉴别的肽可以包含选自以下的序列：GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ IDNO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG(SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ IDNO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GGGGDYALQGGGG(SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
在其它实施方案中，附着于所述肽阵列的肽或使用所述肽阵列鉴别的肽可以具有包含GGGDYALQGGG (SEQ ID NO: 26)或DYALQ (SEQ ID NO:1)的序列。在另一个实施方案中，附着于所述肽阵列的转谷氨酰胺酶底物肽可以具有在第五个位置的谷氨酰胺，或可以具有包含[FY][FYT]LQ、[YF]VAQ、K[YLS]K或TKL的序列基序。
在其它实施方案中，提供了用于交联肽、蛋白或化合物或它们的组合的方法。在本文描述的交联实施方案中，术语“交联”是指，在适当的反应条件下，使转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺底物肽和转谷氨酰胺酶的赖氨酸底物与转谷氨酰胺酶发生接触，由此所述转谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺残基的γ-甲酰胺基和转谷氨酰胺酶底物肽的赖氨酸残基的ε-氨基之间的异肽键的形成。在不同的实施方案中，当所述肽已经掺入蛋白或化合物中时，或当所述肽尚未掺入蛋白或化合物中时，可以发生所述交联。
在交联方法的一个实施方案中，提供了一种用于交联蛋白的方法。所述方法包括下述步骤：将至少一种异源转谷氨酰胺酶底物肽序列掺入所述蛋白中，和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白，其中所述异源转谷氨酰胺酶肽序列包含选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ(SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ IDNO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ(SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ IDNO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG(SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ IDNO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG(SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)、ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ IDNO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL(SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在另一个交联实施方案中，提供了一种用于交联蛋白的方法。所述方法包括下述步骤：将至少一种异源转谷氨酰胺酶底物肽序列掺入所述蛋白中，和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白，其中所述异源转谷氨酰胺酶肽序列包含选自以下的序列基序：SK[LS]K、[KR][ST]KL、[YF][VA]LQG和GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)或它们的组合。在该实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽可以包含选自以下的序列：ARSKL (SEQ IDNO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG(SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQID NO:71)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ IDNO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)或它们的组合。在另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽可以包含选自以下的序列：DYALQ (SEQ IDNO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、NYVLQ(SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQID NO:23)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。在另一个实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽可以包含选自以下的序列：CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG(SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ IDNO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG(SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ IDNO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。
在这些交联实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶肽序列可以包含序列DYALQ (SEQID NO: 1)或序列GGGDYALQGGG (SEQ ID NO: 26)。在另一个实施方案中，所述转谷氨酰胺酶底物肽可以具有在第五个位置的谷氨酰胺，或可以具有包含[FY][FYT]LQ、[YF]VAQ、K[YLS]K或TKL的序列基序。
如本文中使用的，关于肽的“异源”是指这样的转谷氨酰胺酶底物肽：其源自与其掺入的蛋白不同的蛋白(例如，掺入在维生素D结合蛋白中的转谷氨酰胺酶底物肽)。
在这些交联实施方案中，通过众所周知的分子克隆技术可以将SEQ ID NO: 1-93的肽掺入蛋白中，所述分子克隆技术描述在例如Sambrook等人, “Molecular Cloning: ALaboratory Manual”, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)（通过引用并入本文）中。在不同的实施方案中，所述交联可以发生在一个蛋白内部或两个不同蛋白之间(即，相同或不同类型的单独蛋白)或蛋白和肽之间(例如，掺入标记、亲和标签、用于聚乙二醇化的部分等中的肽)。在该实施方案中，“掺入”是指将包含SEQ ID NO: 1-93的肽的两端整合进蛋白内部中，或将包含SEQ ID NO: 1-93的肽的一端连接至所述蛋白的内部序列或所述蛋白或肽的N-端或C-端。在另一个实施方案中，可以掺入通过亲和标签在所述肽的任一端或两端侧接的肽。在一个方面，所述肽可以通过置换、缺失、截短、延伸进行修饰，和/或可以与其它肽分子融合或连接至其它肽分子，其中所述经修饰的肽在该方法实施方案中是有用的。在通过置换修饰的肽的一个实施方案中，所述肽中的氨基酸可以各自被19种其它天然氨基酸中的任一种或被任意合适的非天然氨基酸置换。在另一个实施方案中，本文描述的肽可以包含天然的或非天然的氨基酸。在不同的实施方案中，在这些交联实施方案中使用的肽可以与SEQ ID NO: 1-93的任意肽具有约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同源性。
在不同的示例性方面，在这些交联实施方案中使用的肽可以如下进行修饰：做出如本文中所述的保守置换，或改变所述肽的长度以包含约5至约19个氨基酸、约5至约18个氨基酸、约5至约17个氨基酸、约5至约16个氨基酸、约5至约15个氨基酸、约5至约14个氨基酸、约5至约13个氨基酸、约5至约12个氨基酸、约5至约11个氨基酸、约5至约10个氨基酸、约5至约9个、约5至约8个、约5至约7个或约5至约6个氨基酸的肽。在其它示例性方面，所述肽可以包含5-19个氨基酸、5-18个氨基酸、5-17个氨基酸、5-16个氨基酸、5-15个氨基酸、5-14个氨基酸、5-13个氨基酸、5-12个氨基酸、5-11个氨基酸、5-10个氨基酸、5-9个氨基酸、5-8个氨基酸、5-7个氨基酸或5-6个氨基酸的肽。在另一个示例性实施方案中，所述肽可以选自5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体、12-聚体、13-聚体、14-聚体、15-聚体、16-聚体、17-聚体、18-聚体或19-聚体或它们的组合。
