JP2981488B2 - 生物適合性フィルムを有する生体用材 - Google Patents
生物適合性フィルムを有する生体用材Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生物適合性フィルム
を有する生体用材に関するものである。より詳しくは本
発明は、フィルム状の生物適合剤を有し、そして生物適
合性が強化された種々の生体用材およびその製造方法に
関するものである。 【０００２】 【従来の技術】代用血管、合成物の眼内レンズ、電極、
カテーテルその他のような生体用材の体内および体表へ
の移植は急速に発展している医学の分野である。合成の
血管用グラフト（移植片）のような生体用材移植物を長
期間使用する際の第一の障害は満足すべきグラフト表面
を持たないことである。例えば、プラスチック製の合成
血管の非処理表面は、急速な血栓形成作用を刺激するこ
とが多い。種種の血漿蛋白質はプラスチック表面におい
て血小板およびフイブリン沈着を起こさせる。このよう
な作用が血流障害となる血管圧縮につながり、それに引
き続く炎症反応が合成移植物の機能を失わせることにつ
ながる。「生体用材」（バイオマテリアル）とは、実際
上、体液に不溶で、体内または体表面に置くか、体液と
接触させるように設計され、つくられた機材を云う。血
管グラフトおよびコンタクトレンズが生体用材の例であ
る。 【０００３】理想的には、生体用材は次のような性質を
持つ。 １． 凝血、組織死、腫瘍形成、アレルギー反応、異物
反応（拒否反応）または炎症反応のような、体内での望
ましくない反応を誘導しない。 ２． 目的通りに機能するために要求される、強度、弾
性、透過性および柔軟性のような物理的性質を持つ。 ３． 容易に精製、製造および滅菌できる。 ４． １時間であれ一生涯であれ、体内に移植され、ま
たは体と接触している間は、その物理的住質および機能
を実際上保っている。 【０００４】生物体に対し、正味で有益な効果を与えつ
つ生物体の生物学的液体および／または組織と接触して
機能し、存在し得るならば、ここに使ったように、その
生体用材の固体表面は「生物適合性」としての性質を持
つ。宿主生物にとっての妨害を低減するために長期の生
物適合性が望まれる。 【０００５】移植物体の生物適合性を改善するため多く
の解決法が提案されてきた。ひとつの解決法は、望まし
くない蛋白質の付着を防ぐために生体用材に低分極性表
面、負荷電表面または酵素、内皮細胞や蛋白質のような
生物学的物質によって被覆した表面を与えることによっ
て、生体用材の表面を修飾することであった。固体表面
をヘパリン、アルブミンおよびストレプトキナーゼのよ
うな生化学材で被覆して血栓耐性を強化した。特にアル
ブミンはポリマー表面に物理的に吸着され、静電的およ
び共有的に結合される。 【０００６】アメリカ特許第４，５３０，９７４号明細
書においてマンロー等（Ｍｕｎｒｏｅｔ ａｌ）は、ア
ルブミンが選択的に結合する非イオン性疎水性脂肪族鎖
を表面に共有結合させることにより、ポリウレタンのよ
うな水不溶性ポリマーにアルブミンを吸着させる方法を
発表している。アメリカ特許第４，３７８，２２４号明
細書においてニンニ等（Ｎｉｍｎｉｅｔ ａｌ）は、補
綴物をつくるために使用される動物組織を、主としてカ
ルシウム化阻害剤からなる三次元架橋マトリックスを形
成させることにより被覆する方法を示している。 【０００７】生体用材の存在で起る副作用の一例はコン
タクトレンズ上への蛋白質の沈着である。コンタクトレ
ンズ装着者は時間が経つにつれてコンタクトレンズに対
してしばしば我慢ができなくなる。これは装着している
間にレンズ上に沈着した生化学物質（蛋白質、脂質、ム
コ多糖その他）に対する刺激およびアレルギー反応と結
びついている。現在行われている洗浄および消毒法でこ
れら沈着物をある程度除去できるが、これらの方法はし
ばしばレンズに穴やひびを残し、それが装着者の眼への
刺激を更に加えたシ、一層生化学物質沈着の中心になっ
たりする。 【０００８】アメリカ特許第３，９５９，０７８号明細
書においてガイア（Ｇｕｉｒｅ）はアミノエチルセルロ
ースまたはアルキルアミンガラスに酵素を共有結合する
試薬を使用することを記載している。下記のものも参
照。ガイア（Ｇｕｉｒｅ）、酵素安定化および固定化の
ための段階的熱光化学的架橋；エンザイム エンジニア
リング３巻６３−７０頁（１９７８年）（Ｅｎｚｙｍｅ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：６３−７０（１９７
８））およびガイア（Ｇｕｉｒｅ）、酵素および他の生
化学物質の光化学的固定化、メソーズ イン エンザイ
モロジー ＸＬＩＶ巻、２８０−２８８頁（１９７６
年）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
ＸＬＩＶ：２８０−２８８（１９７６））。固体表面に
連結試薬を熱化学的にカップリングさせ、次いでこの連
結試薬に酵素を光化学的にカップリングさせることによ
ク、調節した孔を持つガラス、セルロース、アガロース
およびポリアクリルアミドのような基質に酵素を共有的
に結合させて体外診断分析を行う際に有用な表面をつく
る方法がこれらの文献に記載されている。 【０００９】〔課題を解決するための手段〕本発明は望
ましい生物適合性表面を与えられた生体用材に関する。
生体用材の固体表面を修飾する方法には、生物適合性剤
の分子と、活性化することにより固体表面に共有結合す
ることができる光化学反応性基および活性化することに
より生物適合性剤の離れた分子に共有結合することがで
きる別の反応性基を持つ化学的連結性基の分子を使用す
る。これらの基の一方は他方の基が応答する刺激による
活性化に対して応答しない。本方法は、刺激を加えて基
を順次活性化し、連結基の上記の別の反応性基を生物適
合性剤の分子に共有結合させ、次いで生物適合性剤の分
子が固体表面を効果的に覆いつくすに十分な表面密度を
持たせて固体表面に連結基を光化学的に共有結合させる
ことにより、生物適合性の効果ある表面を得ることを特
徴とする。 【００１０】生物適合性の「効果ある」表面は、連結基
を介して生体用材の固体表面に共有結合的に連結され
て、生物適合性剤が持っているものと実質的に同じ生物
適合性の性質を持つ表面を得るようにした、生物適合性
剤の複数の分離した分子から形成されている。生物適合
性剤の分子によって形成された効果ある表面は生体用材
の全表面を覆う必要はない。表面を点で覆ってよい。例
えば、血管グラフトの表面に沿った点をフィブロネクチ
ンのような細胞付着因子で被覆してよい。このような点
で形成された生物適性の効果ある表面はこの修飾した表
面への細胞付着の中心として働く。連結基の別の反応性
基は、最初に述べた光化学的な反応性基が応答する刺激
に応答せず、生物適合性剤が共有結合する熱化学的基ま
たは光化学的基であることが望ましい。 【００１１】本発明のもうひとつの実施態様として、化
学的連結基残基で器具の固体表面に共有的に連結された
生物適合性剤の離れた分子で形成された、生物適合性の
効果ある表面を持つ器具を得ることである。化学的連結
基残基には、固体表面に共有的に結合された光化学的反
応性基の残基、および、生物適合性剤の分子に共有結合
された別の反応基の残基で、その反応基はもうひとつの
反応基が応答する刺激に応答しない反応基のひとつであ
るものを含む。生物適合剤の個々の分子は、たがいに十
分に近づいて固体表面を効果的に覆い、生物適合性の効
果ある表面となるように、固体表面に連結基残基を介し
て付着している。生物適合性剤はそれぞれの器具の機能
を高めるようなものを選択する。例えば、コンタクトレ
ンズの機能は、ポリエチレングリコール分子をレンズ表
面に付着させて表面への蛋白質の沈着を低減することで
高められる。もうひとつの例としては、フイブロネクチ
ンまたはラミニンのような細胞付着因子をポリ塩化ビニ
ル表面を持つ器具に結合させて器具への細胞付着を増加
させる。これはカテーテルや付用血管のような移植物の
場合に望ましい。 【００１２】更に、もうひとつの本発明の実施態様に、
生物適合性剤をたがいに結びつけて生物適合性のフィル
ムとした生物適合剤の分子と、生体用材の固体表面にこ
のフィルムを連結することができる化学的連結基を使用
する、生体用材の固体表面を修飾する方法が含まれる。
この化学的連結基には、活性化によって固体表面に共有
結合され得る光化学反応性基、およびフィルムに共有結
合された（例えば、フィルムをつくっている生物適合性
剤の残基に共有結合された）反応基の残基が含まれる。
反応基のひとつは他の反応基が応答する刺激に応答しな
い。この方法には光化学的反応基を刺激で活性化して生
物適合性分子を共有結合させることが含まれる。本明細
書で「結びつける」ということは、隣接した生物適合性
剤分子を共有結合させるだけでなく、水素結合、イオン
結合、ファンデルバール力による結合その他のような力
により引起される相互作用を云う。たがいに結びつけら
れてフィルムを形成した分子を持つ生物適合性剤は、一
種の剤の分子でもよいし、ヘパリンとアルブミンのよう
な二種以上の剤の分子でもよい。 【００１３】〔発明の実施の形態〕本発明の生物適合性
を示す固体表面は生理的液体に不溶の合成または天然の
材料が望ましい。その表面は、生きている生物の組織お
よび／または液体に接触して機能するよう意図された器
具のひとつ以上の表面であってよい。器具の固体表面は
研磨されたチタンまたはステンレススチールのようない
かなる好適な金属、またはポリウレタン、ポリビニルピ
ロリドン、シリコンエラストマー、ポリエチレン、ポリ
テトラフルオロエチレン、ポリ−（ｐ−フェニレンテレ
フタルアミノード）、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレ
ン、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアクリレート
（ポリメタクリレートを含む）のようなポリマー；ヒド
ロキシアパタイトのようなミネラルまたはセラミック
ス；骨、皮ふおよび歯のような人の組織；木材、セルロ
ースおよび圧縮炭素のような有機材料；およびガラス、
ゴム、木材のような他の天然および合成の材料であって
よい。本発明の生物適合性表面を持った器具の例は、血
管グラフトチューブ、透析チューブまたは膜、血液オキ
シジェネイターチューブまたは膜、限外▲ろ▼過膜、大
動脈内バルーン、血液バッグ、カテーテル、縫合糸、軟
質または硬質組織補綴、合成補綴、人工器官、およびコ
ンタクトおよび眼内レンズのような眼のためのレンズで
ある。 【００１４】固体表面は熱化学的に反応性のないものが
望ましい。「熱化学的に反応性のない」とは熱化学的に
反応する表面の能力を高めるために考えられたいかなる
表面処理もされていないという意味である。熱化学的に
反応性のない表面の例はポリテトラフルオロエチレン、
ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ
ビニルピロリドン、シリコンエラストマー、ステンレス
スチールおよびチタンである。 【００１５】生物適合性剤の分子を生体用材の表面に付
着させて生物適合性を改善する。生物適合性剤は、内皮
細胞増殖因子、造骨細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因
子、血小板誘導増殖因子、神経生長因子、または脈管形
成生長因子のような増殖因子；ライソザイムまたはペニ
シリンのような抗菌剤；ヘパリン、アルブミン、ストレ
プトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰ
Ａ）またはウロキナーゼのような抗血栓形成剤；コラー
ゲンのような血栓形成剤またはポリエチレングリコー
ル、ヒアルウロン酸、キトサンまたはメチルセルロー
ス、その他の蛋白質、炭水化物、脂肪酸のような親水性
ポリマーである。生物適合性剤は上記の剤の一種の剤の
分子であってもよいし、二種以上の剤の分子であっても
よい。例えば、生物適合性剤はアルブミンとヘパリン両
方を含んでいてよい。 【００１６】ひとつの実施態様において、生物適合性剤
を互いに結合させてフィルムとし、それを連結基により
固体表面に付着させる。生物適合性剤はヒアルロン酸ま
たはアルブミンが望ましい。フィルムを付着させた生物
適合性を持つ生体用材としてヒアルロン酸のフィルムで
被覆された人工股関節が挙げられる。 【００１７】化学的連結基は、次式： Ａ−Ｘ−Ｂ （式中、Ａは特別の活性化に応答して固体表面に共有的
に結合できる光化学的反応性基を表わし；ＢはＡで表わ
される基が応答しない特別の活性化に応答して生物適合
性剤と共有結合を形成することができる別の反応性基を
表わし、ＸはＡおよびＢで表わされる両基を結び合わせ
る相対的に不活性で非妨害性の骨格基で、水性の生理的
液体中で分解されにくいものを表わす）で表わされるこ
とが望ましい。この生理的液体とはＸが接触するであろ
う液体を云う。Ｘはポリメチレンのような炭素原子数１
乃至１０のアルキル基、ポリメチロールのような炭水化
物、ポリエチレングリコールのようなポリオキシエチレ
ン、またはポリリジンのようなポリペプチドであること
が望ましい。Ｂで表わされる反応性基は好適な活性化に
より蛋白性またはその他の生物適合性剤と共有結合する
基である。典型的なこのような基は、本明細書で参照文
献として示したガイア（Ｇｕｉｒｅ）、アメリカ特許第
３，９５９，０７８号明細書に記載し例示されているよ
うな、熱化学的基および光化学的基である。 【００１８】光化学的反応性基（Ａ）（化学線照射によ
り活性化される共有結合）は、アリール、アルキルおよ
びアシルアジド、オキサジジン、イソシアネート（ニト
レン生成剤）、アルキルおよび２−ケトジアゾ誘導体お
よびジアジリン（カルベン生成剤）、芳香族ケトン（三
重項酸素生成剤）、芳香族ジアゾニウム誘導体および多
種類のカルボニウムイオンおよびラジカル生成剤により
代表される。文献Frederick J. DarflerおよびAndrew
M. Tometsko, Chemistry and Biochemistry ofAmino Ac
ids, Peptides and Proteins (Boris Weinstein 編) 第
５巻（Marcel Dekker, Inc. New York, 1978）の第２章
が光化学的反応性基をさらに記載するものとして参照さ
れる。アジドニトロフェニル、フルオロアジドニトロベ
ンゼンおよび芳香族ケトンが暗所下での化学反応条件に
安定であり、かつ、ほとんどの生体用材に無害の波長の
光による活性化に感受性であり、生体用材の多くの部位
と有用な収率で共有結合を形成できる短寿命の反応性中
間体を形成する故に好ましい基を形成する。 【００１９】ニトロフェニルアジド誘導体（Ｘで表わさ
れる基を含むとして示される）は、大部分の光化学的反
応性基がフルオロ−２−ニトロ−４−アジドベンゼンか
ら誘導されるので使用するのに適当であり、４−アジド
−２−ニトロフェニル（ＡＮＰ）−４−アミノ−ブチリ
ール、ＡＮＰ−６−アミノカプロイル、ＡＮＰ−１１−
アミノウンデカノイル、ＡＮＰ−グリシル、ＡＮＰ−ア
ミノプロピル、ＡＮＰ−メルカプトエチルアミノ、ＡＮ
Ｐ−ジアミノヘキシル、ＡＮＰ−ジアミノプロピル、お
よびＡＮＰ−ポリエチレングリコールが含まれる。ＡＮ
Ｐ−６−アミノカプロイル、ＡＮＰ−１１−アミノウン
デカノイル、およびＡＮＰ−ポリエチレングリコールが
望ましい。光化学的反応性基として使用するに望ましい
芳香族ケトンにベンジルベンゾイルおよびニトロベンジ
ルベンゾイルが含まれる。 【００２０】熱化学的反応性基（熱エネルギーで活性化
される）はニトロフェニルハライド、アルキルアミノ、
アルキルカルボキシル、アルキルチオール、アルキルア
ルデヒド、アルキルメチルイミデート、アルキルイソシ
アネート、アルキルイソチオシアネートおよびアルキル
ハライド基が代表的なもので、これらが含まれる。熱化
学的反応性基として使用するに適当な基にはカルボキシ
ル基、ヒドロキシル基、第一アミノ基、チオール基、マ
レイミドおよびハライド基が含まれる。６−アミノヘキ
サン酸およびアミノウンデカン酸のような基のＮ−オキ
シスクシンイミドカルボン酸エステル、メルカプトスク
シニックアンヒドリドおよびβ−メルカプトプロピオン
酸、ホモシステインチオラクトン、およびポリエチレン
グリコール誘導体が望ましい。 【００２１】本発明の器具は生物適合性剤の分子および
化学的連結基残基を含む生物適合性固体表面を持ってい
る。化学的連結基残基は、固体表面に結合された光化学
的反応性基の残基並びに生物適合性剤に共有結合された
別の基の残基を持っている。光化学的反応性基の残基は
一般式において「Ａ」で表わされる光反応性基（前述）
の一部で、共有結合形成後も残っている。光反応基がＡ
