JPH03503005A - 生体適合性被膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生体適合性被膜 本願は、１９８６年１０月１７日に提出されたアメリカ合衆国特許願事９２０． ５６７号の、及び１９８２年９月２９日に提出されたアメリカ合衆国特許願事４ ２８．０７４号の部分継続出願である１９８７年１０月１６日に提出されたアメ リカ合衆国特許願事１０８．７６５号の部分継続出願である。

発明の背景 生体分子−これは、生物学的活性を示すか又は生物学的活性を調節する際に有効 な化合物の分子である−は通常、溶液中で又はガラスピーズのような固体支持表 面に吸着若しくはその外に結合されて使用される。アメリカ合衆国特許第３．９ ５９．０７８号には、固体表面への酵素の結合について開示されている。

生体分子は、それらが結合する固体又は半固体表面を変えることができる。例え ば、ヘパリンは抗凝結性を付与するために血液袋のポリエチレン表面に結合させ ることができる。エバート（Ｅｌｂｅｒｔ）他；誘導化され且つ固定化されたヘ パリンの抗凝結活性（Ｔｈｅ　Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　Ａｃｔ−ｊｖｉｔ ｙ　ｏｆ　Ｄｅｒｉｖａｔｊｚｅｄ　ａｎｄ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｈｅｐ ａｒｉｎｓ）、生体材料（Ｂｆｏｍａｔｅｒｊｌｓ）　：界面現象及び応用（Ｉ ｎｔｅｒｆａｃｉａｌＰｈｅｎｏｍｅｎａ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ）、　タッパ−（Ｃｏｏｐｅｒ）細編。

アメリカン　ケミカル　ソサエティ（Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）、　１ ９８２年、第１６１〜１７６頁。

現在い（つかの方法が、固体又は半固体基材上に合成及び自然に産生された分子 を固定化するために存在する。

一般的に用いられる化学手法は、高度に基材依存性であるか又は固定化された種 の充分に減少した活性を与える。

前記化学手法の例は、コポリマーグラフト化方法〔シーソン、ピー、エッチ、　 （Ｌａｒｓｓｏｎ、　Ｐ、　Ｈ，）、　　ジＥ！ハンソン。

ニス、ジー、（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｓ、Ｇ、）；　フルト、エイ、　（Ｈｕｌ ｔ。

人、）；及びゴｘ、　ｘ：Ｘ、、　（Ｇｏｔｈｅ、Ｓ、）：イムノアッセイのた めに適するグラフト化されたプラスチック表面への蛋白質の結合（Ｃｏｖａｌｅ ｎｔ　Ｂｉｎｄｉｎｇｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｏ　Ｇｒａｆｔｅｄ　Ｐｌ−ａ ｓｔｉｃ　５ｕｒｆａｃｅｓ　５ｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ ｅｙｓ）；ジエイ。

イムノ、メソッズ（Ｊ、　［ｍｍｕｎｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第９８号、　１ ９８７年、第１２９〜１３５頁〕を含む。

蛋白質及び多糖類としての前記生体分子の第三級及び第四級構造は、歴史的には 本質的に“静的”であると見られていた。生体分子機能のこの静的外見は、最近 機能のための基礎として分子内構造の動的な運動を理解する方法を提供した。ジ ャープラス、エム、　（Ｊａｒｐｌｕｓ、Ｍ）；マッ力モン、ジェイ、エイ、　 （ＭｃＣａｍｍｏｎ、Ｊ、Ａ、）：蛋白質の動力学（Ｔｈｅ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ 　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、サイエンティフィック　アメリカン（Ｓｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ）、四方、　　１９８６年。

第４２〜５１頁。この理解の意味は、最適な活性のためには、蛋白質及び他の生 体分子は生体分子の配座のみならず分子運動も歪めない方法により固定化される べきであるということである。

活性の損失に加えて、生体分子の固定化の際に起こり得る配座の歪みは、特に移 植及び医療器具表面の望ましくない生物学的応答を起こす可能性がある。例えば 、血餅形成性の増大又は他律反応の誘導及び移植後の拒絶反応が報告された。特 定の高分子（例えば、蛋白質及び多糖類）が先に未処理のポリマー又は他の医療 器具材料に出合った場合には、それらは前記表面上に吸着され、次いで配座及び 活性の両方において変性を起こす。軟組織移植における他律反応及び大部分のポ リマーの血餅形成性は、蛋白質層が器具表面上に吸着された後の被移植体内の細 胞レベルの応答を含む。いわゆる逆波移植体応答は、器具表面上に固定化された 場合に異常な機能を生ずる変質した高分子構造の影響を受けるかもしれない。

種々の血漿蛋白質は、変性したヘリックス又はベーターシートのような第二構造 の損失の結果として遅い配座の変化を起こす。前記種類の変化による表面に固定 化された蛋白質の変性は、それらを抗原性にするかもしれない。ベータース、ジ ェイ、エッチ、　（Ｐｅｔｅｒｓ、　Ｊ、　Ｈ，）及びガートジル、イー、　（ Ｇｏｅｔｚｌ、Ｂ、）：配座変性アルブミンにおける高い抗原反応性の再生（Ｒ ｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　Ｇｒｅａｔｅｒ　Ａｎｔ−ｉｇｅｎｉｃ　Ｒｅａｃｔｉ ｖｉｔｙ　ｉｎ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ　Ａｌｔｅｒｅｄ　Ａｌｂ ｕ−ｍｉｎ）、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリ（Ｊ、Ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ、）、第２２４号、　１９６９年、第２０６８頁；スタ ーン、アイ、ジェイ＋　（Ｓｔｅｒｎ、　１．　Ｊ、　）他：血漿蛋白質関連物 質の免疫的効果（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｍａｔｅｒｉ ａ−１ｓ　ｏｎ　Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、　　コンフ、ブロク、ア ーティフィシャル　ハート　プログラム（Ｃｏｎｆ、　Ｐｒｏｃ、　Ａｒｔｉｆ ｉｃｉａｌＨｅａｒｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ）、ナショナル　ハート　インステイチ ュート（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、１９６９年、 第２５９頁。

いくつかの血漿蛋白質の固定化は、変性された血餅形成性応答を生ずるかも知れ ない。ブラシュ、ジエイ、エル。

（Ｂｒａｓｈ、　Ｊ、　Ｌ、　）　：人造表面との蛋白質相互作用（Ｐｒｏｔｅ ｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　５ｕｒｆａ ｓｅｓ）、天然及び人造表面との血液の相互作用（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄｗｉｔｈ　Ｎａｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ａｒｔｉｆｉｃｉ ａｌ　５ｕｒｆａｃｅｓ）、サルラマン。

イー、ダプリュ、　（Ｓａｌｚｍａｎ、Ｂ、Ｗ、）編、　１９８１年、マーセル デツカ−社（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ、）、第３９〜４４頁。

生体分子を支持体から離して配置することにより、幾分か改良された生体分子活 性が観察されなければならないということが予想されるであろう。スペーサ一手 段の使用を示す初期の研究が、ヘパリンに対して行われた。

上記エバート（Ｒｂｅｒｔ）他は、ヘパリンの生体活性は支持表面から離してヘ パリン分子を保持するスペーサーの長さに関する限定された寸法に相関し得るこ とを報告した。

活性化された部分的トロンボプラスチン時間は、ヘノ（リン活性を指示するもの としてウシの血漿について定量された。ヘパリンは、種々の長さの疎水性脂肪族 スペーサーに固定化され、そしてスペーサーの長さにより増大するヘパリン活性 を生じた。しかしながら、アルカンスペーサーの疎水性のため、水性の生理的条 件下での長鎖の使用はスペーサー分子の旋回又は折り重なりを起こし、それ故ス ペーサーは固体又は半固体表面から生体分子を離すためのそれらの能力を失うこ とが予想されるであろう。

発明の要約 表面への生体分子の結合に関する特定の実用上の問題は、延長された場合に少な くとも２５人の鎖長により離された二つの反応性基を有する長鎖化学スペーサー を用いることにより避けることができる。反応性基の間のスペーサーの長さは、 スペーサーが結合している表面に関する如何なる実質的に不利な相互作用からも 生体分子基を離すために充分である。本発明のスペーサーは、一般的に下記の要 求に従っている。

１、スペーサーは、支持表面に及び生体分子に共有結合していてよ（、且つ共有 結合は所望により異なる予備決定条件下で起こる。

２スペーサーと生体分子のカップリングのための反応条件は、生体分子の損傷を 避けるために充分に穏やかであり、且つ生体分子とスペーサーの間の不利な相互 作用は最小にされる。

＆好ましくは、スペーサーはその長さが与えられた生体分子の特定の活性を最適 化するために所望により調整し得るような繰り返し単位含む。

４、生体分子が結合した表面における、大きな容積上の物理変化は全くない。

本発明の方法は、化学鎖が鎖の延長された長さに沿つて測定して少な（とも２５ 人の基の間の隔たりを提供する、二つの反応性基をその上に有するヘテロ三官能 性スペーサーの使用により生体分子をその上に固定化することによる表面処理を 含む。本文中での使用において、“延長された′鎖長は、鎖が好ましい結合角を 保持した状態に一致するその最大長さに延ばされた場合の化学鎖に沿った二つの 位置の間の直線距離に関するものである。例えば、プロパンＣＨ，−ＣＨ，−Ｃ Ｈ，は、約２．５人の末端炭素原子間の“延長された”鎖長を示しく１０９．５ °の結合角が観察される）、同様に分子に沿った結合距１１１（炭素原子−炭素 原子）の合計は約３．０６人である。本書記載のスペーサー鎖に沿って測定した 距離は、全て“延長された”鎖長である。

固定化を行うために結合基を生成させるための目標表面の予備処理が全く必要な いように、スペーサーは全体として自己含有的であるのが望ましい。本発明の要 点は、不利な基材／生体分子相互作用が予想し得るように減少させることができ るということを発見したことである。

一実施態様において、本発明は骨格に結合し且つ骨格により約２５人よりも少な くない延長された鎖長能された二つの反応性基有し、該反応性基の一つは与えら れた刺激に応答するために表面と共有結合を形成することが可能であり、そして 他の反応性基は生体分子と共有結合を形成することが可能である化学的骨格から なる、生体分子を表面に拘束し且つ表面の存在による生体分子への実質的な有害 作用を避けるための長鎖スペーサーからなる。

反応性基の一つは他の反応性基が応答しない刺激に応答することが望ましい。反 応性基の一つは光反応性基のような潜反応性基であるのが好ましく、そしてこの 基は表面にスペーサーを結合させるために用いるのが望ましい。

ヘテロ三官能性スペーサーは望ましくはそれが結合している表面よりも更に親水 性であり（即ち、スペーサーは支持表面に対するよりも用いられた液状媒体に対 して更に可溶性である）；本発明の好ましいスペーサーはそれ故好ましくはそれ らが結合している表面から突き出ており、それによりスペーサーにより拘束され ている表面の妨害作用から比較的離して生体分子を配置すると思われる。更に、 表面に結合している反応性基（望ましくは光反応性基）は、好ましくはスペーサ ーよりも更に疎水性であり（即ち、この基はスペーサーに対するよりも支持表面 に対して更に可溶性である）、そして望ましくはアリール基例えばアリールアジ ド又はアリールケトン誘導体である。

他の態様において、本発明は有害な表面効果から充分に逃れられるように表面か ら生体分子を充分に離すような方法により、表面に生体分子を結合させる方法に 関するものである。この方法は、長鎖スペーサーの反応性基を与えられた支持体 と反応させ、次いでスペーサーに含まれる他の反応性基を生体分子と反応させ、 再反応性基を少なくとも２５人の鎖長により互いに離しておくことからなる。表 面に対して形成された結合と、生体分子に対して形成された結合は、共有結合で ある。

別の態様において、本発明は支持体表面、多数の生体分子、及び表面に結合し且 つ表面から生体分子を離してお（スペーサー（生体分子は、スペーサーの延ばさ れた長さに沿って測定された少なくとも２５人の距離により支持体から離されて いる）に関するものである。この態様において、スペーサーは好ましくは一般的 に繰り返し単位（この単位は好ましくはオキシアルキレン基例えばエトキシ基又 はイソプロポキシ基である）を有する親水性鎖からなる。

図面の説明 第１図は以下の実施例２において報告したような、スペーサー鎖分子量の関数と しての生体分子活性のグラフ的表現である。

好ましい実施態様の説明 生体分子は、生物学的活性を示すか又は生物学的活性を調整する際に有効な化合 物の分子である。生体適合性剤の例としては、成長因子例えば内皮細胞成長因子 、上皮細胞成長因子、骨芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板誘導成長 因子、神経成長因子、又はアンジオジェニン；抗微生物剤例えばリゾチーム又は ペニシリン；抗血餅形成剤ヘパリン、アルブミン、ストレプトキナーゼ、組織プ ラスミノジン活性化剤又はウロキナーゼ；血餅形成剤例えばコラーゲン；ヒアル ロン酸、キトサン：及び他の蛋白質、カルボヒトレート及び脂肪酸、及びそれら の錯体分子混合物が挙げられる。

