DE3750989T2

DE3750989T2 - Bioverträglichkeit harter flächen.

Info

Publication number: DE3750989T2
Application number: DE3750989T
Authority: DE
Inventors: Patrick Guire
Original assignee: Bio Metric Systems Inc
Current assignee: Surmodics Inc
Priority date: 1986-10-17
Filing date: 1987-10-16
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2007-10-17
Also published as: ATE116863T1; JPH02500250A; JP2981488B2; EP0326579B1; AU615637B2; DE3750989D1; AU8232087A; EP0326579A1; EP0326579A4; CA1305068C; JPH10179726A; JP2741378B2; WO1988002623A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biochemie und insbesondere auf die Verbesserung der Biokompatibilität verschiedener Oberflächen

Hintergrund der Erfindung

Die Implantation solcher Biomaterialgegenstände wie Ersatzblutgefäße, synthetische und intraokulare Linsen, Elektroden, Katheter und dgl. in und an dem Körper ist ein sich rapide entwickelndes Gebiet der Medizin. Ein wesentlicher Hinderungsgrund, der der längeren Verwendung solcher Biomaterialimplantate, wie synthetischer Gefäßtransplantate, entgegenstand, war das Fehlen zufriedenstellender Transplantatoberflächen. Beispielsweise stimulieren die unbeschichteten Oberflächen synthetischer Blutgefäße aus Kunststoff oft eine thromboseerzeugende Wirkung. Verschiedene Plasmaproteine spielen eine solle bei der Initiierung von Thrombozyten- und Fibrinablagerungen auf Kunststoffoberflächen. Diese Wirkungen führen zu Gefäßverengungen, die den Blutfluß behindern und die darauf folgende Entzündungsreaktion kann zu dem Funktionsverlust des synthetischen Implantats führen.
Ein "Biomaterial" kann als ein Material definiert werden, das im wesentlichen unlöslich in Körperfluiden ist, und das dazu ausgestaltet und konstruiert ist, in oder an dem Körper plaziert zu werden oder in Kontakt zu Körperfluid zu treten. Gefäßtransplantate und Kontaktlinsen sind Beispiele für Biomaterialien.
Idealerweise weist ein Biomaterial die folgenden Eigenschaften auf:
1. Es wird keine unerwünschten Reaktionen in dem Körper wie Blutgerinnung, Gewebetod, Tumorbildung, allergische Reaktionen, Fremdkörperreaktion (Abstoßung) oder entzündliche Reaktionen hervorrufen.
2. Es wird die physikalischen Eigenschaften wie Festigkeit, Elastizität, Permeabilität und Flexibilität aufweisen, die für die gewünschte Funktion erforderlich sind.
3. Es kann leicht gereinigt, hergestellt und sterilisiert werden.
4. Es wird seine physikalischen Eigenschaften und Funktion während der Zeit, in welcher es in den Körper implantiert ist oder in Kontakt mit dem Körper steht, im wesentlichen beibehalten, sei es eine Stunde oder eine Lebensdauer.
Wie hierin verwendet, wird eine feste Oberfläche eines Biomaterials als "biokompatibel" gekennzeichnet, wenn sie in der Lage ist, in Kontakt mit biologischem Fluid und/oder Gewebe eines lebenden Organismus mit einer in Endeffekt nützlichen Wirkung auf den lebenden Organismus zu fungieren oder zu existieren. Eine Biokompatibilität über eine lange Dauer ist zum Zwecke der Reduzierung der Störung des Gastorganismus angestrebt.
Eine Anzahl von Ansätzen wurde vorgeschlagen, um die Biokompatibilität implantierter Gegenstände zu verbessern. Ein Ansatz war die Modifikation der Oberfläche eines Biomaterials, um unerwünschte Proteinadhäsionen zu vermeiden, indem das Biomaterial mit einer niedrigpolaren Oberfläche, einer negativ aufgeladenen Oberfläche oder einer mit biologischen Materialien, wie Enzymen, endothelialen Zellen und Proteinen, beschichteten Oberfläche vorgesehen wurde. Feste Oberflächen wurden mit biochemischen Materialien wie Heparin, Albumin und Streptokinase beschichtet, um die Thrombosewiderstandsfähigkeit zu verbessern. Insbesondere Albumin wurde physikalisch an den Polymeroberflächen adsorbiert und elekrostatisch und kovalent an diesen gebunden.
Munro et al, US-Patent Nr. 4,530,974, beschreiben ein Verfahren zur Adsorption von Albumin an einem wasserunlöslichen Polymer, wie Polyurethan, indem eine nicht-ionische hydrophobe aliphatische Kette, an welche sich Albumin wahlweise bindet, kovalent an die Oberfläche gebunden wurde.
Nimni et al, US-Patent 4,378,224, lehrt ein Verfahren der Beschichtung von Tiergewebe, das zur Herstellung von Prothesevorrichtungen verwendet wird, durch die Bildung einer dreidimensionalen kreuzverbundenen Matrix, die im wesentlichen aus einem Verkalkungshemmer aufgebaut ist.
Ein Beispiel für eine nachteilige Reaktion, die durch die Gegenwart eines Biomaterials hervorgerufen wird, ist die Ablagerung von Protein auf Kontaktlinsen. Häufig entwickeln Kontaktlinsenträger mit der Zeit eine Intoleranz gegenüber ihren Kontaktlinsen und diese Intoleranz kann auf Irritationen und allergische Reaktionen auf Biochemikalien (Proteinen, Fetten, Mucopolysaccharid und anderen), die sich während des Tragens auf den Linsen ablagern, zurückgeführt werden. Herkömmliche Reinigungs- und Desinfektionsverfahren beseitigen manche dieser Ablagerungen, aber diese Verfahren hinterlassen häufig Löcher und Spalte in den Linsen, die die Augenirritation des Trägers verstärken und als Fokus für weitere biochemische Ablagerungen dienen.
Guire, U.S. Patent No. 3,959,978, beschreibt die Verwendung von Reagenzien zum kovalenten Binden eines Enzyms an Aminoethylcellulose oder Alkylaminglas. Vergleiche auch Guire, "Stepwise Thermophotochemical Cross-linking for Enzyme Stabilization and Immobilization"; Enzyme Engineering 3: 63-70 (1978) und Guire, "Photochemical Immobilization of Enzymes and Other Biochemicals", Methods in Enzymology XLIV: 280-288 (1976). Diese Druckschriften beschreiben ein Verfahren des kovalenten Bindens eines Enzyms an Substrate, wie chemische Derivate von Glas mit kontrollierten Poren, Cellulose, Agarose und Polyacrylamiden, durch thermochemisches Koppeln eines Verbindungsreagens an die feste Oberfläche und fotochemisches Koppeln des Enzyms an das Verbindungsreagens, um eine Oberfläche zu schaffen, die bei der Durchführung von in vitro- Diagnoseversuchen nützlich ist.
Die US-A-4 451 568 (Schneider) beschreibt eine Monomerzusammensetzung auf der Basis von Adhäsion, die eine Fotopolymerisation unterläuft, um eine Polymerschicht zu bilden, die in der Lage ist, an einem Substrat zu haften. Die US-A-4 715 558 (Lindstrom) beschreibt eine synthetische Epikorneallinse zur Verwendung bei der Behandlung von Refraktionsfehlern. Die Linse besteht aus einem Kunststoff, der mit der Hornhaut kompatibel ist, gaspermeabel oder metabolitpermeabel sein kann, und mit Basismembranmaterial wie Fibronektin oder Laminin beschichtet sein kann.
Gemäß einem ersten Aspekt schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer biokompatiblen Vorrichtung aus einem Biomaterialsubstrat mit fester Oberfläche, wobei:
die feste Oberfläche durch Verwendung eines chemisch verbindenden Anteils, der eine fotochemisch reaktive Gruppe und eine andere reaktive Gruppe aufweist, mit einer biokompatilen Oberfläche versehen wird, die ein biokompatibles Agens enthält;
dadurch gekennzeichnet, daß bei dem chemisch verbindenden Anteil eine der Gruppen auf eine Aktivierung durch einen Reiz nicht reagiert, auf welche die andere Gruppe reagiert;
daß ein Reiz aufgebracht wird, um nacheinander die Gruppen zu aktivieren, um die unterschiedlichen reaktiven Gruppen kovalent an die Moleküle des biokompatiblen Agens zu binden und um den verbindenden Anteil mit einer ausreichenden Populationsdichte fotochemisch kovalent an die feste Oberfläche zu binden, um die Moleküle des biokompatiblen Agens in die Lage zu versetzen, die feste Oberfläche mit der biokompatiblen Oberfläche wirksam abzuschirmen;
wobei der chemisch verbindende Anteil die Formel A-X-B aufweist, in welcher:
A für eine fotochemisch reaktive Gruppe steht, die sich in Reaktion auf eine spezifische Aktivierung kovalent an die feste Oberfläche binden kann;
B für eine andere reaktive Gruppe steht, die in Reaktion auf eine spezifische Aktivierung, auf welche die Gruppe A nicht reagiert, eine kovalente Bindung zu dem biokompatiblen Agens bilden kann; und
X für einen relativ inerten, keinen Einfluß ausübenden Skelettanteil steht, der die Gruppen "A" und "B" verbindet, wobei der Skelettanteil gegenüber einer Spaltung in wäßrigen physiologischen Fluiden widerstandsfähig ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die biokompatibel "wirksame" Oberfläche aus einer Vielzahl von separaten Molekülen des biokompatiblen Agens gebildet, die über den verbindenden Anteil kovalent an die feste Oberfläche des Biomaterialsubstrats gebunden sind, um diese Oberfläche mit im wesentlichen denselben biokompatiblen Eigenschaften zu versehen, die das biokompatible Agens aufweist. Die durch die Moleküle des biokompatiblen Agens gebildete wirksame Oberfläche muß nicht die gesamte Oberfläche des Biomaterialsubstrats abdecken: Sie kann die Oberfläche in Punkten bedecken. Beispielsweise können Punkte entlang der Oberfläche von Gefäßtransplantaten mit einem Zellenbefestigungsfaktor, wie Fibronektin, bedeckt sein. Die an diesen Punkten ausgebildete biokompatibel wirksame Oberfläche wirkt dann als ein Fokus für die Befestigung der Zellen an der modifizierten Oberfläche.
Die "andere reaktive Gruppe" des verbindenden Anteils kann vorzugsweise eine thermochemische Gruppe oder eine fotochemische Gruppe sein.
Gemäß einem zweiten Aspekt schafft die Erfindung eine biokompatible Vorrichtung mit:
einem Substrat aus einem Biomaterial, das eine feste Oberfläche aufweist, und Moleküle eines biokompatiblen Agens trägt;
einem chemisch verbindenden Anteilsrückstand, der einzelne Moleküle des biokompatiblen Agens an die feste Oberfläche bindet;
dadurch gekennzeichnet, daß der chemisch verbindende Anteilsrückstand einen Rest einer fotochemisch reaktiven Gruppe umfaßt, die kovalent an die feste Oberfläche gebunden ist, und einen Rest einer anderen reaktiven Gruppe umfaßt, die kovalent an die Moleküle des biokompatiblen Agens gebunden ist, wobei der Rest der fotochemisch reaktiven Gruppe so an die feste Oberfläche gebunden ist, daß die einzelnen Moleküle des biokompatiblen Agens ausreichend nahe beieinander angeordnet sind, um zu bewirken, daß die Moleküle die feste Oberfläche wirksam abschirmen, und um eine biokompatibel wirksame Oberfläche zu schaffen, wobei der chemisch verbindende Anteil die Formel A-X-B aufweist, in welcher:
A für eine fotochemisch reaktive Gruppe steht, die in der Lage ist, sich in Reaktion auf eine spezifische Anregung kovalent an die feste Oberfläche zu binden;
B für eine andere reaktive Gruppe steht, die in der Lage ist, in Reaktion auf eine spezifische Aktivierung, auf welche die Gruppe A nicht reagiert, eine kovalente Bindung zu dem biokompatiblen Agens zu bilden; und
X für einen relativ inerten, keinen Einfluß ausübenden Skelettanteil steht, der die Gruppen "A" und "B" verbindet, wobei der Skelettanteil einer Spaltung in wäßrigen physiologischen Fluiden widerseht. Das physiologische Fluid, auf das Bezug genommen wird, ist ein solches Fluid, mit dem X in Kontakt kommt.