ＮＰで固体基質がポリエチレンの時、その残基は炭素−
窒素結合である。ＡＮＰが光活性化されて形成されたニ
トレンはポリエチレンの炭素と反応して共有結合を形成
する。光反応性基がＢＢＡで固体基質がポリエチレンで
ある時、残基は炭素−炭素結合である。ＢＢＡが光で刺
激されると、２個のフェニル基を結び合わせている炭素
が活性化されてトリプレット状態となり、炭素−炭素結
合をポリエチレンとＢＢＡの間に形成し、ヒドロキシル
基を形成する。別の反応性基（「Ｂ」）がＮＯＳである
場合、その残基はフィブロネクチンのような生物適合性
剤の酸素または窒素基に結合された基のカルボキシル炭
素である。 【００２２】生物適合性剤として使用する酵素、細胞付
着因子およびある種の他の物質はやゝ高温に感受性であ
るため、本発明に使用する連結基上の別の反応性基は、
中程度の熱（例えば体温またはそれ以下）および光のよ
うな容易に適用できて無害の刺激によって活性化（すな
わち、それに応答して共有結合を生ずる）されることが
望ましい。光化学的反応性基が応答する刺激に応答しな
い反応性基は、ｐＨ変化、またはもうひとつの化学分子
種その他の添加に反応する基である。 【００２３】化学的連結基は、固体表面を遮蔽して生物
適合性の効果ある表面をつくり得るような密度で、表面
に共有結合することが望ましい。効果ある表面をつくる
に必要な結合化学基の密度は使用する生物適合性剤によ
って変る。 【００２４】〔実施例〕本発明は以下の非限定的な実施
例を参照することにより理解が深かまる。第１表は以下
の記載に使用した用語の略記の表である。 【００２５】実施例１ 内皮細胞付着／生育 １． プラスチック表面 種々の細胞因子をインビトロで（試験管で）試験するた
めの重合体表面に結合させ、これらの因子の細胞付着と
過剰生育への効果を測定した。重合体表面としては、ポ
リ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ
プロピレン（ＰＰ）およびポリテトラフルオロエチレン
（ＰＴＦＥ）ＧＯＲＥ−ＴＥＸ（６ｍｍの強化伸展ＰＴ
ＦＥ、ダブリュー・エル．ゴア アンド アソシエイ
ツ、インコーポレイテッド（Ｗ．Ｌ．Ｇｏｒｅ ａｎｄ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）の商標付製品）で
あった。試験した市販のチューブはポリエステル（Ｄａ
ｃｒｏｎ，Ｄ，６ｍｍの真直に編んだダクロン ベロ
ア、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）の商標付製品）シリコン
エラストマー（ＳｉｌａｓｔｉｃＲ，Ｓ，０．０３内径
のチューブ、ダウ コーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ）の商標付製品）およびポリウレタンである。ポリス
チレンプレートを対照として使用した。 ２．化学的連結基の調製 これらの実施例に使用した化学的連結基は４−アジド−
２−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ＡＮＰ−Ｅ
ＡＣＡ）、４−アジド−２−ニトロフェニルアミノウン
デカン酸（ＡＮＰ−ＡＵＤＡ）およびベンゾイル安息香
酸（ＢＢＡ）のＮ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）エ
ステルであった。ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳとＡＮＰ−Ａ
ＵＤ−ＮＯＳは本明細書に参考文献として示したピー．
ガイア、ディー．フリガーおよびジェイ．ホドグソン、
「哺乳動物細胞への酵素の光化学的カップリング」、フ
ァーマコロジカル リサーチ コミュニケーションズ、
９巻、１３１−１４１頁（１９７７年）（Ｐ．Ｇｕｉｒ
ｅ，Ｄ．Ｆｌｉｇｅｒａｎｄ Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，″
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ
Ｅｎｇｙｍｅｓ ｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌ
ｌｓ″ ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｊｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．
９，ｐｐ１３１−１４１（１９７７））に記載された方
法で調製した。要約すると、フルオロ−２−ニトロ４−
アジドベンゼンをε−アミノカプロン酸またはアミノウ
ンデカン酸と反応させて比較的反応性の低いフッ素をア
ミノアルキルカルボキシル基で置換する。次いでカルボ
キシル基をカルボジイミド活性化により）Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドでエステル化してＮ−オキシスクシン
イミドカルボン酸エステルを得る。ベンゾイル安息香酸
のＮＯＳエステルはカルボキシル基をカルボジイミド活
性化によりＮ−ヒドロキシスクシンイミドでエステル化
して調製した。ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳまたはＡＮＰ−
ＡＵＤ−ＮＯＳを化学的連結基として使用した時、ＡＮ
Ｐ基が前述の一般式Ａ−Ｘ−Ｂの「Ａ」で表わされる光
化学的反応性基である。ＮＯＳ基はこの式の「Ｂ」で表
わされる別の反応性基である。ＥＡＣまたＡＵＤ基は２
個の反応性基の間でスペーサーとして作用し、一般式の
「Ｘ」で表わされる。ＢＢＡ−ＮＯＳが化学的連結基で
ある場合には、ベンゾイル安息香酸基が一般式の「Ａ」
で表わされる光化学的反応性基であり、ＮＯＳ基は
「Ｂ」で表わされる別の反応性基である。Ｘで表わされ
る基は２個の反応性基を結びつける炭素である。 ３． 化学的連結基への生長因子の共有結合 生物適合性剤フイブロネクチン、ラミニン、コラーゲ
ン、内皮生育因子、およびヒト血漿アルブミンについて
合成生体用材への内皮細胞付着および過剰増殖を促進で
きるかどうかを試験した。これらの剤を４−アジド−２
−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ＡＮＰ−ＥＡ
ＣＡ）、４−アジド−２−ニトロフェニル−ウンデカン
アミノ酸（ＡＮＰ−ＡＵＤＡ）またはベンゾイル安息香
酸（ＢＢＡ）のＮ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）エ
ステルに次のようにしてカップリングさせた。ここで使
用する「光標識した」とは別の反応性基によって化学的
連結基にカップリングさせて光化学的反応性基を持つ生
物適合性剤を云う。 Ａ．連結基へのフイブロネクチンおよびラミニンの共有
結合 ヒトのフイブロネクチン（ウィスコンシン大学医学部）
およびマウスのラミニン（ベセスダ リサーチラブＢｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．から入手）
を別々に０．１Ｍホウ酸塩、ｐＨ９．０に１ｍｇ／ｍｌ
の濃度で溶解した。脱水したジメチルホルムアミド（″
ＤＭＦ″）に溶解したＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳまたはＡ
ＮＰ−ＡＵＤ−ＮＯＳまたは脱水したジオキサンに溶解
したＢＢＡ−ＮＯＳの溶液をフイブロネクチンまたはラ
ミニン溶液に対し、蛋白質のε−アミノ基（リジン残
基）の濃度に当モルになるように、暗黒下で１６時間か
け、４℃で注射器を使ってゆっくりと加えた。次いで、
その混合物を冷却しつつ４時間攪拌した。このフイブロ
ネクチンまたはラミニン溶液を遠心分離して不溶物を除
き、セファテックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５カラ
ムに流して未カップリングの光反応剤を除いた。画分に
ついて光基／蛋白質比を調べるため２６０ｎｍと４６２
ｎｍで追跡した。 Ｂ．化学的連結基へのＥＧＦ、コラーゲンおよびＨＳＡ
の共有結合 ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（シグマ ファーマシューテ
ィカルＳｉｇｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、
内皮生長因子（シグマ ファーマシューティカルＳｉｇ
ｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ−ｃａｌ）、およびヒト
血漿アルブミン（シグマ ファーマシューティカルＳｉ
ｇｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）を別々に０．
１Ｍホウ酸塩、ｐＨ９．０に２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解
した。ＤＭＦに溶解したＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳ、ＤＭ
Ｆに溶解したＡＮＰ−ＡＵＰ−ＮＯＳまたはシオキサン
に溶解したＢＢＡ−ＮＯＳの溶液を、ε−アミノ基（リ
ジン）の濃度に対し５Ｘモル量で、生物適合性剤を含む
溶液に対して、注射器を使い４℃で暗黒下、１６時間か
けてゆっくりと加えた。次いで、この溶液をリン酸緩衝
化食塩水（ＰＢＳ）１０００ｍｌを４回交換して透析
し、不溶物を遠心分離で除く。生成物について光基／蛋
白質比を知るため２６０ｎｍ、２８０ｎｍおよび４６２
ｎｍで分析した。 ４． プラスチック表面への生物適合性剤の共有結合 ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリ
ウレタン、ダクロン（ＤａｃｒｏｎＲ）（ベロア）、シ
ラスチック（ＳｉｌａｓｔｉｃＲ）（医学用）、および
ポリテトラフルオロエチレンの種々のシート、チューブ
および平板片を使用した。光標識した生物適合性剤０乃
至５００μｇ／ｍｌを含む溶液０．０５ｍｌをプラスチ
ック表面各０．５ｃｍ２切片に加える。この溶液を暗黒
下、室温で３時間、各片に吸収させた。過剰の液体を除
き、適当な波長で（ＡＮＰにはタングステン「スポット
ライトＳｐｏｔｌｉｔｅ」およびＢＢＡには長波長Ｕ
Ｖ）１２時間光分解することにより生物適合性剤を表面
に共有結合させた。光分解後、光標識生物適合性剤の共
有結合していない分子を除くために標本片にＰＢＳを４
秒間流して洗浄した。その後、標本片を組識培養中に置
き、下記により細胞因子への内皮細胞の反応を調べた。 ５． 修飾した表面について行ったインビトロ試験 Ａ．放射性標識生物適合性剤 放射性標識した〔３Ｈ〕生物適合性剤を上記のようにし
て光標識し、プラスチック表面に光カップリングした。
このプラスチック表面をＰＢＳで十分に洗浄し、有機溶
剤に溶解して液体シンチレーション分光法で測定した。
代表的な結果を第２表に示す。 これらの結果が示すように光標識生物適合性剤は表面に
共有結合されている。 Ｂ．修飾プラスチック表面へのウシ内皮細胞の付着 ウシ内皮細胞は長さ８−２４インチの胎仔から集めた。
角膜、大動脈およびへその内皮細胞を無菌的に集めた。
細胞を、２５ｍｍｏｌｅＨＥＰＥＳ緩衝液、１０％仔ウ
シ血清および２．５μｇアンホテリシンＢ／ｍｌを加え
たダルベッコの改良イーグル培地（アール．ダルベッコ
およびジー．フリーマン、バイロロジー８巻．３９６頁
（１９５９年）（Ｒ．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ａｎｄ Ｇ．
Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８：３９
６（１９５９））およびジェイ．ディー．スミス、ジ
ー．フリーマン、エム．ボグトおよびアール．ダルベッ
コ、バイロロジー１２巻、１８５−１９６頁（１９６０
年）（Ｊ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｍ．
Ｖｏｇｔ ａｎｄ Ｒ．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ Ｖｏｌ．１２：１８５−１９６（１９６０））
に記載）のような公知の高グルコース細胞生育培地
（「生育培地」）中で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベ
イターで生育させた。プレート、チューブまたはシート
を準備する毎に、細胞培養は一次培養から調製した。細
胞を０．２５％トリプシン溶液で細胞株から取り、生育
培地に再懸濁した。次いでトリパンブルー（０．４％）
溶液と血球計を使って細胞数を計測した。種々の濃度の
細胞を準備した材料の上に層状に置いた。細胞の付着を
５分から１４日間の種々の時間間隔で追跡した。付着は
少くとも２種の方法で測定した。第一の方法において
は、試料材料を培地から離し、殺菌した食塩液で２回洗
浄した。次いで細胞染色を行い、表面上の全細胞数を計
測した。第二の方法では、トリプシン溶液を使って細胞
を表面から離し、トリパンブルー法で細胞数を計測し
た。予備被覆したポリ塩化ビニルプラスチック上の内皮
細胞の付着および生育について代表的結果を第３表に示
す。各片に付着した生細胞数はトリパンブルー染色法で
測定した。 【００２６】【００２７】Ｃ．ヒト臍の内皮細胞の付着 一次のヒト内皮細胞を新鮮なヒト臍帯（４日令以前）か
ら採取した。帯を２０ｍｌのコード（ｃｏｒｄ）緩衝液
（０．１４４ＭＮａＣｌ、０．００４Ｍ ＫＣｌおよび
０．００１Ｍ ＰＯ４）で２回洗浄して血液および凝固
物を除く。コラゲナーゼを帯の中に注入し、室温で２０
分間放置した。温コード（ｃｏｒｄ）緩衝液１０ｍｌを
使い、コラゲナーゼと剥離した細胞を試験に噴出させ
る。試験管内の懸濁液を合せて、１５００ｒｐｍで５〜
１０分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を１０ｍｌの
コード（ｃｏｒｄ）緩衝液に再懸濁した。二回目の遠心
分離後、細胞をコード（ｃｏｒｄ）緩衝液に再懸濁し、
組織培養ディスクに置いた。すべての細胞を５％ＣＯ２
を流した３７℃のインキュベイター中でインキーベイト
した。細胞は仔ウシ血清を含まないコード（ｃｏｒｄ）
培地中で５ＩＣｒを使って放射性標識した。この放射標
識した細胞を細胞付着試験に使用した。上記のプラスチ
ックのプレート、シートおよびチューブは前述の通りに
調製した。細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー法
で細胞数を測定した。細胞を調製したプラスチックに３
時間乃至７日間付着させるようにした。細胞をすすぎ落
し、残りの付着している細胞全数を付着していない細胞
数と比較した。代表的な結果を第３表に示す。 Ｄ．内皮細胞を使った生育の測定 下記のようにして修飾した上記のプラスチック表面を細
胞が生育して習う時に、開始時から次の方法で細胞の生
育を追跡した。細胞因子０乃至５００μｇを含む生物適
合性剤溶液を１乃至６ｃｍの長さの表面を濃度勾配をつ
けて被覆した。細胞を組織からトリプシンまたはなにか
プロテイナーゼを使って取るという処理は行わなかっ
た。この組織を勾配の低い方の開始点に置いて印をつけ
た。室温で１５分間組織を落ちつかせ、生育培地をプラ
スチック上を湿めって覆うように加えた。すべての手順
は無菌的に行った。次いで、プレートを５％ＣＯ２イン
キュベイター中、３７℃でインキュベートした。生育を
２週間またはプラスチックの長さが完全に覆われるまで
毎日測定した。第３表に示したように、処理した表面上
の生育を非処理対照の表面と比較した。すべての材料を
すすぎ、永久走査電顕観察のために染色した。これらの
結果は、生育因子のフィブロネクチン（ＦＮ）およびコ
ラーゲン（ＣＯＬ）をプラスチック表面に共有的に付着
させると、プラスチックのウシ内皮細胞への生物適合性
が改善されることを示した。細胞がプラスチック表面で
生育した距離で示されるように、細胞は対照表面より修
飾表面に優先的に付着した。６． イン ビボ（生体
内）試験 この試験のために２匹の条件付けしたイヌ準備した。Ｇ
ＯＲＥ−ＴＥＸ（強化伸展ポリテトラフルオロエチレ
ン、ダプリュー．エル．ゴア アンド アソシエイツ、
インコーポレイテッド（Ｗ．Ｌ．Ｇｏｒｅ ａｎｄ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）の商標付製品）の小片
をＦＮ，ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮ（吸着および光カップリ
ング）、ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮ（吸着のみ）およびＰＢ