“支持表面“は、固体又は半固体又は液体物質の表面を示す。この表面は、硬く てもよいし又はゲル表面のように半固体であってもよい。この表面は、非剛性の 液体表面例えば多相液体又は液体／固体系からなる不連続相として存在する液体 の不連続容積の表面であってもよい。

支持表面は、好ましくは以下に定義されたような生体材料の表面であり、且つ通 常は比較的疎水性である。

“生体材料“は、実質的に体液に不溶性であり且つ体内又は体上に配置すべく又 は体液に接触させるために設計又は構成される材料として定義し得る。血管移植 組織、コンタクトレンズ、シリコーン移植組織及び血液袋は生体材料の例である 。

理想的には、生体材料は下記の特徴の少な（ともいくつかを有するであろう： １、それは、体内の望ましくない反応例えば血餅、組織死、腫瘍形成、アレルギ ー反応、他律反応（拒絶）又は炎症性反応を起こさないであろう。

Ｚそれは、意図された機能に要求される物理的性質例えば強度、弾性、透過性及 び柔軟性を有するであろう。

＆それは、容易に殺菌することができる。

４、体に接触させて使用する場合には、それは、１時間であるか又は寿命である かによらず、それが体内に移植されるか又は体に接触して残る期間中、その物理 的性質及び機能を実質的に保持するであろう。

本書における使用において、生体材料の処理された固体表面は、それが生命有機 体に対する真に有益な（真に有害ではない）効果とともに生体液及び／又は生命 有機体の組織に接触して機能又は存在することができる場合には、“生体適合性 ”として特徴付けられる。

生体材料の基礎材料は、いずれかの適する金属例えば艶出チタン又はステンレス スチール；ポリマー例えばポリウレタン、ポリビニルとロリドン、シリコーン弾 性体、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロ ピレン、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリアクリレート（ポリ メタクリレートを含む）：鉱物又はセラミック例えばヒドロキシアビタイト；人 体組織例えば骨、皮膚及び歯；有機材料例えば木材、セルロース及び圧縮された 炭素；並びに他の天然及び合成材料例えばガラス、ゴム、木材等であってよい。

本発明に基づいて生物適合性表面を提供し得る器具の例は、血管移植チューブ、 透析チューブ又は膜、血液酸素供給器チューブ又は膜、限外濾過膜、大動脈内バ ルーン、血液袋、カテーテル、縫合糸、軟質又は硬質組織補綴、合成補膳、人工 器官、並びに目のためのレンズ例えばコンタクトレンズ及び眼内レンズである。

生体適合性“有効”表面は、生体材料の支持表面に生体分子自体が有するものと 同一の生体適合特性を付与するために、生体材料の支持表面に上記において定義 されたようなスペーサーを介して各々共有結合した多数の分離した生体分子から 形成されているものとして定義される。生体分子は、架橋された網を形成するこ とによるようにして支持表面を隙間なく取り巻くか又は積層しなくてよいが、し かし前記表面に所望の生体分子特性を付与する際にこの生体分子が互いに充分に 接近するように、多数の分離した点によりこの表面を覆ってよい（なお、これは 所望により行われてよい）。例えば、血管移植組織の表面に沿った分離した場所 は、フィブロネクチンのような細胞結合因子である生体分子により覆われてよい 。

前記点により形成された生体適合性有効表面は、次いで細胞の結合のための中心 として作用し、それ改変性された表面となる。

一般的に本発明の化学鎖スペーサーにより保持された反応性基は、スペーサーの 化学鎖の骨格を作っている成分とは化学的に異なる特別な基であり、そして互い に異なる。望ましくは反応性基の少なくとも一つは、スペーサーを支持表面に共 有結合させるために予備決定された刺激に応答する潜反応性基である。望ましく は前記反応性基は光化学的基であり、その共有結合は化学線及び特に可視光線又 は紫外光線により活性化される。前記基は、アリール基、アルキル基及びアシル アジド基、オキサジジン基、イソシアネート基にトレン発生剤）、アルキル及び ２−ケトジアゾ誘導体並びにデアシリン（カルベン発生剤）、芳香族ケトン（三 重酸素発生剤）、芳香族ジアゾニウム誘導体及び多（の種類のカルボニウムイオ ン及びラジカル発生剤により代表される。光化学的反応性基の別の記載は、フレ デリック　ジェイ、ダルフラー（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｊ、　Ｄａｒｆｌｅｒ） 　；及びアンドリューエム。

トメワ：！　（Ａｎｄｒｅｗ　Ｍ、　Ｔｏｍｅｔｓｋｏ）＋　アミノ酸、ペプチ ド及び蛋白質の化学及び生化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ）第２章〔ボリスヴアインシュタイン（Ｂｏｒｉｓ　Ｗｅｉｎｓｔｅｉ ｎ）出版〕第５８゜マーセル　デツカ−（Ｍａｒｃａｌ　Ｄｅｋｋｅｒ）社、ニ ューヨーク。

１９７８年になされている。アジドニトロフェニル例えばフルオロアジドニトロ ベンゼン、及び芳香族ケトンは、暗所中の化学反応条件におけるそれらの安定性 及び生体材料の大部分の部位に対して有用な収率で共有結合を形成する短命の反 応性中間体を形成するための大部分の生体材料に無害な波長の光による活性化に 対するそれらの感受性のために、好ましい基を形成する。

光化学反応基としての使用に適当なニトロフェニルアジド銹導体は、大部分はフ ルオロ−２−ニトロ−４−アジドベンゼンより誘導することができ、モして４− アジド−２−二トロフェニル（“ＡＮＰ″）−アミノ−ブチリル基、ＡＮＰ−６ −アミノカプロイル基、ＡＮＰ−１１−アミノウンデカノイル基、ＡＮＰ−グリ シル基、ＡＮＰ−アミノプロピル基、ＡＮＰ−メルカプトエチルアミノ基、ＡＮ Ｐ−ジアミノヘキシル基、ＡＮＰ−ジアミノプロピル基、およびＡＮＰ−ポリエ チレングリコール基が含まれ、そしてＡＮＰ−６−アミノカプロイル基、ＡＮ　 Ｐ　−１１−アミノウンデカノイル基、およびＡＮＰ−ポリエチレングリコール 基が好ましい、光化学反応基としての使用に好ましいアリールケトンには、ベン ゾイルベンゾイル基およびニトロベンゾイルベンゾイル基が含まれる。

以上の記載より分かるように、光反応基は、大部分芳香族てありよって一般に本 来親水性よりもむしろ疎水性である。その有益さは、下記において説明する。

また反応基には、熱化学基（熱エネルギーにより活性化されるもの）が含まれ、 そしてハロゲン化ニトロフェニル、およびアルキルアミノ基、アルキルカルボキ シル基、アルキルチオ基、アルキルアルデヒド基、アルキルメチルイミデート基 、アルキルイソシアネート基、アルキルイソチオシアネート基ならびにハロゲン 化アルキル基により象徴されかつこれらか含まれる。他のかかる基には、ヒドロ キシル基、第一アミン基、チオ基そして６−アミノヘキサノン酸およびアミノク ンデカン酸のような基のマレイミド、Ｎ−オキシスクシンイミド、無水メルカプ トコ八り酸のようなアルキルチオ基が含まれ、モしてβ−メルカプトプロとオン 酸、ホモシスティンチオラクトン、およびポリエチレングリコール誘導体が好ま しい０以上の記載より、多くの熱化学基、例えばカルボキル基、ヒドロキシル基 およびアミン基は親木性基または打水性基であると分かる。

光化学反応基および熱化学反応基は双方とも潜伏性反応基、即ち、与えられた外 部刺激に応じて反応性になる基てあり、そして支持体表面および生体分子に夫々 共有結合する基に対して潜伏性反応基を使用することは好ましい、かかる基は、 基のうちの一つが他の基が応じないところの刺激に応じるように選択される。

本発明に従ってスペーサとして使用される化学的主鎖は、種々の化学種より作る ことができ、それには天然および合成ポリマーが含まれ、特にホモポリマーおよ びコポリマー、蛋白質鎖および同様のものが含まれる。スペーサ骨を形成する化 学重鎖は好ましくはそれと関連した親水性基、例えばエーテル基、ケトン基およ び同様のものを有する。蛋白質はポリペプチド例えばポリリシンであワてよい、 多糖類のスペーサ鎖例えばチトサン、デキシトラン、ヘパリン、ヒアルロン酸お よび種々の澱粉ならびにセルロースを使用することができる。

特に好ましいものは、種々の千ツマ−およびオリゴマーの重合により作ることが できる反復単位より成る主鎖を有するスペーサである。特に好ましいものは１反 復するエトキシ基（−ＣＨｔ−ＣＬ−０−）またはインプロポキシ基（ＣＨｓ− Ｃ）Ｉ（ＣＨｓ）−０−）を有する鎖であり、そしてこれらの中で、ポリ（エチ レングリコール）（ＰＥＧ）が最も好ましい０反復単位より形成されたスペーサ は一般に種々の長さに製造することができる。；これは、結局、支持体表面より の距離を変えることにより生体分子を間隔を置くようにすることを可能にする。

特定でかつ好ましい態様において、本発明の方法は生体分子を支持体表面に生体 分子の活性を実質的に最適化するように化学的に繋ぐ方法に関する。＃方法は生 体分子を種々の長さのスペーサに付着することより成り、そのスペーサは化学的 特性において実質的変化なく種々の長さに製造することがてきるところの化学種 からなり、スペーサの他端は共有結合により固体支持体に結合している。生体分 子を支持体表面より間隔を置くところの様々に伸びたスペーサ長は、各々２５オ ングストロームを越え、そして数百オングストロームまでおよびそれを越えて変 更することができる。生体分子の活性は測定され、そして生体分子を最適または 実質的に最適に提供するところのスペーサ長は選択される。

ここで使用するところの“実質的に最適の活性”は。

上記の方法によって測定された最適活性の少なくとも約５０％の大きさであるこ とを意味し、その最適活性は、測定されたところの最大の活性であるか、または 重大な活性の増大の結果になるところのスペーサ長がさらに増加する点における 活性である。

本発明のスペーサは、示したように、少なくとも２５オングストロームそして好 ましくは少なくとも５０オングストロームの反応基間の伸びた長さを有する。生 体分子および支持体表面への付着のための反応基は、スペーサ鎖の長さに沿って 所望通り位置せしめることができるが、好ましくはスペーサ鎖の端部または末端 基として持ち運ばれる。

スペーサ鎖それ自体は望むらくは親溶媒性であり、即ち、スペーサ鎖は一般に打 水性でありかつ水性環境において解ける傾向にある。二三の例外を除き、体液は 本来水性であるので、はるかに生体分子の大部分は一般に水性環境中での使用に 適合するような親木性である。望ましくはスペーサ化学銅は、端部基を用いずと も、２５℃の水中において少なくとも部分的に一少なくとも約０．５重量％の程 度にて一可溶である。；好ましくは２５℃の水中でのスペーサ化学銅の溶解度は 少なくとも約２％であり、そして最も好ましくは、スペーサ化学銅は水に混和で きる。スペーサ上の相対的に疎水性の反応基例えば芳香族の光反応基の存在は、 疎水性支持体表面について相対的疎水性の反応基が優先的に支持体表面の近くに 運ばれる一方スペーサ分子の残り部分が一般に疎水性表面から離れたままにある ようにスペーサ分子それ自体を水溶液中で配向せしめるという独特の効果を有す ることを発現せしめる。；この特徴はスペーサを相対的に疎水性の支持体表面と 密に共有結合てきるようにすることを前提としており、そしてこれは結局上記に 定義したような“有効な”生体適合性表面の形成に寄与する。

本発明の特に好ましい態様は、一端に光反応基を持ちモして他端に生体分子を持 つスペーサ主鎖より成り、スペーサは、光反応基と生体分子の間のその伸びた長 さに沿って測定して、少なくとも２５オングストロームおよび少なくとも５０オ ングストロームの伸びた長さを有するものである。この態様において、特に好ま しいのは、ＰＥＧスペーサである。