在另一个交联实施方案中，提供了一种用于交联至少两种化合物的方法。所述方法包括下述步骤：将具有[YF][VA]LQG或GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)的序列基序的异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述至少两种化合物之一中，和通过使所述化合物与转谷氨酰胺酶接触来交联所述化合物。所述方法还可以包括以下步骤：向所述其它化合物中掺入包含SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序的异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽。在该实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽可以包含选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQ IDNO:71)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL(SEQ ID NO:73)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)或它们的组合。在该实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽可以包含选自以下的序列：DYALQ(SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQ ID NO:23)和NFVLQ (SEQ ID NO:25)或它们的组合。在该实施方案的另一个方面，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽可以包含选自以下的序列：CGGDYALQGPG (SEQID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG(SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ IDNO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG(SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG (SEQID NO: 53)或它们的组合。
在另一个实施方案中，提供了一种用于交联至少两种化合物的方法。所述方法包括下述步骤：将包含选自以下的序列的异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述至少两种化合物之一中，和通过使所述化合物与转谷氨酰胺酶接触来交联所述化合物：DYALQ(SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ IDNO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ(SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ IDNO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG(SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ IDNO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG(SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQID NO: 85)和GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)或它们的组合。
在该方法实施方案中，所述方法还可以包括将异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述至少两种化合物中的另一种中的步骤。所述赖氨酸底物肽可以包含选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ IDNO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA(SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO:82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在这些交联实施方案中，所述化合物可以选自：蛋白、肽和小有机分子(例如，标记、亲和标签等)或它们的组合。在这些实施方案中的任一个中，所述谷氨酰胺底物肽可以具有包含DYALQ (SEQ ID NO: 1)的序列。在另一个实施方案中，所述转谷氨酰胺酶底物肽可以具有在第五个位置的谷氨酰胺，或可以具有包含[FY][FYT]LQ、[YF]VAQ、K[YLS]K或TKL的序列基序。在一个实施方案中，所述化合物可以是肽和可附着于固体支持物（诸如在肽阵列中）的肽中的至少一种。
在一个实施方案中，用于用在本文任意适当实施方案中的标记可以包含荧光素、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、俄勒冈绿(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿514等)、AlexaFluor 488、AlexaFlour 647(Molecular Probes, Eugene, Oregon)、Cy3、Cy5、Cy7、生物素、钌、DyLight荧光剂（包括、但不限于DyLight 680）、CW 800、反式-环辛烯、四嗪、甲基四嗪等。
如在这些另外的示例性交联实施方案中使用的，关于肽的“异源”是指这样的转谷氨酰胺酶底物肽：其源自与其掺入的蛋白不同的蛋白(例如，掺入在维生素D结合蛋白中的转谷氨酰胺酶底物肽)。
在这些另外的交联实施方案中，通过众所周知的分子克隆技术可以将SEQ ID NO:1-93的肽或[YF][VA]LQG、GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)、SK[LS]K或[KR][ST]KL的基序的肽掺入化合物(例如，蛋白)中，所述分子克隆技术描述在例如Sambrook等人, “MolecularCloning: A Laboratory Manual”, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)（通过引用并入本文）中。在一个实施方案中，所述交联可以发生在两种不同蛋白(即，相同或不同类型的单独蛋白)之间。在该实施方案中，“掺入”是指将包含SEQ ID NO:1-93的肽的两端整合进蛋白序列内部中，或将包含SEQ ID NO: 1-93的肽的一端连接至所述蛋白的内部序列或所述蛋白的N-端或C-端。通过技术人员众所周知的连接化学，可以将本文描述的肽连接至化合物(例如，标记或亲和标签)。
在一个方面，描述的用于用在这些另外的交联实施方案中的肽可以通过置换、缺失、截短、延伸进行修饰，和/或可以与其它肽分子融合或附着于其它肽分子，其中所述经修饰的肽在该方法实施方案中是有用的。在通过置换修饰的肽的一个实施方案中，所述肽中的氨基酸可以各自被19种其它天然氨基酸中的任一种或被任意合适的非天然氨基酸置换。在另一个实施方案中，本文描述的肽可以包含天然的或非天然的氨基酸。在不同的实施方案中，用于用在该方法实施方案中的肽可以与SEQ ID NO: 1-93中的任一个具有约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同源性。
在不同的示例性方面，用于用在这些另外的交联实施方案中的肽可以如下进行修饰：做出如本文中所述的保守置换，或改变所述肽的长度以包含约5至约19个氨基酸、约5至约18个氨基酸、约5至约17个氨基酸、约5至约16个氨基酸、约5至约15个氨基酸、约5至约14个氨基酸、约5至约13个氨基酸、约5至约12个氨基酸、约5至约11个氨基酸、约5至约10个氨基酸、约5至约9个、约5至约8个、约5至约7个或约5至约6个氨基酸的肽。在其它示例性方面，所述肽可以包含5-19个氨基酸、5-18个氨基酸、5-17个氨基酸、5-16个氨基酸、5-15个氨基酸、5-14个氨基酸、5-13个氨基酸、5-12个氨基酸、5-11个氨基酸、5-10个氨基酸、5-9个氨基酸、5-8个氨基酸、5-7个氨基酸或5-6个氨基酸的肽。在另一个示例性实施方案中，所述肽可以选自5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体、12-聚体、13-聚体、14-聚体、15-聚体、16-聚体、17-聚体、18-聚体或19-聚体或它们的组合。
在另一个实施方案中，提供了一种用于在内部交联蛋白的方法。所述方法包括下述步骤：将具有[YF][VA]LQG或GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)的序列基序的异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述蛋白中，将转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述蛋白中，和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白。在该方法实施方案中，所述赖氨酸底物肽可以包含SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序。在该实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽可以包含选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ IDNO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA(SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、LSKLK (SEQID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO:82)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)或它们的组合。在该实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽可以包含选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ IDNO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、RYALQ(SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、NFVLQ (SEQID NO:25)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG(SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ IDNO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG(SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ IDNO:51)和GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 53)或它们的组合。在这些实施方案中，所述谷氨酰胺底物肽可以包含序列DYALQ (SEQ ID NO: 1)。在另一个实施方案中，所述转谷氨酰胺酶底物肽可以包含在第五个位置的谷氨酰胺，或可以具有包含[FY][FYT]LQ、[YF]VAQ、K[YLS]K或TKL的序列基序。