Ｓ対照により前被覆した。試験はブラインド試験で行っ
た。グラフトは文字によって標識されているが、外科の
チームはどのグラフトが修飾表面で、どれが対照かを知
らない。各イヌの左右の腸骨動脈に２個の６ｍｍ×５ｃ
ｍのＧＯＲＥ−ＴＥＸ片を移植した。グラフトをイヌの
中で１ケ月（３０日）間放置した。ヒトでの移植手順を
模放するために、抗炎症剤ペルソンチン（Ｐｅｒｓｏｎ
ｔｉｎｅ）およびアスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ）をイヌ
に与えた。両対照グラフト（ＰＢＳとＦＮ）は開いてい
て十分な口径を持っていた。吻合線はそのままで、内部
表面は滑らかであった。対照グラフトについては内皮化
は不十分であった。有意な血栓の証拠はみられなかっ
た。ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮが結合した両グラフト（光カ
ップリングと吸着のみ）に血栓はなく、内皮化は完全
で、グラフト内部表面は平滑で輝いて見えた。 【００２８】実施例２ コンタクトレンズおよび眼内レンズ移植物の表面の修飾 本実施例の実験においては、化学的連結基に結合した親
水性ポリマー（生物適合性剤）の調製、コンタクトレン
ズ表面への基の光カップリング、および非処理レンズと
比較したこれらレンズへの人工涙液からのインビトロで
の蛋白の沈着測定を行った。生物適合性剤の角膜片との
インビトロでの適合性およびインビボでのウサギ眼内で
の適合性を知る実験を行い、レンズへの毒性または刺激
性反応がないことを確かめた。 １．化学的連結基への生物適合性剤の結合 Ａ．光標識ポリエチレングリコールの調製 分子量１０００（ＰＥＧ−１０００）と４０００（ＰＥ
Ｇ−４０００）のポリエチレングリコールを、本明細書
に参考文献で取り入れた「キムラ、及びエス．レーゲ
ン、ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー４
８巻、１９５頁（１９８３年）（Ｋｉｍｕｒａ，ａｎｄ
Ｓ．Ｒｅｇｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＯｒｇａｎｉ
ｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：１９５（１９８３）」
の相輸送法の修飾法により、フルオロニトロアジドベン
ゼン（ＦＮＡＢ）で標識した。要約すると、４−アジド
−２−ニトロフェニルポリエチレングリコール（ＡＮＰ
−ＰＥＧ）の相輸送合成では、６０％水酸化カリウム水
溶液（「ＫＯＨ」）／トルエンとＦＮＡＢおよびＰＥＧ
を混合し、抽出して下記のように薄層クロマトグラフィ
ー（ＴＬＣ）精製を行う。 ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００ ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００は０．０５ｍｍｏｌｅ ＰＥ
Ｇ−１０００を５ｍｌの６０％ＫＯＨおよび０．５ｍｍ
ｏｌｅ ＦＮＡＢ、１０ｍｌのトルエンに加えて調製し
た。この反応混液を室温で１６時間、急速に攪拌した。
生成物を有機溶媒層から分離した。クロロホルム／メタ
ノール／Ｈ２Ｏ／酢酸または水酸化アンモニウム、８５
／１５／１／１でのＴＬＣにより、非標識ＰＥＧからＡ
ＮＰ−ＰＥＧ−１０００のモノ−およびジ−置換誘導体
を分離した。ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００に相当するバン
ド（低いＲｆ値）をシリカゲルからＴＬＣ溶媒で抽出
し、残存の酸または塩基を除くために共沸蒸溜した。最
絡生成物は水に可溶で、出発物質ＰＥＧの３０―４０％
がＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００に転換した。 ＡＮＰ−ＰＥＧ−４０００ ＡＮＰ−ＰＥＧ−４０００を、反応中にすべての試薬を
溶液中に止まらせつつ５０℃で反応混液を急速に攪拌す
ること以外は、上記と同じ方法で調製した。ＡＮＰ−Ｐ
ＥＧ−４０００−ＯＨの収率は１０％であった。 Ｂ．光標識ジエファミンの調製 ポリオキシプロピレンポリアミンおよびポリオキシエチ
レンポリアミン（ジエファミン（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ
ｓ）と呼ぶ。ジエファーソン ケミカル カンパニー、
インコーポレイテッド（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）の商標）を、これらポリ
マーにＡＮＰ−ＥＡＣＡ，ＢＢＡおよびｎＢＢＡのＮ−
オキシスクシンイミド（「ＮＯＳ」）エステルをカップ
リングすることによって光標識した。これらのＮＯＳ−
誘導体を０．５×量で１×量ジエファミンに高度に脱水
した（高純度）溶媒中で加えた（ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯ
Ｓは脱水テトラヒドロフラン中、ＢＢＡ−ＮＯＳは脱水
ジオキサンまたはジメチルホルムアミド中、ニトロＢＢ
Ａ−ＮＯＳは脱水ジオキサンまたはジメチルホルムアミ
ド中）。暗黒下、室温で１６時間反応させた後、生成物
をクロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ／酢酸、８５／１
５／１／１のＴＬＣで分離した。モノ置換ジエファミン
誘導体をＴＬＣ溶媒で抽出し、水と共沸蒸溜して残存す
る酢酸を除いた。水溶性生成物ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジエフ
ァミン、ＢＢＡ−ジエファミン、およびｎＢＢＡ−ジエ
ファミンをそれぞれ１５％、１０％および１２％の収率
で分離した。 Ｃ．ＡＮＰ−ヒアルウロン酸の調製 ヒト胎盤ヒアルウロン酸（見かけの分子量１００−１３
０，０００）の末端糖を、イー．ジヤノウイッツ及びエ
ス．イー．チャーム「蛋白固定化およびアフィニティー
クロマトグラフィーのための酸化多糖の誘導」ビオキミ
カ エ ビオフィジカ アクタ４２８巻、１５７―１６
５頁（１９７６年）（Ｅ．Ｊｕｎｏｗｉｃｚ ａｎｄ
Ｓ．Ｅ．Ｃｈａｒｍ，″Ｔｈｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆＯｘｉｄｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ
ｅｓｆｏｒ ＰｒｏｔｅｉｎＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏ
ｇｒａｐｈｙ″，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．４２８：１５７―
１６５（１９７６））に記載され、本明細書に参考文献
とした、過ヨウ素酸法によって活性化した。この方法で
は、このように末端の糖を活性化しているヒアルウロン
酸溶液に過ヨウ素酸ナトリウムまたはカリウムを加える
ことを伴う。ヒアルウロン酸を１０倍量のジエファミン
に加え、室温で４時間反応させる。シアノ水素化ホウ素
ナトリウムで還元することによって連結を安定化させ、
十分に透析して過剰のジエファミンを除去した。ＤＭＦ
に溶解した１０倍モルのＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳを、
０．１Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．０に溶解したジエファミンに
注射器で加えた。この添加は１６時間かけて暗黒下、室
温で行った。過剰のＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳとＡＮＰ−
ＥＡＣ−ジエファミンをゲル▲ろ▼過クロマトグラフィ
ーによって除いた。コンタクトレンズポリマー骨格への
基の光カップリングに必要なアジド基の組込みはＡＮＰ
基を検出するために赤外吸収分光法で分析し、ジエファ
ミンスペーサーを検出するためにポリエチレングリコー
ル分析を、また誘導体のウロン酸含量を定量するため
に、ここに参考文献として挙げるティー．ビター及びエ
イチ．ミュアー、アナリティカルバイオケミストリー４
巻、３３０−３３４頁（１９６２年）（Ｔ．Ｂｉｔｔｅ
ｒａｎｄ Ｈ Ｍｕｉｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．４：３３０−３３４（１
９６２））に記載された修正カルバゾール分析を行っ
た。ポリエチレングリコール分析はドラゴンドルフ試薬
で検出した（テトラヨウドビスマス酸−塩化バリウ
ム）。貯蔵試薬（酢酸と水に４２５ｍｇ硝酸ビスマス、
１０ｇヨードカリウムを溶解）５ｍｌを１０％塩化バリ
ウム水溶液１０ｍｌに加え、５１６ｎｍでバックグラン
ウンドを読む。次いで、０．１ｍｌの試料を加え、キュ
ベットを逆転させて内味を混合し、１分間のインキュベ
イション後に５１６ｎｍで読みとった。値を標準曲線と
比較した。カルバゾール分析は以下のように行った：硫
酸試薬（硫酸中に０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム−１
０Ｈ２Ｏ）３．０ｍｌを−７０℃に冷却した。これに試
料０．５７ｍｌを乗せ、混合物を室温になるまで攪拌し
た（３０分間）。試験管を１００℃に加熱し（１０分
間）、カルバゾール試薬（無水エタノール中に０．１２
５％カルバゾール）０．１ｍｌを加えて内容物を混合し
た（５分間）。１００℃に加熱した後、氷浴で室温に冷
却した。硫酸試薬をブランクとして試料を５３０ｎｍで
分光法分析した。結果を４−４０μｇ／ｍｌグルクロノ
ラクトン標準でつくった標準曲線と比較した。この分析
はヒアルウロン酸２０ｐｍｏｌｅを検出できる感度を持
っていた。１個のＡＮＰ、１個のジエファミンおよび１
個のヒアルウロン酸分子を持つ画分を集め、生物適性剤
として使用した。 Ｄ．光標識ヒアルウロン酸、メチルセルロースおよび硫
酸コンドロイチン ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジエファミン、ＢＢＡ−ジエファミン
およびニトロ−ＢＢＡ−ジェファミンをヒアルウロン酸
および硫酸コンドロイチンのウロン酸残基のカルボキシ
ル基にカルボジイミドを使って以下の方法により連結し
た。５モル過剰の光標識ジエファミンと１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドをＨ
Ｃｌと共に多糖ポリマーと、０．１ＮＨＣｌでｐＨ４．
５に調節した水中で混合した。混合物を暗黒下、室温で
２４時間反応させた。生成物をゲル▲ろ▼過クロマトグ
ラフィーで精製し、光基と炭水化物含量を上記のように
して分析した。 Ｅ．光標識したコラーゲンの調製 ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（シグマ ファーマシューテ
ィカルズ（ＳｉｇｍａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ）から入手）を０．１Ｍホウ酸塩、ｐＭ９．０に１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＤＭＦに溶解したＡＮＰ−
ＥＡＣ−ＮＯＳ、ジオキサンに溶解したＢＢＡ−サルフ
ァ−ＮＯＳまたはジオキサンに溶解したニトロＢＢＡ−
ＮＯＳをコラーゲン溶液に５０×モル過剰にして、暗黒
下、４℃で注射器により１６時間かけてゆっくりと加え
た。完全に添加した後、混合物を冷却して４時間攪拌し
た。コラーゲン生成物をＰＢＳを４回交換して透析した
後、遠心分離して不溶物を除去した。上清を２６０ｎ
ｍ、２８０ｎｍおよび４６２ｎｍで分光法的に測定して
光基／蛋白比を分析した。 Ｆ．光標識プロティナーゼの調製 有機溶媒に２５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したＡＮＰ−Ｅ
ＡＣ−ＮＯＳ，ＢＢＡ−ＮＯＳおよびｎＢＢＡ−ＮＯＳ
光基を５０モル過剰にしてパパイン（パパヤ、分子量２
３，４２６）に対し、暗黒下、４℃で注射器をつかって
１６時間かけて加えた。光基の添加終了後、混合物を更
に４時間攪拌し、次いでＰＤＳに透析してカップリング
していない光基を除去した。上清を２６０ｎｍ、２８０
ｎｍ、および４６２ｎｍで分光法的に測定して光基／蛋
白比を分析した。 ２． レンズ表面に対する生物適合性剤の光カップリン
グ 上記のようにして得られた光標識生物適合性剤を第４表
記載のコンタクトレンズ材料に２５０−１０００ｐｍｏ
ｌｅ／コンタクトレンズの濃度で加えた。溶液をコンタ
クトレンズ上に暗黒下、室温で３時間吸着させた。次い
で光標識剤を適当な波長で（ＡＮＰでは４５０ｎｍ、Ｂ
ＢＡおよびｎＢＢＡ誘導体では３２０ｎｍ）１２時間、
光分解によってプラスチックに共有結合させた。光分解
後、コンタクトレンズを５×５ｍｌの正常な食塩液
（０．８５％ＮａＣｌ）で洗浄して共有結合していない
基を除去した。放射性標識基をレンズ材料にカップリン
グし、レンズ片をテトラヒドロフラン、次いでＤＭＳＯ
で処理して放射性標識を固体表面から放出させることが
できる。シンチレイション剤を加え、液体シンチレイシ
ョン分光法により生物適合性剤／ｃｍ２を測定した。代
表的な結果を第４表に示す。 【００２９】【００３０】ソフスピン（Ｓｏｆｓｐｉｎ）コンタクト
は水分約３８．６％を持つポリマコン（ポリメタクリレ
ート）でつくられ、バウシュ アンド ロン、インコー
ポレイテッド（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ，Ｉｎ
ｃ．）の商標付製品である。パーマフレックス（Ｐｅｒ
ｍａｆｌｅｘ）コンタクトは水分約７４％を持つポリメ
タクリレートがらつくられ、コーパービジョン、インコ
ーポレーテッド（Ｃｏｏｐｅｒｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎ
ｃ．）の商標付製品である。ビスタマーク（Ｖｉｓｔａ
ｍａｒｃ）コンタクトは水分約５８％を持つポリメタク
リレートからつくられ、ジョンソン アンド ジョンソ
ン（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）の商標付製品
である。リドフィルコン（Ｌｉｄｏｆｉｌｃｏｎ）コン
タクトは水分約７０％を持つポリメタクリレートからつ
くられ、バウシュ アンド ロン、インコーポレイテッ
ド（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ，Ｉｎｃ．）の製品で
ある。第４表の値は平方センチメートル表面積当りのｐ
ｍｏｌｅ生物適合性剤またはｎｇ／ｃｍ２で表わされて
いる。カップリング効率は２６０ｐｍｏｌｅ／ｃｍ２生
物適合性剤／コンタクトレンズ材料、７１０ｐｍｏｌｅ
／ｃｍ２生物適合性剤／シリコン、および６６０ｐｍｏ
ｌｅ／ｃｍ２生物適合性剤／ｃｍ３ポリマコンボタンの
添加に基く。ＡＮＰ−ヒアルウロネートはシリコンに対
し３５７ｐｍｏｌｅ／ｃｍ２およびポリマコンボタンに
対し１６５５ｐｍｏｌｅ／ｃｍ３で加えた。ハイドロゲ
ルコンタクトレンズ材料に対しｎＢＢＡ−ジェフよりＡ
ＮＰ−誘導体の方が高い負荷密度でカップリングした。
この結果はシリコン化合物では逆になった。 ３． インビトロ（試験管内）吸着試験 人工ヒト涙液を、ここに参考文献としたビー．ピー．グ
ルア、「涙装置」、アドラーの眼の生理学：臨床応用
（アール．エイ・モーゼス編）、シー．ブイ．モスビー
カンパニー、セントルイス ミズリー（１９８１年）
（Ｂ．Ｐ．Ｇｌｏｏｒ，″Ｔｈｅ Ｌａｃｒｉｍａｌ
Ａｐｐａｒａｔｕｓ″ｉｎＡｄｌｅｖ′ｓＰｈｙｓｉｏ
ｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉ−ｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ａ．Ｍｏｓｅｓ，ｅ
ｄ．），Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ Ｃｏ．，Ｓｆ．Ｌｏｕｉ
ｓ，Ｍｏ（１９８１））に記載されている配合に従って
調製した。この文献に示されているように、ヒトの涙に
存在する主要蛋白は血清アルブミン（ＨＳＡ）、ガンマ
グロブリン（ＨＧＧ）およびリゾチーム（ＬＹＺ）であ
る。ヒトの涙に存在する主要なステロールはコレステロ
ールとコレステロールエステルである。 Ａ．３Ｈ蛋白質 蛋白成分を、ここに参考文献としたエヌ．ジェントフト
及びディー．シー．ディアボーン、ジャーナルオブ バ
イオケミストリー２５４巻４３５９−４３６５頁（１９
