CN113604432A - 体外增殖自然杀伤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种体外增殖自然杀伤细胞的方法，由周边血液单核细胞中培养并增殖自然杀伤细胞，包括使用微量白介素‑2促进细胞增殖并活化自然杀伤细胞，该方法可明显提高细胞生长倍数及自然杀伤细胞所占比例，并且所得到的自然杀伤细胞可用于制备肿瘤疫苗等医药组成物。
Description
【技术领域】
本发明是关于一种体外增殖自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)的方法，特别是一种使用低浓度白介素-2的自然杀伤细胞增殖方法。
【先前技术】
癌症是有关细胞异常增生的复杂疾病。癌细胞与正常细胞有许多不同之处，包含：(1)细胞讯息传递：相较于正常细胞，癌细胞对于调控细胞生长或死亡的讯息较不具反应性；(2)侵犯能力：有些癌细胞会表现较少量的细胞黏附分子，因此较不受限制，可通过血液或淋巴系统轻易转移或扩散至身体其他部位；(3)细胞特化：相较于正常细胞，癌细胞为未特化或分化程度较低的细胞；及(4)免疫抑制：癌细胞可通过活化免疫抑制细胞及/或刺激免疫抑制因子的表现来抑制免疫反应。
常见的抗癌疗法包含外科手术、放射治疗及化学治疗。然而，除了抑制肿瘤生长，该些治疗方法往往伴随着伤害或毒杀正常组织的风险。此外，用于毒杀癌细胞而不产生副作用的替代性疗法尚在研究及临床前试验阶段，其中免疫治疗是最具潜力的治疗策略之一，其通过活化肿瘤专一性免疫细胞(例如T细胞、B细胞、树突细胞、自然杀伤细胞及自然杀伤T细胞)及/或刺激抗肿瘤因子的表现/释放来达到清除肿瘤的目的。该些经活化的免疫细胞可通过辨识和结合至过量或仅表现于癌细胞的肿瘤相关抗原，而专一地目标癌细胞。特别的是，自然杀伤细胞表面缺乏专一性抗原受体，因此其引发的免疫反应为非专一性防御。自然杀伤细胞位于周边血液中，可攻击肿瘤细胞及受病毒感染的细胞，当自然杀伤细胞与这些异质细胞接触后，即驱动其活化受体而活化其自身，并释出穿孔素及颗粒溶解酶等因子；穿孔素将在目标异质细胞膜形成孔洞，接着颗粒溶解酶进入该目标异质细胞后，改变粒线体膜的通透性，并活化细胞凋亡相关的蛋白质以启动细胞凋亡反应。
利用自然杀伤细胞治疗癌症有各种优势：(1)可毒杀癌细胞，抑制肿瘤的生长及扩散；(2)抑制肿瘤附近新血管的增生，限制肿瘤取得所需养分，进而限制肿瘤生长；(3)直接改善并调节患者的免疫力及神经系统；(4)副作用低或几乎无副作用。研究指出，自然杀伤细胞的毒杀范围除了黑色素瘤、头颈癌，还包括肺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、胰脏癌、食道癌、乳癌及许多合并的癌症，尤其对肺、淋巴组织、食道、乳房、肝等血流旺盛且血管较密集部位的癌症较有效。
然而，自然杀伤细胞仅占人体周边血液中淋巴细胞的5％至10％，因此于体外高效率扩增自然杀伤细胞是一重大课题，目前研究者仍极力于提升自然杀伤细胞的体外扩增效率、其细胞存活率、细胞纯度及细胞毒杀活性，进而提升其于医疗上的应用性。
【发明内容】
有鉴于此，发明人致力于研究如何提升体外增殖自然杀伤细胞的效率。白介素-2、白介素-12、白介素-15、白介素-18及白介素-21等具有刺激自然杀伤细胞增殖并活化自然杀伤细胞的作用，目前已应用于自然杀伤细胞体外增殖技术，发明人从中进一步探讨较有效增进自然杀伤细胞增殖的选项及其条件，因而研发出本发明之方法。
本发明提供一种体外增殖周边血液单核细胞中自然杀伤细胞的方法，包括下列步骤：(a)取得一个体的一周边血液样本；(b)由该周边血液样本取得一血浆及一周边血液单核细胞；(c)使用一第一培养基将该周边血液单核细胞的浓度调整为第一浓度后接种并培养5天，其中该第一培养基包含该个体的一血浆；(d)去除上一步骤的培养基，使用一第二培养基将该周边血液单核细胞的浓度调整为该第一浓度后接种并培养2天，其中，该第二培养基包含该血浆及一白介素-2，该白介素-2的浓度为0.3μg/mL至0.5μg/mL；及(e)重复步骤(d)约2至5次，直至该周边血液单核细胞增殖至所需数量。
在一较佳实施例，该个体是人类。
在一较佳实施例，该个体是健康个体或肿瘤患者。
在一较佳实施例，该血浆在使用前经灭活。
在一较佳实施例，该第一浓度为1x106细胞/mL。
在一较佳实施例，该白介素-2的浓度为0.368μg/mL。
在一较佳实施例，步骤(d)是接种于一细胞培养袋或一培养皿。
在一较佳实施例，经步骤(e)增殖的该周边血液单核细胞中，该自然杀伤细胞的数量占61.2％或以上。
在一较佳实施例，由该方法得到的该自然杀伤细胞在细胞培养第10至14天可用于制备一医药组成物。