在另一个交联实施方案中，提供了一种用于在内部交联蛋白的方法。所述方法包括下述步骤：将异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述蛋白中，将转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述蛋白中，和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白，其中所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽包含选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ IDNO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ (SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ(SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ IDNO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG(SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ IDNO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG(SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ ID NO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)和GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)或它们的组合。在该实施方案中，所述转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽可以包含选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ IDNO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ ID NO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL(SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK (SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQ ID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ IDNO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQID NO:78)或它们的组合。
在这些示例性实施方案中，可以将两个转谷氨酰胺酶底物肽掺入相同蛋白中以形成内部交联。如在这些示例性实施方案中使用的，关于肽的“异源”是指这样的转谷氨酰胺酶底物肽：其源自与其掺入的蛋白不同的蛋白(例如，掺入在维生素D结合蛋白中的转谷氨酰胺酶底物肽)。
在该内部交联实施方案中，通过众所周知的分子克隆技术可以将SEQ ID NO: 1-93的肽或[YF][VA]LQG、GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)、SK[LS]K或[KR][ST]KL的基序的肽掺入所述蛋白中，所述分子克隆技术描述在例如Sambrook等人, “Molecular Cloning: ALaboratory Manual”, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)（通过引用并入本文）中。在该实施方案中，“掺入”是指将包含SEQ ID NO: 1-93的肽的两端整合进蛋白序列内部中，或将包含SEQ ID NO: 1-93的肽的一端连接至所述蛋白的内部序列或所述蛋白的N-端或C-端。在一个方面，描述的用于用在该方法实施方案中的肽可以通过置换、缺失、截短、延伸进行修饰，和/或可以与其它肽分子融合或连接至其它肽分子，其中所述经修饰的肽在该方法实施方案中是有用的。在通过置换修饰的肽的一个实施方案中，所述肽中的氨基酸可以各自被19种其它天然氨基酸中的任一种或被任意合适的非天然氨基酸置换。在另一个实施方案中，本文描述的肽可以包含天然的或非天然的氨基酸。在不同的实施方案中，用于用在该方法实施方案中的肽可以与SEQ ID NO: 1-93中的任一个具有约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同源性。
在不同的示例性方面，用于用在该方法实施方案中的肽可以如下进行修饰：做出如本文中所述的保守置换，或改变所述肽的长度以包含约5至约19个氨基酸、约5至约18个氨基酸、约5至约17个氨基酸、约5至约16个氨基酸、约5至约15个氨基酸、约5至约14个氨基酸、约5至约13个氨基酸、约5至约12个氨基酸、约5至约11个氨基酸、约5至约10个氨基酸、约5至约9个、约5至约8个、约5至约7个或约5至约6个氨基酸的肽。在其它示例性方面，所述肽可以包含5-19个氨基酸、5-18个氨基酸、5-17个氨基酸、5-16个氨基酸、5-15个氨基酸、5-14个氨基酸、5-13个氨基酸、5-12个氨基酸、5-11个氨基酸、5-10个氨基酸、5-9个氨基酸、5-8个氨基酸、5-7个氨基酸或5-6个氨基酸的肽。在另一个示例性实施方案中，所述肽可以选自5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体、10-聚体、11-聚体、12-聚体、13-聚体、14-聚体、15-聚体、16-聚体、17-聚体、18-聚体或19-聚体或它们的组合。
在一个方面，对于上述交联实施方案中的任一个，交联的蛋白、肽或化合物可以是例如靶向配体或药物，其中使用所述方法将靶向配体缀合至药物。在其它实施方案中，可以使用所述交联方法将蛋白、肽或化合物缀合至亲和标签，将蛋白、肽或化合物缀合至标记，将蛋白、肽或化合物聚乙二醇化，或将蛋白、肽或化合物生物素化或钌化，等。在另一个实施方案中，诊断性蛋白（诸如抗体和抗体结合蛋白）可以是交联的。在另一个方面，诊断性蛋白或治疗性蛋白可以是交联的，或研究用蛋白可以是交联的，诸如用于至少两种蛋白的位点特异性缀合。
在本文描述的任意交联实施方案中，所述蛋白或化合物可以是例如维生素D结合蛋白(VitDBP)。在一个实施方案中，与VitDBP连接的化合物可以是任何适当的标记，诸如Cy5、钌或生物素。在一个实施方案中，所述交联可以通过掺入在VitDBP中的异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽发生，其中所述肽包含序列GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)。在另一个实施方案中，异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽可以掺入在所述标记中，且可以包含序列RSKLG (SEQ ID NO:58)。
在一个方面，用于用在本文描述的任意交联实施方案中的具有掺入的异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽的标记可以是任意下式的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
，
Figure 725642DEST_PATH_IMAGE014
，
Figure DEST_PATH_IMAGE015
，
Figure 518017DEST_PATH_IMAGE016
，
Figure DEST_PATH_IMAGE017
，
Figure 921317DEST_PATH_IMAGE018
。
但是，应当理解，任意合适的标记可以与根据本发明的转谷氨酰胺酶底物组合。合适的标记的例子包括荧光标记、化学发光标记、放射性标记、化学标记(例如，掺入“点击”化学)等，和它们的组合。更一般而言，合适的标记与转谷氨酰胺酶的至少一种底物(例如，赖氨酸供体底物、谷氨酰胺供体底物等)相容，因为所述标记不会消除所述转谷氨酰胺酶的作用于包括所述标记的底物的能力。此外，合适的标记可以产生相对于未标记的转谷氨酰胺酶底物可检测的信号。