７９年）（Ｎ．Ｊｅｎｔｏｆｔ ａｎｄ Ｄ．Ｃ．Ｄｅ
ａｒｂｏｒｎ、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２５４：４３５９−４３６５（１９
７９））に記載されているようにホルムアルデヒドおよ
びトリチウム標識された水素化ホウ素ナトリウムで還元
的にメチル化してトリチュウム標識した。要約すると
０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に１ｍｇ／ｍｌ濃度
に溶解した生物適合性剤をトリチウム標識された水素化
ホウ素ナトリウムと反応させ、２２℃で２時間ゆり動か
しつつ、ホルムアルデヒドによりメチル化した。生成物
を０．０１Ｍリン酸塩、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ７．４のＰＢＳに対して透析し、ゼラチンセファロー
ズを使った親和クロマトグラフィーで精製した。結合し
た剤を１Ｍ臭化ナトリウム、０．０２Ｍ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．０で溶出し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して
透析した。 Ｂ．人工涙液の調製 上記の放射性標識蛋白質を人工涙液の調製に使用した。
放射性標識した蛋白質の１種またはトリチュウム標識さ
れたコレステロールを各人工涙液混液に含ませた。他の
成分は放射性標識されていない。コンタクトレンズ材料
を人工涙液中に３７℃で１週間、ゆるやかにゆすりなが
らインキュベートした。終了後、レンズ材料を０．８５
％ＮａＣｌの５×１０ｍｌで洗浄した。次いで、レンズ
材料に吸着した蛋白質の量を液体シンチレイション測定
で分析した。インビトロ蛋白沈着の結果を第５表に示
す。全蛋白質沈着の減少はＡＮＴ−１０００−ＯＨ修飾
ソフスピンレンズで８５％に達した。各生物適合性剤は
対照コンタクトレンズ材より高いか、同じレベルであっ
たが、ＡＮＰ−１０００−ＯＨ被覆ポリマコンボタン、
ＡＮＰ−４０００−ＯＨ被覆ポリマコンボタンおよびＡ
ＮＰ−ヒアルウロネート被覆ポリマコンボタンを除くす
べてのレンズ材料で全体の蛋白量は減少していた。成績
の悪いものはすべてポリマコン材料そのものについてで
あり、これはソフスピンレンズのようなポリマコンコン
タクトレンズと異って反応しているようであった。全体
的に見て、これらインビトロ蛋白沈着試験により、１週
間でコンタクトレンズ材料上に人工涙液からおこる蛋白
沈着に有意にあるいは劇的に減少していた。 【００３１】 【００３２】インビトロのコレステロール沈着試験結果
を第６表に示す。人工涙液中に７日間インキュベイトし
た後のコレステロール沈着量はポリ塩化ビニルの場合よ
り８３％減少していた。ポリマコンボタン以外のすべて
の型のコンタクトレンズでコレステロール沈着の減少が
BR>見られた。この場合もこれらの材料は同じポリマー
でつ〈られたコンタクトレンズと異る反応をする。 【００３３】 【００３４】Ｃ．アミノ酸分析 対照および表面修飾したレンズを３７℃で１週間、ゆる
やかにゆすりながら人工涙液中でインキュベイトした。
レンズを５×１０ｍｌの０．８５％ＮａＣｌで洗浄し、
６ＮＨＣｌで加水分解した後、加水分解物をアミノ酸分
析機によって標準的なアミノ酸分析を行った。対照と表
面修飾したレンズの全アミノ酸含量をたがいに比較し
た。全アミノ酸含量のの減少は蛋白質吸収の減少を示
す。酸水解したコンタクト レンズの全アミノ酸分析を
第８表に示す。これらの結果は全アミノ酸をｎｍｏｌｅ
／ｍｌで示している。これらの結果から、ソフスピンポ
リマコンレンズのＡＮＰ−１０００−ＯＨ，ＡＮＰ−４
０００−ＯＨおよびｎＢＢＡ−ジェフ修飾は人工ヒト涙
液に７日間インキュベイトした後のレンズへの蛋白質沈
着を減少させることが明らかになった。 【００３５】【００３６】４． インビトロ毒性試験 上記の生物適合性レンズ材料について刺激性または毒性
反応を調べた。対照および生物適合性レンズをラミナー
フロー（層状流）フード内で最終洗浄を行って無菌的に
調製した。レンズを、１０％仔ウシ胎仔血清と５％グル
タミンを加えたダルベツコ修正エッセンシャル培地（抗
生物質および抗かび剤を添加）のような公知の高グルコ
ース細胞培地の溶液中に置いた。生きている３−５ケ月
令胎仔ウシ角膜をレンズ上に置いた。角膜の上皮表面を
いくつかの試験ではレンズ表面と接触させ、他の試験で
は内皮細胞表面をレンズ表面に直接置く。この系を７−
１０％ＣＯ２培養器内で３７℃、１−２週間置いた。培
養開始から種々の時間後に上皮および／または内皮細胞
の生存を染色法で測定した。 ５． 共有結合の安定性のインビトロ試験 表面修飾したポリマコン（ポリメタクリレート）を酵素
クリーナー（パパイン）、熱殺菌および化学殺菌（塩化
ナトリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸を含む緩衝
化した水溶液）処理することによって共有結合の安定性
を調べた。これらの結果を第８表に示す。 【００３７】 【００３８】共有結合は酵素的洗浄と熱殺菌に対して１
００％安定であった。化学殺菌に対してＡＮＰ−ヒアル
ウロン酸以外は生物適合性剤の幾分の損失があった。 ６． 生物適合性のインビボ（生体内）試験 予備的なインビボ生物適合性試験をウサギ系で行った。
少くとも２４匹の動物を各試験に使用した。ウサギの眼
に合うようにデザインした鞏膜レンズをこの試験で使用
した。ウサギには次のスケジュールでレンズを着用させ
た。 ６匹のウサギ 左眼はレンズなし。右眼に対照のレン
ズ。 ６匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。右眼に物理的に処
理したレンズ（表面修飾レンズと同じ物理的処理をした
が、生物適合性剤で被覆していない）。 １２匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。右眼に表面修飾
したレンズ。 ウサギの眼にレンズを装着する前に、ケラタミン／キシ
ラジンによりウサギを麻酔した。メチルセルロース／正
常食塩液湿潤液を１時間毎に与えて眼とレンズの適当な
潤滑性を保った。コンタクト レンズを８時間／日装着
させた。適当な時間、レンズ着用後、スリットランプと
螢光染料法でウサギを検査した。眼刺激の程度を、参考
文献としたティー．オウ．マクドナルド及びジェイ．エ
イ．シャダック、「眼刺激」、アドバンシズインモダン
トキシコロジー ４巻１６２−１６６頁（１９７７年）
（Ｔ．Ｏ．ＭｃＤｏｎａｌｄ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｓｈａ
ｄｄｕｃｋ，″Ｅｙｅ ｌｒｒｉｔａｔｉｏｎ，″ｉｎ
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎＭｏｄｅｒｎＴｏｘｉｃｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ １６２−１６６（１９７
７））に記載されているマクドナルド−シャダック（Ｍ
ｃ Ｄｏｎａｌｄ−Ｓｈａｄｄｕｃｋ）スケールによっ
てグレード付を行った。マクドナルド−シャダック法で
は、結膜充血、結膜肥厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常お
よび角膜混濁およびその他の病状を０−４のスケールで
グレード付けし、その際、０は正常、＋４が異常が最高
とした。インビボのウサギ試験結果を第９表に示す。ウ
サギについてのマクドナルド−シャダックスコアを表に
示した。これらの結果についてマン−ホイットニー（Ｍ
ａｎｎ−Ｗｈｉｔｕｅｙ）Ｕ検定を行い、表面修飾およ
び対照レンズ間に統計学的に有意差が認められなかった
（Ｐ＜０．０５）。したがって、これらの検定から、こ
のウサギにおける４日間の試験で、表面修飾レンズの結
膜充血、結膜肥厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常、角膜混
濁、パンヌス血管新生、上皮由来損傷は対照レンズに比
較して差は認められないことが明らかになった。対照お
よび修飾レンズで見られた刺激はウサギのコンタクトレ
ンズへの耐性発現と関連しているようであった。 【００３９】 【００４０】実施例３ ポリウレタンチューブへのアルブミン、ヘパリンおよび
ウロキナーゼのカップリング １．光標識アルブミンの調製 血清アルブミン（イヌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ
９．０）に溶解した。ＤＭＦに２５ｍｇ／ｍｌで溶解し
た４−アジド−２−ニトロフェニル−６−アミノカプロ
イル−Ｎ−オキシスクシンイミド（ＡＮＰ−ＥＡＣ−Ｎ
ＯＳ）溶液を、アルブミンに対してＡＮＰ−ＥＡＣ−Ｎ
ＯＳが１０倍モル過剰になるように、暗所下、室温で攪
拌しながら注射器で１２時間かけてアルブミンに加え
た。次いで、この溶液を暗所下、１ｌのリン酸緩衝化食
塩水（ＰＢＳ）に対して透析を３回行った。透析後、溶
液を遠心分離して不溶物を除去した。１／１００に希釈
して４７０ｎｍでの吸光度を分光学的に測定してＡＮＰ
／アルブミン比を測定した。 ２．ポリウレタンチューブへのアルブミンの光カップリ
ング ポリウレタンチューブをジオキサンに３０秒間浸漬し、
その後直ちに脱イオン水ですすいだ。このエッチングし
たチューブを暗所下、室温で攪拌しつつ、少なくとも２
時間、光反応性アルブミン溶液に浸漬した。次いで、チ
ューブを暗所下で少なくとも１０分間風乾し、そして少
なくとも１時間強い可視光線に暴露した。光反応性アル
ブミンへの浸漬、乾燥および光分解を２回繰り返し、最
後は浸漬を一晩行った。次いで、チューブを室温で１時
間、１．０Ｎ ＮａＣｌで洗浄した。ＮａＣｌ溶液は１
時間の間に少なくとも１回交換した。 ３．ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのヘパリン
のカップリング アルブミン−ポリウレタンチューブを脱イオン水５．０
ｍｌに浸漬した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）２００ｍｇを水
に溶解し、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで４．０に調整した。ヘ
パリン３０ｍｇを含む水１ｍｌをＥＤＣ溶液に加え、ｐ
Ｈを再び１Ｎ ＨＣｌで４．０に調整した。浸漬したポ
リウレタンチューブを含む溶液を室温で２時間攪拌し、
その後、さらにＥＤＣ２００ｍｇを加えた。反応を室温
で一晩続け、そしてチューブをＰＢＳ中ですすぎ、カッ
プリングしていないヘパリンと反応副生成物を除去し
た。 ４．ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのウロキナ
ーゼのカップリング 血清アルブミンを固定化したポリウレタンチューブを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１．２
５％グルタルアルデヒドに室温で１５−１８時間浸漬し
た。次いで、チューブを脱イオン水中で３０分間洗浄
し、その間、少なくとも１回水を交換した。ポリウレタ
ン−アルブミン−グルタルアルデヒドを次に０．１Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解したウロキナーゼ溶液
（８．３単位／ｍｌ，２〜３ｍｇ／ｍｌ）に浸漬し、４
℃で一晩攪拌した。チューブをＰＢＳで４時間すすぎ、
その後、ウロキナーゼ活性を測定した。ポリウレタンと
ポリヘマの２種のポリマーを固体表面として使用した。
修飾表面は１〜１０ｍｇヘパリン／ｃｍ2 、０．６〜
１．３ｍｇウロキナーゼ／ｃｍ2を有していた。 【００４１】実施例４ 固体表面へのフィルムのカップリング被覆フィルムの形
成と表面へのその共有結合 ＡＮＰ−ヒアルウロン酸の調製 ヒアルウロン酸の光標識誘導体（ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェ
ファミン、ＢＢＡ−ジェファミンおよびニトロＢＢＡ−
ジェファミン）を前述のようにして調製した。光反応性
被覆材からフィルムをつくり、暗黒下にコンタクトレン
ズの表面上に置く（浸漬して乾燥による）。生体用材表
面への共有結合および分子間架橋によるフィルムの強化
を照明によって行った。もうひとつの実施例において、
人工股関節をＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェファミン−ヒアルウ
ロン酸（１．１：１ｍｇ／ｍｌ）に暗黒下で３時間浸漬
した。これを溶液から取り出し、乾燥して人工関節上に
被覆材料の薄いフィルムを形成させた。次いで、フィル
ムを関節に対し、４℃で８時間、４００乃至４５０ｎｍ
で照明を当てて共有結合させた。次に、関節を生理食塩
液ですすいで未カップリングのＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェフ
ァミン−ヒアルウロン酸を除去した。骨に結合したヒア
ルウロン酸は摩擦を低減し、関節領域での骨の磨耗を減
らす。ウシ血清アルブミン１００ｍｇを２ｍｌの０．１
Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９に溶解した。ＡＮＰ−ＡＵＤ−
ＮＯＳ１４ｍｇを５０μｌのジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）に溶解し、このＡＮＰ−ＡＵＤ−ＮＯＳ溶液をＢ
ＳＡ溶液に対し、暗黒下、室温で十分攪拌しながら１５
時間かけてゆっくりと加えた。更に３乃至４時間攪拌し
た後、溶液を０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ９に対し暗黒下
で２４時間透析し、この間少くとも４回、各２ｌの緩衝
液を交換した。透析したＡＮＰ−ＢＳＡを暗黒下でパラ
フィンフィルム上にピペットで１００μｌ置き、乾燥さ
せた。フィルムが乾燥した後、ホウ酸緩衝液、ｐＨ９中
の１．２５％グルタルアルデヒド１００μｇを重ねて載
せ、暗黒下、室温で１時間インキュベイトした。次いで
フィルムをパラフィンフィルム上で水をゆっくりと滴下
して洗浄し、水を流しておく。この洗浄を１時間行った
後、フィルムを再乾燥して、注意深くパラフィンフィル
ムからフィルムを持ち上げ、プラスチック表面に移す
（例えばポリウレタン）。プラスチック表面上で、フィ
ルムを再び２０％ジオキサン含有水で湿らせ、暗黒下で
再乾燥した。プラスチック表面上のフィルムを４℃で４
時間、強烈な可視光線に露光してフィルムを表面に結合
させるが、この間表面の過熱を防ぐためにファンで通気
した。本発明の望ましい実施態様を記載したが、本発明
の主旨、特許請求の範囲から離れることなしに、種々の
変更、適応および修飾を行うことができることを銘記す
べきである。
を有する生体用材に関するものである。より詳しくは本
発明は、フィルム状の生物適合剤を有し、そして生物適
合性が強化された種々の生体用材およびその製造方法に
関するものである。 【０００２】 【従来の技術】代用血管、合成物の眼内レンズ、電極、
カテーテルその他のような生体用材の体内および体表へ
の移植は急速に発展している医学の分野である。合成の
血管用グラフト（移植片）のような生体用材移植物を長
期間使用する際の第一の障害は満足すべきグラフト表面
を持たないことである。例えば、プラスチック製の合成
血管の非処理表面は、急速な血栓形成作用を刺激するこ
とが多い。種種の血漿蛋白質はプラスチック表面におい
て血小板およびフイブリン沈着を起こさせる。このよう
な作用が血流障害となる血管圧縮につながり、それに引
き続く炎症反応が合成移植物の機能を失わせることにつ
ながる。「生体用材」（バイオマテリアル）とは、実際
上、体液に不溶で、体内または体表面に置くか、体液と
接触させるように設計され、つくられた機材を云う。血
管グラフトおよびコンタクトレンズが生体用材の例であ
る。 【０００３】理想的には、生体用材は次のような性質を
持つ。 １． 凝血、組織死、腫瘍形成、アレルギー反応、異物
反応（拒否反応）または炎症反応のような、体内での望
ましくない反応を誘導しない。 ２． 目的通りに機能するために要求される、強度、弾
性、透過性および柔軟性のような物理的性質を持つ。 ３． 容易に精製、製造および滅菌できる。 ４． １時間であれ一生涯であれ、体内に移植され、ま
たは体と接触している間は、その物理的住質および機能
を実際上保っている。 【０００４】生物体に対し、正味で有益な効果を与えつ
つ生物体の生物学的液体および／または組織と接触して
機能し、存在し得るならば、ここに使ったように、その
