CN111225676A - 诱导骨软骨修复的多能性干细胞 - Google Patents

Abstract

有可分化为多种系统的应激抗性的(Muse)细胞是存在于间充质干细胞(MSC)集团的阶段特异性的胚抗原3(SSEA‑3)阳性细胞。Muse细胞有分化为作为胚胎干细胞的全部胚层的多能性。在本研究中，旨在调查用于修复骨软骨损伤的Muse细胞移植的有效性。Muse细胞从人骨髓MSC单离。骨软骨损伤在免疫缺陷大鼠的膝盖沟发生。向该大鼠注射细胞，分为3组：在对照组中，注射PBS；在非Muse细胞组中，注射5×10⁴个SSEA‑3阴性的非Muse细胞；在Muse细胞组中，注射5×10⁴个SSEA‑3阳性的Muse细胞。被修复的组织在Muse组中在处置后的12周有大致平滑的均质表面，在对照及非Muse组中检测不到修复组织。根据组织学评价，在处置后的4周及12周与其他组比较而在Muse组中在骨软骨损伤部位显示更良好的修复。Muse细胞可为用于骨软骨损伤的治疗的新的有希望的细胞源。

Description

诱导骨软骨修复的多能性干细胞

【技术领域】

本发明涉及在再生医疗中使用的细胞制剂及/或医药组合物。更具体而言，本发明涉及含对于骨软骨损伤的治疗或修复有效的多能性干细胞的细胞制剂或医药组合物。

【背景技术】

软骨病变成为自身修复能力受限或起因于关节功能的降低的关节障碍的原因，这特别对应于高龄患者的重大的障碍(非专利文献1)[1]。

使用了骨髓刺激技术或骨软骨移植等的方法的若干临床试验作为改善软骨修复的尝试进行，但成功有限。在1994年，Brittberg等实施称为自身软骨移植(ACI)的第1代的细胞治疗(非专利文献2)[2]。Ochi等通过将端胶原凝胶与软骨细胞组合使用，改变ACI，带来良好的临床转归(非专利文献3)[3]。但是，由于Imtakt的软骨的罹患率、脱分化、及2阶段的外科的处置，成功依然受限。

近年，在再生医疗领域中，使用干细胞的细胞疗法对于各种各样的疾病进行研究，作为期待向临床应用的可能性的干细胞，已知胚胎干细胞(ES细胞)、神经干/前体细胞(NSPC)、人工多能性干细胞(iPS细胞)、脐带血干细胞(UCBC)。

另外，骨髓间充质细胞级分(MSC)从成体单离，已知有例如分化为骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等的能力(非专利文献4及5)。但是，MSC是含各种各样的细胞的细胞群，不知其分化能的实体，在治疗效果上偏差大。另外，作为成体来源的多能性干细胞报告了iPS细胞(专利文献1)，在iPS细胞的建立中，除了以向体细胞导入对于作为间充质细胞的皮肤成纤维细胞级分特定的基因或特定的化合物这样的极其复杂的操作作为必要之外，iPS细胞有高的肿瘤形成能力，从而存在向临床应用的极其高的障碍。

在过去10年间，变得可容易地单离间充质干细胞(MSC)，从各种各样的组织非常容易地接入，而且非常地快速增殖，从而作为用于临床应用的基于细胞的治疗法广泛使用。再者，可广范围地分化为三胚层系(非专利文献6)[4]。

根据作为本发明人的一人的出泽的研究，存在于间充质细胞级分，无诱导操作地得到的以SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)作为表面抗原表达的多能性干细胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells；Muse细胞)担负间充质细胞级分所具有的多能性，得知有可应用于旨在组织再生的疾病治疗的可能性。另外还得知，Muse细胞可通过将间充质细胞级分用各种应激刺激来浓缩(专利文献2；非专利文献7)。

但是，伴随胎儿发育不全的脑障碍的改善及/或治疗中使用Muse细胞，无明显得到了期待的治疗效果的例。

【现有技术文献】

【专利文献】

【专利文献1】日本专利第4183742号公报

【专利文献2】国际公开第2011/007900号

【非专利文献】

【非专利文献1】A.Mobasheri,et al.,Histol.Histopathol.,vol.24,p.347-366(2009)

【非专利文献2】M.Brittberg,et al.,N.Engl.J.Med.,vol.331,p.889-895(1994)

【非专利文献3】M.Ochi,et al.,J.Bone.Joint Surg.Br.,vol.84,p.571-578(2002)

【非专利文献4】M.Dezawa,et al.,J.Clin.Investi.,vol.113,p.1701-1710(2004)