在另一个示例性实施方案中，描述了包含异源转谷氨酰胺酶底物肽序列的VitDBP。在一个实施方案中，所述VitDBP可以包含含有选自以下的序列基序的转谷氨酰胺酶底物肽：[YF][VA]LQG、GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)、SK[LS]K和[KR][ST]KL或它们的组合。在一个实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽可以包含选自以下的序列：ARSKL (SEQ ID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ IDNO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL(SEQ ID NO:63)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、KLGAK (SEQID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)和GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO:80)或它们的组合。在一个实施方案中，所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽可以包含选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ ID NO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQ ID NO:7)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQ ID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、NFVLQ (SEQ ID NO:25)、CGGDYALQGPG(SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQ ID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ IDNO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG(SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ IDNO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)和GNGDYALQGPG(SEQ ID NO: 53)或它们的组合。在一个方面，所述转谷氨酰胺酶底物肽包含序列DYALQ(SEQ ID NO: 1)。在另一个实施方案中，所述转谷氨酰胺酶底物肽可以包含在第五个位置的谷氨酰胺，或可以具有包含[FY][FYT]LQ、[YF]VAQ、K[YLS]K或TKL的序列基序。
在另一个实施方案中，描述了包含异源转谷氨酰胺酶底物肽的VitDBP，其中所述肽包含选自以下的序列：DYALQ (SEQ ID NO:1)、DYVLQ (SEQ ID NO:2)、NYALQ (SEQ IDNO:3)、EYALQ (SEQ ID NO:4)、PYALQ (SEQ ID NO:5)、EYVLQ (SEQ ID NO:6)、DFALQ (SEQID NO:7)、DYFLQ (SEQ ID NO:8)、NYFLQ (SEQ ID NO:9)、FYALQ (SEQ ID NO:10)、DYTLQ(SEQ ID NO:11)、NYVLQ (SEQ ID NO:12)、EYVAQ (SEQ ID NO:13)、RYALQ (SEQ ID NO:14)、YFALQ (SEQ ID NO:15)、PYVLQ (SEQ ID NO:16)、WYALQ (SEQ ID NO:17)、SYALQ (SEQID NO:18)、HYALQ (SEQ ID NO:19)、DYVAQ (SEQ ID NO:20)、EFVAQ (SEQ ID NO:21)、DFYLQ (SEQ ID NO:22)、EFALQ (SEQ ID NO:23)、EYFLQ (SEQ ID NO:24)、NFVLQ (SEQ IDNO:25)、GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:26)、CGGDYALQGPG (SEQ ID NO:27)、WGGDYALQGPG (SEQID NO:28)、YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:29)、DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:30)、GDGDYALQGPG(SEQ ID NO:31)、NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:32)、GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:33)、EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:34)、PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:35)、TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:36)、QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:37)、IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:38)、FGGDYALQGPG (SEQ IDNO:39)、HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:40)、LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:41)、VGGDYALQGPG (SEQID NO:42)、RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:43)、GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:44)、MGGDYALQGPG(SEQ ID NO:45)、SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:46)、AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:47)、GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:48)、GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:49)、GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:50)、GHGDYALQGPG (SEQ ID NO:51)、WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:52)、GNGDYALQGPG (SEQ IDNO:53)、GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)、GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)、ARSKL (SEQID NO:54)、KSKLA (SEQ ID NO:55)、TKSKL (SEQ ID NO:56)、KLSKL (SEQ ID NO:57)、RSKLG (SEQ ID NO:58)、RGSKL (SEQ ID NO:59)、RGTKL (SEQ ID NO:60)、FPKLK (SEQ IDNO:61)、RSKSK (SEQ ID NO:62)、SKSKL (SEQ ID NO:63)、FTKSK (SEQ ID NO:64)、KLKYK(SEQ ID NO:65)、PKTKL (SEQ ID NO:66)、RLKSK (SEQ ID NO:67)、RSKLA (SEQ ID NO:68)、GRSKL (SEQ ID NO:69)、RAKYK (SEQ ID NO:70)、SKLSK (SEQ ID NO:71)、KLGAK (SEQID NO:72)、QRSKL (SEQ ID NO:73)、KTKYK (SEQ ID NO:74)、LSKLK (SEQ ID NO:75)、NRTKL (SEQ ID NO:76)、QRTKL (SEQ ID NO:77)、GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)、GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 80)和GYKLK (SEQ ID NO:78)或它们的组合。
在一个实施方案中，所述VitDBP包含序列DYALQ (SEQ ID NO: 1)或序列GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)。在另一个实施方案中，所述VitDBP可以包含含有在第五个位置的谷氨酰胺的转谷氨酰胺酶底物肽，或所述肽可以具有包含[FY][FYT]LQ、[YF]VAQ、K[YLS]K或TKL的序列基序。
在另一个实施方案中，描述了具有以下序列的VitDBP：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
Figure 836052DEST_PATH_IMAGE020
。
值得注意的是，在体内从VitDBP除去N-端序列MKRVLVLLLAVAFGHA。因此，在其它实施方案中，描述了具有以下序列的VitDBP：
Figure DEST_PATH_IMAGE021
Figure 980594DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE023
。
在另一个实施方案中，本文描述的方法、肽阵列、肽和蛋白包括下述实施例。所述实施例进一步举例说明了本文描述的发明的不同实施方案的另外特征。但是，应当理解，所述实施例是示例性的，不应解释为限制本文描述的发明的其它实施方案。另外，应当理解，在本文描述的发明的不同实施方案中包括所述实施例的其它变体。