生体用材の固体表面は「生物適合性」としての性質を持
つ。宿主生物にとっての妨害を低減するために長期の生
物適合性が望まれる。 【０００５】移植物体の生物適合性を改善するため多く
の解決法が提案されてきた。ひとつの解決法は、望まし
くない蛋白質の付着を防ぐために生体用材に低分極性表
面、負荷電表面または酵素、内皮細胞や蛋白質のような
生物学的物質によって被覆した表面を与えることによっ
て、生体用材の表面を修飾することであった。固体表面
をヘパリン、アルブミンおよびストレプトキナーゼのよ
うな生化学材で被覆して血栓耐性を強化した。特にアル
ブミンはポリマー表面に物理的に吸着され、静電的およ
び共有的に結合される。 【０００６】アメリカ特許第４，５３０，９７４号明細
書においてマンロー等（Ｍｕｎｒｏｅｔ ａｌ）は、ア
ルブミンが選択的に結合する非イオン性疎水性脂肪族鎖
を表面に共有結合させることにより、ポリウレタンのよ
うな水不溶性ポリマーにアルブミンを吸着させる方法を
発表している。アメリカ特許第４，３７８，２２４号明
細書においてニンニ等（Ｎｉｍｎｉｅｔ ａｌ）は、補
綴物をつくるために使用される動物組織を、主としてカ
ルシウム化阻害剤からなる三次元架橋マトリックスを形
成させることにより被覆する方法を示している。 【０００７】生体用材の存在で起る副作用の一例はコン
タクトレンズ上への蛋白質の沈着である。コンタクトレ
ンズ装着者は時間が経つにつれてコンタクトレンズに対
してしばしば我慢ができなくなる。これは装着している
間にレンズ上に沈着した生化学物質（蛋白質、脂質、ム
コ多糖その他）に対する刺激およびアレルギー反応と結
びついている。現在行われている洗浄および消毒法でこ
れら沈着物をある程度除去できるが、これらの方法はし
ばしばレンズに穴やひびを残し、それが装着者の眼への
刺激を更に加えたシ、一層生化学物質沈着の中心になっ
たりする。 【０００８】アメリカ特許第３，９５９，０７８号明細
書においてガイア（Ｇｕｉｒｅ）はアミノエチルセルロ
ースまたはアルキルアミンガラスに酵素を共有結合する
試薬を使用することを記載している。下記のものも参
照。ガイア（Ｇｕｉｒｅ）、酵素安定化および固定化の
ための段階的熱光化学的架橋；エンザイム エンジニア
リング３巻６３−７０頁（１９７８年）（Ｅｎｚｙｍｅ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：６３−７０（１９７
８））およびガイア（Ｇｕｉｒｅ）、酵素および他の生
化学物質の光化学的固定化、メソーズ イン エンザイ
モロジー ＸＬＩＶ巻、２８０−２８８頁（１９７６
年）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
ＸＬＩＶ：２８０−２８８（１９７６））。固体表面に
連結試薬を熱化学的にカップリングさせ、次いでこの連
結試薬に酵素を光化学的にカップリングさせることによ
ク、調節した孔を持つガラス、セルロース、アガロース
およびポリアクリルアミドのような基質に酵素を共有的
に結合させて体外診断分析を行う際に有用な表面をつく
る方法がこれらの文献に記載されている。 【０００９】〔課題を解決するための手段〕本発明は望
ましい生物適合性表面を与えられた生体用材に関する。
生体用材の固体表面を修飾する方法には、生物適合性剤
の分子と、活性化することにより固体表面に共有結合す
ることができる光化学反応性基および活性化することに
より生物適合性剤の離れた分子に共有結合することがで
きる別の反応性基を持つ化学的連結性基の分子を使用す
る。これらの基の一方は他方の基が応答する刺激による
活性化に対して応答しない。本方法は、刺激を加えて基
を順次活性化し、連結基の上記の別の反応性基を生物適
合性剤の分子に共有結合させ、次いで生物適合性剤の分
子が固体表面を効果的に覆いつくすに十分な表面密度を
持たせて固体表面に連結基を光化学的に共有結合させる
ことにより、生物適合性の効果ある表面を得ることを特
徴とする。 【００１０】生物適合性の「効果ある」表面は、連結基
を介して生体用材の固体表面に共有結合的に連結され
て、生物適合性剤が持っているものと実質的に同じ生物
適合性の性質を持つ表面を得るようにした、生物適合性
剤の複数の分離した分子から形成されている。生物適合
性剤の分子によって形成された効果ある表面は生体用材
の全表面を覆う必要はない。表面を点で覆ってよい。例
えば、血管グラフトの表面に沿った点をフィブロネクチ
ンのような細胞付着因子で被覆してよい。このような点
で形成された生物適性の効果ある表面はこの修飾した表
面への細胞付着の中心として働く。連結基の別の反応性
基は、最初に述べた光化学的な反応性基が応答する刺激
に応答せず、生物適合性剤が共有結合する熱化学的基ま
たは光化学的基であることが望ましい。 【００１１】本発明のもうひとつの実施態様として、化
学的連結基残基で器具の固体表面に共有的に連結された
生物適合性剤の離れた分子で形成された、生物適合性の
効果ある表面を持つ器具を得ることである。化学的連結
基残基には、固体表面に共有的に結合された光化学的反
応性基の残基、および、生物適合性剤の分子に共有結合
された別の反応基の残基で、その反応基はもうひとつの
反応基が応答する刺激に応答しない反応基のひとつであ
るものを含む。生物適合剤の個々の分子は、たがいに十
分に近づいて固体表面を効果的に覆い、生物適合性の効
果ある表面となるように、固体表面に連結基残基を介し
て付着している。生物適合性剤はそれぞれの器具の機能
を高めるようなものを選択する。例えば、コンタクトレ
ンズの機能は、ポリエチレングリコール分子をレンズ表
面に付着させて表面への蛋白質の沈着を低減することで
高められる。もうひとつの例としては、フイブロネクチ
ンまたはラミニンのような細胞付着因子をポリ塩化ビニ
ル表面を持つ器具に結合させて器具への細胞付着を増加
させる。これはカテーテルや付用血管のような移植物の
場合に望ましい。 【００１２】更に、もうひとつの本発明の実施態様に、
生物適合性剤をたがいに結びつけて生物適合性のフィル
ムとした生物適合剤の分子と、生体用材の固体表面にこ
のフィルムを連結することができる化学的連結基を使用
する、生体用材の固体表面を修飾する方法が含まれる。
この化学的連結基には、活性化によって固体表面に共有
結合され得る光化学反応性基、およびフィルムに共有結
合された（例えば、フィルムをつくっている生物適合性
剤の残基に共有結合された）反応基の残基が含まれる。
反応基のひとつは他の反応基が応答する刺激に応答しな
い。この方法には光化学的反応基を刺激で活性化して生
物適合性分子を共有結合させることが含まれる。本明細
書で「結びつける」ということは、隣接した生物適合性
剤分子を共有結合させるだけでなく、水素結合、イオン
結合、ファンデルバール力による結合その他のような力
により引起される相互作用を云う。たがいに結びつけら
れてフィルムを形成した分子を持つ生物適合性剤は、一
種の剤の分子でもよいし、ヘパリンとアルブミンのよう
な二種以上の剤の分子でもよい。 【００１３】〔発明の実施の形態〕本発明の生物適合性
を示す固体表面は生理的液体に不溶の合成または天然の
材料が望ましい。その表面は、生きている生物の組織お
よび／または液体に接触して機能するよう意図された器
具のひとつ以上の表面であってよい。器具の固体表面は
研磨されたチタンまたはステンレススチールのようない
かなる好適な金属、またはポリウレタン、ポリビニルピ
ロリドン、シリコンエラストマー、ポリエチレン、ポリ
テトラフルオロエチレン、ポリ−（ｐ−フェニレンテレ
フタルアミノード）、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレ
ン、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアクリレート
（ポリメタクリレートを含む）のようなポリマー；ヒド
ロキシアパタイトのようなミネラルまたはセラミック
ス；骨、皮ふおよび歯のような人の組織；木材、セルロ
ースおよび圧縮炭素のような有機材料；およびガラス、
ゴム、木材のような他の天然および合成の材料であって
よい。本発明の生物適合性表面を持った器具の例は、血
管グラフトチューブ、透析チューブまたは膜、血液オキ
シジェネイターチューブまたは膜、限外▲ろ▼過膜、大
動脈内バルーン、血液バッグ、カテーテル、縫合糸、軟
質または硬質組織補綴、合成補綴、人工器官、およびコ
ンタクトおよび眼内レンズのような眼のためのレンズで
ある。 【００１４】固体表面は熱化学的に反応性のないものが
望ましい。「熱化学的に反応性のない」とは熱化学的に
反応する表面の能力を高めるために考えられたいかなる
表面処理もされていないという意味である。熱化学的に
反応性のない表面の例はポリテトラフルオロエチレン、
ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ
ビニルピロリドン、シリコンエラストマー、ステンレス
スチールおよびチタンである。 【００１５】生物適合性剤の分子を生体用材の表面に付
着させて生物適合性を改善する。生物適合性剤は、内皮
細胞増殖因子、造骨細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因
子、血小板誘導増殖因子、神経生長因子、または脈管形
成生長因子のような増殖因子；ライソザイムまたはペニ
シリンのような抗菌剤；ヘパリン、アルブミン、ストレ
プトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰ
Ａ）またはウロキナーゼのような抗血栓形成剤；コラー
ゲンのような血栓形成剤またはポリエチレングリコー
ル、ヒアルウロン酸、キトサンまたはメチルセルロー
ス、その他の蛋白質、炭水化物、脂肪酸のような親水性
ポリマーである。生物適合性剤は上記の剤の一種の剤の
分子であってもよいし、二種以上の剤の分子であっても
よい。例えば、生物適合性剤はアルブミンとヘパリン両
方を含んでいてよい。 【００１６】ひとつの実施態様において、生物適合性剤
を互いに結合させてフィルムとし、それを連結基により
固体表面に付着させる。生物適合性剤はヒアルロン酸ま
たはアルブミンが望ましい。フィルムを付着させた生物
適合性を持つ生体用材としてヒアルロン酸のフィルムで
被覆された人工股関節が挙げられる。 【００１７】化学的連結基は、次式： Ａ−Ｘ−Ｂ （式中、Ａは特別の活性化に応答して固体表面に共有的
に結合できる光化学的反応性基を表わし；ＢはＡで表わ
される基が応答しない特別の活性化に応答して生物適合
性剤と共有結合を形成することができる別の反応性基を
表わし、ＸはＡおよびＢで表わされる両基を結び合わせ
る相対的に不活性で非妨害性の骨格基で、水性の生理的
液体中で分解されにくいものを表わす）で表わされるこ
とが望ましい。この生理的液体とはＸが接触するであろ
う液体を云う。Ｘはポリメチレンのような炭素原子数１
乃至１０のアルキル基、ポリメチロールのような炭水化
物、ポリエチレングリコールのようなポリオキシエチレ
ン、またはポリリジンのようなポリペプチドであること
が望ましい。Ｂで表わされる反応性基は好適な活性化に
より蛋白性またはその他の生物適合性剤と共有結合する
基である。典型的なこのような基は、本明細書で参照文
献として示したガイア（Ｇｕｉｒｅ）、アメリカ特許第
３，９５９，０７８号明細書に記載し例示されているよ
うな、熱化学的基および光化学的基である。 【００１８】光化学的反応性基（Ａ）（化学線照射によ
り活性化される共有結合）は、アリール、アルキルおよ
びアシルアジド、オキサジジン、イソシアネート（ニト
レン生成剤）、アルキルおよび２−ケトジアゾ誘導体お
よびジアジリン（カルベン生成剤）、芳香族ケトン（三
重項酸素生成剤）、芳香族ジアゾニウム誘導体および多
種類のカルボニウムイオンおよびラジカル生成剤により
代表される。文献Frederick J. DarflerおよびAndrew
M. Tometsko, Chemistry and Biochemistry ofAmino Ac
ids, Peptides and Proteins (Boris Weinstein 編) 第
５巻（Marcel Dekker, Inc. New York, 1978）の第２章
が光化学的反応性基をさらに記載するものとして参照さ
れる。アジドニトロフェニル、フルオロアジドニトロベ
ンゼンおよび芳香族ケトンが暗所下での化学反応条件に
安定であり、かつ、ほとんどの生体用材に無害の波長の
光による活性化に感受性であり、生体用材の多くの部位
と有用な収率で共有結合を形成できる短寿命の反応性中
間体を形成する故に好ましい基を形成する。 【００１９】ニトロフェニルアジド誘導体（Ｘで表わさ
れる基を含むとして示される）は、大部分の光化学的反
応性基がフルオロ−２−ニトロ−４−アジドベンゼンか
ら誘導されるので使用するのに適当であり、４−アジド
−２−ニトロフェニル（ＡＮＰ）−４−アミノ−ブチリ
ール、ＡＮＰ−６−アミノカプロイル、ＡＮＰ−１１−
アミノウンデカノイル、ＡＮＰ−グリシル、ＡＮＰ−ア
ミノプロピル、ＡＮＰ−メルカプトエチルアミノ、ＡＮ
Ｐ−ジアミノヘキシル、ＡＮＰ−ジアミノプロピル、お
よびＡＮＰ−ポリエチレングリコールが含まれる。ＡＮ
Ｐ−６−アミノカプロイル、ＡＮＰ−１１−アミノウン
デカノイル、およびＡＮＰ−ポリエチレングリコールが
望ましい。光化学的反応性基として使用するに望ましい
芳香族ケトンにベンジルベンゾイルおよびニトロベンジ
ルベンゾイルが含まれる。 【００２０】熱化学的反応性基（熱エネルギーで活性化
される）はニトロフェニルハライド、アルキルアミノ、
アルキルカルボキシル、アルキルチオール、アルキルア
ルデヒド、アルキルメチルイミデート、アルキルイソシ
アネート、アルキルイソチオシアネートおよびアルキル
ハライド基が代表的なもので、これらが含まれる。熱化
学的反応性基として使用するに適当な基にはカルボキシ
ル基、ヒドロキシル基、第一アミノ基、チオール基、マ
レイミドおよびハライド基が含まれる。６−アミノヘキ
サン酸およびアミノウンデカン酸のような基のＮ−オキ
シスクシンイミドカルボン酸エステル、メルカプトスク
シニックアンヒドリドおよびβ−メルカプトプロピオン
酸、ホモシステインチオラクトン、およびポリエチレン
グリコール誘導体が望ましい。 【００２１】本発明の器具は生物適合性剤の分子および
化学的連結基残基を含む生物適合性固体表面を持ってい
る。化学的連結基残基は、固体表面に結合された光化学
的反応性基の残基並びに生物適合性剤に共有結合された
別の基の残基を持っている。光化学的反応性基の残基は
一般式において「Ａ」で表わされる光反応性基（前述）
の一部で、共有結合形成後も残っている。光反応基がＡ
ＮＰで固体基質がポリエチレンの時、その残基は炭素−
窒素結合である。ＡＮＰが光活性化されて形成されたニ
トレンはポリエチレンの炭素と反応して共有結合を形成
する。光反応性基がＢＢＡで固体基質がポリエチレンで
ある時、残基は炭素−炭素結合である。ＢＢＡが光で刺
激されると、２個のフェニル基を結び合わせている炭素
が活性化されてトリプレット状態となり、炭素−炭素結
合をポリエチレンとＢＢＡの間に形成し、ヒドロキシル
基を形成する。別の反応性基（「Ｂ」）がＮＯＳである
場合、その残基はフィブロネクチンのような生物適合性
剤の酸素または窒素基に結合された基のカルボキシル炭
素である。 【００２２】生物適合性剤として使用する酵素、細胞付
着因子およびある種の他の物質はやゝ高温に感受性であ
るため、本発明に使用する連結基上の別の反応性基は、
中程度の熱（例えば体温またはそれ以下）および光のよ
うな容易に適用できて無害の刺激によって活性化（すな
わち、それに応答して共有結合を生ずる）されることが
望ましい。光化学的反応性基が応答する刺激に応答しな
い反応性基は、ｐＨ変化、またはもうひとつの化学分子
種その他の添加に反応する基である。 【００２３】化学的連結基は、固体表面を遮蔽して生物
適合性の効果ある表面をつくり得るような密度で、表面
に共有結合することが望ましい。効果ある表面をつくる
に必要な結合化学基の密度は使用する生物適合性剤によ
って変る。 【００２４】〔実施例〕本発明は以下の非限定的な実施
例を参照することにより理解が深かまる。第１表は以下
の記載に使用した用語の略記の表である。 【００２５】実施例１ 内皮細胞付着／生育 １． プラスチック表面 種々の細胞因子をインビトロで（試験管で）試験するた
めの重合体表面に結合させ、これらの因子の細胞付着と
過剰生育への効果を測定した。重合体表面としては、ポ
リ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ
プロピレン（ＰＰ）およびポリテトラフルオロエチレン
（ＰＴＦＥ）ＧＯＲＥ−ＴＥＸ（６ｍｍの強化伸展ＰＴ