支持体表面に対する生体分子の負荷密度は、案内基をスペーサ中に支持体表面と 共有結合する潜伏性反応基に隣接して組み入れることにより増大することができ る。

案内基は、側基としてスペーサ鎖もしくは潜伏性反応基と結合する一官能性基で あるか、または、好ましくは、潜伏性反応基とスペーサ鎖の残り部分の間に望ま しくは位置する二官能性基でありうる。案内基は、場合場合により疎水性または 親水性であフてよく、そして支持体表面が疎水性であるとき疎水性であるように 、また支持体表面が親木性であるとき親木性であるように、すべて支持体表面に 近接した結合においてスペーサの潜伏性反応基を優先的に配向せしめる目的のた めに選択される。上記で指摘したように１本発明の長いスペーサ鎖は普通支持体 表面に塗布するところの溶液の形態で用いられ、溶液の液体ビヒクルは長いスペ ーサ鎖にある程度の移動性を与える。よって案内基は、スペーサ分子を親木性液 体媒体中で用いたとき疎水性であり、またスペーサを疎水性液体媒体中で用いた とき親木性である基として定義することもできる。スペーサ基が支持体表面に深 く埋め込まれるのを抑えるために、別の基、ここに“停止基”と呼称するものを スペーサ鎖の中に含めることができる。

停止基は一般に親溶媒性；および親水性の点において案内基と反対の意味にある 。；即ち、停止基は、支持体表面が（もし使用するならば、案内基も）が疎水性 であるとき相対的に親水性であるように選択され、また支持体表面が（もし使用 するならば、案内基も）親水性であるとき相対的に疎水性であるように選択され る。別言すれば、停止基は、支持体表面が疎水性であるとき親水性でありそして その表面が親木性で液体媒体が疎水性であるとき疎水性であるところの基である 。

“停止基”は二官能性であり、使用するとき、常に潜伏性反応基および案内基が 停止基よりも支持体表面により近づくように位置決めされる。停止基は好ましく は長いスペーサ鎖の大部分と案内基および潜伏性反応基との間に位置する。

従って案内基および停止基を利用するスペーサ鎖は。

（？ｌ伏性反応基）−（案内基）−（停止基）−一（スペーサ鎖）のように図式 的に表わすことかできる。

生体分子を相対的に疎水性の表面に結合するのに用いる一般に親水性の液体系に おいて、案内基（この例において、疎水性基）の例には、ニブシロンアミノカブ ロン酸（“ＥＡＣ″）、アミノウンデカン酸（“ＡＵＤ”）および他のアミノア ルキルカルボン酸例えばガンマアミノ酪酸およびベーターアラニンより誘導され た基が含まれる。停止基（この例において、親木性）には、イヌ血清アルブミン （“ＣＳＡ″）、単糖類および多糖類、シスチン酸、グルコン酸、および例えば タウリンのスルホン酸か例である他のイオン化可能基が含まれる。

“親水性”および“疎水性”は１次の言葉に従って、夫々、打水性および嫌水性 として配合物を記載するのにここに使用される。：親水性化合物は通常相対的に 極性がありそしてしばしばイオン化可能である。かような化合物は通常水分子と 強く結合している。疎水性化合物は通常相対的に非極性でありかつ非イオン性で ある。疎水性表面は一般に表面上またはその近くにて水分子を氷状の立体配座の 構造にする。勿論、′疎水性”および“親木性”は相対的な語句であり、そして ここにおいては、種々の配合物、液体および表面がお互いに関して疎水性または 親木性でありうることの意味で使用される。当該主題についての論説は、ホフマ ン（Ｈｏｆｆｍａｎ）　、編集者への書状（Ｌｅｔｔｅｒ　ｔｏ　Ｅｄｉｔｏｒ ）　：　“親木性”および“疎水性”生体材料表面についての一般的な分類図式 （」−ｅｎｅｒａｌ　　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｓｃｈｅｍｅ　　ｆ ｏｒ　　″　ｈ　ｄｒｏ　ｈｉｌｉｃ”ａｎｄ″　ｈ　ｄｒｏ　ｈｏｂｉｃ”　 ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ　５ｕｒｆａｃｅｓ）　　、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｍａｔ、　Ｒｅｓ、　２０．　ｐｐ、　１ｘ−ｘｉ　（１９８６）において見出 される。

本発明は以下の非限定的な実施例を参照することによりより容易に理解すること ができる。実施例において部は別な方法て示さない限り重量部を表わす。

丈Ｊ１例」２： この実施例は最適の活性を会合した生体分子に提供するようにスペーサの長さを 調節することができる−の方法を記載する。ジアミノ　ポリエチレン　グリコー ルポリマー（商標Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ　　のもとで販売、Ｊｅｆｆｅｒｅｓｏｎ Ｃｈｅ＋＋１ｃａｌ　Ｃｏ、製）を、ボール！１Ｉ（Ｐａｉｌ　＊ｅ＋ｅｂｒａ ｎｅｓ）（Ｐａｌｌ　Ｂｊｏｓｕｐｐｏｒｔ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）に、該ポリマ ーと該層の遊離アミンカップリングにより直接カップリングした。

ジアミノ　ポリエチレン　グリコール　ポリマーは、それぞれ、約６０．９０． １９０および３３０オングストロームの鎖長を有する６００，９００．２０００ および３５００ダルトンの分子量のものてあフた。非共有結合の全てのスペーサ を膜より洗浄した。

その後グルコースオキシダーゼをスペーサアームの残りの末端アミンにカップリ ングするグルタルアルデヒドにより活性化された膜に加えた。酵素の出発濃度は 固定化されたスペーサアーム　ナノモル当り酵素１．２．４および６ナノグラム に近似するものであった。固定化酵素の総量を液体シンチレーション技術により 分析評価できるようにトリチル化（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ）グルコースオキシダー ゼを使用した。出発濃度の酵素の各々について固定点酵素分析を行なった。これ らの分析より、特定活性の固定化酵素の特定活性を測定しそして膜に直接共宥結 合する酵素より成る対照に対して標準化した。酵素活性における最大の増加は、 約１９０オングストロームの伸びた鎖長に相当する。　ｚｏｏｏのスペーサ分子 量にて見出された。

この実験の結果を第１図に図解的に描いた。

この実験に従い、分子量２０００のジアミノＰＥＧよりなるスペーサ鎖は一端に おいて光反応基例えばＡＮＰとモして他端においてグルコースオキシダーゼと付 着することができる。水溶液中のこの生成物は光に暴露することにより適当な支 持体表面に共宥結合することができ、そして酵素免疫分析に使用することができ る。

支凰皇ユニ この実施例は、分子量２０００でかつ約１９０オングストロームの伸びた長さを 有する長鎖のポリエチレングリコールスペーサを介して、ポリウレタン管体の一 部への管類表面のトロンビノゲン特性を減じるための生体分子（ウロキナーゼ） の付着を記載するものである。最初に、イヌ血清アルブミン（ＣＳＡ）を光反応 基アジドニトロフェニル−６−アミノカブロイル−Ｎ−オキシスクシンイミド（ ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳ”　）　に結合り、、化シタ材料をＡＮＰ基を介してポ リウレタン管体に光カップリングした。その後ＧＮＰ基に、次にはウロキナーゼ 末端基を備えるポリオキシエチレン顧を加えた。

Ｃ５Ａ（イヌ血清アルブミン）２００ミリグラムを０．１Ｍホウ酸塩緩衝液　ｐ Ｈ９，０１０ｍ１に溶解した。アジドニトロフェニル−６−アミノカブロイル− Ｎ−オキシスクシンイミド（ＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳ）をジメチルホルムアミド 中に２０ミリグラム／ミリリツトルで溶解し、そしてＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳ溶 液５６７マイクロミツトルをＣＳＡ溶液に室温にて暗室条件下添加した。８時間 の間一定に攪拌した後、溶液を４℃にて大量に透析した。

４６０ナノメーターでの吸光度に基づいて、ＣＳＡ分子当り８．６４Ａ　Ｎ　Ｐ 基がカップリングされたのを算出した。

ポリウレタン管体（ＰＵＴ”）の試験片は、液体が中に入るのを防止するために ガラス棒の小片で閉栓された端部な有するが、上記溶液の中に２時間の間暗所に て浸漬した。その後これら試験片を取り除きそして可視光線に１時間の間暴露し た。この手順を各試験片について一回以上繰り返した。その後ＰＵＴ試験片を、 可視光線の１時間暴露に続いてＡＮＰ−ＥＡＣ−Ｃ３Ａ溶液中に一晩浸漬した。

ポリオキシエチレンビスアミン（約２０００分子量のＰＥＧ−ジアミン、Ｔｅｘ ａｃｏよりの“Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ　ＥＤ　２００１”　）３０ミリグラムを水 １ミリリットルの中に溶解しそしてｐＨをＩＮ　ＨＣＬで４．０にＥ１ｍ節した 。これとは別に、！−エチルー３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボ ジイミド（Ｅ　Ｄ　Ｃ）　　２００ミリグラムを水５ミリリットルに溶解した。

ＰＵＴ試料をＥＤＣ溶液に浸漬し、その後ＰＥＧ−ジアミン溶液を加えた。その 後２時間の間室温にて反応を進行せしめ、その後別のＥＤＣ２００ミリグラムを 加えそして反応混合物を一晩放置することとした。

ＰＵＴ試料を室温にてグルタルアルデヒド　１．２５％とｐ）ｌ　６．８で反応 させ、すすぎ、そしてウロキナーゼの溶液（８，３単位／ミリリウトル、約２− ３ミリグラム／ミリリツトル）の中に浸漬しモして４°Ｃにて一晩反応させるこ ととした。管体を洗浄して未カップリングのウロキナーゼを除去しそしてその後 プラスミノーゲン゛の活性化およびアゾカゼインの消化によりウロキナーゼ活性 について分析評価した。測定はポリウレタン管体の試験片当りウロキナーゼ０． １８８ミリグラムが固定化されたことを示した。

１隻■１ 種々の細胞因子をインヴイトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で試験されたポリマー表面 にカップリングして細胞付着および過剰生育についてこれら因子の効果を測定し た。ポリマー表面としては、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン（ＰＥ） 、ポリプロピレン（ｐｐ）およびポリテトラフルオロエチレ、１／　（ＰＴＦＥ ）ＧＯＲＥ−ＴＥＸ　（６ｍｍ強化伸展Ｐ　Ｔ　Ｆ　Ｅ　、　Ｗ、Ｌ、Ｇｏｒｅ 　ａｎｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ、の商標付製品）であった、試験した 市販の管体には、ポリエステル（Ｄａｃｒｏｎ、　Ｄ、　６■Ｉ直編みのダクロ ン　ベロア、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）の商標付製品）、シリコンエラストマー 　（Ｓｉｌａｓｔｉｃ　”　、“Ｓ”　、　０．０３−インチ内径の管、ダウコ ーニング（Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　）の商標付製品）およびポリウレタンが含 まれる。ポリスチレン板を対照として使用した。

化］コ１詰１ｋｉＬ分 これら実施例に使用された化学的結合部分は、４−アジド−２−二トロフェニル エプシロンアミノヵブロン融（ＡＮＰ−ＥＡＣ）、４−アジド−２−二トロフェ ニルアミノウンデカン酸（ＡＮＰ−ＡＵＤＡ）およびベンゾイル安息香酸（ＢＢ Ａ）の各Ｎ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）エステルであった。

スベー　へのコラ−ンの コラーゲンを０．Ｉ　Ｍ　ＭＥＳ　、ｐＨ５，０中テ２．０ｍｇ／ｍｌニ希釈し た。ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＮＨｔまたはＢＢＡ−ＰＥＧ−ＮＨ，をコラーゲンに対し て１０倍モル過剰に加えた０次に、３０倍モル過剰のＥＤＣを半時間の間隔で加 えた。室温での４時間の攪拌の後、生成物をＰＥＳに対して透析して非共有結合 の光反応試薬およびＰＥＧ−ＮＨ，スペーサを除去した。生成物をＵＶ分光分析 法および蛋白質分析法により分析して光反応基：蛋白質比を測定した。

普通１１の比が観察された。

ラスチック　　への　　Ａ　　のｆ、Ａ上記ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポ リプロピレン、ポリウレタン、ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ・）（ベロア）、シラス チック（５ｉｌａｓｔｉｃ・）（医療用）およびポリテトラフルオロエチレンの 種々のシート、チューブおよび平板片を使用した。上記のように調製された光標 識生体適合性剤０ないし５００Ｍｇ／ｎ＋１を含む溶液のアリコートＯ，Ｏ５ｏ ＋１をプラスチック表面の各０．５ｃｍ２部分に加えた。該溶液を暗黒下、室温 で３時間、各月に吸収させた。過剰の液体を除き、適当な波長で（ＡＮＰにはタ ングステン「スポットライト　５ｐｏｔｌｉｔｅ　ＪおよびＢＢＡには長波長Ｕ Ｖ）１２時間光分解することにより生体適合性剤を表面に共有結合させた。光分 解後、光標識生体適合性剤の共有結合していない分子を除くために標本片にＰＢ Ｓを４秒間流して洗浄した。その後、該片を組織培養中に置き、下記により細胞 因子への内皮細胞反応を調べた。