III. 实施例
实施例1：测定开发
为了测试MTG (Zedira GmbH)对Gln-底物的特异性，使用N-(生物素基)尸胺(Zedira GmbH)作为Lys-底物的替代物以将使用无掩模的光指导的肽阵列合成来合成的肽阵列上的Gln-肽生物素化。类似地，为了测试MTG对Lys-底物的特异性，使用Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Zedira GmbH)作为Gln-底物的替代物以将Lys-肽生物素化。Z-Gln-Gly-CAD-生物素是具有下式的转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺供体底物：
Figure 389710DEST_PATH_IMAGE024
。
在有生物素化的底物之一存在下用MTG处理以后，将阵列洗涤，用Cy5-抗生蛋白链菌素染色以标记生物素部分，并在635 nm扫描以测量在该肽区域处的信号强度。使用与MTG反应效率对应的信号强度来确定不同肽序列的特异性。
实施例2：测定条件
一般而言，在优化最初在溶液条件下开发的酶测定的阵列性能时要考虑两个问题。第一个问题是低信号产生的挑战，其可能由以下原因造成：所述酶不能识别结合至表面的肽，低肽浓度，肽合成量不足，或对酶稳定性和反应性的表面效应。第二个问题是高背景产生的挑战，其可能是酶和/或底物与阵列表面的非特异性结合或由阵列上的副反应驱动的非特异性标记的结果。
为了找到在阵列上的MTG测定的条件，分析了反应的不同参数对信号和背景产生的影响。这些因素包括MTG和底物浓度、反应缓冲液组成、和温育时间和温度。为了使背景最小化，使用了非蛋白封闭溶液(Pierce)，并发现它在反应缓冲液中的最佳浓度是50%。本文描述了用于研究MTG对Lys-肽和Gln-肽的肽阵列的特异性的条件。
在阵列上的Lys-肽的标记：0.1 ng/ μL MTG (Zedira GmbH)；10 μM Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Zedira GmbH)；100 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM二硫苏糖醇(DTT), 50%无蛋白阻滞剂(Pierce)；20 min在37℃。
在阵列上的Gln-肽的标记：0.5 ng/ μL MTG (Zedira GmbH)；50 μM N-(生物素基)尸胺(Zedira GmbH)；100 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM DTT, 50%无蛋白阻滞剂(Pierce)；1 h在37℃。
实施例3：MTG对Gln-肽的特异性
在实施例2所述的条件下，在有MTG和生物素化的胺供体N-(生物素基)尸胺底物存在下，温育5-聚体肽阵列。绘制信号分布和两个重复之间的关联(图1)。
参考图1，重复之间的信号强度的关联表现出数据的高再现性，并且允许鉴别具有最高标记效率的肽。在该研究中发现的在使用生物素化的胺-供体底物的阵列MTG测定中具有最高标记效率的25种肽的序列和对应信号强度显示在表2中。与MTG特异性一致地，所有肽含有Gln (Q)残基。Gln排它地占据所有选择的序列的第五个位置。因为在阵列上合成的5-聚体肽侧接G:S接头（为其使用Gly和Ser氨基酸前体的3:1混合物），所以在最佳MTG底物中Gln之后可以是Gly。
表2:
Figure DEST_PATH_IMAGE025
实施例4：基序鉴别
为了发现共同基序，用Peplib软件分析通过阵列MTG测定鉴别出的最佳序列，所述Peplib软件使用基本组分分析来发现短肽序列共享的基序(Andrew D. White等人, J. Chem. Inf. Model., 2013, 53 (2)，第493-499页)。回到图2A-2H，MTG的最佳Gln-肽底物的分析鉴别出两个密切相关的基序，它们可以组合在共同基序[YF][VA]LQG中，假定Gln之后是Gly。也就是说，(5-聚体基序的)位置1选自氨基酸Y和F，位置2选自氨基酸V和A，位置3是氨基酸L，位置4是氨基酸Q，且位置5 (未显示在图2A-2H中)是氨基酸G。令人感兴趣的是，商购可得的Gln-供体底物Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Zedira GmbH)是在阵列MTG测定中发现的基序的短双氨基酸形式。
实施例5：用5-聚体肽阵列选择的Gln-基序的延伸和成熟
选择通过阵列MTG测定发现的最佳DYALQ (SEQ ID NO: 1)序列用于基序进化的第二步，其包括基序延伸和成熟。使5-聚体基序从N-和C-端延伸三个Gly残基以建立11-聚体GGGDYALQGGG (SEQ ID NO: 26)序列。使用无掩模的光指导的肽阵列合成在新设计的阵列上合成该肽和所有它的可能的单和双氨基酸置换变体，并针对MTG活性进行测试。对于新阵列，使用了所有20种氨基酸，包括Cys。具有最高标记效率的27个序列的列表显示在表3中。延伸和成熟步骤证实了在第一步中选择的5-聚体肽的特异性，并且将DYALQ (SEQ ID NO:1) 5-聚体基序延伸至潜在更有效的GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79) 9-聚体基序。
表3:
Figure 506571DEST_PATH_IMAGE026
实施例6：在溶液反应中证实阵列选择的基序
接下来确定在阵列测定中选择的肽是否在溶液反应中也是优选的底物。对比了在阵列测定中发现的GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 26)肽和常用于测试MTG活性的QG肽底物的性能。两种底物的对比包括针对MTG活性的连续酶偶联测定，其由来自渥太华大学（University of Ottawa）的S.K. Oteng-Pabi和J.W. Keillor开发(图3)。
在有10 mMα-酮戊二酸盐、10 mM作为酰基受体的甘氨酸甲酯、2 U的谷氨酸脱氢酶(GLDH)、500µM NADH (即，还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和在200 mM MOPS (即，3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)中的0.2-20 mM范围内的含有Gln的底物肽浓度、1 mM EDTA pH 7.2 (总体积/孔200µl)存在下在96-孔微孔滴定板中进行测定。通过加入0.1 U的MTG (Zedira GmbH)开始反应，并使用Biotek Synergy H4微量培养板读数器（在37℃恒温）在340 nm相对于空白连续记录NADH的氧化20 min，在每次测量之前有短摇动期间。短迟延期（其中GLDH被MTG介导的氨释放饱和）以后，观察到吸光度相对于时间的线性比率，其对应于MTG周转，并进行Michaelis-Menten动力学分析。
如在图3和表4中所示的结果提示，阵列选择的底物与标准QG-底物相比具有改善的性能，从而表现出至少3倍的MTG催化效率差异。
表4:
Figure DEST_PATH_IMAGE027
应当指出，图3和表4中的每个肽序列的‘Z-’代表具有下式的羧基苄基保护基：
Figure 920103DEST_PATH_IMAGE028
其中R是对应的肽序列(例如，QG或GGGDYALQGGGG)。
实施例7：在溶液反应中证实另一个阵列选择的基序
在与含有Gln的底物类似的溶液中测定Lys-标签肽：在有1.25 mMα-酮戊二酸盐、100µM Z-GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 86)作为胺受体的肽、0.2 U的谷氨酸脱氢酶(GLDH)、500µM NADH和在200 mM MOPS中的0-500µM范围内的含有Lys的底物肽浓度、1 mM EDTA pH7.2 (总体积/孔200µl)存在下在96-孔微孔滴定板中进行所述测定。通过加入0.1 U的MTG(Zedira GmbH)开始反应，并使用Biotek Synergy H4微量培养板读数器（在37℃恒温）在340 nm相对于空白连续记录NADH的氧化20 min，在每次测量之前有短摇动期间。短迟延期（其中GLDH被MTG介导的氨释放饱和）以后，观察到吸光度相对于时间的线性比率，其对应于MTG周转，并进行Michaelis-Menten动力学分析。
如在图4和表5中所示的结果证实，阵列选择的高信号底物GGGARSKLGGGG (SEQ IDNO: 80)与低信号底物相比具有改善的性能。GGGDEKPDGGGG (SEQ ID NO: 81)肽的动力学数据由于极低的活性不可确定(在表5中指示为“n. d.”)，但是观察到至少10倍的MTG催化效率的明显差异。表5中的每个肽序列的‘Z-’代表上面参考图3和表4描述的羧基苄基保护基。
表5:
Figure DEST_PATH_IMAGE029
实施例8：MTG对Lys-肽的特异性
为了研究MTG对Lys-底物的特异性，在实施例2所述的条件下，在有MTG和生物素化的Gln供体Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Zedira GmbH)底物存在下，温育5-聚体肽阵列。信号分布和两个重复之间的关联显示在图5中。
来自图5的右上处的圆圈区域的25个最佳序列(即，“高信号肽”)显示在表6中。所有肽含有至少一个Lys (K)残基，且大多数（64%）具有两个Lys残基。优选的Lys-肽序列的Peplib分析揭示了两个密切相关的基序SK[LS]K和[KR][ST]KL。
表6:
Figure 833833DEST_PATH_IMAGE030
实施例9：发现的基序的进化