Das biokompatible Agens wird ausgewählt, um die Funktion einer besonderen Vorrichtung zu verbessern. Beispielsweise kann die Funktion von Kontaktlinsen verbessert werden, indem Polyethylenglykolmoleküle an den Linsenoberflächen befestigt werden, um die Ablagerung von Proteinen an diesen Oberflächen zu verringern. Als weiteres Beispiel kann ein Zellenbefestigungsfaktor, wie Fibronektin oder Laminin, an eine Vorrichtung mit einer Polyvinylchloridoberfläche gebunden werden, um die Zellenbefestigung an der Vorrichtung zu verstärken. Dies wird im Fall von Implantaten, wie Kathetern und Ersatzblutgefäßen gewünscht.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung verwendet Moleküle eines biokompatiblen Agens, die miteinander verbunden sind, um einen biokompatiblen Film zu bilden, und einen chemischen Verbindungsanteil, der in der Lage ist, den Film mit der festen Oberfläche des Biomaterials zu verbinden. Der chemische Verbindungsanteil umfaßt eine fotochemisch reaktive Gruppe, die in der Lage ist, sich bei Aktivierung kovalent an die feste Oberfläche zu binden, sowie den Rückstand einer reaktiven Gruppe, die kovalent an den Film gebunden ist (bspw. den Rückstand der biokompatiblen Agensmoleküle, die den Film bilden). Eine der reaktiven Gruppe reagiert nicht auf eine Anregung, auf welche die andere reaktive Gruppe reagiert. Das Verfahren umfaßt das Aktivieren der fotochemisch reaktiven Gruppe mit einem Reiz, um die biokompatiblen Moleküle kovalent zu binden. Mit "verbunden" wird in diesem Kontext nicht nur Bezug genommen auf das kovalente Binden angrenzender biokompatibler Agensmoleküle, sondern auch auf Wechselwirkungen, die durch solche Kräfte, wie Wasserstoffbindungen, Ionenbindungen, Bindungen durch Van der Waals- Kräfte und dgl. hervorgerufen werden.
Das biokompatible Agens, das Moleküle aufweist, die miteinander verbunden sind, um einen Film zu bilden, kann Moleküle eines Agens aufweisen, oder es kann Moleküle von zwei oder mehreren Agenzien, wie Heparin und Albumin, aufweisen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die feste Oberfläche, die gemäß der vorliegenden Erfindung biokompatibel gemacht wurde, besteht vorzugsweise aus einem synthetischen oder natürlichen Material, das in physiologischen Fluiden nicht löslich ist. Die Oberfläche kann eine oder mehrere Oberflächen von Vorrichtungen sein, die dazu vorgesehen sind, in Kontakt mit Gewebe und/oder Fluiden von lebenden Organismen zu funktionieren. Die feste Oberfläche der Vorrichtung kann aus jedem geeigneten Metall, wie poliertem Titan oder rostfreiem Stahl, oder einem Polymer, wie Polyurethan, Polyvinylpyrrolidon, Silikonelastomeren, Polyethylen, Polytetrafluorethylen, Poly-(φ-Phenyleneterephthalamid), Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyolefinen, Polyestern, Polyacrylaten (einschließlich Polymethacrylaten); Mineralien oder Keramiken, wie Hydroxyapatit; Humangewebe, wie Knochen, Haut oder Zähne; organischen Materialien, wie Holz, Cellulose und gepreßter Kohlenstoff; und anderen natürlichen und synthetischen Materialien, wie Glas, Gummi, Holz und dgl. bestehen. Beispiele von Vorrichtungen, die mit biokompatiblen Oberflächen gemäß der vorliegenden Erfindung versehen werden können, umfassen Gefäßtransplantatrohre, Dialyserohre oder -membranen, Blut mit Sauerstoff anreichernde Rohre oder -membranen, Ultrafiltrationsmembranen, intraaortische Ballons, Bluttaschen, Katheter, Nähte, weiche oder harte Gewebeprothesen, synthetische Prothesen, künstliche Organe und Linsen für das Auge, wie Kontakt- und Intraokularlinsen.
Die feste Oberfläche ist vorzugsweise thermochemisch inreaktiv. "Thermochemisch inreaktiv" bedeutet, daß die Oberfläche frei ist von jeglicher Oberflächenbehandlung, die dazu dient, die Fähigkeit der Oberfläche zu erhöhen, thermochemisch zu reagieren. Beispiele thermochemisch inreaktiver Oberflächen umfassen Polytetrafluorethylen, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyrrolidon, Silikonelastomere, rostfreien Stahl und Titan.
Moleküle eines biokompatiblen Agens sind an der Oberfläche des Biomaterialsubstrats befestigt, um die Biokompatibilität zu verbessern. Das biokompatible Agens kann ein Wachstumsfaktor, wie ein Endothelzellenwachstumsfaktor, ein Epithelzellenwachstumsfaktor, ein Osteoblast-Wachstumsfaktor, ein Fibroblast-Wachstumsfaktor, ein Plättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor, ein neuraler Wachstumsfaktor oder ein Angiogenin- Wachstumsfaktor sein; ein Antimikrobenagens, wie Lysozym oder Penicillin; ein antithrombogenes Agens, wie Heparin, Albumin, Streptokinase, Gewebeplasminogen-Aktivator (TPA) oder Urokinase; ein thrombogenes Agens, wie Kollagen oder ein hydrophiles Polymer, wie Polyethylenglykol, Hyaluronsäure, Chitosan oder Methylcellulose, und andere Proteine, Kohlenhydrate und Fettsäuren. Das biokompatible Agens kann Moleküle eines der oben aufgeführten Agenzien oder Moleküle von zwei oder mehr Agenzien aufweisen. Beispielsweise kann das biokompatible Agens Moleküle sowohl von Albumin als auch Heparin aufweisen.
Bei einer Ausführungsform sind die Moleküle eines biokompatiblen Agens miteinander verbunden, um einen Film zu bilden, der über einen Verbindungsanteil an einer festen Oberfläche befestigt ist. Das biokompatible Agens kann vorzugsweise Hyaluronsäure oder Albumin sein. Eine biokompatible Vorrichtung mit einem daran befestigten Film kann ein künstliches Hüftgelenk sein, das mit einem Film aus Hyaluronsäure beschichtet ist.
Unter Bezugnahme auf den chemischen Verbindungsanteil A-X-B ist X vorzugsweise: eine C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylgruppe, wie Polymethylen; ein Kohlenhydrat wie Polymethylol; ein Polyoxyethylen, wie Polyethylenglykol; oder ein Polypeptid, wie Polylysin.
Die reaktive Gruppe B ist eine Gruppe, die sich bei geeigneter Aktivierung kovalent an proteinaceöse oder andere biokompatible Agenzien bindet. Solche Gruppen werden durch thermochemische Gruppen und fotochemische Gruppen, wie sie in Guire, U.S.-Patent 3,959,078 beschrieben und beispielhaft angegeben sind, typisiert.
Die fotochemisch reaktive Gruppe (A) (deren kovalente Bindung durch aktinische Strahlung aktiviert wird) kann typisiert werden durch Aryl-, Alkyl- und Akylsäuren, Oxazidin, Isocyanat (Nitrengeneratoren), Alkyl- und 2-Ketodiazo-Derivate und Diazirine (Carbengeneratoren), aromatische Ketone (Triplett- Sauerstoffgeneratoren), aromatische Diazoniumderivate und zahlreiche Klassen von Carbonium-Ionen und radikalen Generatoren. Bezug genommen wird auf Frederick J. Darfler und Andrew M. Tometsko, Kapitel 2 von "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins" (Boris Weinstein, ed) Vol. 5, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 für die weitere Beschreibung von fotochemisch reaktiven Gruppen. Azidonitrophenyle, Fluorazidonitrobenzene und aromatische Ketone bilden eine bevorzugte Gruppe dank ihrer Stabilität im Hinblick auf chemische Reaktionsbedingungen im Dunkeln und ihre Empfänglichkeit für Aktivierung durch Licht von Wellenlängen, die für die meisten Biomaterialien harmlos sind, um kurzlebige reaktive Intermediate zu bilden, die in der Lage sind, mit brauchbarer Ausbeute kovalente Bindungen mit den meisten Bereichen an dem Biomaterial zu bilden.
Nitrophenylsäurederivate (wie sie als die X-Gruppe umfassend dargestellt sind), die zur Verwendung als fotochemisch reaktive Gruppen geeignet sind, können größtenteils abgeleitet werden aus Fluor-2-Nitro-4-Azidobenzol und umfassen 4-Azido- 2-Nitrophenyl (ANP)-4-Amino-Butyryl, ANP-6-Aminocaproyl, ANP- 11-Aminoundecanoyl, ANP-Glycyl, ANP-Aminopropyl, ANP-Mercaptoethylamino, ANP-Diaminohexyl, ANP-Diaminopropyl und ANP- Polyethylenglycol. ANP-6-Aminocaproyl, ANP-11-Aminoundecanoyl und ANP-Polyethylenglycol werden bevorzugt. Aromatische Ketone, die zur Verwendung als fotochemisch reaktive Gruppen bevorzugt werden, umfassen Benzylbenzoyl und Nitrobenzylbenzoyl.
Thermochemisch reaktive Gruppen (die durch Wärmeenergie aktiviert werden) werden typisiert durch und umfassen Nitrophenylhalogenide, Alkylamino-, Alkylcarboxyl-, Alkylthio-, Alkyaldehyd-, Alkylmethylimidat-, Alkylisocyanat-, Alkylisothiocyanat- und Alkylhalogenidgruppen.
Gruppen, die zur Verwendung als thermochemisch reaktive Gruppen geeignet sind, umfassen Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, primäre Aminogruppen, Thiolgruppen, Maleimide und Halogenidgruppen. N-Oxysuccinimid-Carboxyl-Ester solcher Gruppen wie 6-Amino-Capronsäure und Amino-Undecansäure, Alkylthiolgruppen, wie Mercaptosuccinanhydrid und Beta-Mercaptopropionsäure, Homocysteinthiolactone und Polyethylenglykolderivate werden bevorzugt.
Die Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung weisen biokompatible feste Oberflächen auf, die Moleküle eines biokompatiblen Agens und einen chemischen Verbindungsanteilrückstand umfassen. Der chemische Verbindungsanteilrückstand umfaßt einen Rückstand einer fotochemisch reaktiven Gruppe, die an die feste Oberfläche gebunden ist, und umfaßt einen Rückstand einer anderen reaktiven Gruppe, die kovalent an das biokompatible Agens gebunden ist. Der Rückstand der fotochemisch reaktiven Gruppe ist der Anteil einer fotoreaktiven Gruppe (oben beschrieben), die durch "A" in der allgemeinen Formel repräsentiert wird, der verbleibt, nachdem sich eine kovalente Bindung gebildet hat. Ist die fotoreaktive Gruppe ANP und das feste Substrat Polyethylen, so ist der Rückstand eine Kohlenstoff-Stickstoffverbindung. Ein Nitren, das gebildet wird, wenn ANP mit Licht aktiviert wird, reagiert mit einem Kohlenstoff des Polyethylens, um eine kovalente Bindung zu bilden. Ist die fotoreaktive Gruppe BBA und das feste Substrat Polyethylen, so ist der Rückstand eine Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindung. Wird BBA durch Licht stimuliert, so wird der Kohlenstoff, der die beiden Phenylgruppen verbindet, in einen Triplett-Zustand aktiviert, der die Bildung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verbindung zwischen dem Polyethylen und dem BBA und die Bildung einer Hydroxyl-Gruppe bewirkt. Ist die andere reaktive Gruppe ("B") NOS, so ist der Rückstand der Carboxyl-Kohlenstoff der Gruppe, der an eine Sauerstoff- oder Stickstoffgruppe eines biokompatiblen Agens gebunden ist, wie Fibronektin.
Da Enzyme, Zellbefestigungsfaktoren und bestimmte andere Substanzen, die als biokompatible Agenzien eingesetzt werden können, in gewisser Hinsicht sensibel gegenüber hohen Temperaturen sind, wird angestrebt, daß die andere reaktive Gruppe an dem verbindenden Anteil, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch einfach aufgebrachte und harmlose Stimuli, wie mäßige Hitze (bspw. Körpertemperatur oder darunter) und Licht, aktiviert wird (d. h. als Antwort darauf eine kovalente Bindung eingeht). Reaktive Gruppen, die auf den Reiz nicht reagieren, auf den die fotochemisch reaktive Gruppe reagiert, können Gruppen sein, die auf Wechsel des pH-Wertes oder die Zugabe anderer chemischer Spezies und dgl. reagieren.
Wie oben dargestellt, bindet sich der chemische Verbindungsanteil kovalent in einer solchen Populationsdichte an die feste Oberfläche, daß die Moleküle des biokompatiblen Agens in die Lage versetzt werden, die feste Oberfläche mit der biokompatiblen Oberfläche wirksam abzuschirmen. Die Dichte der gebundenen chemischen Anteile, die notwendig ist, um eine wirksame Oberfläche zu schaffen, variiert in Abhängigkeit von dem bestimmten verwendeten biokompatiblen Agens.
Die Erfindung läßt sich durch Bezugnahme auf die nach folgenden, nicht einschränkenden Beispiele besser verstehen. Tabelle 1 ist eine Liste von Abkürzungen der in der nachfolgenden Beschreibung verwendeten Begriffe.