だ　　について′−なったインビトロ−Ａ、′−’Ａ 放射性標ｍ［”Ｈ］コラシーンを上記のように光標識してＡＮＰ−ＥＡＣ−ＰＥ Ｇ−コラーゲンを用意し、それをプラスチック表面へ光カップリングした。

該プラスチック表面をＰＢＳで充分に洗浄してから有機溶媒中に溶解して液体シ ンチレーション分光法で測定した。幾つかの代表的な結果を、表面への共有結合 を明らかにしている第１表に示す。

１上１ 固体表面　　適用したＮｇ生　光種１ｍＮｇ生　カップリン長因子／ＣＱＩ”　 　　長因子／ｃｍ”　　グ効率％Ｐ　Ｖ　Ｃ２６８０３７４１４，０ ポリウレタン　　２６８０　　　　２１７０　　　　８１．３Ｂ、　　プラスチ ック　　へのウシ　　　　のイ・ウシ内皮細胞は長さ８〜２４インチの胎仔から 集めた。角膜、大動脈及び謄の内皮細胞を無菌的に集めた。細胞を、２５ミリモ ルＨＥＰＥＳ緩衝液、ｌＯ％仔ウシ血清および２５μｇアンホテリシンＢ／ｍｌ を加えたダルベツコの改良イーグル培地〔アール、ダルベツコおよびジー、フリ ーマン（Ｒ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　＆　Ｇ、Ｆｒｅｅ＋＋＋ａｎ　）、バイオロジ ー　Ｖｔｏｌｏ　　　第８巻、３９６頁（１９５９年）およびジエイ、ディー、 スミス、ジー、フリーマン、エム、ボグトおよびアール、ダルベツコ（Ｊ、Ｄ、 Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｆｒｅｅｍａｎ　、　Ｍ、Ｖｏｇｔ　＆　Ｒ，Ｄｕｌｂｅｃｃ ｏ　）　、バイオロジ二工ｎ坦」Ｌ上第１２巻、１８５−１９６　頁（１９６０ 年）　ｉ、：記載〕のような公知の高グルコース細胞生育培地（ｇｒｏｗ−ｔｈ 　ｍｅｄｉａ　）中で３７℃にて５％ｃｏｔインキュベイターで生育させた。プ レート、チューブまたはシートを準備する毎に、細胞培養は一次培養系から調製 した。細胞を０．２５％トリプシン溶液で細胞株から取り、生育培地に再懸濁し た６次いでトリパンブルー（０，４％）溶液と血球計を使って細胞数を計測した ０種々の濃度の細胞を準備した材料の上に層状に置いた。細胞の付着を５分から １４日間の種々の時間間隔で追跡した。付着は少なくとも２種の方法で測定した 。第一の方法においては、試料材料を培地から離し、殺菌した食塩液で２回洗浄 した０次いで細胞染色を行ない、表面上の全細胞数を計測した。第二の方法では 、トリプシン溶液で細胞を表面から離すトリプシン処理（ｔｒｙｌ）Ｓ−ｉｎｉ ｚｅ）を行ない、トリバンブルー法を用いて計測した。

予備被覆したポリ塩化ビニルプラスチック片上の内皮細胞の付着および増殖につ いて代表的結果を第２表に示す、各月に付着した生細胞数はトリバンブルー染色 法で測定した。

第２表 入ＮＰ−ＥＡＣ−ＰＥＧ−３７４，０１４５００１５８００１，０−３，０ｍｓ ＋ＪＥＦＦ−ＣＯＬ 対照ＰＶＣ０７１，５−２，ｈｍ 仁　ヒ　ト　　の　　　細　　の　・ −次のヒト内皮細胞を新鮮なヒト調帯（４日令以前）から採取した。帯を２ｈｌ のコード緩衝液（ｃｏｒｄｂｕｆｆｅｒ）　　（０，１４４Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ１ ，０，００４Ｍ　　Ｋ　Ｃｌ　。

および０．００１Ｍ　　ＰＯ４）で２回洗浄して血液および凝固物を除く、コラ ゲナーゼを帯の中に注入し、室温で２０分間放置した。温コード緩衝液（ｗａｒ ａ＋　ｃｏｒｄｂｕｆｆｅｒ）　１０＋ｍｌを使い、コラゲナーゼと剥離した細 胞を試験管内にどっと入れた。試験管内の懸濁液を合わせてｌｓＯＯｒｐｍで５ 〜ｌＯ分間遠心分離した。上澄みを捨て、細胞をｌｏｍｔのコード緩衝液に再懸 濁した。二回目の遠心分離後、細胞をコード緩衝液に再懸濁し、組織培養ディス クに置いた。全ての細胞を５％ＣＯ３を流した３７℃のインキュベイター中でイ ンキュベイトし゛た。細胞は仔ウシ血清を含まないコード培地（ｃａｒｄｗ＋ｅ ｄｉａ　）中で１１Ｃを使らて放射性標識した。

標識細胞を次いで細胞付着試験に使用した。上記プラスチックのプレート、シー トおよびチューブは前述の通りに調製した。細胞をトリプシン処理し、トリバン ブルー法で細胞数を測定した。調製したプラスチックに細胞を３時間ないし７日 間付着させるようにした。細胞をすすぎ落とし、残りの付着している細胞全数を 付着していない細胞数と比較した。それらの比較し得る結果を表わす上記第３表 が得られた。

Ｄ、　　　　　　つな　　の 次の方法で、上記のプラスチック表面を細胞が増殖して覆う時の、開始時からの 細胞の増殖を追跡した。

細胞因子Ｏないし５００μｇを含む生体適合佐剤溶液を１ないし６ｃｍの長さの 表面上に濃度勾配をつけて被覆した。細胞を組織からトリプシンまたは何らかの プロティナーゼを使って取ることはしなかった。該組織を勾配の低い方の開始点 に置いて印をつけた。室温で１５分間組織を落ち看かせだ、生育培地をプラスチ ック上を湿って覆うように加えた。全ての手順は無菌条件で行なった。次いでプ レートを５％Ｃｏｔインキ１ベーター中、３７℃でインキュベートした。増殖を ２週間またはプラスチックの長さが完全に覆われるまで毎日測定した。上記第２ 表に示したように、処理した表面上の増殖を非処理対照の表面と比較した。全て の材料をすすぎ、永続走査電子顕微鏡観察のために染色した。

これらの結果は、生育因子のフィブロネクチン（ＦＮ）およびコラーゲン（ＣＯ Ｌ）をプラスチック表面に共有結合的に付着させると、プラスチックのウシ内皮 細胞への生体適合性が改善されることを示した。細胞がプラスチック表面で生育 した距離で示されるように、細胞は対照表面より修飾表面に優先的に付着した。

実施例４ コンタクトレンズおよび目　レンズ　　　の　　の飾 本実施例の実験は、インビトロでの非処理レンズと比較した、調製レンズ上への 人工涙液からの蛋白沈着の測定を含む。

・　　　への　　　Ａ　剤のＰ人 ４０００）のポリエチレングリコールを、本明細書で参考文献に入れた「キムテ およびニス、レーゲン（Ｋｉｍｕｒａ＆　　Ｓ、Ｒｅｇｅｎ　）　、ジャーナル 　才ブ　オーガニックケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第４８巻、１９５頁（１９８３年）」の相輸送法（ｐｈａ ｓｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｍｅｔｈｏｄｌの修飾法によりフルオロニトロアジド ベンゼン（ＦＮＡＢ）で標識した。要約すると、４−アジド−２−二トロフェニ ルポリエチレングリコール（ＡＮＰ−ＰＥＧ）の相輸送合成は、下記のような６ ０％水性水酸化カリウム・トルエンとＦＮＡＢおよびＰＥＧとの混合、それに続 く抽出および薄層クロマトグラフィー　（ＴＬＣ）精製を含む。

Ａ　Ｎ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　Ｇ　−１０００Ａ　Ｎ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　Ｇ　−１０００ は、０．０５ミリモルのＰＥＧ−１０００を５＋＊１の６０％ＫＯＨに、および ０．５ミリモルのＦＮＡＢを１Ｏｅ１１のトルエンに加えて調製した。この反応 混合物を室温で１６時間、急速に撹拌した。生成物を有機溶媒層から分離した。

クロロホルム／メタノール／Ｈ友０／酢酸または水酸化アンモニウム　８５／　 １５／１／ｌでの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により非１１１識ＰＥＧか らＡ　Ｎ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　Ｇ　−１０００のモノ−およびジー置換誘導体を分離 した。　Ａ　Ｎ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　Ｇ　−１００（１に相当するバンド（低いＲｆ 値）をシリカゲルからＴＬＣ溶媒で抽出し、残存の酸または塩基を除くために共 沸蒸留した。最終生成物は水に可溶で、出発物質ＰＥＧの３０〜４０％がＡ　Ｎ 　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　Ｇ　−１０００に転化した。

ＡＮＰ−ＰＥＧ−４０００ Ａ　Ｎ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　Ｇ　−４０００を、反応中に全ての試薬を溶液中に残ら せつつ５０℃で反応混合物を急速に撹拌すること以外は、上記と同じ方法で調製 した。ＡＮＰ−Ｐ　Ｅ　Ｇ　−４０００−ＯＨノ収率は１０９６ｔ−あツタ。

Ｂ、ｌ−スペーサの　６ ポリオキシプロピレンポリアミンおよびポリオキシエチレンポリアミン［シェフ アミン（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅｓ）と呼ぶ、ジェファーソン　ケミカル　カンパニ ー　インコーホレーテッド（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　Ｃｈｅ＋１ｉｃａｌ　Ｃｏ、 、Ｉｎｃ、）の商標］を、これらポリマーにＮＡＰ−ＥＡＣＡ。

ＢＢＡおよびｎＢＢＡのＮ−オキシスクシンイミド（”ＮＯＳ”）エステルをカ ップリングすることによって光標識した。これらのＮ０Ｓ−誘導体を０．５倍な いし１倍量でシェフアミンに高度に脱水した（高純度）溶媒中で加えた（ＡＮＰ −ＥＡＣ−ＮＯＳは脱水テトラヒドロフラン中、ＢＢＡ−ＮＯＳは脱水ジオキサ ンまたはジメチルホルムアミド中、ニトロＢＢＡ−ＮＯＳは脱水ジオキサンまた はジメチルホルムアミド中）、暗黒下、室温で１６時間反応させた後、生成物を クロロホルム／メタノール／Ｈ，ｏ／酢酸　８５／１５／１／　ｌのＴＬＣで分 離した。モノ置換シェフアミン誘導体をＴＬＣ溶媒で抽出し、水と共沸蒸留して 残存する酢酸を除いた。水溶性生成物ＡＮＰ−ＥＡＣ−シェフアミン、ＢＢＡ− シェフ７ミン、およびｎＢＢＡ−シェフアミンをそれぞれ１５％、１０％および １２％の収率で分離した。

Ｃ，ＡＮＰ−ヒアルロン　の−１ ヒト胎盤ヒアルロン酸（見掛けの分子量１０Ｇ、０ＯＱ−１３０，０００）の末 端糖を、本明細書で参考文献としたイー、ジャノウィッツおよびニス、イー、チ ャーム（Ｅ、Ｊｕｎｏｗｉｃｚ　　＆　Ｓ、Ｅ、Ｃｈａｒｍ）　　“蛋白固定化 およびアフィニティークロマトグラフィーのための酸化多糖の誘導／Ｔｈｅ　Ｄ ｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　０ｘｉｄｉｚｅｄ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃａｒ ｉｄｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｍｎ＋ｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ 　　ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”　ｅ　’ｒ土Ｅｈ　　ｘ 　　Ｉ？：ｔ７　　’）ｈ　　７クタ　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏ　 ｈ　５ｉｃａ　Ａｃｔａ　　第４２８巻、１５７−１６５頁（１９７６年）に記 載されている過ヨウ素酸法［ｐｅｒｉｏｄａｔｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によっ て活性化した。この方法では、このように末端の糖を活性化するヒアルロン酸の 溶液に過ヨウ素酸ナトリウムまたはカリウムを加えることを伴う、ヒアルロン酸 を１０倍過剰のシェフアミンに加え、Ｍ温で４時間反応させた。シアノ水素化ホ ウ素ナトリウムで還元することによって連結を安定化させ、充分に透析して過剰 のシェフアミンを除去した。ＤＭＦに溶解した１０倍モル過剰のＡＮＰ−ＥＡＣ −ＮＯＳを、０−Ｉ　Ｍ炭酸塩、ｐ）（ｓ、。