相较于习知技术，本发明使用浓度低约500倍的白介素-2于自然杀伤细胞增殖，可明显提高细胞生长倍数及自然杀伤细胞在周边血液单核细胞中所占比例，即，本发明大幅减少白介素-2用量，不仅降低体外培养的成本外，且可于较短的时间内获得更理想的细胞增殖效果，有利于改善自然杀伤细胞在医疗上的应用。
【实施方式】
本领域技术人员通过以下叙述可轻易明了此发明之必要技术，且只要不违反其中的精神及范围，即可多样地改变及修饰此发明来适应不同用途及状况。如此，其他的实施例也包含于申请专利范围中。
本文中术语“一”及“一种”代表于本文中的语法对象有一个或多于一个(即至少一个)。
本文中字词“包括”、“包含”、“具有”或“含有”是包含性或开放性，并不排除其他未阐述之元素或方法步骤。
本发明提供一种体外增殖周边血液单核细胞中自然杀伤细胞的方法，包括下列步骤：(a)取得一个体的一周边血液样本；(b)由该周边血液样本取得一血浆及一周边血液单核细胞；(c)使用一第一培养基将该周边血液单核细胞之浓度调整为一第一浓度后接种并培养5天，其中该第一培养基包含该个体之一血浆；(d)去除上一步骤的培养基，使用一第二培养基将该周边血液单核细胞的浓度调整为该第一浓度后接种并培养2天，其中，该第二培养基包含该血浆及一白介素-2，该白介素-2的浓度为0.3μg/mL至0.5μg/mL；及(e)重复步骤(d)约2至5次，直至该周边血液单核细胞增殖至所需数量。本文所称之“白介素-2之浓度”是指在培养基的总体积中，所含的白介素-2的量而换算出的浓度。
所述个体是哺乳类，哺乳动物包括(但不限于)鼠科、啮齿类、猿猴、人类、农用动物和宠物。在一较佳实施例，该个体是人类。
所述个体可为健康个体或肿瘤患者。在一较佳实施例，该个体是健康个体，以确保自然杀伤细胞的质量及活性处于健康有效的状态。
所述血浆于使用前经灭活，以免妨碍该周边血液单核细胞增殖。该血浆是该个体的自体血浆，对于自然杀伤细胞肿瘤治疗方案较具安全性。
所述第一培养基及第二培养基分别为NKCC-1培养基及NKCC-2培养基(取自人类NK细胞培养试剂盒(KBM NK Kit)，捷升生物科技有限公司)，然而，也可使用本领域技术人员所知任何适用的培养基或培养套组，本发明不予限制，在此先行叙明。
在一实施例，步骤(d)是接种于一细胞培养角瓶。在一更佳实施例，步骤(d)是接种于一细胞培养袋或一培养皿。
所述第一浓度可为2x105细胞/mL至1.5x106细胞/mL，例如但不限于2x105细胞/mL、2.5x105细胞/mL、3x105细胞/mL、3.5x105细胞/mL、4x105细胞/mL、4.5x105细胞/mL、5x105细胞/mL、5.5x105细胞/mL、6x105细胞/mL、6.5x105细胞/mL、7x105细胞/mL、7.5x105细胞/mL、8x105细胞/mL、8.5x105细胞/mL、9x105细胞/mL、9.5x105细胞/mL、1x106细胞/mL或1.5x106细胞/mL。在一较佳实施例，该第一浓度为1x106细胞/mL。
所述白介素-2的浓度为0.3μg/mL至0.5μg/mL，例如但不限于0.3μg/mL、0.31μg/mL、0.32μg/mL、0.33μg/mL、0.34μg/mL、0.35μg/mL、0.36μg/mL、0.37μg/mL、0.38μg/mL、0.39μg/mL、0.4μg/mL、0.41μg/mL、0.42μg/mL、0.43μg/mL、0.44μg/mL、0.45μg/mL、0.46μg/mL、0.47μg/mL、0.48μg/mL、0.49μg/mL或0.5μg/mL。在一较佳实施例，该白介素-2的浓度为0.368μg/mL。
由该方法得到的自然杀伤细胞，在细胞培养第10至14天，不仅达到所需数量或称有效量，并且据发明人观察，此时自然杀伤细胞处于最佳状态，因此，可用于制备医药组成物。例如，该自然杀伤细胞可连同适当体积的该血清及生理食盐水，用于制备肿瘤疫苗等医药组成物，透过静脉注射等方式回输至该个体体内。该自然杀伤细胞也可与其他癌症治疗手段(如手术、放射治疗、细胞毒性药物)联合给药或应用。依照物种、年龄和患者的一般症状、所欲治疗症状的严重度以及相关的特定给药模式等等，所需确切的自然杀伤细胞有效量在患者间各不相同。就任何个别的案例，适当的「有效」量可由熟知本项技术的普通技术人员使用例行的实验来决定。
[实施例]
样本来源：
周边血液来自7名健康献血者，献血者经临床诊断无血液系统恶性肿瘤和严重自身免疫性疾病。发明人获得研究伦理委员会同意，同时与所有献血者签署知情书。
以下为体外增殖周边血液单核细胞中自然杀伤细胞的示例步骤：
(1)由该7名献血者分别取得100mL周边血液，分别为7组(实施例一至三及比较例一至四)进行细胞增殖。