ＦＥ、ダブリュー・エル．ゴア アンド アソシエイ
ツ、インコーポレイテッド（Ｗ．Ｌ．Ｇｏｒｅ ａｎｄ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）の商標付製品）で
あった。試験した市販のチューブはポリエステル（Ｄａ
ｃｒｏｎ，Ｄ，６ｍｍの真直に編んだダクロン ベロ
ア、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）の商標付製品）シリコン
エラストマー（ＳｉｌａｓｔｉｃＲ，Ｓ，０．０３内径
のチューブ、ダウ コーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ）の商標付製品）およびポリウレタンである。ポリス
チレンプレートを対照として使用した。 ２．化学的連結基の調製 これらの実施例に使用した化学的連結基は４−アジド−
２−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ＡＮＰ−Ｅ
ＡＣＡ）、４−アジド−２−ニトロフェニルアミノウン
デカン酸（ＡＮＰ−ＡＵＤＡ）およびベンゾイル安息香
酸（ＢＢＡ）のＮ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）エ
ステルであった。ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳとＡＮＰ−Ａ
ＵＤ−ＮＯＳは本明細書に参考文献として示したピー．
ガイア、ディー．フリガーおよびジェイ．ホドグソン、
「哺乳動物細胞への酵素の光化学的カップリング」、フ
ァーマコロジカル リサーチ コミュニケーションズ、
９巻、１３１−１４１頁（１９７７年）（Ｐ．Ｇｕｉｒ
ｅ，Ｄ．Ｆｌｉｇｅｒａｎｄ Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，″
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ
Ｅｎｇｙｍｅｓ ｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌ
ｌｓ″ ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｊｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．
９，ｐｐ１３１−１４１（１９７７））に記載された方
法で調製した。要約すると、フルオロ−２−ニトロ４−
アジドベンゼンをε−アミノカプロン酸またはアミノウ
ンデカン酸と反応させて比較的反応性の低いフッ素をア
ミノアルキルカルボキシル基で置換する。次いでカルボ
キシル基をカルボジイミド活性化により）Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドでエステル化してＮ−オキシスクシン
イミドカルボン酸エステルを得る。ベンゾイル安息香酸
のＮＯＳエステルはカルボキシル基をカルボジイミド活
性化によりＮ−ヒドロキシスクシンイミドでエステル化
して調製した。ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳまたはＡＮＰ−
ＡＵＤ−ＮＯＳを化学的連結基として使用した時、ＡＮ
Ｐ基が前述の一般式Ａ−Ｘ−Ｂの「Ａ」で表わされる光
化学的反応性基である。ＮＯＳ基はこの式の「Ｂ」で表
わされる別の反応性基である。ＥＡＣまたＡＵＤ基は２
個の反応性基の間でスペーサーとして作用し、一般式の
「Ｘ」で表わされる。ＢＢＡ−ＮＯＳが化学的連結基で
ある場合には、ベンゾイル安息香酸基が一般式の「Ａ」
で表わされる光化学的反応性基であり、ＮＯＳ基は
「Ｂ」で表わされる別の反応性基である。Ｘで表わされ
る基は２個の反応性基を結びつける炭素である。 ３． 化学的連結基への生長因子の共有結合 生物適合性剤フイブロネクチン、ラミニン、コラーゲ
ン、内皮生育因子、およびヒト血漿アルブミンについて
合成生体用材への内皮細胞付着および過剰増殖を促進で
きるかどうかを試験した。これらの剤を４−アジド−２
−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ＡＮＰ−ＥＡ
ＣＡ）、４−アジド−２−ニトロフェニル−ウンデカン
アミノ酸（ＡＮＰ−ＡＵＤＡ）またはベンゾイル安息香
酸（ＢＢＡ）のＮ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）エ
ステルに次のようにしてカップリングさせた。ここで使
用する「光標識した」とは別の反応性基によって化学的
連結基にカップリングさせて光化学的反応性基を持つ生
物適合性剤を云う。 Ａ．連結基へのフイブロネクチンおよびラミニンの共有
結合 ヒトのフイブロネクチン（ウィスコンシン大学医学部）
およびマウスのラミニン（ベセスダ リサーチラブＢｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．から入手）
を別々に０．１Ｍホウ酸塩、ｐＨ９．０に１ｍｇ／ｍｌ
の濃度で溶解した。脱水したジメチルホルムアミド（″
ＤＭＦ″）に溶解したＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳまたはＡ
ＮＰ−ＡＵＤ−ＮＯＳまたは脱水したジオキサンに溶解
したＢＢＡ−ＮＯＳの溶液をフイブロネクチンまたはラ
ミニン溶液に対し、蛋白質のε−アミノ基（リジン残
基）の濃度に当モルになるように、暗黒下で１６時間か
け、４℃で注射器を使ってゆっくりと加えた。次いで、
その混合物を冷却しつつ４時間攪拌した。このフイブロ
ネクチンまたはラミニン溶液を遠心分離して不溶物を除
き、セファテックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５カラ
ムに流して未カップリングの光反応剤を除いた。画分に
ついて光基／蛋白質比を調べるため２６０ｎｍと４６２
ｎｍで追跡した。 Ｂ．化学的連結基へのＥＧＦ、コラーゲンおよびＨＳＡ
の共有結合 ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（シグマ ファーマシューテ
ィカルＳｉｇｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、
内皮生長因子（シグマ ファーマシューティカルＳｉｇ
ｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ−ｃａｌ）、およびヒト
血漿アルブミン（シグマ ファーマシューティカルＳｉ
ｇｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）を別々に０．
１Ｍホウ酸塩、ｐＨ９．０に２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解
した。ＤＭＦに溶解したＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳ、ＤＭ
Ｆに溶解したＡＮＰ−ＡＵＰ−ＮＯＳまたはシオキサン
に溶解したＢＢＡ−ＮＯＳの溶液を、ε−アミノ基（リ
ジン）の濃度に対し５Ｘモル量で、生物適合性剤を含む
溶液に対して、注射器を使い４℃で暗黒下、１６時間か
けてゆっくりと加えた。次いで、この溶液をリン酸緩衝
化食塩水（ＰＢＳ）１０００ｍｌを４回交換して透析
し、不溶物を遠心分離で除く。生成物について光基／蛋
白質比を知るため２６０ｎｍ、２８０ｎｍおよび４６２
ｎｍで分析した。 ４． プラスチック表面への生物適合性剤の共有結合 ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリ
ウレタン、ダクロン（ＤａｃｒｏｎＲ）（ベロア）、シ
ラスチック（ＳｉｌａｓｔｉｃＲ）（医学用）、および
ポリテトラフルオロエチレンの種々のシート、チューブ
および平板片を使用した。光標識した生物適合性剤０乃
至５００μｇ／ｍｌを含む溶液０．０５ｍｌをプラスチ
ック表面各０．５ｃｍ２切片に加える。この溶液を暗黒
下、室温で３時間、各片に吸収させた。過剰の液体を除
き、適当な波長で（ＡＮＰにはタングステン「スポット
ライトＳｐｏｔｌｉｔｅ」およびＢＢＡには長波長Ｕ
Ｖ）１２時間光分解することにより生物適合性剤を表面
に共有結合させた。光分解後、光標識生物適合性剤の共
有結合していない分子を除くために標本片にＰＢＳを４
秒間流して洗浄した。その後、標本片を組識培養中に置
き、下記により細胞因子への内皮細胞の反応を調べた。 ５． 修飾した表面について行ったインビトロ試験 Ａ．放射性標識生物適合性剤 放射性標識した〔３Ｈ〕生物適合性剤を上記のようにし
て光標識し、プラスチック表面に光カップリングした。
このプラスチック表面をＰＢＳで十分に洗浄し、有機溶
剤に溶解して液体シンチレーション分光法で測定した。
代表的な結果を第２表に示す。 これらの結果が示すように光標識生物適合性剤は表面に
共有結合されている。 Ｂ．修飾プラスチック表面へのウシ内皮細胞の付着 ウシ内皮細胞は長さ８−２４インチの胎仔から集めた。
角膜、大動脈およびへその内皮細胞を無菌的に集めた。
細胞を、２５ｍｍｏｌｅＨＥＰＥＳ緩衝液、１０％仔ウ
シ血清および２．５μｇアンホテリシンＢ／ｍｌを加え
たダルベッコの改良イーグル培地（アール．ダルベッコ
およびジー．フリーマン、バイロロジー８巻．３９６頁
（１９５９年）（Ｒ．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ａｎｄ Ｇ．
Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８：３９
６（１９５９））およびジェイ．ディー．スミス、ジ
ー．フリーマン、エム．ボグトおよびアール．ダルベッ
コ、バイロロジー１２巻、１８５−１９６頁（１９６０
年）（Ｊ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｍ．
Ｖｏｇｔ ａｎｄ Ｒ．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ Ｖｏｌ．１２：１８５−１９６（１９６０））
に記載）のような公知の高グルコース細胞生育培地
（「生育培地」）中で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベ
イターで生育させた。プレート、チューブまたはシート
を準備する毎に、細胞培養は一次培養から調製した。細
胞を０．２５％トリプシン溶液で細胞株から取り、生育
培地に再懸濁した。次いでトリパンブルー（０．４％）
溶液と血球計を使って細胞数を計測した。種々の濃度の
細胞を準備した材料の上に層状に置いた。細胞の付着を
５分から１４日間の種々の時間間隔で追跡した。付着は
少くとも２種の方法で測定した。第一の方法において
は、試料材料を培地から離し、殺菌した食塩液で２回洗
浄した。次いで細胞染色を行い、表面上の全細胞数を計
測した。第二の方法では、トリプシン溶液を使って細胞
を表面から離し、トリパンブルー法で細胞数を計測し
た。予備被覆したポリ塩化ビニルプラスチック上の内皮
細胞の付着および生育について代表的結果を第３表に示
す。各片に付着した生細胞数はトリパンブルー染色法で
測定した。 【００２６】【００２７】Ｃ．ヒト臍の内皮細胞の付着 一次のヒト内皮細胞を新鮮なヒト臍帯（４日令以前）か
ら採取した。帯を２０ｍｌのコード（ｃｏｒｄ）緩衝液
（０．１４４ＭＮａＣｌ、０．００４Ｍ ＫＣｌおよび
０．００１Ｍ ＰＯ４）で２回洗浄して血液および凝固
物を除く。コラゲナーゼを帯の中に注入し、室温で２０
分間放置した。温コード（ｃｏｒｄ）緩衝液１０ｍｌを
使い、コラゲナーゼと剥離した細胞を試験に噴出させ
る。試験管内の懸濁液を合せて、１５００ｒｐｍで５〜
１０分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を１０ｍｌの
コード（ｃｏｒｄ）緩衝液に再懸濁した。二回目の遠心
分離後、細胞をコード（ｃｏｒｄ）緩衝液に再懸濁し、
組織培養ディスクに置いた。すべての細胞を５％ＣＯ２
を流した３７℃のインキュベイター中でインキーベイト
した。細胞は仔ウシ血清を含まないコード（ｃｏｒｄ）
培地中で５ＩＣｒを使って放射性標識した。この放射標
識した細胞を細胞付着試験に使用した。上記のプラスチ
ックのプレート、シートおよびチューブは前述の通りに
調製した。細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー法
で細胞数を測定した。細胞を調製したプラスチックに３
時間乃至７日間付着させるようにした。細胞をすすぎ落
し、残りの付着している細胞全数を付着していない細胞
数と比較した。代表的な結果を第３表に示す。 Ｄ．内皮細胞を使った生育の測定 下記のようにして修飾した上記のプラスチック表面を細
胞が生育して習う時に、開始時から次の方法で細胞の生
育を追跡した。細胞因子０乃至５００μｇを含む生物適
合性剤溶液を１乃至６ｃｍの長さの表面を濃度勾配をつ
けて被覆した。細胞を組織からトリプシンまたはなにか
プロテイナーゼを使って取るという処理は行わなかっ
た。この組織を勾配の低い方の開始点に置いて印をつけ
た。室温で１５分間組織を落ちつかせ、生育培地をプラ
スチック上を湿めって覆うように加えた。すべての手順
は無菌的に行った。次いで、プレートを５％ＣＯ２イン
キュベイター中、３７℃でインキュベートした。生育を
２週間またはプラスチックの長さが完全に覆われるまで
毎日測定した。第３表に示したように、処理した表面上
の生育を非処理対照の表面と比較した。すべての材料を
すすぎ、永久走査電顕観察のために染色した。これらの
結果は、生育因子のフィブロネクチン（ＦＮ）およびコ
ラーゲン（ＣＯＬ）をプラスチック表面に共有的に付着
させると、プラスチックのウシ内皮細胞への生物適合性
が改善されることを示した。細胞がプラスチック表面で
生育した距離で示されるように、細胞は対照表面より修
飾表面に優先的に付着した。６． イン ビボ（生体
内）試験 この試験のために２匹の条件付けしたイヌ準備した。Ｇ
ＯＲＥ−ＴＥＸ（強化伸展ポリテトラフルオロエチレ
ン、ダプリュー．エル．ゴア アンド アソシエイツ、
インコーポレイテッド（Ｗ．Ｌ．Ｇｏｒｅ ａｎｄ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）の商標付製品）の小片
をＦＮ，ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮ（吸着および光カップリ
ング）、ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮ（吸着のみ）およびＰＢ
Ｓ対照により前被覆した。試験はブラインド試験で行っ
た。グラフトは文字によって標識されているが、外科の
チームはどのグラフトが修飾表面で、どれが対照かを知
らない。各イヌの左右の腸骨動脈に２個の６ｍｍ×５ｃ
ｍのＧＯＲＥ−ＴＥＸ片を移植した。グラフトをイヌの
中で１ケ月（３０日）間放置した。ヒトでの移植手順を
模放するために、抗炎症剤ペルソンチン（Ｐｅｒｓｏｎ
ｔｉｎｅ）およびアスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ）をイヌ
に与えた。両対照グラフト（ＰＢＳとＦＮ）は開いてい
て十分な口径を持っていた。吻合線はそのままで、内部
表面は滑らかであった。対照グラフトについては内皮化
は不十分であった。有意な血栓の証拠はみられなかっ
た。ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＦＮが結合した両グラフト（光カ
ップリングと吸着のみ）に血栓はなく、内皮化は完全
で、グラフト内部表面は平滑で輝いて見えた。 【００２８】実施例２ コンタクトレンズおよび眼内レンズ移植物の表面の修飾 本実施例の実験においては、化学的連結基に結合した親
水性ポリマー（生物適合性剤）の調製、コンタクトレン
ズ表面への基の光カップリング、および非処理レンズと
比較したこれらレンズへの人工涙液からのインビトロで
の蛋白の沈着測定を行った。生物適合性剤の角膜片との
インビトロでの適合性およびインビボでのウサギ眼内で
の適合性を知る実験を行い、レンズへの毒性または刺激
性反応がないことを確かめた。 １．化学的連結基への生物適合性剤の結合 Ａ．光標識ポリエチレングリコールの調製 分子量１０００（ＰＥＧ−１０００）と４０００（ＰＥ
Ｇ−４０００）のポリエチレングリコールを、本明細書
に参考文献で取り入れた「キムラ、及びエス．レーゲ
ン、ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー４