に溶解したシェフアミンに注射器で加えた。この添加は１６時間かけて暗黒下、 室温で行なった。過剰のＡＮＰ−ＥＡＣ−ＮＯＳとＡＮＰ−ＥＡＣ−シェフアミ ンをゲル濾過クロマトグラフィーによって除いた。

コンタクトレンズポリマー骨格への基の光カップリングに必要なアジド基の組み 込みは、ＡＮＰ基を検出するための赤外吸収分光法、シェフアミンスペーサを検 出するためのポリエチレングリコール分析法および誘導体のウロン酸含量を定量 するための、ここに参考文献として掲げたティー、ビターおよびエイチ、ミュア −（Ｔ、Ｂｉｔｔｅｒ　　＆　）ｆ、Ｍｕｉｒ　）　、　７ｆ−’ｉｆ　　ｈ） Ｌ−）＜Ｋオケミスト盲−＾ｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　 　第４巻、３３０−３３４頁（１９６２年）に記載された修正カルバゾール分析 法で分析した。

１個のＡＮＰ、１個のシェフアミンおよび１個のヒアルロン酸分子を持つ画分を 集め、生体適合性剤として使用した。

Ｄ、　　・ヒアルロン　、メチルセルロースおよびコンドロイチン　　の ＡＮＰ−ＥＡＣ−シェフアミン、ＢＢＡ−シェフアミンおよびニトロ−ＢＢＡ− シェフアミンをヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸のウロン酸残基のカルボ キシル基に以下のようなカルボジイミド法により連結しり、　０．１　Ｎ　ＨＣ ｌ　テｐ　Ｈ４，５＋＝調節Ｌり水中で、５モル過剰の光標識シェフアミンおよ びｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドをＨＣＩと 共に多糖ポリマ〜に混合した。混合物を暗黒下、室温で２４時間反応させた。生 成物をゲル濾通りロマトグラフィーで精製し、次いで光基と炭水化物含量を上記 のようにして分析した。

上記のようにして得られた光標識生体適合性剤をコンタクトレンズ材料に２５０ −１０００ピコモル剤／コンタクトレンズの濃度で加えた。溶液をコンタクトレ ンズ上に暗黒下、室温で３時間吸着させた０次いで光標識剤を適当な波長で（Ａ ＮＰでは４ＳＯｎｍ、　Ｂ　Ｂ　ＡおよびｎＢＢＡ誘導体では３２Ｑｎｍ）　１ ２時間、光分解によってプラスチックに共有結合させた。光分解後、コンタクト レンズを５Ｘ５ｍｌの通常の食塩液（０，８５％ＮａＣ１）で洗浄して共有結合 していない基を除去した。

３、インビトロ 人工ヒト涙液を、ここに参考文献としたビー。

ビー、グルア（Ｂ、Ｐ、Ｇｌｏｏｒ　）　　”涙装置（Ｔｈｅ　Ｌａｃｒｉ＊ａ ｌＡｐｐａｒａｔｕｓ　）　−ｒアルダ−の百の　　　：　　　、Ａｌｄｅｒ’ ｓ　　Ｐｈ　　５ｉｏｌｏ　　　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｅ　　ｅ　　：　　Ｃ１ １ｎｉｃａｌ＾　１ｉｃａｔｉｏｎｎｓ　　　、アール、ニー、モーゼス（Ｒ， Ａ。

Ｍｏ５ｅｓ　）編、シー、ブイ。モスビー　カンパニー（Ｃ。

Ｙ、Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、、）セントルイス　ミズリー（Ｓｔ、　ＬｏｕｉｓＭＯ ）　　（１９８１年）に記載されているような配合によって調製した。この文献 に示されているように、ヒトの涙に存在する主要蛋白は血清アルブミン（Ｈ５Ａ ）、ガンマ−グロブリン（ＨＧＧ）およびリゾチーム（ＬＹＺ）である、ヒトの 涙に存在する主要なステロールはコレステロールとコレステロールエステルであ る。

入ユ」【液Ｕ斃 上記の放射性標識蛋白質を人工涙液の調製に使用した。放射性標識した蛋白質ま たはトリチウム標識されたコレステロールの１種を各人工涙液混液に含ませた。

他の成分は放射性標識されていない、コンタクトレンズ材料を人工涙液中、３７ ℃で１週間、ゆるやかにゆすりながらインキエベートした。終了後、レンズ材料 を０．８５％ＮａＣｌの５×１０ｍ１で洗浄した。次いで、レンズ材料に吸着し た蛋白質の量を液体シンチレーション測定で分析した。

インビトロ蛋白沈着結果は、ある種のコンタクトレンズ材料上に人工涙液から起 こる蛋白沈着が１週間で有意に減少することを示した。

実施例６ へのフ　ルムのカップＩング ヒアルロン酸の光標識誘導体（ＡＮＰ−ＥＡＣ−シェフアミン、ＢＥＡ−シェフ アミンおよびニトロ−ＢＢＡ−シェフアミン）を調製した。光反応性被覆材料か らフィルムを作り、暗黒下にコンタクトレンズの表面上に置く（浸漬して乾燥に よる）、生体用材表面への共有結および分子間架橋によるフィルムの強化を照明 によって行なった。

もうひとつの実施例において、人工股関節をＡＮＰ−ＥＡＣ−シェフ７ミンーヒ アルロン酸（０，１：１１ｎｇ／ｍｌ）に暗黒下で３時間浸漬した。関節を溶液 から取り出し、乾燥して人工関節上に被覆材料の薄いフィルムを形成させた。次 いで４℃で８時間、４００ないし４ＳＯｎ＋ｗの照明を当ててフィルムを関節に 共有結合させた０次に関節を整理食塩液ですすいで未カップリングのＡＮＰ−Ｅ ＡＣ−シェフアミン−ヒアルロン酸を除去した。骨に結合したヒアルロン酸は摩 擦を低減し、関節領域での骨の摩耗を減らす。

実施例７ この実験では、眼内レンズ（ＩＯＬ）と眼の長期生体適合性の改善のために市販 の眼内レンズ（ＩＯＬ）材料ヘノ生体分子の共有付＠（ｃｏｖａｌｅｎｔ　ａｔ ｔａｃｈｍｅｎｔ）を述べる。

−ｈｏｔｏｒｅａ　ｅｎｔｓ　　の１ アジド−ニトロフェニル− フルオロ−ニトロ−アジドベンゼン（ＦＮＡＢ）カツブリング基を４−ヒルオワ −３−ニトロ−アニリンから調製した。アニリン（ｉｏ、ｏｇ　）をＭＣ１６Ｇ 耐とＨｚ　Ｏｌｏｍｌに加えた。その混合物を撹拌しながら４０〜４５℃に温め た。Ｎ　ａ　Ｎ　Ｏ＊の５．６０ｇ分量をＨ＊Ｏｓ、ａｌｌｌｌに溶解し、そし てＮａＮ−をＨ宜０１５．ｏｍｌに溶解した。アニリン／ＨＣＩ混合物を乾燥氷 ／イソプロパツール洛中で一２０℃に冷却し、続いてＮ　ａ　Ｎ　Ｏｚ溶液を１ ５分間にわたって滴下添加した。添加終了後、混合物を一２０℃で更に１５分間 撹拌した。反応混合物を一２０℃ないし一１０℃に維持しなからＮ　ａ　Ｎ　Ｏ ｓ溶液を滴下添加した。泡立ちを少なくするため少量のエーテルを添加した。− ２０℃で３０分間撹拌した後、氷−冷Ｈ，Ｏを加えて生成物を沈殿させ、次いで 濾過によりＦＮＡＢを収集した。乾燥後、精製物を３０〜６０℃の石油エーテル から晶出させた。この走査で精製物が７６％の収率で得られた。

４−アジド−３５−ジクロロ−２６−シフルオロービ１ジニウム ３．５−ジクロロ−２，４，ロートリフルオロピリジンの１．ＯＩＯｇ　（ｓ、 ｏミリモル）分量を計って５Ｏｎ＋ｌ丸底フラスコ内に入れ、アセトニトリル２ ０ｍ１で希釈した。

Ｎ　ａ　Ｎ　ｓ　　５．０ミリモル（３２５ｍｇ　）を室温で１０〜Ｉ　Ｓａｇ づつ分別して加え、反応を発熱反応として追跡した。

固体アジドがアセトニトリル中で限られた溶解度を持つことが明瞭となった。反 応を計２時間続行させた。石油エーテル溶媒系での薄層クロマトグラフィー　（ ＴＬＣ）で出発物質の全てが反応していたことが示された。減圧下、冷水浴上で アセトニトリルを除いた結果、油質固体が生成した。生成物をエーテル４０ｍ１ およびＨｘＯ１Ｏｆｆｉｌ中に溶解し分液ロート中で振盪し、そして水相を取り 除いた。エーテル相をＨ，Ｏで洗浄し、そして合わせた洗浄水をエーテルｌＱｍ ｌで裏抽出した。合わせた有機画分をＭｇ５Ｏ＋で乾燥した。ＴＬＣは生成物の 生成を示した。９７．５重量％収率の粗生成物が透明油状物の形態で得られた。

−のム 光標識表面変成試薬の構造を表４に示す、ポリエチレングリコール（”ＰＥＧ” ）は、前述の実施例に関連した方法で製造される。　ＰＥＧの４−アジド−３， ５−ジクロロ−２，６−ジフルオロピリジン誘導体は、この基をビス−アミノ− ＰＥＧに添加し、続いて８５：１：１のクロロホルム：メタノール：　Ｈ！Ｏ： 酢酸系での薄層クロマトグラフィで精製することにより、製造される。

ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸の光活性誘導体は、水溶性カルボジイ ミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（Ｅ ＤＣ）の存在下で、ヒアルロン酸溶液へＡＮＰ−ＰＥＧ−ＮＨｘ＋　ＢＢＡ−Ｐ ＥＧ−Ｎｕｔ又はＮ−（４−アジド−３，５−ジクロロ−６−フルオロ−ピリジ ニル）−ＰＥＧ−ＮＬを添加することによって製造された。

結果として得られた誘導体は、パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｐ−２００カラ ムでのゲル濾過クロマトグラフィにより、又は透析により精製され、ウロン酸分 析ポリエチレングリコールアッセイ、光反応基の存在を決定するための分光測光 法によって、並びに光反応基のアジド基、又はカルボニル基の完全さを評価する ための赤外分光法によって測定される。

これらの試薬の合成法、及び特徴についての説明を以下で述べる。

コーー°ン９・　　　　　　の力・　１ンコラーゲンを０．１ＨのｌｌＥｓ中に 、ＰＨ５，０で２．０ｓ＋ｇ／■ｌの濃度に希釈する。　ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＮＨ ｘ　　（分子量１４５０）をコラーゲンに対し、ＩＯＸモルの過剰量に添加する ０次に、３０分間隔で、ＥＤＣのＩＯＸモル過剰量を３回添加する。室温で４時 間撹拌後、非共を的に結合した光試薬とＰＥＧ−ＮＯｘスペーサーを除くため生 成物をＰＢＳから透析する。生成物を紫外線分光法、及び光官能基：蛋白質率を 決定するためのプロティンアッセイによって分析する。１１０割合で通常観察さ れる。

ＡＮＰ−ＰＥＧ−Ｎｌ（ＢＢＡ−ＰＥＧ−）ＩＩ　　　お　し　　　Ａ［１ＤＰ −ＰＥＧ−ＩＪＩ＋　　　の　　゛構造 ビス−アミノポリ（オキシエチレン）グリコール及びポリ（オキシプロピレン） グリコールポリマーは、蛋白質のために述べられたものと類似の方法によって光 活性カンプリング試薬で標識される。しかし、ポリマーおよび光反応基のどちら も有機溶媒に可溶である。

ＰＥＧに対してＯ，Ｓ　Ｘモル率の光反応基を、乾燥溶媒中（ジオキサン、ジメ チルホルムアミド、又はテトラヒドロフラン）の合成ポリマーに添加し、１６時 間暗黒下、室温で撹拌する。その時間の最後に、モノー標議されたＰＥＧ生成物 を８５：１５：１：１のクロロホルム：メタノール：Ｈ！０；酢酸系での１層ク ロマトグラフィによって出発物質から精製する。

＾Ｂ−の、。

ＡＮＰ−ＰＥＧは通常、前述に関連した相間移動反応によって製造される。フル オロ−ニトロ−アジドベンゼン、およびＰＥＧをトルエンに溶解し、ＫＯＨの添 加によって最終濃度が６０％になる。