【非专利文献5】M.Dezawa,et al.,Science,vol.309,p.314-317(2005)

【非专利文献6】K.Tamai,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.108,p.6609-6614(2011)

【非专利文献7】S.Wakao,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.108,p.9875-9880(2011)

【发明的概要】

【发明要解决的课题】

本发明旨在提供在再生医疗中使用多能性干细胞(Muse细胞)的新的医疗用途。更具体而言，本发明旨在提供含有Muse细胞的用于修复骨软骨损伤的细胞制剂及/或医药组合物。

【用于解决课题的手段】

本发明人发现，通过向免疫缺陷大鼠模型注入或施用Muse细胞，Muse细胞在骨软骨损伤部位局部蓄积，在损伤部位分化为软骨细胞，可修复骨软骨损伤，从而完成本发明。

即，本发明如下所述。

[项目1]用于治疗或修复骨软骨损伤的细胞制剂，其含从生物体的间充质组织或培养间充质细胞分离的SSEA-3阳性的多能性干细胞。

[项目2]上述[1]所述的细胞制剂，其含由外部应激刺激浓缩SSEA-3阳性的多能性干细胞的细胞级分。

[项目3]上述[项目1]或[项目2]所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是CD105阳性。

[项目4]上述[项目1]～[项目3]之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是CD117阴性及CD146阴性。

[项目5]上述[项目1]～[项目4]之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性、及CD271阴性。

[项目6]上述[项目1]～[项目5]之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性、及Dct阴性。

[项目7]上述[项目1]～[项目6]之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是有以下的性质的全部的多能性干细胞：

(i)端粒末端转移酶活性低或无；

(ii)具有分化为三胚层之任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；及

(iv)具有自我更新能力。

[项目8]上述[项目1]～[项目7]之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞有在骨软骨损伤部位蓄积的能力。

[项目9]上述[项目1]～[项目8]之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞有分化为软骨细胞的能力。

本发明通过对于患骨软骨损伤的对象，向损伤部位直接、或者从静脉等施用Muse细胞，可由Muse细胞在损伤部位分化为软骨细胞这样的骨软骨组织再生机制修复骨软骨损伤、特别是由纤维组织覆盖的软骨下骨。

【附图的简单的说明】

【图1】图1显示在处置后的4周及12周的，对照组、非Muse组、及Muse组中的修复的组织的肉眼的所见。在12周，Muse组与正常组织同水平而由白色的组织完全地补充损伤部位。

【图2】图2显示由肉眼的评分系统的，在处置后的4周，在Muse组见到改善倾向。另外，在12周，Muse组显示比其他组显著地良好的结果。*P＜0.05。

【图3】图3A显示在4周及12周的，使用番红O/固绿染色的修复组织的组织学评价。图3B及C显示在12周的H&E染色像。比例尺：A及B：500μm、C：100μm。

【图4】图4显示在4周及12周进行使用Sellers规格的组织学评分的结果，与非Muse组及对照组之任一者不同，在Muse组中，确认到组织学显著的差异。*P＜0.05。

【具体实施方式】

本发明涉及用于治疗或修复骨软骨损伤的细制剂或医药组合物，其含SSEA-3阳性的多能性干细胞(Muse细胞)。

【1.适用疾病】

本发明可使用含SSEA-3阳性的多能性干细胞(Muse细胞)的细胞制剂或医药组合物而在变形性关节症、外伤性软骨损伤、类风湿性关节炎、及癌等的与骨软骨损伤关联的疾病或症候状态的治疗、修复或缓和中使用。在本发明中，“骨软骨损伤”不限定，是指起因于上述疾病等的骨及/或软骨的损伤、以及由事故及外科的操作的结果发生的损伤。其中，“损伤”是指正常的结构或功能的变化，有与一般使用的用语相同的含意，可以与障碍、变性、外伤、或者缺损同义使用。

在本发明中使用之时，“骨”主要是指，含以羟基磷灰石、胶原(主要I型胶原)的形态沉积的钙及磷酸的成分、及骨细胞(例如，成骨细胞、骨细胞、及破骨细胞)、以及在实际软骨内骨的内部形成的骨髓的钙化(矿化)的结合性的组织。骨组织与其他组织(含软骨组织)显著地不同。具体而言，骨组织是由细胞、及二相性的介质(含矿化、无机成分(主要羟基磷灰石结晶)及有机成分(主要I型胶原))构成的脉管化的组织。葡萄糖胺聚糖构成不足2％的此有机成分及不足1％的二相性介质自身、或者骨组织本身。再者，与软骨组织比较，存在于骨组织的胶原以非常地组织化的平行的配置存在。