８巻、１９５頁（１９８３年）（Ｋｉｍｕｒａ，ａｎｄ
Ｓ．Ｒｅｇｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＯｒｇａｎｉ
ｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：１９５（１９８３）」
の相輸送法の修飾法により、フルオロニトロアジドベン
ゼン（ＦＮＡＢ）で標識した。要約すると、４−アジド
−２−ニトロフェニルポリエチレングリコール（ＡＮＰ
−ＰＥＧ）の相輸送合成では、６０％水酸化カリウム水
溶液（「ＫＯＨ」）／トルエンとＦＮＡＢおよびＰＥＧ
を混合し、抽出して下記のように薄層クロマトグラフィ
ー（ＴＬＣ）精製を行う。 ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００ ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００は０．０５ｍｍｏｌｅ ＰＥ
Ｇ−１０００を５ｍｌの６０％ＫＯＨおよび０．５ｍｍ
ｏｌｅ ＦＮＡＢ、１０ｍｌのトルエンに加えて調製し
た。この反応混液を室温で１６時間、急速に攪拌した。
生成物を有機溶媒層から分離した。クロロホルム／メタ
ノール／Ｈ２Ｏ／酢酸または水酸化アンモニウム、８５
／１５／１／１でのＴＬＣにより、非標識ＰＥＧからＡ
ＮＰ−ＰＥＧ−１０００のモノ−およびジ−置換誘導体
を分離した。ＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００に相当するバン
ド（低いＲｆ値）をシリカゲルからＴＬＣ溶媒で抽出
し、残存の酸または塩基を除くために共沸蒸溜した。最
絡生成物は水に可溶で、出発物質ＰＥＧの３０―４０％
がＡＮＰ−ＰＥＧ−１０００に転換した。 ＡＮＰ−ＰＥＧ−４０００ ＡＮＰ−ＰＥＧ−４０００を、反応中にすべての試薬を
溶液中に止まらせつつ５０℃で反応混液を急速に攪拌す
ること以外は、上記と同じ方法で調製した。ＡＮＰ−Ｐ
ＥＧ−４０００−ＯＨの収率は１０％であった。 Ｂ．光標識ジエファミンの調製 ポリオキシプロピレンポリアミンおよびポリオキシエチ
レンポリアミン（ジエファミン（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ
ｓ）と呼ぶ。ジエファーソン ケミカル カンパニー、
インコーポレイテッド（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）の商標）を、これらポリ
マーにＡＮＰ−ＥＡＣＡ，ＢＢＡおよびｎＢＢＡのＮ−
オキシスクシンイミド（「ＮＯＳ」）エステルをカップ
リングすることによって光標識した。これらのＮＯＳ−
誘導体を０．５×量で１×量ジエファミンに高度に脱水
した（高純度）溶媒中で加えた（ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯ
Ｓは脱水テトラヒドロフラン中、ＢＢＡ−ＮＯＳは脱水
ジオキサンまたはジメチルホルムアミド中、ニトロＢＢ
Ａ−ＮＯＳは脱水ジオキサンまたはジメチルホルムアミ
ド中）。暗黒下、室温で１６時間反応させた後、生成物
をクロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ／酢酸、８５／１
５／１／１のＴＬＣで分離した。モノ置換ジエファミン
誘導体をＴＬＣ溶媒で抽出し、水と共沸蒸溜して残存す
る酢酸を除いた。水溶性生成物ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジエフ
ァミン、ＢＢＡ−ジエファミン、およびｎＢＢＡ−ジエ
ファミンをそれぞれ１５％、１０％および１２％の収率
で分離した。 Ｃ．ＡＮＰ−ヒアルウロン酸の調製 ヒト胎盤ヒアルウロン酸（見かけの分子量１００−１３
０，０００）の末端糖を、イー．ジヤノウイッツ及びエ
ス．イー．チャーム「蛋白固定化およびアフィニティー
クロマトグラフィーのための酸化多糖の誘導」ビオキミ
カ エ ビオフィジカ アクタ４２８巻、１５７―１６
５頁（１９７６年）（Ｅ．Ｊｕｎｏｗｉｃｚ ａｎｄ
Ｓ．Ｅ．Ｃｈａｒｍ，″Ｔｈｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆＯｘｉｄｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ
ｅｓｆｏｒ ＰｒｏｔｅｉｎＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏ
ｇｒａｐｈｙ″，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．４２８：１５７―
１６５（１９７６））に記載され、本明細書に参考文献
とした、過ヨウ素酸法によって活性化した。この方法で
は、このように末端の糖を活性化しているヒアルウロン
酸溶液に過ヨウ素酸ナトリウムまたはカリウムを加える
ことを伴う。ヒアルウロン酸を１０倍量のジエファミン
に加え、室温で４時間反応させる。シアノ水素化ホウ素
ナトリウムで還元することによって連結を安定化させ、
十分に透析して過剰のジエファミンを除去した。ＤＭＦ
に溶解した１０倍モルのＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳを、
０．１Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．０に溶解したジエファミンに
注射器で加えた。この添加は１６時間かけて暗黒下、室
温で行った。過剰のＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳとＡＮＰ−
ＥＡＣ−ジエファミンをゲル▲ろ▼過クロマトグラフィ
ーによって除いた。コンタクトレンズポリマー骨格への
基の光カップリングに必要なアジド基の組込みはＡＮＰ
基を検出するために赤外吸収分光法で分析し、ジエファ
ミンスペーサーを検出するためにポリエチレングリコー
ル分析を、また誘導体のウロン酸含量を定量するため
に、ここに参考文献として挙げるティー．ビター及びエ
イチ．ミュアー、アナリティカルバイオケミストリー４
巻、３３０−３３４頁（１９６２年）（Ｔ．Ｂｉｔｔｅ
ｒａｎｄ Ｈ Ｍｕｉｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．４：３３０−３３４（１
９６２））に記載された修正カルバゾール分析を行っ
た。ポリエチレングリコール分析はドラゴンドルフ試薬
で検出した（テトラヨウドビスマス酸−塩化バリウ
ム）。貯蔵試薬（酢酸と水に４２５ｍｇ硝酸ビスマス、
１０ｇヨードカリウムを溶解）５ｍｌを１０％塩化バリ
ウム水溶液１０ｍｌに加え、５１６ｎｍでバックグラン
ウンドを読む。次いで、０．１ｍｌの試料を加え、キュ
ベットを逆転させて内味を混合し、１分間のインキュベ
イション後に５１６ｎｍで読みとった。値を標準曲線と
比較した。カルバゾール分析は以下のように行った：硫
酸試薬（硫酸中に０．０２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム−１
０Ｈ２Ｏ）３．０ｍｌを−７０℃に冷却した。これに試
料０．５７ｍｌを乗せ、混合物を室温になるまで攪拌し
た（３０分間）。試験管を１００℃に加熱し（１０分
間）、カルバゾール試薬（無水エタノール中に０．１２
５％カルバゾール）０．１ｍｌを加えて内容物を混合し
た（５分間）。１００℃に加熱した後、氷浴で室温に冷
却した。硫酸試薬をブランクとして試料を５３０ｎｍで
分光法分析した。結果を４−４０μｇ／ｍｌグルクロノ
ラクトン標準でつくった標準曲線と比較した。この分析
はヒアルウロン酸２０ｐｍｏｌｅを検出できる感度を持
っていた。１個のＡＮＰ、１個のジエファミンおよび１
個のヒアルウロン酸分子を持つ画分を集め、生物適性剤
として使用した。 Ｄ．光標識ヒアルウロン酸、メチルセルロースおよび硫
酸コンドロイチン ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジエファミン、ＢＢＡ−ジエファミン
およびニトロ−ＢＢＡ−ジェファミンをヒアルウロン酸
および硫酸コンドロイチンのウロン酸残基のカルボキシ
ル基にカルボジイミドを使って以下の方法により連結し
た。５モル過剰の光標識ジエファミンと１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドをＨ
Ｃｌと共に多糖ポリマーと、０．１ＮＨＣｌでｐＨ４．
５に調節した水中で混合した。混合物を暗黒下、室温で
２４時間反応させた。生成物をゲル▲ろ▼過クロマトグ
ラフィーで精製し、光基と炭水化物含量を上記のように
して分析した。 Ｅ．光標識したコラーゲンの調製 ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（シグマ ファーマシューテ
ィカルズ（ＳｉｇｍａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ）から入手）を０．１Ｍホウ酸塩、ｐＭ９．０に１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＤＭＦに溶解したＡＮＰ−
ＥＡＣ−ＮＯＳ、ジオキサンに溶解したＢＢＡ−サルフ
ァ−ＮＯＳまたはジオキサンに溶解したニトロＢＢＡ−
ＮＯＳをコラーゲン溶液に５０×モル過剰にして、暗黒
下、４℃で注射器により１６時間かけてゆっくりと加え
た。完全に添加した後、混合物を冷却して４時間攪拌し
た。コラーゲン生成物をＰＢＳを４回交換して透析した
後、遠心分離して不溶物を除去した。上清を２６０ｎ
ｍ、２８０ｎｍおよび４６２ｎｍで分光法的に測定して
光基／蛋白比を分析した。 Ｆ．光標識プロティナーゼの調製 有機溶媒に２５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したＡＮＰ−Ｅ
ＡＣ−ＮＯＳ，ＢＢＡ−ＮＯＳおよびｎＢＢＡ−ＮＯＳ
光基を５０モル過剰にしてパパイン（パパヤ、分子量２
３，４２６）に対し、暗黒下、４℃で注射器をつかって
１６時間かけて加えた。光基の添加終了後、混合物を更
に４時間攪拌し、次いでＰＤＳに透析してカップリング
していない光基を除去した。上清を２６０ｎｍ、２８０
ｎｍ、および４６２ｎｍで分光法的に測定して光基／蛋
白比を分析した。 ２． レンズ表面に対する生物適合性剤の光カップリン
グ 上記のようにして得られた光標識生物適合性剤を第４表
記載のコンタクトレンズ材料に２５０−１０００ｐｍｏ
ｌｅ／コンタクトレンズの濃度で加えた。溶液をコンタ
クトレンズ上に暗黒下、室温で３時間吸着させた。次い
で光標識剤を適当な波長で（ＡＮＰでは４５０ｎｍ、Ｂ
ＢＡおよびｎＢＢＡ誘導体では３２０ｎｍ）１２時間、
光分解によってプラスチックに共有結合させた。光分解
後、コンタクトレンズを５×５ｍｌの正常な食塩液
（０．８５％ＮａＣｌ）で洗浄して共有結合していない
基を除去した。放射性標識基をレンズ材料にカップリン
グし、レンズ片をテトラヒドロフラン、次いでＤＭＳＯ
で処理して放射性標識を固体表面から放出させることが
できる。シンチレイション剤を加え、液体シンチレイシ
ョン分光法により生物適合性剤／ｃｍ２を測定した。代
表的な結果を第４表に示す。 【００２９】【００３０】ソフスピン（Ｓｏｆｓｐｉｎ）コンタクト
は水分約３８．６％を持つポリマコン（ポリメタクリレ
ート）でつくられ、バウシュ アンド ロン、インコー
ポレイテッド（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ，Ｉｎ
ｃ．）の商標付製品である。パーマフレックス（Ｐｅｒ
ｍａｆｌｅｘ）コンタクトは水分約７４％を持つポリメ
タクリレートがらつくられ、コーパービジョン、インコ
ーポレーテッド（Ｃｏｏｐｅｒｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎ
ｃ．）の商標付製品である。ビスタマーク（Ｖｉｓｔａ
ｍａｒｃ）コンタクトは水分約５８％を持つポリメタク
リレートからつくられ、ジョンソン アンド ジョンソ
ン（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）の商標付製品
である。リドフィルコン（Ｌｉｄｏｆｉｌｃｏｎ）コン
タクトは水分約７０％を持つポリメタクリレートからつ
くられ、バウシュ アンド ロン、インコーポレイテッ
ド（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ，Ｉｎｃ．）の製品で
ある。第４表の値は平方センチメートル表面積当りのｐ
ｍｏｌｅ生物適合性剤またはｎｇ／ｃｍ２で表わされて
いる。カップリング効率は２６０ｐｍｏｌｅ／ｃｍ２生
物適合性剤／コンタクトレンズ材料、７１０ｐｍｏｌｅ
／ｃｍ２生物適合性剤／シリコン、および６６０ｐｍｏ
ｌｅ／ｃｍ２生物適合性剤／ｃｍ３ポリマコンボタンの
添加に基く。ＡＮＰ−ヒアルウロネートはシリコンに対
し３５７ｐｍｏｌｅ／ｃｍ２およびポリマコンボタンに
対し１６５５ｐｍｏｌｅ／ｃｍ３で加えた。ハイドロゲ
ルコンタクトレンズ材料に対しｎＢＢＡ−ジェフよりＡ
ＮＰ−誘導体の方が高い負荷密度でカップリングした。
この結果はシリコン化合物では逆になった。 ３． インビトロ（試験管内）吸着試験 人工ヒト涙液を、ここに参考文献としたビー．ピー．グ
ルア、「涙装置」、アドラーの眼の生理学：臨床応用
（アール．エイ・モーゼス編）、シー．ブイ．モスビー
カンパニー、セントルイス ミズリー（１９８１年）
（Ｂ．Ｐ．Ｇｌｏｏｒ，″Ｔｈｅ Ｌａｃｒｉｍａｌ
Ａｐｐａｒａｔｕｓ″ｉｎＡｄｌｅｖ′ｓＰｈｙｓｉｏ
ｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉ−ｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ａ．Ｍｏｓｅｓ，ｅ
ｄ．），Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ Ｃｏ．，Ｓｆ．Ｌｏｕｉ
ｓ，Ｍｏ（１９８１））に記載されている配合に従って
調製した。この文献に示されているように、ヒトの涙に
存在する主要蛋白は血清アルブミン（ＨＳＡ）、ガンマ
グロブリン（ＨＧＧ）およびリゾチーム（ＬＹＺ）であ
る。ヒトの涙に存在する主要なステロールはコレステロ
ールとコレステロールエステルである。 Ａ．３Ｈ蛋白質 蛋白成分を、ここに参考文献としたエヌ．ジェントフト
及びディー．シー．ディアボーン、ジャーナルオブ バ
イオケミストリー２５４巻４３５９−４３６５頁（１９
７９年）（Ｎ．Ｊｅｎｔｏｆｔ ａｎｄ Ｄ．Ｃ．Ｄｅ
ａｒｂｏｒｎ、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２５４：４３５９−４３６５（１９
７９））に記載されているようにホルムアルデヒドおよ
びトリチウム標識された水素化ホウ素ナトリウムで還元
的にメチル化してトリチュウム標識した。要約すると
０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に１ｍｇ／ｍｌ濃度
に溶解した生物適合性剤をトリチウム標識された水素化
ホウ素ナトリウムと反応させ、２２℃で２時間ゆり動か
しつつ、ホルムアルデヒドによりメチル化した。生成物
を０．０１Ｍリン酸塩、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ７．４のＰＢＳに対して透析し、ゼラチンセファロー
ズを使った親和クロマトグラフィーで精製した。結合し
た剤を１Ｍ臭化ナトリウム、０．０２Ｍ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．０で溶出し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して
透析した。 Ｂ．人工涙液の調製 上記の放射性標識蛋白質を人工涙液の調製に使用した。
放射性標識した蛋白質の１種またはトリチュウム標識さ
れたコレステロールを各人工涙液混液に含ませた。他の
成分は放射性標識されていない。コンタクトレンズ材料
を人工涙液中に３７℃で１週間、ゆるやかにゆすりなが
らインキュベートした。終了後、レンズ材料を０．８５
％ＮａＣｌの５×１０ｍｌで洗浄した。次いで、レンズ
材料に吸着した蛋白質の量を液体シンチレイション測定
で分析した。インビトロ蛋白沈着の結果を第５表に示
す。全蛋白質沈着の減少はＡＮＴ−１０００−ＯＨ修飾
ソフスピンレンズで８５％に達した。各生物適合性剤は
対照コンタクトレンズ材より高いか、同じレベルであっ
たが、ＡＮＰ−１０００−ＯＨ被覆ポリマコンボタン、
ＡＮＰ−４０００−ＯＨ被覆ポリマコンボタンおよびＡ