Tabelle 1: Liste der Abkürzungen

Abkürzungen Voller Name

EGF Endothel-Wachstumsfaktor
PEG Polyethylenglykol
PVC Polyvinylchlorid
PE Polyethylen
PP Polypropylen
PTFE Polytetrafluorethylen
FNAB Fluornitroacidobenzol
ANP 4-Azido-2-Nitrophenyl
KOH Kaliumhydroxid
TLC Dünnschichtchromatografie
NOS N-Oxysuccinimid
EAC(A) Epsilon-Aminocapronsäure
AUD(A) Amino-Undecansäure
BBA Benzoylbenzoesäue
DMSO Dimethylsulfoxid
DMF Dimethylformamid
EDC 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodimid
PEG-1000 Polyethylenglykol, Molekulargewicht 1000
PEG-4000 Polyethylenglykol, Molekulargewicht 4000
PBS phosphatgepufferte Saline
FN Fibronektin
COL Kollagen
nBBA Nitrobenzoylbenzoesäure
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure
HSA Humanserum Albumin
HGG Humangammaglobulin
LYZ Lysozym
mmol Millimol
ml Milliliter
MWapp ungefähres Molekulargewicht
mg Milligramm
M Molar
pmol Picomol
ng Nanogramm
ug Mikrogramm
ID innerer Durchmesser

Beispiel 1

Endothel-Zellenbefestigung/Wachstum

1. Kunststoffoberflächen

Verschiedene Zellfaktoren wurden mit in vitro getesteten polymeren Oberflächen gekoppelt, um den Effekt dieser Faktoren auf Zellbefestigung und Wucherung festzustellen. Die polymeren Oberflächen umfaßten Polyvinylchlorid (PVC), Polyethylen (PE), Polypropylen (PP) und Polytetrafluorethylen (PTFE) GORE-TEX (6 mm verstärktes ausgedehntes PTFE, ein Handelsprodukt der W.L. Gore and Associates, Inc). Getestete herkömmmliche Rohre umfaßten Polyester (Dacron, D, 6 mm flachgestrecktes Dacron-Velours, ein Handelsprodukt von Dupont), Silikonelastomer (Silastic®, S, 0,03 I.D., Rohre, ein Handelsprodukt von Dow Corning) und Polyurethan. Polystyrolplatten wurden zur Kontrolle verwendet.

2. Vorbereitung des chemischen Verbindungsanteils

Der in diesen Beispielen verwendete chemische Verbindungsanteil waren N-Oxysuccinimid (NOS)-Ester von 4-Azido-2-Nitrophenyl-Epsilon-Amino-Capronsäure (ANP-EACA), 4-Azido-2-Nitrophenyl-Amino-Undecansäure (ANP-AUDA) und Benzoylbenzoesäure (BBA). ANP-EAC-NOS und ANP-AUD-NOS wurden mittels des Verfahrens hergestellt, das in P. Guire, D. Fliger und J. Hodgson, "Photochemical Coupling of Enzymes to Mammalian Cells", Pharmacological Research Communications, Band 9, Seiten 131-141 (1977), das hiermit durch Bezugnahme einbezogen wird, beschrieben ist. Kurz gesagt, wurde Fluor-2-Nitro-4-Azidobenzol entweder mit Epsilon-Aminocapronsäure oder Amino-Undecansäure reagiert, um die relativ schwach reaktiven Fluoride durch eine Aminoalkylcarboxy-Gruppe zu ersetzen. Die Carboxygruppe wurde dann verestert durch Carbodiimidaktivierung mit N-Hydroxysuccinimid um N-Oxysuccinimidcarboxyl-Ester zu erhalten. Die NOS-Ester von Benzoylbenzoesäure wurden hergestellt durch Verestern der Carboxygruppe durch Carbodiimidaktivierung mit N-Hydroxysuccinimid.
Ist ANP-EAC-NOS der verwendete chemische Verbindungsanteil, so ist die ANP-Gruppe die fotochemisch reaktive Gruppe, die durch den Buchstaben "A" in der oben beschriebenen allgemeinen Formel A-X-B dargestellt wird. Die NOS-Gruppe ist die andere reaktive Gruppe, die in der Formel durch den Buchstaben "B" dargestellt wird. Die EAC- oder AUD-Gruppe wirkt als der Abstandshalter zwischen den beiden reaktiven Gruppen und wird in der allgemeinen Formel durch X dargestellt. Ist BBA-NOS der chemische Verbindungsanteil, so ist die Benzoylbenzoegruppe die fotochemisch reaktive Gruppe, die in der allgemeinen Formel durch "A" dargestellt ist, und die NOS- Gruppe ist die andere reaktive Gruppe, die durch den Buchstaben "B" dargestellt wird. Die durch X dargestellte Gruppe ist der Kohlenstoff, der die beiden reaktiven Gruppen verbindet.

3. Kovalente Bindung von Wachstumsfaktoren an die chemischen Verbindungsanteile

Die biokompatiblen Agenzien Fibronektin, Laminin, Kollagen, Endothel-Wachstumsfaktor und Humanserum-Albumin wurden auf ihre Fähigkeit getestet, Endothel-Zellbefestigung und Wucherung an synthetischen Biomaterialien zu fördern. Diese Agenzien wurden wie folgt an N-Oxysuccinimid (NOS)-Ester aus 4- Azido-2-Nitrophenyl-Epsilon-Amino-Capronsäure (ANP-EACA), 4- Azido-2-Nitrophenyl-Undecanaminosäure (ANP-AUDA) oder Benzoylbenzoesäure (BBA) gekoppelt. "Fotomarkiert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein biokompatibles Agens, das durch die andere reaktive Gruppe an einen chemischen Verbindungsanteil gekoppelt wurde und das eine fotochemische reaktive Gruppe aufweist.

A. Kovalente Bindung von Fibronektin und Laminin an den Verbindungsanteil

Humanfibronektin (University of Wisconsin Medical School) und Mauslaminin (bezogen von Bethesda Research Lab.) wurden getrennt in 1 mg/ml Konzentrationen in 0,1 M Borat, pH-Wert 9,0 aufgelöst. Eine Lösung von ANP-EAC-NOS in trockenem Dimethylformamid ("DMF"), ANP-AUD-NOS in trockenem DMF, oder BBA-NOS in trockenem Dioxan wurde langsam der Fibronektin- oder Lamininlösung zugegeben in äquimolaren Mengen zu der Konzentration von Protein-Epsilon-Aminogruppen (Lysinrückständen) durch Einspritzen bei 4ºC im Dunkeln über 16 Stunden. Dann wurde die Mischung 4 Stunden im Kalten gerührt. Die Fibronektin- oder Lamininlösung wurde zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen, und dann auf eine Sephadex G-75 Säule gegeben, um ungekoppeltes Fotoreagens zu entfernen. Die Fraktionen wurden bei 260 nm und 462 nm überwacht, um die Fotogruppen/Protein-Verhältnisse festzustellen.

B. Kovalente Bindung von EGF, Kollagen und HSA an chemische Verbindungsanteile

Humanplazenta Typ IV-Kollagen (Sigma Pharmaceutical), Endothel-Wachstumsfaktor (Sigma Pharmaceutical) und Humanserum Albumin (Sigma Pharmaceutical) wurden getrennt bei 2 mg/ml- Konzentrationen in 0,1 M Borat, pH-Wert 9,0 aufgelöst. Lösungen von ANP-EAC-NOS in DMF, ANP-AUD-NOS in DMF oder BBA-NOS in Dioxan wurden langsam der das biokompatible Agens enthaltenden Lösung zugegeben in 5X molaren Mengen zu der Konzentration von Epsilon-Aminogruppen (Lysin)-Rückständen durch Einspritzen bei 4ºC im Dunkeln über 16 Stunden. Dann wurde die Lösung gegen 4 1000 ml-Wechsel von phosphatgepufferter Saline (PBS) dialysiert und zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Das Produkt wurde analysiert bei 260 nm, 280 nm und 462 nm, um die Fotogruppen/Protein-Verhältnisse festzustellen.

4. Kovalentes Binden der biokompatiblen Agenzien an Kunststoffoberflächen

Verschiedene Blätter, Rohre und flache Teile aus Polyethylen, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyurethan, Dacron® (Velour), Silastic® (medizinische Qualität) und Polytetrafluorethylen wurden verwendet. Ein 0,05 ml Lösungsaliquot mit 0 bis 500 ug/ml fotomarkiertes biokompatibles Agens wurde jedem 0,5 cm²-Abschnitt der Kunststoffoberfläche zugegeben. Die Lösung konnte auf jedem Teil bei Raumtemperatur im Dunkeln 3 Stunden lang adsorbieren. Die überschüssige Flüssigkeit wurde entfernt und die biokompatiblen Agenzien wurden kovalent an die Oberflächen gebunden durch Fotolyse für 12 Stunden bei der geeigneten Wellenlänge (Wolfram "Spotlicht" für ANP und langwelliges UV für BBA). Nach der Fotolyse wurden die Proben mit einem 4 Sekundenstrom von PBS gewaschen, um nicht kovalent gebundene Moleküle von dem fotomarkierten biokompatiblen Agens zu entfernen. Die Teile wurden dann in Gewebekulturen angeordnet, um die Endothel-Zellreaktion auf die Zellfaktoren wie folgt festzustellen.