在本发明中使用之时，“软骨”是指含软骨细胞或软骨细胞样细胞、细胞间质(例如，I类型、II类型、IX类型、及XI型胶原)、蛋白聚糖(例如，硫酸软骨素蛋白聚糖、角质素硫酸蛋白聚糖、及皮肤素硫酸蛋白聚糖)、及其他蛋白质的结缔组织。在软骨中，含关节软骨及非关节软骨。

“关节软骨”是指覆盖关节内的骨的连接表面，发挥作为2个面对的骨表面之间的摩擦降低接合部分的功能的无血管的非无机化结缔组织。由关节软骨，骨彼此能不直接接触运动。关节软骨从邻接的滑膜的血管及被覆的骨的血管部分得到营养素。关节软骨含II型及IX型的胶原以及各种蛋白聚糖，不含与软骨内性骨形成关联的X型胶原。关节软骨覆盖在骨上，将软骨之下的骨称为软骨下骨。将损伤扩大至软骨和软骨下骨称为骨软骨损伤(软骨全层缺损)，将停留至软骨层称为软骨损伤(软骨部分损伤)。在本发明中，“软骨损伤”包含上述“骨软骨损伤”及“软骨损伤”。

“非关节软骨”是指未被覆关节表面的软骨，含纤维软骨(关节圆板、纤维软骨圆板、结合纤维软骨、及关节边缘纤维软骨)及弹性软骨。在纤维软骨中，与微多糖网突出的胶原束组合，软骨细胞比透明软骨或关节软骨广泛散在。关节圆板暴露于冲击，并且在频繁运动的关节(例如，膝的半月板)上发现。在这样的关节的例中，含侧头下颚骨、胸锁关节、手关节、及膝关节，但不限于这些。二次软骨结合由纤维软骨的半月板形成。在面对的两表面密切而接附的这样的纤维软骨圆板由软骨的薄层所介于的纤维组织的同心圆状的轮构成。这样的纤维软骨圆板的例是脊髓的椎间盘。结合纤维软骨介于这些关节的骨表面之间，能在椎体之间及耻骨之间微少移动。关节边缘纤维软骨包围几个关节腔(臀部的宽骨臼及肩的关节窝等)的缘部。

【2.细胞制剂】

【(1)多能性干细胞(Muse细胞)】

在本发明的细胞制剂中使用的多能性干细胞是作为本发明人的一人的出泽在人活体内发现其存在，命名为“Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring)细胞”的细胞。Muse细胞可从骨髓液、脂肪组织(Ogura,F.，et al.，Stem Cells Dev.，Nov 20,2013(Epub)(published on Jan 17,2014))或真皮结缔组织等的皮肤组织得到，还散在于各器官的结缔组织。另外，此细胞是有多能性干细胞和间充质干细胞的两方的性质的细胞，被鉴定为例如作为各自的细胞表面标志物的“SSEA-3(Stage-specific embryonicantigen-3)”和“CD105”的双阳性。从而，Muse细胞或含Muse细胞的细胞集团例如，可以这些抗原标志物作为指标从生物体组织分离。Muse细胞的分离法、鉴定法、及特征等的详细信息在国际公开第WO2011/007900号中公开。另外，如由Wakao等(2011、上述)报告，在从骨髓、皮肤等培养间充质细胞，以其作为Muse细胞的母集团使用时，得知SSEA-3阳性细胞的全部是CD105阳性细胞。从而，在本发明中的细胞制剂中，在从生物体的间充质组织或培养间充质干细胞分离Muse细胞时，可简单以SSEA-3作为抗原标志物纯化Muse细胞使用。再者，在本说明书中，以可在用于治疗骨软骨损伤(含后遗症)的细胞制剂中使用的SSEA-3作为抗原标志物，有时将从生物体的间充质组织或培养间充质组织分离的多能性干细胞(Muse细胞)或含Muse细胞的细胞集团简单记作“SSEA-3阳性细胞”。另外，在本说明书中，“非Muse细胞”是指生物体的间充质组织或培养间充质组织中所含的细胞，是指“SSEA-3阳性细胞”以外的细胞。