混合物を乳Ｓ製剤にするために撹拌し、全１８時間、３５−４０°Ｃで加熱する 。９：１０ＣＬＣ１ｘ　：メタノール溶媒系を使用したＴＬＣによって反応をモ ニターする。

ジーＡＮＰ及びモノーＡｌ’ＩＰ生成物を紫外線下で映像化し、３個の生成物す べては、ドラーゲンドルフ試薬でオレンジ色に着色される０選択的抽出操作が、 ＰＥＧ生成物をその相対極性に基づいてトルエン中に強制的に入れるために水層 のイオン強度を注意深く増加させることにより混合物に対して実施された。

反応混合物を冷却後、ＫＯＨＮを除去する。飽和ＮａＣ１を注意深く添加し、そ して得られるトルエン層を遊離ＰＥＧ　。

モノ−ＡＮＰ−ＰＥＧおよびジーＡＮＰ−ＰＥＧ生成物の分布を評価するために ＴＬＣによってモニタリングする。

ジーＡＮＰ−ＰＥＧ生成物をすべて除去した後、固体のＮａＣｌを水層に添加し 、モノーＡＮＰ生成物をトルエンとの混合物から抽出する。抽出は、ＴＬＣでト ルエン層のモノ−ＡＮＰが見られなくなるまで繰り返される。

これらの抽出物は合わされ、Ｍｇ５Ｏ，で乾燥され、減圧下で蒸発され、望みの モノーＡＮＰ−ＰＥＧ生成物を得る。

カー　町ン　　　　Ｉｊｉ　　′　−ヒ　ルロンーコン′ロ　　ンＰ　の−リ゛ 告 ＡＮｒ’−ＥＡＣ−ＰＥＧ−ＮＨｔまたはＢＢＡ−ｆ’ＥＧ−ＮＨｔの末端アミ ノ基は１−エチル−３・（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（Ｅ ＤＣ）を使用して、ヒアルロン酸、又はコンドロイチン硫酸のカルボキシ基にカ ップリングする。

ヒアルロン酸をＰＨ５，０，０，１！１ＥＳ緩衝液に溶解する。

カルボヒドラーゼに対し、５Ｘモル過剰量に匹敵する量のＡＮＰ−ＥＡＣ−ＰＥ Ｇ−Ｎ）＋！またはＢＢＡ−ＰＥＧ−）ＪＨヨを添加する。

次に、固体ＥＤＣをポリサッカライドの５Ｘモル量において、１時間かけて３度 に分けて添加する。

６−８時間撹拌後、生成物を透析によって精製する。生成物を紫外線分光法、ウ ロン酸アシセイ、及びＰＥＧアシセイによって、光反応基：スペーサー−ポリサ ンカライドの割合を決定するために分析する。１個のヒアルロン酸に対して１０ 個の光反応基、及びフンドロイチン硫酸分子それぞれに対して９個の光反応基の ような代表的な割合を得る。

この点に関連した幾つかの化合物を表３および４に列挙する。

表五 表　　４゜ ベンゾイルベンゾイック−ポリエ チレングリコール （ＢＢＡ−ＰＥＧ−ｊ４５０） アジド−ニドローア＝ニルーイブ シロン−アミノ−カブロイツク ポリエチレングリコールアミ／ （ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＮＨｔ　） ペンゾイルーペンゾイックホリエ チレングリコールーアミン （ＢＢＡ−ＰＥＧ−ＮＨｔ） 表　　４ （続き） 化　　合　　物　　　　　　　　　　　　　檎　　　　　　造４−アジド−３， ５−ジクロロ− ２−フルオロ−アミノポリエチ レングリコールアミン （ＡＤＯＰ−ＰＥＧ−ＮＨ忠） ＰＥＧ−ＢＢＡ ０　　　　　に　　　　　　　　　　　　の　・ＴＯＬ材料（ＰＭＭＡボタン、 ポリプロピレン、ポリエチレン、シリコン、ジメチル−シロキサン、及びポリプ ロピレンｔａを伴ったＰＭＭＡレンズ）をＢ２０に溶解したコーティング溶液に 浸漬する。

３時間沈めた後、レンズ材料を除去し、空気流または窒素下で、素早（乾燥させ る０次いで、表面変成試薬を適当な波長の光分解によって共有結合的に結合する 。レンズ片を脱イオンされたＨよ０で洗浄する。

このコーティング操作がレンズの表面に影響を及ぼすがどうかを測定するため、 対照のレンズに対するコーティングされたレンズの光沢、及び仕上がりを走査電 子顕微鏡で評価する。

生体分子の負荷密度は、合成ポリマーの放射線同位元素によって標識された誘導 体、及び天然に誘導された生体分子を使って評価される。各々同一の寸法のマト リックス材料に対する表面変成試薬の最大マイクログラム数を決定するために、 各マトリックス片は液体シンチレーシ冒ン分光法によって分析される。

計数効率は、これらのマトリックスそれぞれに、トリチウムでｌ！識された化合 物を標準的に添加することによって決定され、それにより負荷の正確な評価がな される。

その結果は、光標識合成ポリマー、蛋白質、及び長鎖ボリサ７カライドと、ポリ ビニルクロリドＣＰＶＣ）　、ポリプメチルメタクリレート（Ｐ？Ｉ？ｌＡ）と の共有結合を示した。

以下の表５は種々の材料に対するカンプリング効率を示す。

表　　５゜ 変成剤溶液　マトリックス（リ　　適用したｎｇ　　　　結合したｎｇ　　　カ ッカングｃｒ／ｌｃｒ／ｌ　　　　　　　％ ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＰＶＣ７８ａ２６＋　１１５３　２７１．３２＋　ＩＣ１７０ ３４，４２％コラーシー　　　ＰＰ　　　　　　　７８ａ２６＋１１５５　１６ ７．０８−）−１ａ２８　２１．１９％ＰＥ　　　　　　　７Ｂ＆２６＋ｌＡ３ ３　　ｊ４４．７８＋１７６８　１ａ３７％Ｓｉｌ／Ｄｏｗ　　　７８１Ｌ２６ ＋１１５３　１２１．６４−）−１６，１６１５，４３％Ｓ目／Ｄｏｗ　　　　 ４１９２＋５．Ｂ５　　３７．２２−）−＆５４　８４．７４％Ｓｉｌ／Ｒｅｆ 　　　７８ａ２６＋１′５．５４　１３４４０＋５９．８６　１ｚ３０％Ｓ　ｉ 　Ｉ　／Ｒｅ　ｆ　　　　４五９２＋　　Ａ８５　　２α９２＋　５．７８　４ ７．６５％ＰＭＭＡ　　　　１５９２．６８＋　２１９０　１８＋１４９＋　２ ９．７５　１２−９６％ＰＭＭＡ　　　　　　７７．５９＋　４８０　　２４． ２６＋　４．３３　３１．２７％廣−ＰＥＧ−ＰＶＣ８９２，２Ｏ−）−１２２ ，３８３９４，８４＋　５２．７４　４４．２５％ｍｍ２）　　　　ｐｐ　　　 　　　５ｑｚ２ａ＋１２ｚｓａ　　２２１．１４＋　２４．８６２４．７８％Ｐ Ｅ　　　　　　　８９２．２Ｏ−）−１２Ｌ３８　２８１５６＋　１４．７８　 ３１．７８％Ｓ７１／Ｄｏｗ　　　８９２．２（１＋ｆ２２．３８　４０１．２ ５＋９２．０３　４４．９７％Ｓｉｔ／Ｒｅｆ　　　８９２．２０＋１２２．３ ８　５０７．８７−）−Ｂ５．４４　３１．８４％（２）ＨＹＡＬ＝ヒアルロン 酸 湿Ｗ定 市販のＰＩＩＭＡまたはシリコンフィルムのコーティングしていないＩＯＬ材料 に対するコーティングされたＩＯＬ材料の湿潤性の測定は、実質的にＰｒｏｔｏ ｃｏｌ　ｆｏｒ　ＣｏｎｔａｃｔＡｎｇｌｅ　　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ　　 ａｔ　　ｔｈｅ　　Ｐｏ１ｙｖｅｒ−＠ａｔｅｒ　　Ｉａｔｅｒｆａｃｅ”（Ｇ ｕｉｄｅｌｔｎａｄ　ｆｏｒ　Ｂｌｏｏｄ−Ｍａｔｅｒｉａｌ　Ｉｎｔｅｒａｃ ｔｉｏｎｓの第７補遺版、ｔｈｅ　Ｎａｔｊｏｎａｌ　ＨｅａｒｔｌＬｕｎｇ　 ａｎｄ　ＢｌｏｏｏｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐのレポ ート、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔ閤ｅｎｔｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ 　５ｅｒｖｉｃｅｓ　５Ａ−３０頁、１９８５年９月〕り示されている通り、行 われる。

表面が変成された時に、ＰＭＭＡおよびシリコン材料のどちらも湿潤性が統計的 有意に改良される。

これは以下の表６に示されている通り、対照のレンズに比べて表面を変成された レンズにおける、より低い接触角の測定によりて示される０両材料へのコーティ ングに伴って、湿潤性は有意に改良される。

表　　６ ＰＭＭＡ　　　　　無臘入の対照群　　　　８α４５＋　　２．３９ＡＮＰ−Ｐ ＥＧ−ＮＨｚ　　　６７．２０　＋　ｌ−７０ＢＢＡ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　７ ４．６５十五９３シリコン　　　無し　　　　　　　　　１０２．５＋　　２． ７５ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＮＨｔ　　　　　９五５Ｏ−）−２，８７・ＢＢＡ−ＰＥ Ｇ−ＮＨｚ　　　　　９α４０−１−４．１０ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　　 　６　＆Ｓ　Ｏ−）−５，３７（リ　　　　　　！＃均鳴肛拘は、慈復されたも のと対照群のそれぞれにおいて、左の角度１０回及び右の角度１０回の測定に基 ずいている。

蛋工目り翌Ｊ巳り註 対照！ＯＬ材料に対して表面を変成されたＩＯＬ材料への蛋白質の吸着が測定さ れる。

トリチウム化された■型コラーゲン、ヒト血清アルブミン、及びヒト血漿フィブ ロネクチンを、アルダ−の目の生理学：３床応用（アール、エイ、モーゼス編） 、シー。

ブイ、モスビー　カンパニー、セントルイス　ミズリー（１９８１年）　　（Ｂ 、Ｐ、Ｇｌ’ｏｏｒ、’Ｔｈｅ　Ｌｃｒｉｍａｌ　ａｐｐａｒａｔｕｓ”　　１ ｎＡｌｄｅｒ’ｓ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｙｅ：Ｃ１１ｎｉ ｃａｌ＾ｐｐｌｉｃａｔｔｏｎｓ（Ｒ，Ａ、１１ｏｓｅｓ＋　ｅｄ、）＋Ｃ，Ｖ 、Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、＋Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓｔ　ＭＯ（１９８１）〕に記載されて いるように製造し、涙液電解溶液に希釈する。

そして、変成されたｌ’ＨＭＡレンズ、及び対照ＰＭＩＩ＾レンズをこれらの溶 液に添加し、７日間蛋白質を吸着させる。

この期間の最後に、それぞれのレンズを緩衝生理食塩水で洗浄し、テトラヒドロ フランに溶解し、液体シンチレーシッン分光法により分析する。対照Ｐ？！！！ Ａレンズに対して吸着された蛋白質の量は、表面を変成されたＰｌ’１ＭＡレン ズに対する吸着された蛋白質の量と比較される。結果は以下の！ＥＴに示す。

表　　７ 対　照　　　　　　コラーゲン　α７６＋、０２ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　 コラーゲ：／　　ＣＬ５３＋、０５　　　３（１２６対　　照　　　　　　　　 　フィブロネクチン　［１１８＋　、００３ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　　フ イプｏネクｆン　Ｑ、１４＋−００５２２２２対　　照　　　　　　　　Ｈ８Ａ 　　　　　　１１５−）−，００６ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　Ｈ８Ａ　　　 　　Ｑ、　１０＋、０１１　　３３．３５（１）平均マイクログラム　ｔｔｌ” ＆　　／レンズ価は、４回試行の結果である。

シ　　１日の　　　　　　　　　　　に　　　　　　　　　八　　のダウ／コー ニング　シリコン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルクロリド、及び ＰＭＭＡのレンズの小片を種々の表面変成試薬によって処理し、光分解し、生理 食塩水で大量に洗浄する。

直径２■−の角膜のボタンを、体長８−２４インチの胎児から集める。

角膜片は、３７℃、５％Ｃ（ｈインキュベーター中で２５−麺ｏ１のＨＥＰＥＳ 　ｌｌｌ液液１０％ウシ胎児角膜、及びアンフォテリシン８２．５ｍｇ／ｓｌを 伴ったダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変成イーグル培地（ＥＢｌｅ　ｍｅｄ ｉｕｍ）で成長する。