5. In Vitro-Tests durchgeführt mit modifizierten Oberflächen

A. Radio-markierte biokompatible Agenzien

Radio-markierte (³H) biokompatible Agenzien wurden wie oben beschrieben fotomarkiert und an Kunststoffoberflächen fotogekoppelt. Die Kunststoffoberflächen wurden ausgiebig mit PBS gewaschen, dann in organischem Lösungsmittel aufgelöst und durch Flüssigszintillationsspektrometrie gezählt. Einige repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Probenergebnisse von Mengen von Wachstumsfaktoren, die mit verschiedenen Materialien fotogekoppelt wurden Fotomarkiertes biokompatibles Agens Feste Oberfläche Ng-Wachstumsfaktor aufgebracht/cm² Ng-Wachstumsfaktor fotogekoppelt/cm² % der Kopplungseffizienz ANP-EAC-FN PVC Polyurethan BBA-FN ANP-EAC-COL BBA-COL
Diese Ergebnisse zeigen die fotomarkierten biokompatiblen Agenzien kovalent gekoppelt an diese Oberflächen.

B. Befestigung von Rinderendothelzellen an modifizierten Kunststoffoberflächen

Rinderendothelzellen wurden von fötalen Tieren der Länge 8- 24'' gesammelt. Hornhaut, Aorta- und Nabel-Endothel-Zellen wurden aseptisch geerntet. Zellen wurden in einem 5% CO&sub2; Inkubator bei 37ºC in einem bekannten Hochglukose-Zellwachstumsmedium, wie Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (beschrieben in R. Dulbecco und G. Freeman, "Virology", Band 8: 396 (1959) und J.D. Smith, G. Freeman, M. Vogt und R. Dulbecco, "Virology", Band 12 : 185-196 (1960)) gewachsen mit 25 mmol HEPES-Puffer, 10% Rinderkalbserum und 2,5 ug Amphotericin B/ml (dem "Wachstumsmedium"). Nach Vorbereitung der Platten, Rohre oder Blätter wurden Zellkulturen von den primären Zellinien hergestellt. Die Zellen wurden von der Zellkulturoberfläche abgelöst mit einer 0,25%-Lösung aus Trypsin und wieder in das Wachstumsmedium eingebracht. Die Zellen wurden dann unter Verwendung einer Trypan-Blau (0,4%)-Lösung und eines Hämocytometers gezählt. Verschiedene Zellkonzentrationen wurden auf den vorbereiteten Materialien geschichtet. Die Zellbefestigung wurde für verschiedene Zeitdauern von 5 Minuten bis 14 Tagen überwacht. Die Befestigungen wurden mit wenigstens zwei Methoden festgestellt. Bei einer wurden Probematerialien von den Kulturmedien entfernt und zweimal mit steriler Saline gewaschen. Dann wurde Zellfarbstoff aufgebracht und die gesamten Zellen auf der Oberfläche wurden gezählt. Eine zweite Methode bestand darin, die Zellen von der Oberfläche mit einer Trypsinlösung wegzutrypsinieren und unter Verwendung der Trypan-Blau-Methode zu zählen.
Repräsentative Ergebnisse der Befestigung und des Auswachsens von Endothelzellen auf vorbeschichteten Polyvinylchloridkunststoffteilen sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Anzahl der an jedem Stück befestigten lebensfähigen Zellen wurde mittel Trypan-Blau-Färbeverfahren festgestellt. Tabelle 3 Zellbefestigungsfeststellung und Herauswachsen von Endothelzellen auf der behandelten Polyvinylchloridoberfläche Biokompatibles Agens und chemischer Verbindungsanteil Ng-Wachstumsfaktor/cm² 3-Tage-Zellzähler 7-Tage-Zellzähler 7-Tage-Auswuchs ANP-EAC-FN BBA-FN ANP-EAC-COL BBA-COL Kontroll-PVC

C. Befestigung von Human-Nabel-Endothelzellen

Primäre Human-Endothelzellen wurden von frischen (weniger als 4 Tag alten) humanen Nabelschnüren geerntet. Die Schnüre wurden mit 20 mls-Schnurpuffer (0,144M NaCl, 0,004M KCL und 0,001M PO&sub4;) zweimal gespült, um Blut und Blutgerinsel zu entfernen. Kollagenase wurde in die Schnur hineingedrückt und für 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Unter Verwendung von 10 ml warmem Schnurpuffer wurde die Kollagenase und abgelöste Zellen in Röhrchen ausgespült. Die Suspension in den Röhrchen wurde kombiniert und zentrifugiert bei 1500 U/min für 5 bis 10 Minuten. Das Aufschwimmende wurde abgeschüttet und die Zellen wieder in 10 ml Schnurpuffer eingebracht. Nach der zweiten Zentrifugierung wurden die Zellen wieder in Schnurpuffer eingebracht und in Gewebekulturscheiben ausgestrichen. Alle Zellen wurden in einen 37ºC-Inkubator mit 5% CO&sub2; inkubiert. Die Zellen wurden unter Verwendung von &sup5;¹Cr im Schnurmedium ohne Kalbserum radiomarkiert.
Markierte Zellen wurden dann für Zellbefestigungsuntersuchungen verwendet. Platten, Blätter und Rohre aus den oben beschriebenen Kunststoffen wurden wie oben dargestellt vorbereitet. Die Zellen wurden trypsinisiert und mittels der Trypan-Blau-Methode gezählt. Die Zellen konnten an dem vorbereiteten Kunststoff für 3 Stunden bis 7 Tage haften. Die Zellen wurden abgespült und die Gesamtzahl aller verbleibenden befestigten Zellen wurde mit der Anzahl der nicht befestigten Zellen verglichen. Repräsentative Ergebnisse erscheinen in der obigen Tabelle 3.

D. Auswuchsmessung unter Verwendung von Endothel-Zellen

Die folgenden Techniken wurden verwendet zur Überwachung des Auswuchses von Zellen von einem Ursprungspunkt, wenn die Zellen wachsen, um die Oberfläche der oben aufgeführten Kunststoffe abzudecken, die wie folgt modifiziert sind. Lösungen von biokompatiblen Agenzien, die von 0 bis 500 um von Zellfaktoren enthalten, wurden auf 1 bis 6 cm lange Oberflächen beschichtet, um einen Gradienten zu erzeugen. Die Zellen wurden nicht von dem Gewebe mit Trypsin oder Proteinase abgelöst. Das Gewebe wurde an einem Ursprungspunkt an dem unteren Ende des Gradienten angeordnet und markiert. Das Gewebe konnte für 15 Minuten bei Raumtemperatur dort bleiben. Wachstumsmedium wurde zugegeben, um eine Feuchtigkeitsschicht über dem Kunststoff zu erzeugen. Alle Protokolle wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Platten wurden dann bei 37ºC in einem 5% CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Der Auswuchs wurde täglich für bis zu 2 Wochen oder bis die Länge des Kunststoffs vollständig abgedeckt war gemessen. Der Auswuchs auf den behandelten Oberflächen wurde verglichen mit nicht behandelten Kontrolloberflächen, wie in der obigen Tabelle 3 dargestellt. Alle Materialien wurden gespült und für eine Scan-Elektronenmikroskopie gefärbt.
Diese Ergebnisse zeigten, daß die kovalente Befestigung der Wachstumsfaktoren Fibronektin (FN) und Kollagen (COL) an der Kunststoffoberfläche die Biokompatibilität des Kunststoffs mit Rinderendothelzellen verbesserte. Die Zellen befestigten sich vorzugsweise an den modifizierten Oberflächen gegenüber den Kontrolloberflächen, wie sich aus der Entfernung ergibt, um die sie über die Kunststoffoberfläche ausgewachsen sind.

6. In Vivo-Untersuchungen

Zwei konditionierte Hunde wurden für diese Untersuchung verwendet. Teile aus GORE-TEX (verstärktes expandiertes Polytretrafluorethylen, ein Handelsprodukt von W.L. Gore and Associates, Inc.) wurden mit FN, ANP-EAC-FN (adsorbiert und fotogekoppelt), ANP-EAC-FN (nur adsorbiert) und einer PBS-Kontrolle vorbeschichtet. Der Versuch war eine blinde Untersuchung. Die Transplantate wurden durch Buchstaben markiert; das Chirurgenteam wußte jedoch nicht, welche Transplantate modifizierte Oberflächen hatten und welche nur der Kontrolle dienten. Jeder Hund erhielt zwei 6 mm·5 cm Teile aus GORE-TEX in die linke und rechte Darmbeinarterie implantiert. Die Transplantate wurden für einen Monat (30 Tage) in den Hunden gelassen. Den Hunden wurden die anti-entzündlichen Drogen Persantin und Aspirin verabreicht, um humane Implantationsverfahren zu imitieren.
Beide Kontrolltransplantate (PBS und FN) waren durchgängig und hatten einen ausreichenden Durchmesser. Die anastomatischen Linien waren intakt und die inneren Oberflächen waren glatt. Endothelialisierung war bei den Kontrolltransplantaten nicht komplett. Es gab keine Hinweise auf wesentliche Thrombosen. Beide Transplantate, an die ANP-EAC-FN gebunden war (fotogekoppelt und nur adsorbiert) waren frei von Thrombosenbildung. Endothelialisierung war komplett, was den inneren Oberflächen der Tansplantate ein glattes, glänzendes Aussehen verlieh.

Beispiel 2

Modifizierung der Oberflächen von Kontaktlinsen- und Intraokularlinsenimplantaten

Die bei diesem Beispiel beschriebenen Versuche umfaßten die Vorbereitung von hydrophilen Polymeren (einem biokompatiblen Agens), die an einen chemischen Verbindungsanteil gebunden sind, Fotokopplung der Anteile an Kontaktlinsenoberflächen und Messung der In Vitro-Proteinablagerung von künstlichen Tränenlösungen auf diese Linsen im Vergleich zu nicht behandelten Linsen. Versuche zum Studium der Kompatibilität der biokompatiblen Agenzien in vitro mit Hornhautstücken und in vivo in Kaninchenaugen wurden durchgeführt, um sicherzustellen, daß keine toxischen oder irritierenden Reaktionen auf die erhaltenen Linsen auftraten.