ＮＰ−ヒアルウロネート被覆ポリマコンボタンを除くす
べてのレンズ材料で全体の蛋白量は減少していた。成績
の悪いものはすべてポリマコン材料そのものについてで
あり、これはソフスピンレンズのようなポリマコンコン
タクトレンズと異って反応しているようであった。全体
的に見て、これらインビトロ蛋白沈着試験により、１週
間でコンタクトレンズ材料上に人工涙液からおこる蛋白
沈着に有意にあるいは劇的に減少していた。 【００３１】 【００３２】インビトロのコレステロール沈着試験結果
を第６表に示す。人工涙液中に７日間インキュベイトし
た後のコレステロール沈着量はポリ塩化ビニルの場合よ
り８３％減少していた。ポリマコンボタン以外のすべて
の型のコンタクトレンズでコレステロール沈着の減少が
BR>見られた。この場合もこれらの材料は同じポリマー
でつ〈られたコンタクトレンズと異る反応をする。 【００３３】 【００３４】Ｃ．アミノ酸分析 対照および表面修飾したレンズを３７℃で１週間、ゆる
やかにゆすりながら人工涙液中でインキュベイトした。
レンズを５×１０ｍｌの０．８５％ＮａＣｌで洗浄し、
６ＮＨＣｌで加水分解した後、加水分解物をアミノ酸分
析機によって標準的なアミノ酸分析を行った。対照と表
面修飾したレンズの全アミノ酸含量をたがいに比較し
た。全アミノ酸含量のの減少は蛋白質吸収の減少を示
す。酸水解したコンタクト レンズの全アミノ酸分析を
第８表に示す。これらの結果は全アミノ酸をｎｍｏｌｅ
／ｍｌで示している。これらの結果から、ソフスピンポ
リマコンレンズのＡＮＰ−１０００−ＯＨ，ＡＮＰ−４
０００−ＯＨおよびｎＢＢＡ−ジェフ修飾は人工ヒト涙
液に７日間インキュベイトした後のレンズへの蛋白質沈
着を減少させることが明らかになった。 【００３５】【００３６】４． インビトロ毒性試験 上記の生物適合性レンズ材料について刺激性または毒性
反応を調べた。対照および生物適合性レンズをラミナー
フロー（層状流）フード内で最終洗浄を行って無菌的に
調製した。レンズを、１０％仔ウシ胎仔血清と５％グル
タミンを加えたダルベツコ修正エッセンシャル培地（抗
生物質および抗かび剤を添加）のような公知の高グルコ
ース細胞培地の溶液中に置いた。生きている３−５ケ月
令胎仔ウシ角膜をレンズ上に置いた。角膜の上皮表面を
いくつかの試験ではレンズ表面と接触させ、他の試験で
は内皮細胞表面をレンズ表面に直接置く。この系を７−
１０％ＣＯ２培養器内で３７℃、１−２週間置いた。培
養開始から種々の時間後に上皮および／または内皮細胞
の生存を染色法で測定した。 ５． 共有結合の安定性のインビトロ試験 表面修飾したポリマコン（ポリメタクリレート）を酵素
クリーナー（パパイン）、熱殺菌および化学殺菌（塩化
ナトリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸を含む緩衝
化した水溶液）処理することによって共有結合の安定性
を調べた。これらの結果を第８表に示す。 【００３７】 【００３８】共有結合は酵素的洗浄と熱殺菌に対して１
００％安定であった。化学殺菌に対してＡＮＰ−ヒアル
ウロン酸以外は生物適合性剤の幾分の損失があった。 ６． 生物適合性のインビボ（生体内）試験 予備的なインビボ生物適合性試験をウサギ系で行った。
少くとも２４匹の動物を各試験に使用した。ウサギの眼
に合うようにデザインした鞏膜レンズをこの試験で使用
した。ウサギには次のスケジュールでレンズを着用させ
た。 ６匹のウサギ 左眼はレンズなし。右眼に対照のレン
ズ。 ６匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。右眼に物理的に処
理したレンズ（表面修飾レンズと同じ物理的処理をした
が、生物適合性剤で被覆していない）。 １２匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。右眼に表面修飾
したレンズ。 ウサギの眼にレンズを装着する前に、ケラタミン／キシ
ラジンによりウサギを麻酔した。メチルセルロース／正
常食塩液湿潤液を１時間毎に与えて眼とレンズの適当な
潤滑性を保った。コンタクト レンズを８時間／日装着
させた。適当な時間、レンズ着用後、スリットランプと
螢光染料法でウサギを検査した。眼刺激の程度を、参考
文献としたティー．オウ．マクドナルド及びジェイ．エ
イ．シャダック、「眼刺激」、アドバンシズインモダン
トキシコロジー ４巻１６２−１６６頁（１９７７年）
（Ｔ．Ｏ．ＭｃＤｏｎａｌｄ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｓｈａ
ｄｄｕｃｋ，″Ｅｙｅ ｌｒｒｉｔａｔｉｏｎ，″ｉｎ
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎＭｏｄｅｒｎＴｏｘｉｃｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ １６２−１６６（１９７
７））に記載されているマクドナルド−シャダック（Ｍ
ｃ Ｄｏｎａｌｄ−Ｓｈａｄｄｕｃｋ）スケールによっ
てグレード付を行った。マクドナルド−シャダック法で
は、結膜充血、結膜肥厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常お
よび角膜混濁およびその他の病状を０−４のスケールで
グレード付けし、その際、０は正常、＋４が異常が最高
とした。インビボのウサギ試験結果を第９表に示す。ウ
サギについてのマクドナルド−シャダックスコアを表に
示した。これらの結果についてマン−ホイットニー（Ｍ
ａｎｎ−Ｗｈｉｔｕｅｙ）Ｕ検定を行い、表面修飾およ
び対照レンズ間に統計学的に有意差が認められなかった
（Ｐ＜０．０５）。したがって、これらの検定から、こ
のウサギにおける４日間の試験で、表面修飾レンズの結
膜充血、結膜肥厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常、角膜混
濁、パンヌス血管新生、上皮由来損傷は対照レンズに比
較して差は認められないことが明らかになった。対照お
よび修飾レンズで見られた刺激はウサギのコンタクトレ
ンズへの耐性発現と関連しているようであった。 【００３９】 【００４０】実施例３ ポリウレタンチューブへのアルブミン、ヘパリンおよび
ウロキナーゼのカップリング １．光標識アルブミンの調製 血清アルブミン（イヌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ
９．０）に溶解した。ＤＭＦに２５ｍｇ／ｍｌで溶解し
た４−アジド−２−ニトロフェニル−６−アミノカプロ
イル−Ｎ−オキシスクシンイミド（ＡＮＰ−ＥＡＣ−Ｎ
ＯＳ）溶液を、アルブミンに対してＡＮＰ−ＥＡＣ−Ｎ
ＯＳが１０倍モル過剰になるように、暗所下、室温で攪
拌しながら注射器で１２時間かけてアルブミンに加え
た。次いで、この溶液を暗所下、１ｌのリン酸緩衝化食
塩水（ＰＢＳ）に対して透析を３回行った。透析後、溶
液を遠心分離して不溶物を除去した。１／１００に希釈
して４７０ｎｍでの吸光度を分光学的に測定してＡＮＰ
／アルブミン比を測定した。 ２．ポリウレタンチューブへのアルブミンの光カップリ
ング ポリウレタンチューブをジオキサンに３０秒間浸漬し、
その後直ちに脱イオン水ですすいだ。このエッチングし
たチューブを暗所下、室温で攪拌しつつ、少なくとも２
時間、光反応性アルブミン溶液に浸漬した。次いで、チ
ューブを暗所下で少なくとも１０分間風乾し、そして少
なくとも１時間強い可視光線に暴露した。光反応性アル
ブミンへの浸漬、乾燥および光分解を２回繰り返し、最
後は浸漬を一晩行った。次いで、チューブを室温で１時
間、１．０Ｎ ＮａＣｌで洗浄した。ＮａＣｌ溶液は１
時間の間に少なくとも１回交換した。 ３．ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのヘパリン
のカップリング アルブミン−ポリウレタンチューブを脱イオン水５．０
ｍｌに浸漬した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）２００ｍｇを水
に溶解し、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで４．０に調整した。ヘ
パリン３０ｍｇを含む水１ｍｌをＥＤＣ溶液に加え、ｐ
Ｈを再び１Ｎ ＨＣｌで４．０に調整した。浸漬したポ
リウレタンチューブを含む溶液を室温で２時間攪拌し、
その後、さらにＥＤＣ２００ｍｇを加えた。反応を室温
で一晩続け、そしてチューブをＰＢＳ中ですすぎ、カッ
プリングしていないヘパリンと反応副生成物を除去し
た。 ４．ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのウロキナ
ーゼのカップリング 血清アルブミンを固定化したポリウレタンチューブを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１．２
５％グルタルアルデヒドに室温で１５−１８時間浸漬し
た。次いで、チューブを脱イオン水中で３０分間洗浄
し、その間、少なくとも１回水を交換した。ポリウレタ
ン−アルブミン−グルタルアルデヒドを次に０．１Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解したウロキナーゼ溶液
（８．３単位／ｍｌ，２〜３ｍｇ／ｍｌ）に浸漬し、４
℃で一晩攪拌した。チューブをＰＢＳで４時間すすぎ、
その後、ウロキナーゼ活性を測定した。ポリウレタンと
ポリヘマの２種のポリマーを固体表面として使用した。
修飾表面は１〜１０ｍｇヘパリン／ｃｍ2 、０．６〜
１．３ｍｇウロキナーゼ／ｃｍ2を有していた。 【００４１】実施例４ 固体表面へのフィルムのカップリング被覆フィルムの形
成と表面へのその共有結合 ＡＮＰ−ヒアルウロン酸の調製 ヒアルウロン酸の光標識誘導体（ＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェ
ファミン、ＢＢＡ−ジェファミンおよびニトロＢＢＡ−
ジェファミン）を前述のようにして調製した。光反応性
被覆材からフィルムをつくり、暗黒下にコンタクトレン
ズの表面上に置く（浸漬して乾燥による）。生体用材表
面への共有結合および分子間架橋によるフィルムの強化
を照明によって行った。もうひとつの実施例において、
人工股関節をＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェファミン−ヒアルウ
ロン酸（１．１：１ｍｇ／ｍｌ）に暗黒下で３時間浸漬
した。これを溶液から取り出し、乾燥して人工関節上に
被覆材料の薄いフィルムを形成させた。次いで、フィル
ムを関節に対し、４℃で８時間、４００乃至４５０ｎｍ
で照明を当てて共有結合させた。次に、関節を生理食塩
液ですすいで未カップリングのＡＮＰ−ＥＡＣ−ジェフ
ァミン−ヒアルウロン酸を除去した。骨に結合したヒア
ルウロン酸は摩擦を低減し、関節領域での骨の磨耗を減
らす。ウシ血清アルブミン１００ｍｇを２ｍｌの０．１
Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９に溶解した。ＡＮＰ−ＡＵＤ−
ＮＯＳ１４ｍｇを５０μｌのジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）に溶解し、このＡＮＰ−ＡＵＤ−ＮＯＳ溶液をＢ
ＳＡ溶液に対し、暗黒下、室温で十分攪拌しながら１５
時間かけてゆっくりと加えた。更に３乃至４時間攪拌し
た後、溶液を０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ９に対し暗黒下
で２４時間透析し、この間少くとも４回、各２ｌの緩衝
液を交換した。透析したＡＮＰ−ＢＳＡを暗黒下でパラ
フィンフィルム上にピペットで１００μｌ置き、乾燥さ
せた。フィルムが乾燥した後、ホウ酸緩衝液、ｐＨ９中
の１．２５％グルタルアルデヒド１００μｇを重ねて載
せ、暗黒下、室温で１時間インキュベイトした。次いで
フィルムをパラフィンフィルム上で水をゆっくりと滴下
して洗浄し、水を流しておく。この洗浄を１時間行った
後、フィルムを再乾燥して、注意深くパラフィンフィル
ムからフィルムを持ち上げ、プラスチック表面に移す
（例えばポリウレタン）。プラスチック表面上で、フィ
ルムを再び２０％ジオキサン含有水で湿らせ、暗黒下で
再乾燥した。プラスチック表面上のフィルムを４℃で４
時間、強烈な可視光線に露光してフィルムを表面に結合
させるが、この間表面の過熱を防ぐためにファンで通気
した。本発明の望ましい実施態様を記載したが、本発明
の主旨、特許請求の範囲から離れることなしに、種々の
変更、適応および修飾を行うことができることを銘記す
べきである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
A61L 33/00
A61L 27/00
A61L 29/00
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．生体用材の固体表面と、互いに結合された生物適合
性剤の分子からなる生物適合性フィルムと、活性化によ
り前記固体表面に共有結合できる光化学的反応性基およ
び前記フィルムに結合された別の反応性基の残基で、一
方の基は他方の基が応答する刺激に応答しないような基
を持つ化学的連結基とを使って生物適合性フィルムを持
つ生体用材を得る方法であって、 前記化学的連結基の光化学的反応性基を活性化して前記
固体表面に前記光化学的反応性基を共有結合させること
を特徴とする、生物適合性フィルムを持つ生体用材を得
る方法。 ２．前記別の反応性基が熱化学的反応性基である請求項
１記載の方法。 ３．前記固体表面が実質的に熱化学的に非反応性である
請求項１記載の方法。 ４．前記固体表面がポリマー材料である請求項１記載の
方法。 ５．前記ポリマー材料がポリウレタン、ポリビニルピロ
リドン、ポリアミド、ポリアミン、ポリテトラフルオロ
エチレン、ポリ（ｐ−フェニレンテレフタルアミド）、
ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリアクリレート、
ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリイミ
ン、ポリエステル、ポリエチレン、セルロースまたはシ
リコーンである請求項４記載の方法。 ６．前記生体用材が血管グラフトチューブ、透析チュー
ブまたは膜、血液酸素供給器チューブまたは膜、血液バ
ッグ、カテーテル、縫合糸、軟質または硬質組織補綴、
合成補綴、人工器官、コンタクトレンズまたは眼内レン
ズからなる請求項１記載の方法。 ７．前記生体適合性剤が成長因子、コラーゲン、アルブ
ミンまたはプロテイナーゼである請求項１記載の方法。 ８．生体用材の固体表面と、互いに結合された生物適合
性剤の分子からなる生物適合性フィルムと、活性化によ
り前記固体表面に共有結合できる光化学的反応性基およ
び前記フィルムに結合された別の反応性基の残基で、一
方の基は他方の基が応答する刺激に応答しないような基
を持つ化学的連結基とを有する生物適合性フィルムを持
つ生体用材であって、 前記固体表面が前記化学的連結基に該連結基の光化学的
反応性基を介して共有結合され、そして前記フィルムが
前記化学的連結基に該連結基の別の反応性基を介して共
有結合されていることを特徴とする、上記生物適合性フ
ィルムを持つ生体用材。 ９．前記フィルムがアルブミンである請求項８記載の生
体用材。 １０．前記別の反応性基が熱化学的反応性基である請求
項８記載の生体用材。 １１．前記固体表面が実質的に熱化学的に非反応性であ
る請求項８記載の生体用材。 １２．前記固体表面がポリマー材料である請求項８記載
の生体用材。 １３．前記ポリマー材料がポリウレタン、ポリビニルピ
ロリドン、ポリアミド、ポリアミン、ポリテトラフルオ
ロエチレン、ポリ（ｐ−フェニレンテレフタルアミ
ド）、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリアクリレ
ート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ
イミン、ポリエステル、ポリエチレン、セルロースまた
はシリコーンである請求項１２記載の生体用材。 １４．前記生体用材が血管グラフトチューブ、透析チュ
ーブまたは膜、血液酸素供給器チューブまたは膜、血液
バッグ、カテーテル、縫合糸、軟質または硬質組織補
綴、合成補綴、人工器官、コンタクトレンズまたは眼内
レンズからなる請求項８記載の生体用材。 １５．前記生物適合性剤が成長因子、コラーゲン、アル
ブミンまたはプロテイナーゼである請求項８記載の生体
用材。
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