简言之，Muse细胞或含Muse细胞的细胞集团可单独使用对于作为细胞表面标志物的SSEA-3的抗体，或者使用对于SSEA-3及CD105的各自的抗体两方，从生物体组织(例如，间充质组织)分离。其中，“生物体”是指哺乳动物的生物体。在本发明中，在生物体中，不含发生阶段在受精卵或囊胚期之前的胚包括含胎儿或囊胚的囊胚期往后的发生阶段的胚。在哺乳动物中，虽不限定，可举出人、猴等的灵长类、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等的啮齿类、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、雪貂等。在本发明的细胞制剂中使用的Muse细胞在从生物体的组织直接用标志物而分离的点，与胚胎干细胞(ES细胞)或iPS细胞明确地区别。另外，“间充质组织”是指存在于骨、滑膜、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、腱、齿髓、脐带、脐带血等的组织及各种器官的组织。例如，Muse细胞可从骨髓或皮肤、脂肪组织得到。例如，优选采集生物体的间充质组织，从此组织分离Muse细胞而利用。另外，也可使用上述分离手段而从成纤维细胞或骨髓间充质干细胞等的培养间充质细胞分离Muse细胞。再者，在本发明的细胞制剂中，使用的Muse细胞可为对于受细胞移植的受者是自身的，或者也可为异体的。

如上所述，已知Muse细胞或含Muse细胞的细胞集团，例如，可以SSEA-3阳性、及SSEA-3和CD105的双阳性作为指标而从生物体组织分离，在人成人皮肤中，含各种类型的干细胞及前体细胞。但是，Muse细胞与这些细胞不相同。在这样的干细胞及前体细胞中，可举出皮肤来源前体细胞(SKP)、神经嵴干细胞(NCSC)、成黑色素细胞(MB)、血管周围细胞(PC)、内皮前体细胞(EP)、脂肪来源干细胞(ADSC)。以这些细胞中固有的标志物的“非表达”作为指标，可对Muse细胞进行分离。更具体而言，Muse细胞可将选自CD34(EP及ADSC的标志物)、CD117(c-kit)(MB的标志物)、CD146(PC及ADSC的标志物)、CD271(NGFR)(NCSC的标志物)、NG2(PC的标志物)、vWF因子(冯·威利布兰德因子)(EP的标志物)、Sox10(NCSC的标志物)、Snai1(SKP的标志物)、Slug(SKP的标志物)、Tyrp1(MB的标志物)、及Dct(MB的标志物)的11个标志物之中至少1个、例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个标志物的非表达作为指标进行分离。例如，虽不限定，可将CD117及CD146的非表达作为指标进行分离，再者，可将CD117、CD146、NG2、CD34、vWF及CD271的非表达作为指标进行分离，再者，可将上述的11个标志物的非表达作为指标进行分离。

另外，在本发明的细胞制剂中使用的有上述特征的Muse细胞也可有选自以下的至少1个性质：

(i)端粒末端转移酶活性低或无；

(ii)具有分化为三胚层之任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；及

(iv)具有自我更新能力。

在本发明的一方面，在本发明的细胞制剂中使用的Muse细胞有全部上述性质。其中，对于上述(i)，“端粒末端转移酶活性低或无”是指在例如，使用TRAPEZE XL telomerasedetection kit(Millipore公司)而检测端粒末端转移酶活性时，低或无法检测。端粒末端转移酶活性“低”是指例如，与作为体细胞的人成纤维细胞有同程度的端粒末端转移酶活性，或者与Hela细胞比有1/5以下，优选1/10以下的端粒末端转移酶活性。对于上述(ii)，Muse细胞有在体外及体内分化为三胚层(内胚层系、中胚层系、及外胚层系)的能力，例如，通过在体外诱导培养，可分化为肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。另外，在体内移植到精巢时，也有显示分化为三胚层的能力的情况。再者，通过由静脉注射移植到生物体而向受损伤的器官(心脏、皮肤、脊髓、肝、肌肉等)游走及植活，有分化为对应于组织的细胞的能力。对于上述(iii)，Muse细胞有在悬浮培养中以增殖速度约1.3天增殖，在悬浮培养中从1细胞增殖，制作胚样体样细胞块，在14天左右停止增殖这样的性质，对这些胚样体样细胞块进行接附培养，则再开始细胞增殖，从细胞块增殖的细胞扩大。在再移植到精巢时，有至少半年间不癌化这样的性质。另外，对于上述(iv)，Muse细胞有自我更新(自身复制)能力。其中，“自我更新”是指通过从1个Muse细胞通过悬浮培养来培养可确认到从得到的胚样体样细胞块中所含的细胞向3胚层性的细胞的分化的同时，通过再对胚样体样细胞块的细胞以1细胞进行悬浮培养，可使以下的世代的胚样体样细胞块形成，从此再次确认到3胚层性的分化和在悬浮培养中的胚样体样细胞块。自我更新也可重复1次或多次的循环。