为了进化发现的基序，选择具有单个Lys的最佳序列之一RSKLA (SEQ ID NO:68)，并用Gly残基延伸以得到GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)序列，并设计新阵列，其包括该肽和它的序列的所有可能的单和双氨基酸置换变体。在有生物素化的Gln-底物存在下用MTG活性测定测试了肽阵列。为了证实MTG对GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 82)序列的特异性，为基序序列的所有单氨基酸置换绘制MTG活性信号强度(图6)。发现在位置6处的反应性Lys是高度保守的，并且不可被任意其它氨基酸替换。在RSKLA (SEQ ID NO: 68)基序的5个氨基酸中，除了在位置8处的可以被Gly替换的Ala以外，4个残基表现出在对应位置处的最高特异性。总之，发现MTG接受宽范围的Lys底物，除了可能在反应性Lys的背景下具有Asp (D)或Glu (E)酸性氨基酸的那些以外。
实施例10：使用阵列选择的基序对VitDBP的位点特异性标记
制备了用于重组表达VitDBP的构建体，所述VitDBP与具有序列HHHHHHHH (SEQ IDNO: 84)的八组氨酸标签(His8标签)融合或者与His8标签和具有序列GGGGDYALQGGGG (SEQID NO. 85)的谷氨酰胺供体标签(Q2标签)二者融合。将重组地生产的具有C-端融合的His8标签和Q2标签的VitDBP (wt-VitDBP-His8-Q2)和具有C-端融合的His8标签、但是没有C-端融合的Q2标签的VitDBP (wt-VitDBP-His8)与化学合成的Lys-肽-Cy5荧光标记(图7)一起和与MTG一起温育。wt-VitDBP-His8-Q2和wt-VitDBP-His8的C-端氨基酸序列和分子量分别是HHHHHHHHGGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 83)，53618.8 Da和HHHHHHHH (SEQ ID NO: 84)，52571.7 Da。标记的分子的N-端序列是Z-RSKLG (SEQ ID NO: 58)，其中‘Z代表羧基苄基保护基。标记的总分子量是5724.9 Da。对于标记反应，分别以6.48µl或5.81µl的总体积将10µg (0.19 nmol) wt-VitDBP-His8-Q2或wt-VitDBP-His8与10.9µg (1.9 nmol)标记和0.004U的MTG (Zedira GmbH)混合。在50 mM HEPES (即，4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、150mM NaCl（pH 7.5）中在37℃进行反应15 min，并通过使混合物穿过用Ni-NTA Superflow(Qiagen)填充的柱停止。将所述柱用5柱体积的50 mM HEPES、150 mM NaCl（pH 7.5）洗涤，并用500 mM咪唑洗脱His-标记的蛋白。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析洗脱液的等分试样，如在图8A和8B中所示。通过在考马斯蓝(图8A)染色的凝胶上的分子量迁移和通过Cy5荧光(图8B)鉴别被标记的蛋白，所述Cy5荧光在配备Cy5 LED和滤片设置(BioRad)的ChemiDoc CCD成像仪上分析。
wt-VitDBP-His8-Q2的序列如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE031
Figure 968011DEST_PATH_IMAGE032
。
实施例11：使用阵列选择的基序对VitDBP的位点特异性的生物素和BP钌标记
将重组地生产的wt-VitDBP-His8-Q2和wt-VitDBP-His8与化学合成的Lys-肽-生物素或Lys-肽-BP钌标记(图9)一起和与MTG一起温育。wt-VDitBP-His8-Q2和wt-VitDBP-His8的C-端氨基酸序列和分子量分别为HHHHHHHHGGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 83)(53618.8 Da)和HHHHHHHH (SEQ ID NO: 84) (52571.7 Da)。标记分子的N-端序列是Z-RSKLG (SEQ ID NO: 58)，且生物素和BP钌标记的总分子量分别是1267.4 Da和5623.7 Da。对于生物素标记反应，分别在13.3µl或11.8µl的总体积将0.4 nmol的wt-VitDBP-His8-Q2或wt-VitDBP-His8与4 nmol的标记和0.008 U的MTG (Zedira GmbH)混合。在37℃在200 mMMOPS、1 mM EDTA（pH 7.2）中进行反应。温育15、30和60 min以后，取3µl等分试样，并使用在SuperBlock TBS (Pierce)中1:2000稀释的抗生蛋白链菌素-HRP缀合物(NEB)通过SDS-PAGE和蛋白质印迹(iBlot, Life Technologies)进行分析。通过被Ponceu S染色的膜上的分子量迁移，和通过在CCD成像仪(LAS-3000, Fujifilm)上分析的经抗生蛋白链菌素-HRP对生物素标记的化学发光检测，鉴别标记的蛋白。
对于BP钌标记反应，分别以48.5µl或41.3µl的总体积将2 nmol的wt-VitDBP-His8-Q2或wt-VitDBP-His8与20 nmol的标记和0.04 U的MTG (Zedira GmbH)混合。在200mM MOPS、1 mM EDTA（pH 7.2）中在37℃进行反应15 min。通过使用具有10 K MWCO的离心过滤器(Amicon Ultra, EMD Millipore)在缓冲液中透析，除去多余的标记。通过SDS-PAGE分析等分试样。通过在考马斯蓝(图10A)染色的凝胶上的分子量迁移和通过BP钌荧光(图10B)鉴别被标记的蛋白，所述BP钌荧光在配备Blue LED和605 nm发射滤片(ChemiDoc, BioRad)的CCD成像仪上分析。
实施例12：阵列选择的基序向VitDBP的添加不会干扰与天然配体的结合
进行实验来确定阵列选择的基序的添加是否干扰VitDBP的结合它的天然配体25-羟基化的维生素D2 (25-OH-VitD2)的能力。为使用选择的谷氨酰胺供体基序是GGGGDYALQGGGG (即，SEQ ID NO 86)。将BIACORE SA传感器固定在BIACORE 3000仪器中。使所述仪器在25℃回火（temper）。按照生产商(GE Healthcare)的推荐预调节传感器。系统缓冲液是含有5%DMSO和0.05%TWEEN20的PBS（pH 8.2）。样品缓冲液是补充了1mg/ml CMD(Sigma)的系统缓冲液。从300 nM生物素标记的25-OH-VitD2 (25-OH-VitD2-bi)样品溶液中，通过在10µl/分钟的2 min注射将860 RU捕获在传感器流动池2上。最后将传感器表面用5µM氨基-PEO-生物素(Pierce)饱和。作为参照，以10µl/分钟的速率将1µM氨基-PEO-生物素注射进流动池1中保持1 min。
针对它们与25-OH-VitD2的结合行为，对比分析物wt-VitDBP-His8和wt-VitDBP-His8-Q2。随后通过描述的MTG催化的反应将Gln-基序钌化(图10A和10B)。
以600 nM、200 nM、67 nM、22 nM、7.4 nM和0 nM (仅缓冲液)的浓度系列注射分析物。监测分析物结合3 min，并在20µl/分钟解离5 min (图11和12)。
每次注射以后，如下使系统再生：在20µl/分钟注射100 mM HCl 1分钟15秒，随后注射10 mM甘氨酸缓冲液（pH 1.5）2 min。在BIACORE传感图中叠加数据，并通过使用Bia评价软件4.1版使Langmuir 1:1结合模型拟合至按照生产商推荐得到的数据来计算动力学数据。
实施例12的测定的一个目标是，研究阵列选择的Gln-基序的添加是否会干扰VitDBP的与它的天然配体(例如，25-OH-VitD)相互作用的能力。对于wt-VDBP-His8：ka =1.38 x 104 M-1 s-1，kd = 1.31 x 10-3 s-1，KD = 9.5 x 10-8 M (图11)。对于wt-VDBP-His8-Q2：ka = 1.55 x 104 M-1 s-1，kd = 1.44 x 10-3 s-1，KD = 9.3*10-8 M (图12)。因此，由于动力学曲线是相同的，确定Gln-基序在该测定中不会影响VitDBP动力学。
wt-VDBP-His8-Q2表达质粒的构建：
使用下述引物从wtVDBP-His8 pM1MT质粒PCR扩增wt-VDBP-His8-Q2基因[wtVDBP(Gc1F)-GGGS-(His)8-GGGGDYALQGGGG]：
F1引物：
Figure DEST_PATH_IMAGE033
R1引物：
Figure 532853DEST_PATH_IMAGE034
R帮助引物：
Figure DEST_PATH_IMAGE035
。
PCR条件显示在表7中。将PCR产物使用SalI-HF/BamHI-HF消化并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将新基因(wt-VDBP-His8-Q2)再次插入pM1MT表达载体中。
Figure 602440DEST_PATH_IMAGE036
在HEK293细胞中的表达：
如下执行转染方案。在FreeStyle 293表达培养基(Gibco)中使用2 x 106个细胞/ml。使用Novagen转染试剂。将10µg质粒DNA加入20 ml细胞培养物中。在转染后3小时加入4mM丙戊酸。在7天表达时间中加入补料7 (L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、L-天冬酰胺、大豆蛋白胨)。
使用NiNTA重力流动柱的纯化：
将NiNTA金属亲和树脂(Qiagen)用上清液温育过夜。将树脂用缓冲液A (50 mMHEPES、110 mM NaCl; pH 7.5)洗涤几次。将蛋白用缓冲液B (50mM HEPES、360 mM NaCl、250 mM咪唑; pH7.5)洗脱。通过以消光系数0.573在280 nm的UV-分光光度法确定蛋白浓度。
实施例13：微阵列和它们的用途