1. Bindung von biokompatiblen Agenzien an den chemischen Verbindungsanteil

A. Vorbereitung von fotomarkierten Polyethylenglykolen

Polythylenglykole mit Molekulargewichten von 1000 (PEG-1000) und 4000 (PEG-4000) wurden mit Fluornitroazidobenzol (FNAB) durch Modifikation der Phasentransfermethode von Kimura und S. Regen, Journal of Organic Chemistry 48; 195 (1983) markiert, deren Lehren hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden. Kurz gesagt, umfaßte die Phasentransfersynthese von 4-Azido-2-Nitrophenylpolyethylenglykol (ANP-PEG) die Mischung von 60% wäßrigem Kaliumhydroxid ("KOH")/Toluol mit FNAB und PEG, gefolgt von Extraktion und dünnschichtchromatografischer (TLC) Purifizierung wie unten beschrieben.
ANP-PEG-1000: ANP-PEG-1000 wurde durch Zugabe von 0,05 mmol PEG-1000 auf 5 ml 60% KOH und 0,5 mmol FNAB auf 10 ml Toluol vorbereitet. Diese Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden schnell gerührt. Das Produkt wurde von der organischen Schicht isoliert. TLC in 85/15/1/1 Chloroform/Methanol/H&sub2;O/Essigsäure oder Ammoniumhydroxid trennten mono- und di-substituierte Derivate von ANP-PEG-1000 von unmarkiertem PEG. Das ANP-PEG-1000 (niedriger Rf-Wert) entsprechende Band wurde dann von Silicagel mit TLC-Lösungsmittel extrahiert und azeotrophiert, um Säure- oder Laugenreste zu entfernen. Das Endprodukt war wasserlöslich und führte zu der Konversion von 30 bis 40% des PEG-Startmaterials in ANP-PEG-OH-Produkt.
ANP-PEG-4000: Das ANP-PEG-4000 wurde mittels desselben Verfahrens vorbereitet wie oben beschrieben, außer daß die Reaktionsmischung bei 500 schnell gerührt wurde, um sicherzustellen, daß alle Reagenzien während des Verlaufes der Reaktion in Lösung blieben. Das Ergebnis an ANP-PEG-4000-OH war 10%.

B. Vorbereitung von fotomarkierten Jeffaminen

Polyoxypropylenpolyamine und Polyoxyethylenamine (bezeichnet als "Jeffamine", einem Warenzeichen der Jefferson Chemical Co., Inc.) wurden durch Kopplung der N-Oxysuccinimid ("NOS")- Ester von ANP-EACA, BBA und nBBA mit den Polymeren fotomarkiert. Diese NOS-Derivate wurden in Mengen von 0,5X zu 1X Jeffamine in sehr trockenen (hochreinen) Lösungen zugegeben (ANP-EAC-NOS in trockenem Tetrahydrofuran, BBA-NOS in trockenem Dioxan oder Dimethylformamid und Nitro-BBA-NOS in trockenem Dioxan oder Dimethylformamid). Nach 16 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur im Dunkeln wurden die Produkte durch TLC in 85/15/1/1/Chloroform/Methanol/H&sub2;O/Essigsäure isoliert. Monosubstituierte Jeffamine-Derivate wurden mit dem TLC-Lösungsmittel extrahiert und mit Wasser azeotrophiert, um Essigsäurereste zu entfernen. Die wasserlöslichen Produkte ANP- EAC-Jeffamine, BBA-Jeffamine und nBBA-Jeffamine wurden in 15%, 10% bzw. 12%-Mengen isoliert.

C. Vorbereitung von ANP-Hyaluronsäure

Der Endzucker der humanen Plazentahyaluronsäue (MWapp 100- 130,000) wurde durch das Perjodat-Verfahren aktiviert, das in E. Junowicz und S.E. Charm, "The Derivatization of Oxidized Polysaccarides for Protein Immobilization and Affinity Chromatography", Biochimica et Biophysica Acta, Band 428 : 157-165 (1976) beschrieben, das hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen wird. Dieses Verfahren bringt mit sich die Zugabe von Natrium- oder Kaliumperjodat zu einer Lösung von Hyaluronsäure, wodurch der Endzucker aktiviert wird. Die Hyaluronsäure wurde einem zehnfachen Überschuß von Jeffaminen zugegeben und konnte 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Die Bindungen wurden stabilisiert durch eine Reduktion mit Natriumcyanborhydrid, gefolgt von einer erschöpfenden Dialyse, um das meiste des überschüssigen Jeffamine zu entfernen. Ein zehnfacher molarer Überschuß an ANP-EAC-NOS in DMF wurde dem Jeffamine-Hyaluronat in 0,1 M Karbonat, pH-Wert 9,0 über eine Spritze zugegeben. Diese Zugabe erforderte 16 Stunden und wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln durchgeführt. Das überschüssige ANP-EAC-NOS und ANP-EAC-Jeffamine wurde durch Gelfiltrationschromatografie entfernt. Die Integrität der Säuregruppe, die für die Fotokopplung des Anteils an dem Kontaktlinsenpolymerrückgrat erforderlich ist, wurde durch Infrarotspektroskopie analysiert, um die ANP-Gruppe festzustellen, durch einen Polyethylenglykolversuch, um den Jeffamine-Abstandshalter festzustellen, und durch einen modifizierten Carbazolversuch, wie er in T. Bitter und H. Muir, "Analytical Biochemistry", Band 4 : 330-334 (1962) beschrieben ist und hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen wird, um den Uronsäuregehalt des Derivats festzustellen.
Der Polyethylenglykolversuch wurde unter Verwendung des Dragendorff-Reagens (Tetrajodwismutsäure-Bariumchlorid) entwickelt. Eine 5 ml-Portion Stammreagens (425 mg Wismutnitrat, 10 gm Kaliumjod in Essigsäure und Wasser) wurde zu 10 ml 10% Bariumchlorid in Wasser zugegeben und eine Hintergrundablesung bei 516+nm wurde aufgenommen. Dann wurden 0,1 ml der Probe zugegeben und der Inhalt durch Umdrehen der Küvette gemischt. Eine Ablesung erfolgte bei 516-nm nach einer Minute Inkubation. Die Werte wurde mit einer Standardkurve verglichen.
Der Carbazolversuch wurde wie folgt durchgeführt. Eine 3,0 ml Portion Schwefelsäurereagens (0,025M Natriumtetraborat-10 H&sub2;O in Schwefelsäure) wurde auf -70ºC abgekühlt. Eine 0,5 ml-Portion der Probe wurde auf die Säure geschichtet und die Mischung wurde gerührt (30 Minuten) bis sie Raumtemperatur erreichte. Die Röhrchen wurden bei 100ºC erhitzt (10 Minuten), ein 0,1 ml Aliquotcarbazolreagens (0,125 Carbazol in absolutem Ethanol) wurde zugegeben, der Röhrcheninhalt wurde gemischt (5 Minuten), bei 100ºC erhitzt (15 Minuten), dann in einem Eisbad auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Proben wurden spektrofotometrisch bei 530 nm gegen eine Schwefelsäurereagenslücke analysiert. Die Ergebnisse wurde mit einer Standardkurve verglichen, die mit 4-40 ug/ml Glukurolactonstandards erstellt wurde. Der Versuch war genau genug, um 20 pmol Hyaluronsäure festzustellen.
Die Fraktionen, die ein ANP, ein Jeffamine und ein Hylaruonatmolekül enthielten, wurden zusammengeführt und als ein biokompatibles Agens verwendet.

D. Vorbereitung von fotomarkierter Hyaluronsäure, Methylzellulose und Chondroitinsulfat

ANP-EAC-Jeffamine, BBA-Jeffamine und Nitro-BBA-Jeffamine wurden an die Carboxylgruppen von Uronsäurerückständen von Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat durch ein Carbodiimidverfahren wie folgt gebunden. Ein 5-molarer Überschuß fotomarkierter Jeffamine und 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimid mit HCl wurde mit dem Polysaccharidpolymer in Wasser gemischt, das mit 0,1N HCl auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt war. Die Mischung konnte bei Raumtemperatur im Dunkeln für 24 Stunden reagieren. Das Produkt wurde durch Gelfiltrationschromatografie gereinigt, dann wie oben beschrieben im Hinblick auf Fotogruppen und Carbonitratgehalt analysiert.

E. Vorbereitung von fotomarkiertem Kollagen

Humanplazenta Typ IV-Kollagen (erhältlich von Sigma Pharmaceuticals) wurde in einer 1 mg/ml Konzentration in 0,1M Borat, pH-Wert 9,0 aufgelöst. ANP-EAC-NOS in DMF, BBA-Sulfo-NOS in Dioxan oder Nitro-BBA-NOS in Dioxan wurde der Kollagenlösung langsam in einem 50x-molaren Überschuß über eine Spritze bei 4ºC im Dunkeln über 16 Stunden zugegeben. Nach vollständiger Zugabe wurde die Mischung 4 Stunden im Kalten gerührt. Das Kollagenprodukt wurde gegen vier Wechsel von PBS dialysiert, dann zentrifugiert, um unlösliche Materialien zu entfernen. Das Aufschwimmende wurde spektrofotometrisch bei 260 nm, 280 nm und 462 nm gemessen, um das Fotogruppen/Proteinverhältnis festzustellen.

F. Vorbereitung von fotomarkierten Proteinasen

ANP-EAC-NOS, BBA-NOS und nBBA-NOS Fotogruppen, die in organischem Lösungsmittel bei Konzentrationen von 25 mg/ml gelöst waren, wurden in 50-molarem Überschuß über eine Spritze bei 4ºC im Dunkeln über 16 Stunden Papain (Papaya, MW 23, 426) zugegeben. Nach vollständiger Zugabe der Fotogruppe wurde die Mischung für zusätzliche 4 Stunden gerührt, dann in PBS dialysiert, um ungekoppelte Fotogruppen zu entfernen. Nach der Dialyse wurde das Produkt zentrifugiert, um unlösliche Materialien zu entfernen. Das Aufschwimmende wurde spektrofotometrisch bei 260 nm, 280 nm und 462 nm gemessen, um das Fotogruppen/Proteinverhältnis abzuschätzen.

2. Fotokopplung biokompatibler Agenzien an Linsenoberflächen

Die oben erhaltenen fotomarkierten biokompatiblen Agenzien wurden den in Tabelle 4 beschriebenen Kontaktlinsenmaterialien zugegeben bei einer Konzentration von 250-1000 pmol Agens/Kontaktlinse. Die Lösung konnte auf den Kontaktlinsen bei Raumtemperatur im Dunkeln für 3 Stunden adsorbieren. Die fotomarkierten Agenzien wurden dann kovalent an den Kunststoff gebunden durch Fotolyse für 12 Stunden bei der geeigneten Wellenlänge (450 nm für ANP und 320 nm für BBA und nBBA Derivate). Nach der Fotolyse wurden die Kontaktlinsen mit 5·5 ml normaler Saline (0,85% NaCl) gewaschen, um nicht kovalent gebundene Gruppen zu entfernen.
Radiomarkierte Gruppen können an die Linsenmaterialien gekoppelt werden, und die Linsenteile mit Tetrahydrofuran und anschließend mit DMSO behandelt werden, um die Radiomarkierung von der festen Oberfläche zu lösen. Szintillationsfluor wird dann zugegeben und die Menge des durch Flüssigszintillationsspektroskopie festgestellten biokompatiblen Agens/cm² wird festgestellt. Repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Beladungsdichten von bikompatiblen Agenzien auf verschiedenen Kontaktlinsenmaterialien Biokompatibles Agens Kontaktlinsenmaterial Kopplungseffizienz ANP-1000 Polyvinylchlorid Sofspin (polymacon) Permaflex Vistamarc Lidofilcon Silikon ** Polymaconknöpfe ANP-4000 Nitro BBA-2000 BBA-2000 ANP-Hyaluronsäure * Es wurde ein Durchschnitt der Werte von 10 Wiederholungsversuchen gebildet ** Polymaconbeladungen sind auf das totale Volumen (cm³) abgestellt und nicht auf die Oberflächenfläche.
Sofspin-Kontakte von Polymacon (Polymethacrylat) mit etwa 38,6% Wasser wurden hergestellt und sind ein Handelsprodukt von Busch & Lomb, Inc.
Permaflex-Kontakte von Polymethacrylat mit etwa 74% Wasser wurden hergestellt und sind ein Handelsprodukt der Coopervision, Inc.
Vistamarc-Kontakte von Polymethacrylat mit etwa 58% Wasser wurden hergestellt und sind ein Handelsprodukt von Johnson & Johnson.
Lidofilcon-Kontakte von Methacrylat mit etwa 70% Wasser wurden hergestellt und sind ein Produkt von Bausch & Lomb, Inc.
Die Werte in Tabelle 4 sind ausgedrückt als pmol biokompatibles Agens pro cm² Oberflächenfläche oder ng/cm².
Die Kopplungseffizienzen wurden auf die Grundlage der Zugabe von 260 pmol/cm² biokompatibles Agens /Kontaktlinsenmaterialien, 710 pmol/cm² biokompatibles Agens/Silikon, und 660 pmol/cm³ biokompatibles Agens/cm³ Polymaconknopf gestellt. ANP-Hyaluronat wurde mit 357 pmol/cm² zu Silikon und bei 1655 pmol/cm³ to Polymaconknopfmaterial zugegeben. Die ANP-Derivate koppelten mit höherer Beladungsdichte als die nBBA-Jeff auf den Hydrogelkontaktlinsenmaterialien. Diese Resultate wurden für die Silikonkomponente umgekehrt.