另外，在本发明的细胞制剂中使用的含Muse细胞的细胞级分也可为由包括向外部应激刺激给生物体的间充质组织或培养间充质细胞，杀灭对于该外部应激抗性的细胞以外的细胞，回收残存的细胞的方法得到的，有以下的性质的至少1个，优选全部的，SSEA-3阳性及CD105阳性的多能性干细胞被浓缩的细胞级分。

(i)SSEA-3阳性；

(ii)CD105阳性；

(iii)端粒末端转移酶活性低或无；

(iv)具有分化为三胚层的能力；

(v)不显示肿瘤性增殖；及

(vi)具有自我更新能力。

上述外部应激也可为蛋白酶处理、以低氧浓度的培养、在低磷酸条件下的培养、在低血清浓度的培养、在低营养条件下的培养、在暴露在热休克下的培养、在低温的培养、在冷冻处理、有害物质存在下的培养、在活性氧存在下的培养、在机械的刺激下的培养、在振荡处理下的培养、在压力处理下的培养或物理的冲击之任一者或多个组合。例如，由上述蛋白酶的处理时间，为了向细胞给外部应激，优选进行合计0.5～36小时。另外，蛋白酶浓度只要是在剥接附在培养容器的细胞之时，使细胞块分散为单细胞之时，或者从组织回收单细胞之时使用的浓度即可。蛋白酶优选为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或N末端苏氨酸蛋白酶。再者，上述蛋白酶优选为胰蛋白酶、胶原酶或分散酶。

【(2)细胞制剂的调制及使用】

本发明的细胞制剂不限定，通过将上述(1)中得到的Muse细胞或含Muse细胞的细胞集团悬浮于生理盐水或适合的缓冲液(例如，磷酸缓冲生理盐水)而得到。此时，在从自身或异体的组织分离的Muse细胞数少的情况中，也可在细胞移植前培养细胞而增殖至得到指定的细胞浓度。再者，如已经报告(国际公开第WO2011/007900号单行本)，Muse细胞由于无肿瘤化，即使以未分化的状态含从生物体组织回收的细胞，癌化的可能性也低且安全。另外，回收的Muse细胞的培养不特别限定，可在通常的增殖培养基(例如，含10％仔牛血清的α-最少必须培养基(α-MEM))中进行。更具体而言，可参照上述国际公开第WO2011/007900号单行本，在Muse细胞的培养及增殖中，适宜选择培养基、添加物(例如，抗生物质、血清)等，调制含指定浓度的Muse细胞的溶液。在向人对象施用本发明的细胞制剂时，可从人的肠骨采集数ml程度的骨髓液，例如，作为自骨髓液的接附细胞，培养骨髓间充质干细胞而增加至达可分离有效的治疗量的Muse细胞的细胞量之后，将Muse细胞以SSEA-3的抗原标志物作为指标分离，以自身或异体的Muse细胞作为细胞制剂调制。或者，例如，可将Muse细胞以SSEA-3的抗原标志物作为指标分离后，培养细胞至达有效的治疗量而增加之后，以自身或异体的Muse细胞作为细胞制剂调制。

另外，在向Muse细胞的细胞制剂的使用中，也可为了保护该细胞而使细胞制剂含有二甲基亚砜(DMSO)或血清白蛋白等，为了防细菌的混入及增殖而使细胞制剂含有抗生物质等。再者，也可使细胞制剂含有制剂上容许的其他成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)或间充质干细胞中所含的Muse细胞以外的细胞或成分。本领域技术人员可向细胞制剂以适合的浓度添加这些因子及药剂。这样，Muse细胞作为含各种添加物的医药组合物使用也是可能的。

在上述调制的细胞制剂中所含有的Muse细胞数可以得到骨软骨损伤中的期望的效果(例如，与骨－软骨的再生、骨软骨损伤关联的各种疾病的消失等)的方式考虑对象的性别、年龄、体重、患部的状态、使用的细胞的状态等而适宜调整。在后述的实施例中，对于使大腿骨的一部分缺损的大鼠骨软骨缺损模型而探讨由Muse细胞移植导致的各种效果。对于约200～300g的大鼠，通过将SSEA3阳性细胞以5×10⁴个细胞/头关节内施用，得到了非常地优良的效果。从结果期待，通过施用对每哺乳动物一个体1.6～2.5×10⁵个细胞/kg进行体重换算的细胞量而得到优良的效果。再者，作为对象的个体含大鼠、人，但不限于此。另外，本发明的细胞制剂也可多次(例如，2～10次)、适宜、间隔(例如，1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次、1个月1次、2个月1次、3个月1次、6个月1次)施用至得到期望的治疗效果。从而，虽然也取决于对象的状态，但作为治疗上有效量，例如，优选以每一个体1×10³个细胞～2×10⁷个细胞1～10次的施用量。作为一个体中的施用总量，不限定，可举出1×10³个细胞～2×10⁸个细胞、1×10⁴个细胞～1×10⁸个细胞、2×10⁴个细胞～5×10⁷个细胞、5×10⁴个细胞～2×10⁷个细胞、1×10⁵个细胞～1×10⁷个细胞等。另外，本发明的细胞制剂不特别限定，可直接施用到骨软骨损伤部位(例如，关节、大腿骨等)，另外，也可在静脉内施用。