そして、角膜片をＩＯＬマトリックス材料の方形片の一端か、又はＰ）ＩＭＡレ ンズの中央に置＜、ｍ胞の付着は７日間モニタリングされる。小片に渡った細胞 の成長は鵬一単位で測定され、細胞の成長力はライトーゲムサ（ＩＪｒｉｇｂｔ −Ｇ＠１ｍ５ａ）着色、又はトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ）着色に よる着色によって測定される。

１０Ｌ材料のくもりを防止するため、ＴＯＬ材料に対する角膜の内皮および上皮 細胞の接着を妨げたいが、細胞に毒性、又は有害効果を持ちたくない。

さらに、表面変成試薬が細胞毒でないことを試験で示す。

結果は表８に示す。

表　　８ マトリックス　　　変成　試薬　　　平均副産物　　　生育　率ＰＭＭＡ　　　 無し　　　　　・・・−・−・−・−・−十３ＡＮＰ−ＰＥＧ−コラーゲン　　 −一・−一・・・・・・・−・−・−−一・　　　＋３−−−）−４ＢＢＡ−Ｐ ＥＧ−ＨＹＡＬ　　　−一・・−−−−−−−・−−−＋５−−）−４ＡＮＰ− ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　　−・−・−・−・−ｍ−・−・・−＋３−＋４シリコン 　　　無　し　　　　　　　　　α００−α１０ｍ　　　＋１　　＋２ＡＮＰ− ＰＥＧ−コラーゲ／　　　　五２０露　　　　＋３−＋４ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＨＹ ＡＬ　　　　　α４７　ｗｍ　　　　　＋　５ＢＢＡ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　　 　　　α６７−　　　　　　＋３ポリプロピレン　無　し　　　　　　　　　　 　　１．４４譚　　　　＋２−＋３ＡＮＰ−ＰＥＧ−コラーゲン　　　　　５． ＯＯ鴎　　　　　＋３−−）−４ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　　　　α７１諺 　　　　　＋３ＢＢＡ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　　　　　ｃＬ５５ｍ　　　　　＋ ２−−）−５（１）生育率は、無成長又は、細胞残骸を＋１の目盛シとＬＡＩｓ 胞の完全な生１、完全な成長を＋４とする尺八に基づく。

Ｇ、ウサギの死体の目による角膜内皮損傷度の評価レンズ（ＩＯＬ）の接触によ って起こされる内皮の損傷量を被覆物が減少できるかどうかを決定するために擦 傷試験が行われた。

殺して１ないし２時間以内に成熟ウサギ死体の新鮮な眼を得た。７關の穿孔器を 使用して、中央部の角膜をボタン状に切取り、これを内皮側を上向きにして、顕 微鏡用スライドガラスの上に置いた。

次いで、乾燥したレンズ（ＩＯＬ）を掴み用具で取り上げ、静かに角膜のボタン 状の角膜の上に置く。

非常に柔らかいタップを使用して（掴み用具の上に引張り上げない）、レンズを 互いに９０℃の角度で角膜に押しつける。次いで、ボタン状の角膜から掴み用具 を注意深く掴んでレンズを取り去り、そして緩やかに対角線方向に滑らして外す 。

次いで、内皮をトリパン青の２５％貯蔵液の２〜３滴で染色し、濯ぎ、次いでア リザリン赤（９，９％ＮａＣ１中、０．１％のＮＨ，ＯＨで４．２のｐＨまで滴 定した）の２〜３滴でａ、５分間染色した。

各々のレンズを１０個のボタン状角膜で試験した。モして内皮の損傷の度合いの 変化を示す写真を参考にして評価した。

処理したレンズは損傷度が顕著により低かった。これ表　　９ 対照角膜　　　　　　１．５７　　　　　　　十０．７３添加なし　　　　　　 ２２．７５　　　　　　　＋　５．４１添加なし　　　　　　１８．３０　　　 　　　　＋　６．８９添加なし　　　　　　２５．７５　　　　　　　＋　４． ６２ＡＮＰ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　　　　１４．７５　　　　　　　＋　４．８ ０ＡＮＰ−ＰＥ！Ｇ−ＨＹＡＩ、　　　　　１３．２５　　　　　　　＋　５． ６０ＢＢＡ−ＰＥ！Ｇ−ＨＹＡＬ　　　　　１７．００　　　　　　　＋　６． ４０ＢＢＡ−ＰＥＧ−ＨＹＡＬ　　　　　１３．００　　　　　　　＋　４．３ ０商業的に生育した群から購入した、無条件の１．５ないしＺ５年令の１０匹の 健全雌ネコを使用した。

外科手術の当日に、１０％フェニルエフニリン滴の局所適用をして、最大の瞳孔 拡大をした。ファコフラグメンテーション・アンド・イリゲーシ３ン／アスビレ ーション（ｐｈａｋｏｆｒａｇｍｅｎｔａｔｊｏｎ　ａｎｄ　ｉｒｒｉｇａｔｉ ｏｎ／ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）を使用して、エクストラカブシュラ−・カタラク ト・エクストラクション（ｅｘｔｒａｃｔｃａｐｓｕｌａｒ　ｃａｔａｒａｃｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を行った。個々のレンズに番号を付け、各々のネコの一 方の眼に対照レンズを、残りの一方の眼に表面を改質したＩＯＬを入れた。

外科医は、どちらのレンズが被覆してあり、被覆してないかは知らなかった。眼 に入れるレンズは袋または使用後用溝（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　５ｕｌｃｕｓ）に 入れておいた。

レンズをセットした後、角膜部分を８−０ナイロン縫合糸で閉じた。

試験中の全ての動物を２４時間、４８時間、１週間そして２週間後に評価した。

術後の評価は、炎症による損傷の事実並びに角膜内皮細胞検査のための生物学的 顕微鏡検査から成り立つ。

術後２週間にわたって動物を観察した後、動物を殺して眼球を組織学的研究のた めに取り出した。取り出した眼球をゼンカーズ（Ｚｅｎｋｅｒｓ）−酢酸中で固 定し、洗浄し、７０％アルコールに貯蔵した。

ネコをモデルにした結果 ネコをモデルにした試験は、ホストシステムによる表面改質のＩＯＬの許容度の 初期的評価のための内移植システムとして使用した。

マクドナルトーシ’ｒッダック（ＭｃＤｏｎａｌｄ−Ｓｈａｄｄｕｃｋ）（炎症 ）評点と厚度肝の読みを下記の表１０に示した。

期待されたように、全ての試験動物における葡萄膜長の程度は低く、炎症の期間 は短く角膜の水腫は２週間の治療期間にも治らなかった。

しかしながら、ｉｎ　ｖｉｖｏおよび組織学的研究のいずれをも基礎にしても、 試験動物はレンズに対する異常な反応の事実を示さなかった。

これにより、顕著な眼球の異常は、被覆した眼内のレンズには伴わず、そして角 膜の内皮細胞は被覆加工により保護されていると結論できる。

して１．０〜ＺＯ■／ｒｎＩの液にする。

ジメチルホルムアミドまたはエタノール中４■／１ｎ１にした光反応基（ｐｈｏ ｔｏｇｒｏｕｐ）　−Ｎ　ＯＳの１０’Ｏ倍過剰をゆっくりと添加した。カップ リング工程は、シリンジ・ドライブ（ｓｙｒｉｎｇｅ　ｄｒｉｖｅ）により６時 間かけて４℃で行った。カップリングしたタンパク質を、緩衝液に対して透析し 、カップリングしなかった光反応基を除いた。

各々のタンパク質は、カップリング工程に異なった反応をしたので、最大のカッ プリング効率とタンパク質の安定性を呈する、タンパク質に対する光反応基（ｐ ｈｏｔｏｇｒｏｕｐ）　−Ｎ　ＯＳの改質の比率と緩衝液条件が選択された。

光活性化性（ｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）ポリマースペーサーの魚茎 分子量１０００．１４５０および３３５０の水酸基末端性のポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）の光反応性誘導体は、上述で引用した木材等の相間移動法の準用 により合成された。ＡＮＰ−ＰＥＧ合成の相間移動法は、６０％水性ＫＯＨ／ト ルエンをフルオロニトロアジドベンゼンおよびＰＥＧと共に使用することより成 り、次いで抽出しそして薄層クロマトグラフィーで精製した。

ＡＮＰ−ＥＡＣおよびＢＢＡのＮ−オキシ−スクシンイミドエステルの０．５倍 量を、超乾燥ゴールドラベル溶媒である乾燥ジメチルホルムアミドまたはジオキ サン中のシェフアミンの１倍量に添加した。

暗所、室温で１６時間反応させた後、生成物を８５７１５／１／１＝クロロホル ム／メタノール／Ｈ！　Ｏ／酢酸中の薄層クロマトグラフィーにより精製した。

モノ置換のシェフアミン（ＪＢＰＦ）誘導体を、薄層クロマトグラフィー用の溶 媒で抽出し、そして酢酸を除（ために水と共沸蒸留した。

水溶液生成物であるＡＮＰ−ＥＡＣ−ＪＥＦＦおよびＢＢＡ−ＪＥＦＦは、各々 １５％および１０％の収率で得られた。

不溶性の支持体に対する親水性スペーサーの光カップリング 微量滴定板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　　１ａｔｅｓ）１００−３０００ｎＨのス ペーサーを含有する誘導体になった親水性スペーサーの溶液を、ポリ塩化ビニル およびポリスチレンの９６穴−微量滴定板の窪みに添加する。溶液を放置して吸 着せしめそして乾燥する迄蒸発する。（連続気流フードで吸着した後、約１時間 にわたって７０℃のオーブンにこの滴定板を置くことにより補助した。）。

次いで親水性のスペーサーを光分解により支持体に共有結合的にカップリングし た。支持体を、１２時間、４℃で、適当な高強度ランプから１ｏｏｎ離して置い た。

次いで、非共有結合的にカップリングしたスペーサーを燐酸塩（ＰＢＳ）の緩衝 液で洗い流した。

セファデックスＧ−２５−１５０（ビーズ径　５０−１５０μｍ）の２０℃分を シリコーン化した１２Ｘ７５１のボロシリケート（ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ） ガラス管に入れ、光活性化性（ｐｈｏｔｏａｅｔｉｖａｔａｂｌｅ）の親水性ス ペーサーを各々のガラス管に追加した。

溶液を放置して吸着、乾燥した。この工程に要する時間は、連続気流フードで吸 着した後、約１時間にわたって７０℃のオーブンにこのガラス管を置くことによ り短縮できた。

次いで親水性のスペーサーを光分解により支持体に共有結合的にカップリングし た。支持体を、１２時間、４℃で、適当な高強度ランプから１０口離して置いた 。

次いで、非共有結合的にカップリングしたスペーサーを燐酸塩（ＰＢＳ）の緩衝 液で洗い流した。

不溶性の支持体に誘導体にした親水性スペーサーを光カップリングした後、興味 のある生体分子（開環したペニシリンに対するポリクロナール抗体、ヒトγ−グ ロブリンおよびＨＧＧに対して生成したモノクロナール抗体、そしてヒトα−フ ェトプロティンおよびこの腫瘍随伴性の抗原に対して生成したモノクロナール抗 体等）を、タンパク質−タンパク質カップリング法により、スペーサーに結合し た。２種の方法が採用された。

グルタルアルデヒドにより、生体分子のε−アミノ基をスペーサーの末端アミノ 基にカップリングした。

水溶性のカルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノブロビル ）カルボジイミド・ＨＣＩ（ＥＤＣ）により、生体分子のカルボキシル基を、ス ペーサーのアミノ基にカップリングした。

ポリクロナール抗体の活性の評価 分別したウサギのポリクロナール抗血清を放射線標識した。受動的吸着および親 水性のスペーサーを介してのグルタルアルデヒドまたはＥＤＣカップリングによ り、マトリックスへカップリングした抗体の量を液体シンチレーシタンスベクト ロメトリーにより定量した。

固定化した抗体の活性は［”ＣＩ−ペニシリンの添加により評価した。全体活性 （ｐモル［”ＣＩ　Ｐｅｎ）および特異的活性（［”ＣＩ　Ｐｅｎ（ｐモル）／ 固定化ａｎｔｉ−Ｐｅｎ（ｐモル））は直接のカップリングおよび親水性のスペ ーサーを介しての固定化により決定された。

モノクロナール抗体モデルの活性の評価ＭＧＧとモノクロナールａｎｔｉ　−Ｈ Ｇ　Ｇのベアのモデルが、二の試験のために選ばれた。カップリングした抗原の 量を決定するために、放射線標識したＨＧＧを直接にまたは親水性スペーサーを 介してカップリングした。次いで、免疫反応性を評価するために、非放射線標識 ＨＧＧをこの方法によりカップリングした。次いで、放射線標識したａｎｔｉ− ＨＧＧを固定化したＨＧＧに添加した。