多种用于生产微阵列的方法是在现有技术中已知的。例如，用预制造的肽涂斑或通过用试剂涂斑（例如，在膜上）原位合成，举例说明了已知的方法。用于产生较高密度的肽阵列的其它已知方法是所谓的光刻技术，其中由合适的光不稳定的保护基(PLPG)控制期望的生物聚合物的合成设计，所述保护基在暴露于电磁辐射（诸如光）以后释放各自下一个组分(例如，氨基酸)的连接位点(Fodor等人, (1993) Nature 364:555-556; Fodor等人,(1991) Science 251:767-773)。两种不同的光刻技术是在现有技术中已知的。第一种是光刻掩模，其用于将光引导至合成表面的特定区域，从而实现PLPG的定位去保护。“掩模”方法包括利用支架(例如，“掩模”)合成聚合物，所述支架啮合底物并提供在所述底物和所述支架之间的反应器空间。这样的“掩模”阵列合成的示例性实施方案描述在，例如，美国专利号5,143,854和5,445,934中，它们的公开内容特此通过引用并入。第二种光刻技术是无掩模的光刻技术，其中通过数字投影技术（诸如微镜装置）将光引导至合成表面的特定区域，从而实现PLPG的定位去保护(Singh-Gasson等人, Nature Biotechn. 17 (1999) 974-978)。应当理解，本文中公开的方法的实施方案可以包含或利用上述各种阵列合成技术中的任一种。
PLPG (光不稳定的保护基)的应用是本领域众所周知的，所述PLPG提供基于光刻技术的肽微阵列合成的基础。基于光刻技术的生物聚合物合成的常用PLPG是例如α-甲基-6-硝基胡椒基-氧基羰基(MeNPOC) (Pease等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994)91:5022-5026), 2-(2-硝基苯基)-丙氧基羰基(NPPOC) (Hasan等人(1997) Tetrahedron 53: 4247-4264), 硝基藜芦基氧基羰基(NVOC) (Fodor等人(1991) Science 251:767-773)和2-硝基苄氧基羰基(NBOC) (Patchornik等人(1970) 21:6333-6335)。
已经将氨基酸引入肽微阵列的光刻固相肽合成中，它们用NPPOC作为光不稳定的氨基保护基进行保护，其中使用载玻片作为支持物(美国专利公开号2005/0101763 A1)。使用NPPOC保护的氨基酸的方法具有以下缺点：在某些条件下，用光辐照后所有(除了一个)被保护的氨基酸的半衰期是在大约2-3分钟的范围内。相反，在相同条件下，NPPOC-保护的酪氨酸表现出接近10分钟的半衰期。由于整个合成方法的速度取决于最慢的亚过程，该现象会使合成方法的时间增加3-4倍。伴随地，产光残基离子对增长中的寡聚体的损伤程度随着递增的和过度的光剂量需求而增加。
单个微阵列，或在某些情况下，多个微阵列(例如，3、4、5个或更多个微阵列)可以位于一个固体支持物上。微阵列的大小取决于一个固体支持物上的微阵列的数目。每个固体支持物的微阵列数目越高，在所述固体支持物上必须安装的阵列越小。可以以任意形状设计阵列，但是优选地将它们设计为正方形或矩形。
术语部件表示在微阵列的表面上的确定区域。所述部件包含生物分子，诸如肽等。与其它部件相比，一个部件可以含有具有不同性能（诸如不同序列或取向）的生物分子。部件的大小取决于两个因素：i)阵列上的部件的数目，阵列上的部件的数目越高，每个单个部件越小，ii)可单个寻址的铝镜元件的数目，所述铝镜元件用于辐照一个部件。用于辐照一个部件的镜元件的数目越高，每个单个部件越大。在阵列上的部件的数目可能受限于存在于微镜装置中的镜元件(像素)的数目。例如，来自Texas Instruments, Inc.的现有技术微镜装置目前含有420万个镜元件(像素)，因而在这样的示例性微阵列内的部件的数目因此受该数目限制。但是，应当理解，来自Texas Instruments, Inc.的微镜装置仅仅为了示例性目的而提供，且更高密度阵列是可能的。
应当理解，术语固体支持物表示任何固体材料，其具有有机分子可以通过键形成而连接或通过电子或静电相互作用（诸如共价键）或复合物形成（通过特定官能团）而吸附的表面积。所述支持物可以是材料的组合，诸如在玻璃上的塑料、在玻璃上的碳等。功能表面可以是简单的有机分子，但是还可以包含共聚物、树枝状聚合物、分子刷等。塑料可以用作支持物，且优选地所述塑料是具有确定光学特性的聚烯烃，如TOPAS®或ZEONOR/EX®。
本文中使用的术语“官能团”表示众多形成化学分子的组成部分的原子组合中的任一种，其本身经历特征性反应，且其影响所述分子的剩余部分的反应性。典型的官能团包括、但不限于羟基、羧基、醛、羰基、氨基、叠氮化物、炔基、巯基和腈（nitril）。潜在反应性官能团包括，例如，胺、羧酸、醇、双键等。优选的官能团是氨基酸的潜在反应性官能团诸如氨基或羧基。
如本领域技术人员理解的，肽微阵列包含这样的测定原理：其中将数千(或数百万)种肽(在某些实施方案中，以多个拷贝存在)连接或固定化至固体支持物(在某些实施方案中，其包含玻璃、碳复合材料和/或塑料芯片或载玻片)的表面。根据本发明的实施方案，可以将肽微阵列与酶一起温育。在某些实施方案中，在与目标样品(例如酶)一起温育以后，所述肽微阵列经历一个或多个洗涤步骤，然后暴露于检测系统，例如，利用荧光、化学发光、比色测量方法或放射自显影术。
在结合事件的情况下，在扫描微阵列载玻片以后，扫描仪可以以标签图像文件格式(*.tif)记录20-位、16-位或8-位数字图像。所述.tif-图像使得能够解释和量化从扫描的微阵列载玻片得到的数据。该量化数据可以是执行关于测量的结合事件的统计分析或关于微阵列载玻片的肽修饰的基础。为了评价和解释检测到的信号，必须执行肽斑点(在图像中可见)和对应的肽序列的分配。用于分配的数据经常以GenePix阵列列表(GenePix ArrayList，.gal)文件保存，且与所述肽微阵列一起提供。所述.gal-文件(tab分隔的文本文件)可以使用微阵列定量软件-模块打开或用文字编辑器(例如记事本)或Microsoft Excel处理。该‘gal’文件最经常由微阵列生产商提供，且由输入txt文件和跟踪软件（其嵌入进行微阵列制造的机器人中）产生。
肽微阵列是平面载玻片，其具有点在它上面的肽或通过原位合成直接在表面上组装的肽。肽理想地通过化学选择性键共价地连接，从而产生就相互作用特性而言具有相同取向的肽。替代程序包括非特异性的共价结合和粘附固定化。
鉴别核心命中（core hit）肽序列以后，可以进行“肽成熟”的过程，其中在核心命中肽的每个位置处以不同的方式(通过氨基酸置换、缺失和插入)改变核心命中肽序列，以便进一步优化/验证适当的核心命中序列。例如，根据一些实施方案(例如，在核心命中肽序列包含给定数目（诸如5个）氨基酸的情况下)，产生成熟阵列。所述成熟阵列(第二个肽阵列)可以具有，例如，与其固定化的核心命中肽群体，其中核心命中肽的每个氨基酸已经经历在每个位置处的氨基酸置换。
一种实例/假定核心命中肽被描述为由具有氨基酸序列-M1M2M3M4M5-的5-聚体肽组成。命中成熟可能涉及在位置1、2、3、4和5处的氨基酸置换、缺失和插入中的任一种，或者它们中的任意或全部的组合。例如，关于假定的核心命中肽-M1M2M3M4M5-，实施方案可以包括在位置1处的氨基酸M被其它19种氨基酸中的每一种置换(例如，A1M2M3M4M5-、P1M2M3M4M5-、V1M2M3M4M5-、Q1M2M3M4M5-等)。每个位置(2、3、4和5)也具有被其它19种氨基酸中的每一种置换的氨基酸M(例如，位置2置换是类似的，M1A2M3M4M5-、M1Q2M3M4M5-、M1P2M3M4M5-、M1N2M3M4M5-等)。应当理解，建立一种肽(固定化在阵列上)，其包含核心命中肽的置换的和/或缺失的和/或插入的序列。
在根据本发明的命中成熟的某些实施方案中，可以执行双氨基酸置换。双氨基酸置换包括改变给定位置处的氨基酸(例如，M→P置换，例如在位置1处)，并然后用其它19种氨基酸中的每一种置换在位置2处的氨基酸。重复该过程，直到组合了位置1和2的所有可能的组合。作为例子，回去参考具有氨基酸序列-M1M2M3M4M5-的5-聚体肽的假定核心命中肽，关于位置1和2的双氨基酸置换可以包括，例如，在位置1处的M→P置换，然后在位置2处的所有20种氨基酸的置换(例如，-P1A2M3M4M5-、- P 1F2M3M4M5-、-P1V2M3M4M5-、- P 1E2M3M4M5-等)，在位置1处的M→V置换，然后在位置2处的所有20种氨基酸的置换(例如，- V 1A2M3M4M5-、- V 1F2M3M4M5-、-P1V2M3M4M5-、- V 1E2M3M4M5-等)，在位置1处的M→A置换，然后在位置2处的所有20种氨基酸的置换(例如，- A 1A2M3M4M5-、- A 1F2M3M4M5-、- A 1V2M3M4M5-、- A 1E2M3M4M5-等)。
在命中成熟的某些实施方案中，可以执行核心命中肽的每个氨基酸位置的氨基酸缺失。氨基酸缺失包括制备包括核心命中肽序列的肽，但是从所述核心命中肽序列删除单个氨基酸(从而建立肽，其中在每个肽处的氨基酸被删除)。作为例子，回去参考具有氨基酸序列-M1M2M3M4M5-的5-聚体肽的假定核心命中肽，氨基酸缺失包括制备一系列具有下述序列-M2M3M4M5-、-M1M3M4M5-、-M1M2M4M5-、-M1M2M3M5-和-M1M2M3M4-的肽。应当指出，在假定5-聚体的氨基酸缺失以后，建立5种新的4-聚体。根据一些实施方案，可以针对产生的每种新4-聚体执行氨基酸置换或双氨基酸置换扫描。
类似于上面讨论的氨基酸缺失扫描，命中成熟的一些实施方案可以包括氨基酸插入扫描，其中将20种氨基酸中的每一种插入在核心命中肽的每个位置之前和之后。作为例子，回去参考具有氨基酸序列-M1M2M3M4M5-的5-聚体肽的假定核心命中肽，氨基酸插入扫描可以包括下述序列-XM1M2M3M4M5-、-M1XM2M3M4M5-、-M1M2XM3M4M5-、-M1M2M3XM4M5-、-M1M2M3M4XM5-和-M1M2M3M4M5X- (其中X代表单个氨基，其选自20种已知的氨基酸或所述氨基酸的具体确定子集，其中将针对20种氨基酸中的每一种或氨基酸的确定子集建立肽重复)。
还应当理解，上述的氨基酸置换的肽、双氨基酸置换的肽、氨基酸缺失扫描肽和氨基酸插入扫描肽还可以包括N-端和C-端摇摆氨基酸序列中的一种或两种。与N-端和C-端摇摆氨基酸序列一样，N-端和C-端摇摆氨基酸序列可以包含少至1个氨基酸或多至15或20个氨基酸，且N-端摇摆氨基酸序列可以具有与C-端摇摆氨基酸序列相同、更长或更短的长度。此外，N-端和C-端摇摆氨基酸序列可以包含任意给定比率的氨基酸的任意限定集合(例如，3:1比率的甘氨酸和丝氨酸)。