【3.大鼠骨软骨缺损模型的制作】

在本说明书中，为了探讨由本发明的细胞制剂的骨软骨损伤的治疗效果，可构建大鼠骨软骨缺损模型而使用。在作为该模型使用的大鼠中，不限定，一般而言，可举出免疫缺陷大鼠(例如，F344/NJcl-rnu/rnu)、Wistar系大鼠、Sprague-Dawley(SD)系大鼠。在后述的实施例中，使用在大鼠的大腿骨由有直径1mm的球形的尖端的金属钻使骨软骨缺损的大鼠模型。由于本发明的细胞制剂是人来源的Muse细胞，处于与施用该制剂的大鼠异种的关系。通常，在向模型动物施用异种的细胞等的实验中，为了抑制异种细胞的生物在体内排斥反应，在异种细胞的施用前或同时施用免疫抑制剂(环孢菌素等)。

【4.由Muse细胞的治疗效果】

在本发明的实施方式中，本发明的细胞制剂可使骨软骨损伤的患者的骨及软骨的功能恢复正常。在本说明书中使用之时，骨软骨功能的“恢复”是指伴随骨软骨损伤(含缺损)的各种功能障碍的治疗、修复及缓和，作为一例，是指缓和骨软骨损伤至不妨碍日常生活的程度。另外，“恢复”骨软骨的功能是指起因于骨软骨损伤的功能障碍改善、缓和、或者除去而回到骨软骨损伤前的状态。另外，在骨软骨功能的恢复的评价中，虽不限定，作为组织学评价，可一般使用由骨软骨组织的染色中使用番红O/固绿的Sellers的组织学评分来进行[8]。

根据以下的实施例，对本发明更具体性地进行说明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

【实施例】

关于本研究的动物实验的方法根据广岛大学动物实验的指南而实施。全部的流程由广岛大学大学院生物医学研究科实验动物科学研究设施委员会承认，使用。

【实施例1：细胞调制】

购入人骨髓MSC(hBMSC；Lonza、Basel、Switzerland)，将其在含10％牛胎儿血清(FBS)、0.1mg/ml卡那霉素、及1％Glutamax(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)的Eagle最小必须培养基(α-MEM)中，于37℃以5％CO₂培养。在hBMSC达90～100％汇合之后，使用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸以1:2的比传代培养。根据由Kuroda等的流程[5]。简言之，对应于SSEA-3的表达的有无，将hBMSC分离为Muse细胞(SSEA-3⁺)及非Muse细胞(SSEA-3^-)。将hBMSC与SSEA-3抗体(1:100；Merck Millipore、Darmstadt、Germany)一同温育，在抗体稀释液中由缀合别藻蓝素的抗大鼠IgM(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)检测，由作为Special Order Research Product的FACSAria II(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)筛选。

【实施例2：向骨软骨缺损部位的细胞注入】

本实施例在16只的10周龄的免疫缺陷大鼠(32个膝)(F344/NJcl-rnu/rnu)中进行。使用有直径1mm的球形的尖端的市售的金属钻而在大腿骨的膝盖骨沟内制作(直径2mm、深度2mm)左右的骨软骨缺损。将膝关节闭合之后，立即将大鼠的膝不均一地分布于3组(表1)：对照组-PBS注射；非Muse组-非Muse细胞的关节内注射(5×10⁴)；Muse组-Muse细胞的关节内注射(5×10⁴)。将细胞悬浮于50μl的PBS。

【表1】表1.每个在2个不同的时间点(4周及12周)的组的大鼠的膝的数的分布

时间点	对照组	非Muse组	Muse组	合计
					4周	5	6	5	16
12周	4	6	6	16
					合计	9	12	11	32

【实施例3：肉眼的及组织学的评价法】

(1)肉眼的评价法

在处置后的4周及12周，在腹腔内注射致死量的戊巴比妥钠而处死大鼠。使用由Wayne等[6][7]的肉眼的评分系统而肉眼评价大腿颗。“14”是最良，“0”是最差(表2)。