3. In Vitro-Protein-Adsorptionsuntersuchungen

Künstliche humane Tränen wurden vorbereitet gemäß der Formel, die in B.P. Gloor, "The Lacrimal Apparatus" in Adler's Physiology of the Eye: Clinical Applications (R.A. Moses, ed.), C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1981) gefunden wurde, deren Lehren hierin mit einbezogen werden. Wie in dieser Druckschrift angedeutet ist, sind die in menschlichen Tränen hauptsächlich auftretenden Proteine Serum-Albumin (HSA), Gammaglobulin (HGG) und Lysozym (LYZ). Die in menschlichen Tränen hauptsächlich vorliegende Sterine sind Cholesterin und Cholesterinester.

A. ³H-Proteine

Die Proteinkomponenten wurden durch reduzierende Methylation mit Formaldehyd und tritiummarkiertem Natriumborhydrid tritiummarkiert wie beschrieben bei N. Jentoft und D.C. Dearborn, Journal of Biochemistry, Band 254 : 4359-4365 (1979) und hierin durch Bezugnahme mit einbezogen. Kurz gesagt, wurde das biokompatible Agens in 1 mg/ml Konzentration in 0,1M HEPES, pH-Wert 7,4 durch Formaldehydreagieren mit tritiummarkiertem Natriumborhydrid und Schütteln bei 22ºC für etwa 2 Stunden methyliert. Das Produkt wurde dialysiert gegen PBS in 0,01M Phosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH-Wert 7,4 und affinitätsgereinigt auf Gelatinsepharose. Bindungsmittel wurde eluiert mit 1M Natriumbromid 0,02M Natriumacetat, pH-Wert 5,0, dann gegen PBS, pH-Wert 7,4 dialysiert.

B. Vorbereitung von künstlichen Tränen

Die oben beschriebenen radiomarkierten Proteine wurden bei der Vorbereitung von künstlichen Tränen verwendet. Eine der radiomarkierten Proteine oder das tritiummarkierte Cholesterin wurde in jede Tränenmischung eingeschlossen.- Die anderen Komponenten waren nicht radiomarkiert. Die Kontaktlinsenmaterialien wurden in der künstlichen Tränenlösung für eine Woche bei 37ºC mit leichter Bewegung inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Linsenmaterialien mit 5x10 ml 0,85%-iger NaCl gewaschen. Die Menge des an den Linsenmaterialien adsorbierten Proteins wurde dann durch Flüssigszintillationszählung ermittelt.
Die Resultate der in vitro-Proteinablagerung sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Verringerung der gesamten Proteinablagerung erreichte 85% bei ANP-1000-OH modifizierten Sofspinlinsen. Einzelne biokompatible Agenzien verbesserten oder blieben auf denselben Niveaus wie manche der Kontrollkontaktlinsenmaterialien, aber die Gesamtproteinmengen wurden für alle Linsenmaterialien außer für ANP-1000-OH beschichtete Polymaconknöpfe, ANP-4000-OH beschichtete Polymaconknöpfe und ANP- Hyaluronat beschichtete Polymaconknöpfe reduziert. Diese schlechten Resultate wurde sämtlich mit jungfräulichen Polymaconmaterialien erreicht, die anders zu reagieren scheinen als Polymaconkontaktlinsen, wie Sofspinlinsen. Insgesamt zeigten diese in vitro Proteinablagerungsuntersuchungen signifikante bis dramatische Verringerungen der Proteinablagerung von künstlichen Tränen auf verschiedenen Kontaktlinsenmaterialien über eine Periode von einer Woche. Tabelle 5 In Vitro Proteinadsorption von künstlichen Tränen: ³H Proteine* Biokompatibles Agens Kontaktmaterial % Kontrolle ug Totalprotein % Reduktion Totalprotein Kontrolle Polyvinylchlorid Sofspin (Polymacon) Permaflex Vistamar Lidofilcon Silikon ** Polymaconknöpfe ANP-1000-OH ANP-4000 Polyvinylchlorid Sofspin Vistamar Silikon ** Polymaconknöpfe nBBA-Jeff BBA-Jeff ANP-Jeff * Die Werte wurden anhand von 10 Wiederholungsversuchen berechnet ** Polymaconknöpfe sind auf das Volumen (cm³) und nicht auf die Oberflächenfläche bezogen *** Werte in Klammern bedeuten einen Anstieg der Proteinadsorption
Die Ergebnisse der in vitro Cholesterinablagerungsstudien sind in Tabelle 6 angegeben. Die Menge der Cholesterinablagerungen nach 7 Tagen Inkubation in künstlichen Tränen wurde um bis zu 83% auf Polyvinylchlorid reduziert. Alle Kontaktlinsentypen zeigten eine Reduzierung der Cholesterinablagerung bis auf die Polymaconknopfstücke. Erneut reagieren diese Materialien unterschiedlich als die Kontaktlinsen, die aus demselben Polymer hergestellt sind. Tabelle 6 Cholesterinadsorption von künstlichen Tränen: ³H Cholesterin Biokompatibles Agens Kontaktmaterial *ug Chlolesterin/cm² % Kontrolle % Reduzierung Kontrollen Polyvinylchlorid Sofspin Permaflex Vistamar Lidoflicon Silikon Polymaconknopf ANP-1000 ANP-4000 nBBA-Jeff Tabelle 6: Fortsetzung BBA-Jeff Polyvinylchlorid Silikon Polymaconknopf ANP-Jeff ANP-Hyaluronate * Die Werte sind der Durchschnitt von 10 Wiederholungsversuchen ** Werte in Klammern zeigen eine Zunahme der Cholesterinadsorption an

C. Aminosäureanalyse

Kontroll- und oberflächenmodifizierte Linsen wurden in der künstlichen Tränenlösung für eine Woche bei 37ºC mit leichter Bewegung inkubiert. Die Linsen mit 5 10 ml Wäschen mit 0,85%- NaCl gewaschen, dann hydrolysiert mit 6N HCl und den Hydrolysat-Standardaminosäureanalysen auf einem Aminosäurenanalysator ausgesetzt. Der gesamte Aminosäurengehalt der Kontroll- und oberflächenmodifizierten Linsen wurde miteinander verglichen. Eine Verringrung des gesamten Aminosäurengehaltes zeigte eine Verringerung der Proteinadsorption an.
Die gesamten Aminosäurenanalysen der säurehydrolysierten Kontaktlinsen sind in Tabelle 8 angegeben. Die Resultate sind in gesamten Aminosäuren in nmol/ml ausgedrückt. Diese Resultate zeigen erneut, daß die ANP-1000-OH, ANP-4000-OH und nBBA-Jeff-Modifikationen von Sofspin-Polymaconlinsen die Ablagerung von Proteinen auf den Linsen nach 7 Tagen Inkubation in künstlichen menschlichen Tränen reduzierten. Tabelle 7 Gesamte Aminosäurenanalysen von künstlichen Tränenablagerungen auf Kontaktlinsen Kontaktmaterial Biokompatibles Agens Gesamte Aminosäuren % Reduzierung Sofspin ANP-1000 ANP-4000 nBBA-Jeff Kontrolle Permalens

4. In Vitro Toxizitätsversuche

Die oben beschriebenen biokompatiblen Linsenmaterialien wurden auf irritierende oder Toxizitätsreaktionen untersucht. Kontroll- und biokompatible Linsen wurden unter sterilen Bedingungen vorbereitet, wobei das abschließende Waschen in einer laminaren Strömungskappe durchgeführt wurde. Die Linsen wurden in einer Lösung aus einem bekannten hochglukosen Zellmedium, wie Dulbecco's modifiziertem Essentialmedium, mit 10% fötalem Kalbsserum und 5% Glutamin (wozu antibiotische und antifungale Agenzien zugegeben wurden) angeordnet. Teile einer lebensfähigen 3 bis 5 Monate fötalen Rinderhornhaut wurden auf den Linsen angeordnet. Die Epithelialoberfläche der Hornhaut wurde in manchen Untersuchungen in Kontakt mit der Linsenoberfläche angeordnet, während in anderen Untersuchungen die Endothelialzelloberfläche direkt auf der Linsenoberfläche angeordnet wurde. Die Systeme wurden in Kulturen bei 7 bis 10% CO&sub2; und 37ºC für Perioden von 1 bis 2 Wochen angeordnet. In verschiedenen Intervallen nach der Initiierung der Kultur wurden die Lebensfähigkeiten der Epithelialund/oder Endothelialzellen durch Färbeverfahren überprüft.

5. In Vitro-Untersuchung der Stabilität der kovalenten Bindung

Die Stabilität der kovalenten Befestigung wurde überprüft, indem das oberflächenmodifizierte Polymacon (Polymethacrylat) enzymatischem Reinigungsmittel (Papain), thermischer Desinfektion und chemischer Desinfektion (gepufferte wäßrige Lösung mit Natriumchlorid, Natriumborat und Borsäure) ausgesetzt wurde. Die Resultate sind in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8 Stabilität kovalenter Verbindungen bei Reinigungsdesinfektionsverfahren Biokompatibles Agens Behandlung Verbleibend ANP-1000 Keine Behandlung enzymatisches Reinigungsmittel Kochen chemisches Reinigungsmittel ANP-4000 nBBA-2000 BBA-2000 ANP-Hyaluronat * Die Werte sind der Durchschnitt von 10 Wiederholungsversuchen
Die kovalenten Bindungen blieben unter enzymatischer Reinigung und thermischer Desinfektion zu 100% stabil. Ein gewisser Verlust an biokompatiblem Agens trat bei den chemischen Desinfektionsverfahren auf, außer bei ANP-Hyaluronat.