免疫反応性は、液体シンチレーシタンスペクトロメトリーにより評価した。

（ａｎｔｉ　−ＨＧ　Ｇ　（ｐモル）／ＨＧＧ　（ｐモル）〕の比率は、直接カ ップリングと親水性スペーサーを介しての固定化のために比較した。

表１１と表１２は、ポリスチレン微量滴定板とセファデックス・ゲルに対するカ ップリングする光反応性のスペーサーの効率を説明している。

ＡＮＰ−ＢＳＡ　　４５４．４±１４．１　　　４０９．５±　８．６　　８３ ．５±１．７ＢＢＡ−ＢＳＡ　　３９３．４±１０．４　　３０９．５±１１． ６　　７６．５±２．９ＡＤＤＰ−ＢＳＡ　４３８．０±１４．１　　２８１． ５±５．６　　７２．２±０．８ＡＮＰ−ＯＶＯ７０３，７±２７．１　　６６ ２．６±３０．１　　９４．８±４．８ＢＢＡ−ＯＶＯ３６４，Ｏ＋１２．６　 　１９４．６＋１９．９　　５５．４ｆ４，７ＡＮＰ−ＲＮ　　５３３．５±８ ４．０　　４７４．５±１３．０　　９１．６±２．７８ＢＢＡ−ＲＮ　　４６ ６．８±４２．２　　３３８．８±１８．０　　７２．６±３．８ＡＮＰ−ＪＩ ＦＦ　７８５．５±２０．９　　　７５．９±０．９　　９．５±１．３ＢＢＡ −Ｊｌｌ！ＰＰ　４６６．１±４２．５　　　４８．６±３．８　　１０．５± ０．８ＢＳＡ　　　　　２４８．８　　±８．１５　　　８．３９±１．２３　 　　３．３８±０．４９ＡＮＰ−ＢＳＡ　　２５３．９１　　±１４．９６　１ ６．８９±３．６５　　　６．６５±１．４４ＢＢＡ−ＢＳＡ　　１３２．０１ 　　±　２．００　１２．０６±２．３２　　　９．１４±１．７６ＡＤＤＰ− ＢＳＡ　２２４．１７　　±　８．１５　１３．７６±３．１７　　　６．１３ ±１．４１ＲＮ　　　　　　２７０．７　　±　２．０３　１８．２８±２．２ ２　　　６．７５±０．８２ＡＮＰ−ＲＮ　　　１８０．１５　　±　１．９３ 　２０．６４±１．３０　　１１．４６±０．７２ＢＢＡ−ＲＮ　　　２４５． ４５　　±　２．０２　１３．９１±０．９９　　　５．６７±０．４００ＶＯ ２２４，３±　１．１３　１８．３４±１．４９　　　８．１７±０．６６ＡＮ Ｐ−ＯＶＯ１３６，３±　１．０１　　８．７Ｂ±０．８８　　　６．４４±０ ．６４ＢＢＡ−ＯＶＯ６０，９０±　０．３９　　７．１７±０．５６　　１１ ．７６±０．９１受動的に吸着された生体分子の活性は、親水性スペーサーを介 して固定化された生体分子の活性と比較された。

そして、下記の表１３はａｎｔｉ−ペニシリンポリクロナール抗体のポリスチレ ン微量滴定板へのカップリングの結果を纏めたものである。長鎖の親水性スペー サーを使用すると、抗体を微量滴定板に吸着させた場合または抗体を直接この板 にカップリングさせた場合と比較して、抗体に実質的により大きい特異的な活性 を付与する。

下の表１４には、セファデックスゲル上の固定化モデル抗原、ＨＧＧの活性の比 較からのデータを示す。免疫反応性対の比活性（抗ｆ（ＧＧｎｇ／ＨＧＧｎｇ） はスペーサーの使用により実質的に改良された。

抗ＨＧＧｎｔ／ スペーサー　　　　　カフプリング　　結合ＨＯＧ　　　　　　結合抗ＨＧＧ　 　　　）ＩＧＧｏｇｎｇ　　　　　　　　　　　Ｂ　　　　　　　　　Ｘ　　１ ００表１５は、一端に光反応基（ＡＮＰ）および他端に熱反応基（ＮＯＳ）を有 するポリエチレングリコールスペーサーへのＨＧＧの共有結合カップリングを示 すが、該スペーサーは光反応基の活性化によりポリ塩化ビニルマイクロタイター プレートに共有結合されている。興味深いことに、データはＡＮＰ−ＰＥＧスペ ーサー自体がマイクロタイタープレートへのＨＧＧの非特異的吸着の量を大きく 減少させることを示し、それらに共有結合されたスペーサーを有するプレートが 支持体への容易な特異的カップリングを可能にし、その一方で生体分子の非特異 的吸着を減少させることを示している。

表１５ 本発明の好ましい実施態様を記載してきたけれども、種々の修正、改良および変 更は本発明の精神および添付した請求の範囲の領域から逸脱しない限り、本発明 の範囲内に包含されることは理解されるべきである。

対照に対する活性倍数 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年６月２５日

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．鎖長約２５オングストローム以上の延長された骨格により分離された２つの 反応基を有する化学的骨格をもつ長鎖スペーサーであって、一方の反応基が与え られた刺激に反応して支持体表面に共有結合を形成し得る潜在性反応基であり、 そして他方の反応基が生体分子に共有結合を形成し得る反応基である、支持体表 面に生体分子を連結ずるための長鎖スペーサー。
2. ２．前記反応基が潜在性反応基であり、一方の基は他方が反応しない刺激に対し て反応する請求項１記載のスペーサー。
3. ３．潜在性反応基が光反応基である請求項１記載のスペーサー。
4. ４．潜在性反応基が熱反応基である請求項１記載のスペーサー。
5. ５．スペーサーの反応基のない化学的鎖が２５℃で少なくとも０．５重量％の範 囲まで液体担体中に可溶性である、液体担体中の請求項１記載のスペーサーから なる被覆組成物。
6. ６．化学的鎖が多数のエトキシ基からなる請求項１記載のスペーサー。
7. ７．化学的鎖が多数のイソプロポキシ基からなる請求項１記載のスペーサー。
8. ８．一方の反応基が光反応基であり、そして他方の反応基が熱反応基である請求 項１記載のスペーサー。
9. ９．化学的鎖がポリペプチドである請求項１記載のスペーサー。
10. １０．化学的鎖が多糖である請求項１記載のスペーサー。
11. １１．反応基間のスペーサーの延長された長さが約５０オングストローム以上で ある請求項１記載のスペーサー。
12. １２．光反応基がアリールアジドまたはアリールケトン誘導体である請求項３記 載のスペーサー。
13. １３．化学的骨格に結合し、そして鎖長約２５オンダストローム以上の延長され た骨格により分離された２つの反応基を有する化学的骨格をもつスペーサーであ って、一方の反応基が、アリールアジドまたはアリールケトン誘導体でありそし て与えられた刺激に反応して表面に共有結合を形成し得る光反応基であり、他方 の反応基が異なる刺激に反応して生体分子に共有結合を形成し得る基であり、一 方の反応基は他方の反応基が反応しない刺激に対して反応性である、 表面に生体分子を連結し、その一方で核表面の存在による生体分子への実質的な 悪影響を回避する長鎖ヘテロ二官能性スペーサー。
14. １４．生体分子基、与えられた刺激に反応して支持体表面に共有結合し得る潜在 性反応基、並びに生体分子基および潜在性反応基が結合される長鎖化学的スペー サーであって、該スペーサーの延長された長さ方向に約２５オングストローム以 上の間隔で生体分子基と潜在性反応基とを配置する前記スペーサーからなる、支 持体の表面を生体適合性にするために該表面を変性するための組成物。
15. １５．スペーサーが多数のイソプロポキシ基からなる請求項１４記載の組成物。
16. １６．スペーサーが多数のエトキシ基からなる請求項１０記載の組成物。
17. １７．化学的鎖がポリペプチドである請求項１４記載の組成物。
18. １８．化学的鎖が多糖である請求項１４記載の組成物。
19. １９．潜在性反応基が光反応基である請求項１４記載の組成物。
20. ２０．光反応基がアリールアジドまたはアリールケトン誘導体である請求項１９ 記載の組成物。
21. ２１．潜在性反応基が熱反応基である請求項１４記載の組成物。
22. ２２．潜在性反応基がスペーサーの延長された鎖方向に約５０オングストローム 以上生体分子基から隔てて配置されている請求項１４記載の組成物。
23. ２３．長鎖スペーサーの潜在性反応基を与えられた支持体表面と反応させ、そし てスペーサーが有するもう一つの反応基を生体分子と反応させることからなり、 このとき上記反応基は長さ方向に少なくとも２５オングストロームの延長された 長さを有する鎖を隔てて互いに配置され、上記スペーサーは共有待合により支持 体表面および生体分子に結合される、 支持体表面に生体分子を結合する方法。
24. ２４．スペーサーが支持体表面に共有結合される前に、生体分子に共有結合され る請求項２３記載の方法。
25. ２５．スペーサーが生体分子に共有結合される前に、支持体表面に共有結合され る請求項２３記載の方法。
26. ２６．潜在性反応基が光反応基であり、該光反応基が反応する化学線にスペーサ ーを暴露してスペーサーを支持体表面に共有結合する段階を包含する請求項２３ 、２４または２５のいずれか１項に記載の方法。
27. ２７．スペーサー鎖が支持体表面に比べて比較的親水性であり、支持体表面に結 合されるべき反応基がスペーサー鎖の残部に比べて比較的疎水性の光反応基であ り、スペーサーを含有する水性溶液と支持体表面を接触させて、光反応基が支持 体表面の近くに結合することを可能にし、そしてその後にスペーサーを化学線に 暴露して、スペーサーを支持体表面に光反応基を介して結合する段階を包含する 請求項２３記載の方法。
28. ２８．支持体表面を請求項１４記載の組成物と接触させ、そして反応基を反応さ せて前記表面との共有結合を形成することからなる支持体表面を変性する方法。
29. ２９．支持体表面を請求項２０記載の組成物の水性溶液と３０秒以上の間接触さ せ、そしてその後に光反応基が反応する化学線に前記溶液を暴露してその反応基 の支持体表面への共有結合を引き起こすことからなる支持体表面を変性させる方 法。
30. ３０．支持体表面、多数の生体分子、および支持体表面に潜在性反応基を介して 共有結合し、そして生体分子に共有結合し、そして支持体表面と生体分子とを自 身の延長された長さ方向に少なくとも２５オングストロームの間隔で配置するス ペーサーを有する生体材料。
31. ３１．スペーサーが一般的に親水性の化学的骨格鎖からなる請求項３０記載の生 体材料。
32. ３２．スペーサーが一般的に疎水性の化学的骨格鎖からなる請求項３０記載の生 体材料。
33. ３３．多数のエトキシ基またはイソプロポキシ基からなり、生体材料の表面から 生体分子を隔てる約２５オングストローム以上の延長された鎖長を有するスペー サーにより生体材料の表面に潜在性反応基の反応を介して共有結合された多数の 生体分子基を含む水性環境中の生体材料。
34. ３４．（ａ）支持体表面に共有結合し得る比較的疎水性の光反応基を有する化学 的鎖からなる親水性スペーサーを含む水性溶液と支持体の疎水性表面を接触させ 、（ｂ）光反応基を刺激して該基に支持体表面への共有結合を引き起こさせ、そ して （ｃ）段階（ｂ）の前または後のいずれかに、前記スペーサーに生体分子を共有 結合させる（ここでスペーサーは支持体表面と生体分子の間に少なくとも２５オ ングストロームの延長された鎖長を有する）、ことからなる疎水性表面を有する 支持体へ生体分子を結合する方法。
35. ３５．化学的性質の実質的な変化なしに種々の長さに製造され得る化学種の骨格 鎖を有する化学的スペーサーを準備し、該スペーサーを支持体表面および生体分 子に共有結合させて、表面と生体分子の間に延長されたスペーサーの長さ方向に 沿って測定された少なくとも２５オングストロームの間隔を与え、そして延長さ れたスペーサーの長さ方向に沿って測定された、表面と生体分子との各々が２５ オングストローム以上である種々の間隔を利用して生体分子の活性を測定し、そ して 実質的に最適な活性を有する生体分子を提供する延長されたスペーサーの長さを 選択する、ことからなる生体分子の活性を実質的に最適化するために水性環境中 の支持体表面に生体分子を結合する方法。