【表2.肉眼的评分系统】

【表2-1】(I)被覆率

＞75％补充	4
		50～75％补充	3
25～50％补充	2
		＜25％补充	1
无补充	0

【表2-1】(II)新生软骨的颜色

正常	4
		25％黄色/茶色	3
25～50％黄色/茶色	2
		75％黄色/茶色	1
100％黄色/茶色	0

【表2-3】(III)损伤部边缘

不可视	4
		25％周边可视	3
50％周边可视	2
		75％周边可视	1
整体的周边可视	0

【表2-4】(IV)表面

平滑/正常水平	4
		平滑但有隆起	3
不规则25～50％	2
		不规则50～75％	1
不规则＞75％	0

(2)组织学的评价法

将修复组织在含多聚甲醛的磷酸缓冲溶液(4％)中固定1天，在10％的EDTA(Nacalai Tesque,Inc.、Kyoto、Japan)中脱灰4周之后，在石蜡块中包埋。将试样以矢状切断为5μm切片。为了组织学评价，将切片用番红O/固绿(Muto Pure Chemicals Co.Ltd.，Japan)染色，进行Sellers规格的组织学评分(表3)[8]。使用苏木精及伊红(H&E)染色而评价修复组织的细胞密度。

【表3.用于修复组织的组织学评价的Sellers规格】

【表3-1】(1)对于正常的邻接软骨的表面的损伤部的补充

111％～125％	1
		91％～110％	0
76％～90％	1
		51％～75％	2
26～50％	3
		＜25％	4

【表3-2】(2)修复组织和周围关节软骨的整合

正常的连续性和整合性	0
		细胞性的降低	1
单侧的缝隙或连续性的缺乏	2
		两侧的缝隙或连续性的缺乏	3

【表3-3】(3)由番红/O固绿的基质染色

正常	0
		略减少	1
中度减少	2
		实质上减少	3
无	4

【表3-4】(4)细胞形态(起初选择(a)～(d))

【表3-5】(5)全损伤内的结构(不含边缘)

正常	0
		1～3个小的空隙	1
1～3个大的空隙	2
		＞3个大的空隙	3
裂缝或纤维化	4

【表3-6】(6)表面的结构

正常	0
		略微的纤维化或不规则	1
中度的纤维化或不规则	2
		重度的纤维化或崩解	3

【表3-7】(7)新生软骨下骨的比例

90％～100％	0
		75％～89％	1
50％～74％	2
		25％～49％	3
＜25％	4

【表3-8】(8)钙化前线的形成

完全	0
		75％～99％	1
50％～74％	2
		25％～49％	3
＜25％	4

【实施例4：免疫染色】

在处理后的4周及12周，将切片用抗原回收试剂(Immunoactive、Matsunami GlassInd.、Osaka、Japan)预处理，为了阻断内源性过氧化物酶活性，浸渍到0.3％的H₂O₂中。将切片用封闭溶液(Protein Block Serum-Free；Dako、Carpinteria、CA)封闭，与针对I型胶原(1:250、Daiichi Fine Chemical、Toyama、Japan)及II型胶原(1:250、Daiichi FineChemical)的小鼠单克隆抗体一同温育。用于可视化的反应使用亲和素-生物素过氧化物酶系(Vectastain Elite ABC试剂盒；Vector Laboratories,Inc.、Burlingame、CA)来进行，使用3,3’-二氨基联苯胺(Peroxidase Substrate试剂盒、Vector Laboratories,Inc.)而使切片着色。

【实施例5：各种实验的结果】

(1)肉眼的所见

在4周在对照及非Muse组的膝盖沟中容易地鉴定损伤部边缘，检测不到修复组织。另外，在4周及12周，与Muse组及非Muse组比较，在对照组中，伴随邻接的软骨的变性的变形性关节症变化增加。在12周，在非Muse组中，损伤部的深度充满褐色组织，减少。一方面，在Muse组中，用白色组织完全地被覆损伤部，这对应于周围组织，平滑，有均质的表面，明确地确定损伤部边缘是困难的(图1)。在肉眼的评分中，在处置后的4周在3组间无显著差异，但以对照、非Muse组、Muse组的顺序见到改善倾向(对照组：0.8±0.4；非Muse组：1.3±0.5、Muse组：1.8±0.8)。但是，Muse组的肉眼的结果当由缺陷部的补充测定时，在处置后，在12周比其他组的结果显著地良好(对照组：0.5±0.6、非Muse组：1.5±0.5、Muse组：10.0±1.5)(图2)。各参数的肉眼的评分示于表4。