6. In Vivo Überprüfung der Biokompatibilität

Vorläufige in vivo Biokompatibilitätsüberprüfungen wurden an Kaninchenmodellsystemen durchgeführt. Eine Population von wenigstens 24 Lebewesen wurde bei dieser Studie verwendet. Sclerallinsen, die zum Einpassen in Kaninchenaugen ausgebildet sind, wurden in diesen Studien verwendet. Die Kaninchen trugen Linsen entsprechend dem nachfolgenden Plan:
6 Kaninchen keine Linse im linken Auge, Kontrollinse im rechten Auge
6 Kaninchen Kontrollinse im linken Auge; physikalisch behandelte Linse (dieselbe physikalische Behandlung wie bei oberflächenmodifizierten Linsen, jedoch keine Beschichtung mit biokompatiblem Agens) im rechten Auge
12 Kaninchen Kontrollinse im linken Auge, oberflächenmodifizierte Linse im rechten Auge.
Die Kaninchen wurden vor dem Einsetzen der Linsen in die Kaninchenaugen mit Ketamin/Xylazin betäubt. Eine Methylzellulose/normale Saline-Befeuchtungslösung wurde stündlich aufgebracht, um eine adäquate Augen- und Linsenschmierung aufrechtzuerhalten. Die Kontaktlinsen wurden 8 Stunden pro Tag getragen. Nach ausgewählten Perioden des Linsentragens wurden die Kaninchen mit einer Schlitzlampe und Fluoreszinfarbverfahren analysiert. Der Grad der Augenirritation wurde mittels der McDonald-Shadduck-Skala eingeteilt, wie sie in T.O. McDonald und J.A. Shadduck, "Eye Irritation" in Advances in Modern Toxicology, Band 4, Seiten 162-166 (1977), das hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen wird, beschrieben sind. Das McDonald-Shadduck-Verfahren erlaubt dem Untersuchenden, Konjuktivalkongestion, Konjunktivalschwellung, Konjunktivalausscheidung, wäßriges Aufleuchten, Iriseinbeziehung und Hornhauttrübung und andere Eigenschaften auf einer Skala von 0 bis 4 einzuteilen, wobei 0 normal ist und +4 die am meisten vollständige Einbeziehung darstellt.
Die Ergebnisse der in vivo Kaninchenuntersuchungen sind in Tabelle 9 angegeben. Die McDonald-Shadduck-Ergebnisse für die Kaninchen sind in der Tabelle angegeben. Mann-Whitney U-Tests wurden mit diesen Resultaten durchgeführt und zeigten, daß keine statistischen Differenzen zwischen den oberflächenmodifizierten und Kontrollinsen bestanden (p < 0,05). Daher zeigen diese Tests, daß in dieser 4 Tage Studie an Kaninchen keine feststellbaren Unterschiede hinsichtlich Konjunktivalkongestion, Konjunktivalschwellung, Konjunktivalausscheidung, wäßrigem Aufleuchten, Iriseinbeziehung, Hornhauttrübung, Pannusgefäßbildung, oder Epithelial-Beschädigung der oberflächenmodifizierten Linsen im Vergleich zu Kontrollinsen festgestellt wurden. Die bei den Kontroll- und den modifizierten Linsen gezeigte Irritation scheint mit der Toleranzentwicklung der Kaninchen gegenüber Kontaktlinsen verbunden zu sein. Tabelle 9 Durchschnittliche McDonald-Shadduck-Ergebnisse für in vivo Kaninchenuntersuchungen Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Kontrollinse oberflächenmodifizierte Linse

Beispiel 3

Kopplung von Albumin, Heparin und Urokinase an Polyurethanrohre

1. Vorbereitung von fotomarkiertem Albumin

Serum Albumin (von Kaninchen) wurde in 0,1 M Boratpuffer bei einem pH-Wert von 9,0 aufgelöst. Ein Volumen von 4-Azido-2- Nitrophenyl-6-Aminocaproyl-N-Oxysucciniinid (ANP-EAC-NOS )- Lösung wurde bei 25 mg/ml in DMF unter Rühren bei Raumtemperatur im Dunkeln über etwa 12 Stunden unter Verwendung einer Spritze dem Albumin zugegeben, um einen zehnfachen molaren Überschuß von ANP-EAC-NOS gegenüber Albumin zu erhalten. Die Lösung wurde dann im Dunkeln gegen drei 1 l Volumen phosphatgepufferter Saline (PBS) dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung zentrifugiert, um unlösliche Materialien zu entfernen. Die Adsorption bei 470 nm einer 1/100 Verdünnung wurde fotospektrometrisch gemessen, um das ANP-Albuminverhältnis zu schätzen.

2. Fotokopplung von Albumin an Polyurethanröhren

Eine Polyurethanröhre wurde in Dioxan für 30 Sekunden eingetaucht, wonach es sofort mit deionisiertem Wasser gespült wurde. Das geätzte Rohr wurde in eine Lösung aus fotoreaktivem Albumin für wenigstens 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Mischen eingetaucht. Das Rohr wurde dann für wenigstens 10 Minuten im Dunkeln luftgetrocknet, dann für wenigstens eine Stunde einem hochintensiven sichtbaren Licht ausgesetzt. Das Eintauchen in fotoreaktives Albumin, Trocknen und Fotolysieren wurde zweimal wiederholt, wobei beim letzten Mal das Eintauchen über Nacht erfolgte. Das Rohr wurde dann in 1,0 N NaCl für eine Stunde bei Raumtemperatur gewaschen. Die NaCl-Lösung wurde während der einen Stunde wenigstens einmal ausgewechselt.

3. Kopplung von Heparin an Albumin auf einem Polyurethanrohr

Das Albumin-Polyurethanrohr wurde in 5,0 ml deionisiertes Wasser eingetaucht. 200 mg 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodimid (EDC) wurde in dem Wasser aufgelöst, und dann der pH-Wert mit 1N HCl auf 4,0 eingestellt. Ein ml Wasser mit 30 mg Heparin wurde der EDC-Lösung zugegeben. Der pH-Wert wurde erneut mit 1N HCl auf 4,0 eingestellt. Die das eingetauchte Polyurethanrohr enthaltende Lösung wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur gemischt, woraufhin weitere 200 ml EDC zugegeben wurden. Die Reaktion konnte dann über Nacht bei Raumtemperatur weitergehen. Das Rohr wurde dann in PBS abgespült, um ungekoppeltes Heparin und Reaktionsnebenprodukte zu entfernen.

4. Kopplung von Urokinase an Albumin auf einem Polyurethanrohr

Ein Polyurethanrohr mit darauf immobilisiertem Serum-Albumin wurde in 1,25% Glutaraldehyd in 0,1M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, für 15 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur eingetaucht. Das Rohr wurde dann in deionisiertem Wasser für 30 Minuten gewaschen, wobei das Wasser während dieser Zeit wenigstens einmal gewechselt wurde. Das Polyurehtan-Albumin-Glutaraldehyd wurde dann in eine Lösung aus Urokinase (8,3 Einheiten/ml, 2-3 mg/ml) in 0,1M Borat eines pH-Werts von 9,0 eingetaucht und über Nacht bei 4ºC gemischt. Das Rohr wurde dann für 4 Stunden in PBS abgespült, woraufhin es auf Urokinaseaktivität untersucht wurde.
Zwei Polymere wurden als die feste Oberfläche verwendet, Polyurethan und Polyhema. Die modifizierten Oberflächen erbrachten 1-10 mg Heparin/cm² an 0,6-1,3 mg Urokinase/cm².

Beispiel 4

Kopplung eines Films an eine feste Oberfläche

Bildung eines Beschichtungsfilms und seine kovalente Befestigung an einer Oberfläche. Vorbereitung von ANP-Hyaluronsäure.

Fotomarkierte Derivate der Hyaluronsäure (ANP-EAC-Jeffamine, BBA-Jeffamine und Nitro-BBA-Jeffamine) wurden wie oben beschrieben vorbereitet.
Filme wurden aus dem fotoreaktiven Beschichtungsmaterial gebildet und im Dunkeln an Oberflächen von Kontaktlinsen (durch Eintauchen und Trocknen) angeordnet. Kovalente Befestigung der Biomaterialoberfläche und Verstärkung des Films durch intermolekulare Querverbindungen können durch Beleuchtung erreicht werden.
Bei einem weiteren Beispiel wird ein künstliches Hüftgelenk in ANP-EAC-Jeffamine-Hyaluronsäure (1 : 1 mg/ml) für 3 Stunden im Dunkeln getränkt. Das Gelenk wird dann aus der Lösung entfernt und trocknen gelassen, wobei sich ein dünner Film Beschichtungsmaterial auf dem künstlichen Gelenk ausbildet. Der Film wird dann durch Beleuchtung mit 400 bis 450 nm für 8 Stunden bei 4ºC an dem Gelenk befestigt. Das Gelenk wird dann in physiologischer Saline gespült, um ungekoppelte ANP- EAC-Jeffamine-Hyaluronate zu entfernen. Die Hyaluronsäure, die an den Knochen gebunden ist, reduziert die Reibung und reduziert die Abnutzung des Knochens im Gelenkbereich.
100 ml Rinderserum-Albumin wird in 2 ml von 1M Boratpuffer, pH-Wert 9 aufgelöst. 14 mg ANP-AUD-NOS wird in 50 ul Dimethylformamid (DMF) aufgelöst. Die ANP-AUD-NOS-Lösung wird dann der BSA-Lösung langsam über 15 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln und bei gutem Rühren zugegeben. Nach zusätzlich 3 bis 4 Stunden Rühren wird die Lösung gegen 1M Boratpuffer bei pH-Wert 9 im Dunkeln über 24 Stunden mit wenigstens vier Wechseln von jeweils 21 Puffer dialysiert. Das dialysierte ANP-BSA wird auf Paraffinfilme in 100 ul Aliquoten pipettiert und im Dunkeln getrocknet. Nach dem Trocknen der Filme werden diese mit 100 ug Aliquoten von 1,25% Glutaraldehyd und Boratpuffer, pH-Wert 9, überzogen und für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Filme werden dann durch langsam darauf tropfendes Wasser gewaschen, während sie immer noch auf den Paraffinfilmen sind, und das Wasser kann ablaufen. Nach einer Stunde eines solchen Waschens werden die Filme wieder getrocknet und dann vorsichtig von dem Paraffinfilm abgehoben und zu einer Kunststoffoberfläche (bspw. Polyurethan) überführt. Auf der Kunststoffoberfläche werden die Filme erneut befeuchtet mit Wasser, das 20% Dioxan enthält, und dann im Dunkeln wieder getrocknet. Die Filme auf den Kunststoffoberflächen werden dann für 4 Stunden bei 4ºC hochintensivem sichtbarem Licht ausgesetzt, um den Film an die Oberfläche zu binden, wobei ein Gebläse über die Oberfläche bläst, um eine übergroße Aufheizung der Oberfläche zu verhindern.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer biokompatiblen Vorrichtung aus einem Biomaterialsubstrat mit fester Oberfläche, wobei:

die feste Oberfläche durch Verwendung eines chemisch verbindenden Anteils, der eine fotochemisch reaktive Gruppe und eine andere reaktive Gruppe aufweist, mit einer biokompatiblen Oberfläche versehen wird, die ein biokompatibles Agens enthält;

dadurch gekennzeichnet, daß bei dem chemisch verbindenden Anteil eine der Gruppen auf eine Aktivierung durch einen Reiz nicht reagiert, auf welche die andere Gruppe reagiert;

daß ein Reiz aufgebracht wird, um nacheinander die Gruppen zu aktivieren, um die unterschiedlichen reaktiven Gruppen kovalent an die Moleküle des biokompatiblen Agens zu binden und um den verbindenden Anteil mit einer ausreichenden Populationsdichte fotochemisch kovalent an die feste Oberfläche zu binden, um die Moleküle des biokompatiblen Agens in die Lage zu versetzen, die feste Oberfläche mit der biokompatiblen Oberfläche wirksam abzuschirmen;

wobei der chemische verbindende Anteil die Formel A-X-B aufweist, in welcher:

A für eine fotochemisch reaktive Gruppe steht, die sich in Reaktion auf eine spezifische Aktivierung kovalent an die feste Oberfläche binden kann;

B für eine andere reaktive Gruppe steht, die in Reaktion auf eine spezifische Aktivierung, auf welche die Gruppe A nicht reagiert, eine kovalente Bindung zu dem biokompatiblen Agens bilden kann; und

X für einen relativ inerten, keinen Einfluß ausübenden Skelettanteil steht, der die Gruppen "A" und "B" verbindet, wobei der Skelettanteil gegenüber einer Spaltung in wäßrigen physiologischen Fluiden widerstandsfähig ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die andere reaktive Gruppe eine thermochemisch reaktive Gruppe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die andere reaktive Gruppe eine fotochemisch reaktive Gruppe ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Anregung zur Aktivierung der fotochemisch reaktiven Gruppen anschließend an die Aufbringung der Anregung zur Aktivierung der anderen reaktiven Gruppe aufgebracht wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Oberfläche im wesentlichen thermochemisch inreaktiv ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 mit folgenden Schritten:

Vorsehen eines chemisch verbindenden Anteils, der eine fotochemisch reaktive Gruppe aufweist, die in der Lage ist, sich bei Aktivierung kovalent an die feste Oberfläche zu binden, sowie eine andere reaktive Gruppe, die in der Lage ist, sich an die Moleküle des biokompatiblen Agens zu binden, wobei eine der Gruppen nicht auf einen Reiz anspricht, auf welchen die andere Gruppe anspricht;

Aktivierung der anderen reaktiven Gruppe des chemisch verbindenden Anteils bei Gegenwart von Molekülen des biokompatiblen Agens, um zu bewirken, daß sich die andere reaktive Gruppe im chemisch verbindenden Anteil kovalent an die Moleküle bindet; und

Aktivieren der fotochemisch reaktiven Gruppe des chemisch verbindenden Anteils bei Gegenwart der festen Oberfläche des Biomaterials, um zu bewirken, daß die fotochemisch reaktive Gruppe sich in einer ausreichenden Populationsdichte kovalent an die feste Oberfläche bindet, um eine biokompatible wirksame Oberfläche zu schaffen.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei X eine C&sub1;-C&sub1;&sub0; Alkylgruppe ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gruppe A aus folgender Gruppe ausgewählt wird: Aryl-, Alkyl- und Akylsäuren; Alkyl- und 2-Ketodiazo-Derivate und Diazyrine (Karbengeneratoren); aromatische Ketone (Triplett Sauerstoffgeneratoren), aromatische Diazoniumderivate und Karbonium-Ion und Radikalgeneratoren.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Gruppe A aus folgender Gruppe ausgewählt wird: Azidonitrophenyle, Fluoroazidonitrobenzine und aromatische Ketone.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gruppe B eine thermochemisch reaktive Gruppe ist, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

Nitrophenylhalogenide, Alkylamino-, Alkylcarboxyl-, Alkylthiol-, Alkylaldehyd-, Alkylmethylimidat-, Alkylisozyanat-, Alkylisothiozyanat- und Alkylhalogenidgruppen.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gruppe B aus folgender Gruppe ausgewählt wird: Carboxyl-Gruppen, Hydroxyl-Gruppen, primäre Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Maleimide und Halogenidgruppen.

12. Biokompatible Vorrichtung mit:

einem Substrat aus einem Biomaterial, das eine feste Oberfläche aufweist, und Moleküle eines biokompatiblen Agens trägt;

einem chemisch verbindenden Anteilsrückstand, der einzelne Moleküle des biokompatiblen Agens an die feste Oberfläche bindet;

dadurch gekennzeichnet, daß der chemisch verbindende Anteilsrückstand einen Rest einer fotochemisch reaktiven Gruppe umfaßt, die kovalent an die feste Oberfläche gebunden ist, und einen Rest einer anderen reaktiven Gruppe umfaßt, die kovalent an die Moleküle des biokompatiblen Agens gebunden ist, wobei der Rest der fotochemisch reaktiven Gruppe so an die feste Oberfläche gebunden ist, daß die einzelnen Moleküle des biokompatiblen Agens ausreichend nahe beieinander angeordnet sind, um zu bewirken, daß die Moleküle die feste Oberfläche wirksam abschirmen, und um eine biokompatibel wirksame Oberfläche zu schaffen, wobei der chemisch verbindende Anteil die Formel A-X-B aufweist, in welcher

A für eine fotochemisch reaktive Gruppe steht, die in der Lage ist, sich in Reaktion auf eine spezifische Anregung kovalent an die feste Oberfläche zu binden;

B für eine andere reaktive Gruppe steht, die in der Lage ist, in Reaktion auf eine spezifische Aktivierung, auf welche die Gruppe A nicht reagiert, eine kovalente Bindung zu dem biokompatiblen Agens zu bilden; und

X für einen relativ inerten, keinen Einfluß ausübenden Skelettanteil steht, der die Gruppen "A" und "B" verbindet, wobei der Skelettanteil einer Spaltung in wäßrigen physiologischen Fluiden widersteht.

13. Biokompatible Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Vorrichtung dazu geeignet ist, in einen Körper implantiert zu werden.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die feste Oberfläche im wesentlichen thermochemisch inreaktiv ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Agens ein Zellbefestigungsfaktor ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei der Zellbefestigungsfaktor Laminin oder Fibronektin ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Agens ein Wachstumsfaktor ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei der Wachstumsfaktor ein Endothel-Wachstumsfaktor, ein Epithel-Wachstumsfaktor, ein Osteoplast-Wachstumsfaktor, ein Fibroplast-Wachstumsfaktor, ein Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor, ein neuraler Wachstumsfaktor oder ein Angeogenin-Wachstumsfaktor ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Agens Kollagen ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Agens Albumin ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Agens ein hydrophiles Polymer ist.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei das hydrophile Polymer Polyethylenglykol, Hyaluronsäure, Methylzellulose, Kollagen, Chondroitinsulfat oder Chitosan ist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 22, wobei die feste Oberfläche eine Vaskulargraftrohr, ein Dialyserohr oder eine -membran, ein Blut mit Sauerstoff anreicherndes Rohr oder eine solche Membran, eine Ultrafiltrationsmembran, eine Bluttasche, ein Katheter, ein intraaortischer Ballon, eine Naht, eine weiche oder harte Gewebeprothese, eine synthetische Prothese, ein künstliches Organ oder eine Augenlinse ist.

24. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Moleküle des biokompatiblen Agens miteinander verbunden sind, um einen biokompatiblen Film zu bilden.

25. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Agens ein Antimikrobenagens ist.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, wobei das biokompatible Agens Lysozym oder Penicillin ist.

27. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Agens ein Anti-thromboseerzeugendes Mittel ist.

28. Vorrichtung nach Anspruch 27, wobei das Anti-thromboseerzeugende Mittel Heparin, Streptokinase, Gewebeplasminogen-Aktivator oder Urokinase ist.

29. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Gruppe X des biokompatiblen Agens ein Polyethylenglykol oder ein Polypeptid ist.

30. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Agens eine Fettsäure ist.

31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 30, wobei die feste Oberfläche ein polymeres Substrat ist.

32. Vorrichtung nach Anspruch 31, wobei das polymere Substrat Polyurethan, Polyvinylpyrolidon, Polyamid, Polyamin, Polytetrafluoroethylen, Poly-(φ-phenylenterephtalamid), Polyvinilchlorid, Polypropylen, Polyacrylat, Pholymetacrylat, Polyacrylamid, Polyimin, Polyester, Polyethylen, Cellulose oder Silikon ist.

33. Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei die Linse für das Auge eine Kontaktlinse oder eine intraokulare Linse ist.

34. Biokompatible Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Vorrichtung eine Zellkulturvorrichtung mit einer festen Oberfläche ist, die Moleküle eines biokompatiblen Agens trägt, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Wachstumsfaktoren, Zellbefestigungsfaktoren, synthetischen Polymeren, antithrombogenen Mitteln, Kohlenhydraten, Fettsäuren und Antimikrobenmitteln, sowie einen chemisch verbindenden Anteilsrest, der die einzelnen Moleküle des biokompatiblen Agens kovalent an die feste Oberfläche bindet, wobei der chemisch verbindende Anteilsrückstand einen Rest einer fotochemisch reaktiven Gruppe umfaßt, die kovalent an die feste Oberfläche gebunden ist, und einen Rest einer anderen reaktiven Gruppe, die kovalent an die Moleküle des biokompatiblen Agens gebunden ist, wobei eine der Gruppen auf einen Reiz nicht reagiert, auf welchen die andere Gruppe reagiert, wobei der Rest der fotochemisch reaktiven Gruppe so an die feste Oberfläche gebunden ist, daß einzelne Moleküle des biokompatiblen Agens ausreichend nahe beieinander angeordnet sind, um zu bewirken, daß die Moleküle die Oberfläche wirksam abschirmen, und um eine biokompatibel wirksame Oberfläche zu bilden.

35. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 34, wobei die Vorrichtung in einer Form vorgesehen ist, die aus der aus Platten, Blättern und Rohren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

36. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 34, wobei die Vorrichtung eine polymere Oberfläche zur Zellbefestigung aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polypropylen, Polyfluortetraethylen, Silikonelastomer, Polyuretan, Polystyrol und Polyacrylaten, einschließlich Polymetacrylaten besteht.

37. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 34, wobei das biokompatible Agens ein Wachstumsfaktor ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fibronectin, Laminin, Kollagen, Endothel-Wachstumsfaktor und Humanserumalbumin besteht.

38. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 34, wobei das synthetische Polymer ein hydrophiles synthetisches Polymer ist.

39. Verfahren nach Anspruch 1, wobei X eine C1-10 Alkylgruppe wie Polymethylen, ein Kohlenhydrat wie Polymethylol, ein Polyoxyethylen wie Polyethylenglykol oder ein Polypeptid wie Polylysin ist.

40. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Gruppe A aus der Gruppe entnommen wird, die aus Aryl-, Alkyl-, Akylsäuren; Alkyl- und 2 ketodiazo-Derivaten und Diazyrinen (Karbengeneratoren); aromatischen Ketonen (Triplett Sauerstoffgeneratoren); aromatischen Derivaten und Karbonium-Ion und radikalen Generatoren besteht.

41. Vorrichtung nach Anspruch 40, wobei die Gruppe A aus Azidonitrophenylen, Fluoroazidonitrobenzinen und aromatischen Ketonen ausgewählt wird.

42. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Gruppe B eine thermochemisch reaktive Gruppe ist, die aus Nitrophenylhalogeniden, Alkylamino-, Alkylcarboxyl-, Alkylthio-, Alkylaldehyd-, Alkylmethylimidat-, Alkylisozyanat-, Alkylisothiozyanat- und Alkylhalogenidgruppen besteht.

43. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Gruppe B aus Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, primären Aminogruppen, Thiolgruppen, Maleimiden und Halogenidgruppen ausgewählt wird.

44. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei X ein C1-C10-Alkylgruppe ist.

45. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei X eine C1-10-Alkylgruppe wie Polymethylen; ein Kohlenhydrat wie Polymethylol; ein Polyoxyethylen wie Polyethylenglykol oder ein Polypeptid wie Polylysin ist.

46. Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei das Polypeptid Polylysin ist.