一旦制备核心命中肽的不同置换、缺失和插入变体(例如，以固定化方式，在固体支持物诸如微阵列上)，就分析纯化的浓缩酶(例如，转谷氨酰胺酶)的预定特性，例如，在适当的反应或结合条件下。
在核心命中肽的成熟后(使得鉴别出核心命中肽的更佳氨基酸序列用于结合转谷氨酰胺酶，例如)，所述N-端和/或C-端位置可以经历延伸步骤，由此进一步延长成熟的核心命中肽的长度，用于增加转谷氨酰胺酶的特异性和亲和力。
根据本发明的N-端延伸的不同实施方案，一旦通过成熟过程鉴别出成熟的核心命中肽序列，可以将任何特定氨基酸添加至例如成熟的核心命中肽的N-端末端(或合成在其上面)。同样地，根据本发明的C-端延伸的不同实施方案，一旦通过成熟过程鉴别出成熟的核心命中肽序列，可以将任何特定氨基酸添加至成熟的核心命中肽的C-端末端(或合成在其上面)。根据本发明的一些实施方案，在C-端延伸和N-端延伸中使用的成熟的核心命中肽还可以包括N-端和C-端摇摆氨基酸序列中的一种或两种。所述N-端和C-端摇摆氨基酸序列可以包含少至1个氨基酸或多至15或20个氨基酸(或更多)，且N-端摇摆氨基酸序列可以具有与C-端摇摆氨基酸序列相同、更长或更短的长度。此外，N-端和C-端摇摆氨基酸序列可以包含任意给定比率的氨基酸的任意限定集合(例如，3:1比率的甘氨酸和丝氨酸)。
在使用时，可以将延伸阵列暴露于浓缩的、经纯化的目标蛋白(例如，转谷氨酰胺酶)，由此所述蛋白可以结合任一个群体的任意肽，独立于构成所述群体的其它肽。暴露于目标蛋白以后，例如，测定目标蛋白的结合或活性，例如，通过将所述群体的单一肽和蛋白的复合物暴露于抗体(对所述蛋白具有特异性)，所述抗体具有与其连接的可报告的标记(例如，过氧化物酶) (还应当理解，目标蛋白可以用报告分子直接标记)。因为已知阵列上的每个位置的肽探针序列，可能相对于包含成熟的核心命中肽的具体探针绘制/量化/对比/对照所述蛋白的序列(和例如结合强度或活性)。对比与成熟的核心命中肽-肽探针组合的蛋白结合的一种示例性方法是，在原则性的分析基于分布的聚簇（诸如，描述在，Standardizing and Simplifying Analysis of Peptide Library Data, Andrew DWhite等人, J Chem Inf Model, 2013, 53(2)，第493-499页, 通过引用并入本文）中评论结合强度。在原则性的分析基于分布的聚簇中显示的与各种探针的蛋白结合的聚簇指示具有重叠肽序列的肽-探针。如在下面更详细地证实的，从(每个簇的)重叠肽序列，可以鉴别和构建延长的成熟的核心命中肽序列用于进一步评价。在本申请的某些实施方案中，延长的成熟的核心命中肽经历随后的成熟过程。
本文中公开的N-端和C-端延伸过程证实了惊人的和意外的结果。N-端和C-端延伸过程没有简单地证实核心命中肽序列的“重复”，而是表明了具体的和均匀的N-和C- 端氨基酸连接序列，其为增加成熟的核心命中的长度、对目标蛋白的特异性和亲和力做出贡献。
鉴别出延长的成熟的核心命中肽以后，根据本发明的一些实施方案可以执行特异性分析。特异性分析的一个例子包括BIACORE系统分析，其用于以以下方式表征分子：所述分子与靶标的特异性相互作用，动力学速率(“on”、结合，和“off”、解离)和亲和力(结合强度)。BIACORE系统和过程的概述可得自生产商(GE Healthcare)。BIACORE的一个益处是以无标记方式执行动力学、特异性和亲和力分析的能力。
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Claims (15)

1.一种用于交联第一化合物和第二化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
将包含序列基序YVLQG、YALQG、FVLQG或FALQG的异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述第一化合物中；
将异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入第二化合物；和
通过使所述第一化合物和所述第二化合物与微生物转谷氨酰胺酶接触来交联所述第一化合物和所述第二化合物；
其中：
所述微生物转谷氨酰胺酶是链轮丝菌属种（Streptoverticillium sp.）转谷氨酰胺酶；且
所述异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽包含赖氨酸残基，其能够在适当的反应条件下，与转谷氨酰胺酶发生接触，由此所述微生物转谷氨酰胺酶催化所述序列基序YVLQG、YALQG、FVLQG或FALQG的谷氨酰胺残基的γ-甲酰胺基和异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽的赖氨酸残基的ε-氨基之间的异肽键的形成，以形成所述第一化合物和所述第二化合物的交联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽包含GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物转谷氨酰胺酶是茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述赖氨酸底物肽包含SKLK、SKSK、KSKL、KTKL、RSKL或RTKL的序列基序。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一化合物和所述第二化合物选自蛋白、肽和有机分子或它们的组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一化合物或所述第二化合物是标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述标记选自Cy5、生物素和钌。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述第一化合物是标记且所述第二化合物是维生素D结合蛋白，或所述第二化合物是标记且所述第一化合物是维生素D结合蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中将所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述维生素D结合蛋白中，且所述异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽包含序列GGGGDYALQGGGG(SEQ ID NO: 85)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将所述异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述标记中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述具有掺入的异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽的标记是选自以下的式的化合物：
Figure 24227DEST_PATH_IMAGE001
，
Figure 206947DEST_PATH_IMAGE002
和
Figure 252263DEST_PATH_IMAGE003
。
12.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法用于将具有下式中任一个的标记与附带的转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽缀合：
Figure 178631DEST_PATH_IMAGE004
，
Figure 258583DEST_PATH_IMAGE005
，
Figure 346624DEST_PATH_IMAGE006
，
Figure 895548DEST_PATH_IMAGE007
，
Figure 360028DEST_PATH_IMAGE008
和
Figure 294486DEST_PATH_IMAGE009
。
13.一种包含异源转谷氨酰胺酶底物肽序列的蛋白，所述异源转谷氨酰胺酶底物肽序列包含选自YVLQG、YALQG、FVLQG、FALQG、GDYALQGPG、SKLK、SKSK、KSKL、KTKL、RSKL和RTKL的序列基序，其中所述蛋白是维生素D结合蛋白。
14.根据权利要求13所述的蛋白，其中所述异源转谷氨酰胺酶底物肽序列包含序列GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 85)。
15.根据权利要求14所述的蛋白，所述维生素D结合蛋白由以下异源转谷氨酰胺酶底物肽序列组成：
LERGRDYEKNKVCKEFSHLGKEDFTSLSLVLYSRKFPSGTFEQVSQLVKEVVSLTEACCAEGADPDCYDTRTSALSAKSCESNSPFPVHPGTAECCTKEGLERKLCMAALKHQPQEFPTYVEPTNDEICEAFRKDPKEYANQFMWEYSTNYGQAPLSLLVSYTKSYLSMVGSCCTSASPTVCFLKERLQLKHLSLLTTLSNRVCSQYAAYGEKKSRLSNLIKLAQKVPTADLEDVLPLAEDITNILSKCCESASEDCMAKELPEHTVKLCDNLSTKNSKFEDCCQEKTAMDVFVCTYFMPAAQLPELPDVELPTNKDVCDPGNTKVMDKYTFELSRRTHLPEVFLSKVLEPTLKSLGECCDVEDSTTCFNAKGPLLKKELSSFIDKGQELCADYSENTFTEYKKKLAERLKAKLPDATPTELAKLVNKRSDFASNCCSINSPPLYCDSEIDAELKNILGGGSHHHHHHHHGGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 91)。
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