【表4.肉眼的评分】

【表4-1】被覆率

【表4-2】新颖软骨的颜色

【表4-3】损伤部边缘

【表4-4】表面

*与对照比较而显著地良好(p＜0.05)

(2)组织学见解及评分

在4周及12周，在对照组及非Muse组的处死时，纤维组织是少量，但在损伤部位见不到修复组织。在4周的Muse组中，无软骨的取代，见到伴随软骨下骨的修复的损伤的部分的修复。另外，在12周的Muse组中，确认到软骨损伤的修复，伴随软骨下骨的完全修复，由纤维组织覆盖，除了整合之外，还观察到骨软骨接合(图3A)。在4周及12周，各自，基于Sellers规格而记录以下的结果：对照组(4周：26.2±1.6；12周：27.8±1.5)、非Muse组(4周：27.2±1.2；12周：25±0.6)、及Muse组(4周：17.4±0.6；12周：11.8±2.0)。非Muse组在处置后的12周，显示比对照组显著地良好的结果。再者，Muse组的评分在处置后的4周和12周的两方比其他组显著地良好(图4)。各参数的Sellers评分示于表5。另外，在12周的H&E染色与其他组比较而显示Muse组的修复组织的细胞密度高(图3B、C)。

【表5.Sellers评分】

【表5-1】对于正常的邻接软骨的表面的缺陷的补充

【表5-2】修复组织和周围关节软骨的整合

【表5-3】由番红O-固绿的基质染色

【表5-4】细胞形态(起初选择(a)～(d))

【表5-5】全损伤内的结构(不含边缘)

【表5-6】表面的结构

【表5-7】新生软骨下骨的比例

【表5-8】钙化前线的形成

*与对照比较而显著地良好(p＜0.05)

Muse细胞的关节内注射是修复骨软骨损伤、特别是由纤维组织覆盖的软骨下骨的有希望的方法。

【参考文献】

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[2]M.Brittberg,A.Lindahl,A.Nilsson,C.Ohlsson,O.Isaksson,andL.Peterson,Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologouschondrocyte transplantation.N Engl J Med,vol.331,no.14,pp.889-895,1994。

[3]M.Ochi,Y.Uchio,K.Kawasaki,S.Wakitani,and J.Iwasa,Transplantationof cartilage-like tissue made by tissue engineering in the treatment ofcartilage defects of the knee.J Bone Joint Surg Br,vol.84,no.4,pp.571-578,2002。

[4]K.Tamai,T.Yamazaki,T.Chino,et al.,PDGFRα-positive cells in bonemarrow are mobilized by high mobility group box 1(HMGB1)to regenerate injuredepithelia.Proc Natl Acad Sci U S A,vol.108,no.16,pp.6609-6614,2011。

[5]Y.Kuroda,S.Wakao,M.Kitada,T.Murakami,M.Nojima,and M.Dezawa,Isolation,culture and evaluation of multilineage-differentiating stress-enduring(Muse)cells.Nat Protoc,vol.8,no.7,pp.1391-1415,2013。

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[8]R.S.Sellers,D.Peluso,and E.A.Morris,The effect of recombinanthuman bone morphogenetic protein-2(rhBMP-2)on the healing of full-thicknessdefects of articular cartilage.J Bone Joint Surg Am,vol.79,no.10,pp.1452-1463,1997。

Claims (9)

1.用于治疗或修复骨软骨损伤的细胞制剂，其含从生物体的间充质组织或培养间充质细胞分离的SSEA-3阳性的多能性干细胞。

2.权利要求1所述的细胞制剂，其含由外部应激刺激浓缩SSEA-3阳性的多能性干细胞的细胞级分。

3.权利要求1或2所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是CD105阳性。

4.权利要求1～3之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是CD117阴性及CD146阴性。

5.权利要求1～4之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性、及CD271阴性。

6.权利要求1～5之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性、及Dct阴性。

7.权利要求1～6之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是有以下的性质的全部的多能性干细胞：

(i)端粒末端转移酶活性低或无；

(ii)具有分化为三胚层之任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；及

(iv)具有自我更新能力。

8.权利要求1～7之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞有在骨软骨损伤部位蓄积的能力。

9.权利要求1～8之任一项所述的细胞制剂，其中所述多能性干细胞有分化为软骨细胞的能力。

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