(2)采血后2小时内以离心力1800rpm将周边血液离心10分钟。离心后，上层为血浆，中间层为单核细胞。将血浆灭活并保存于-20℃以备使用。使用人类NK细胞培养试剂盒(KBM NK Kit)，将其中的NKCC-c取1mL加入13mL的杜氏磷酸盐缓冲液DPBS(不含钙镁)中，将此14mL的涂布液加入培养皿中，摇晃使其分布均匀，并将培养皿静置于37℃4小时后，移除该涂布液并用DPBS(不含钙镁)洗涤两次备用。
(3)通过密度梯度离心分离出上述中间层的单核细胞，以缓冲溶液清洗二次后使用台盼蓝/死细胞染色剂(Trypan Blue)计算细胞数量，接着以NKCC-1培养基(经加入10％献血者的自体血浆，该血浆经灭活)将细胞浓度调整至1x106细胞/mL后接种于经涂布后的培养皿，静置于37℃、5％CO2培养箱中培养5天。
(4)取样计算细胞数量后以1200rpm离心5分钟，去除上清液(旧培养基)，以NKCC-2培养基(经加入白介素-2、灭活的自体血浆)将细胞浓度调整至1x106细胞/mL后接种，于37℃、5％CO2培养2天。其中，实施例一至三的培养基所含白介素-2浓度为0.368μg/mL；比较例一至四的培养基所含白介素-2浓度为200μg/mL，此为熟知体外增殖技术常采用的浓度。
(5)重复步骤(4)数次，直至细胞培养总天数达14天。利用流式细胞仪进行细胞表面抗原分析，检测NK细胞(CD3-/CD56+)之数量，比较细胞培养结果如表1。
表1
如表1所示，使用0.368μg/mL白介素-2的实施例一至三，经14天增殖后，细胞生长倍数达到40倍以上，实施例三甚至高达74倍；而使用200μg/mL白介素-2的比较例一至四，其细胞生长倍数皆低于16倍，与实施例有明显落差。此外，增殖后自然杀伤细胞在周边血液单核细胞中所占比例，实施例一至三为61.20％以上，而比较例一至四仅有27.50％以下。可见，实施例所用白介素-2浓度较比较例低五百多倍，但显然更有利于细胞增殖。
综上所述，相较于习知技术，本发明使用浓度低约500倍的白介素-2于自然杀伤细胞增殖，可明显提高细胞生长倍数及自然杀伤细胞在周边血液单核细胞中所占比例，即，本发明大幅减少白介素-2用量，反而获得更理想的细胞增殖效果，有利于改善自然杀伤细胞在医疗上的应用。
以上已将本发明做一详细说明，但以上所述者，仅是本发明之一较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施之范围，即凡一本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应仍属本发明之专利涵盖范围内。
Claims (9)
1.一种体外增殖周边血液单核细胞中自然杀伤细胞的方法，包括下列步骤：
(a)取得一个体的一周边血液样本；
(b)由所述周边血液样本取得一血浆及一周边血液单核细胞；
(c)使用第一培养基将所述周边血液单核细胞的浓度调整为第一浓度后接种并培养5天，其中所述第一培养基包含所述个体的一血浆；
(d)去除上一步骤的培养基，使用第二培养基将所述周边血液单核细胞的浓度调整为所述第一浓度后接种并培养2天，其中，所述第二培养基包含所述血浆及白介素-2，所述白介素-2的浓度为0.3μg/mL至0.5μg/mL；及
(e)重复步骤(d)约2至5次，直至所述周边血液单核细胞增殖至所需数量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述个体是人类。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述个体是健康个体或肿瘤患者。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述血浆在使用前经灭活。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一浓度为1x106细胞/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述白介素-2的浓度为0.368μg/mL。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)是接种于一细胞培养袋或一培养皿。
8.如权利要求1所述的方法，其中经步骤(e)增殖的所述周边血液单核细胞中，所述自然杀伤细胞的数量占61.2％或以上。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其中，由所述方法得到的所述自然杀伤细胞在细胞培养第10至14天可用于制备一医药组成物。
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