KR20140120508A - Ｓｔａｔ３ 저해활성을 갖는 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

Ｓｔａｔ３ 저해활성을 갖는 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 STAT3 저해활성을 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물, 그리고 이들의 약제학적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 다양한 질환과 관련된 STAT3의 비정상적인 활성을 효율적으로 저해시키므로 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 등과 관련된 다양한 STAT3 관련 질환에 대한 예방 및 치료 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＳＴＡＴ３ 저해활성을 갖는 화합물 및 이의 용도{Compounds selectively targeting STAT3 and Uses thereof}
본 발명은 STAT3 저해활성을 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물, 그리고 이들의 약제학적 용도에 관한 것이다.
종전 연구에서, 본 발명자들은 전사신호전달 및 활성인자 3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3; STAT3)이 저산소 유도인자-1alpha (Hypoxia Inducible Factor-1alpha; HIF-1alpha) 단백질의 안정성에 중요한 역할을 하고, 인간 신장암 세포의 HIF-1alpha와 상호작용함으로써 혈관 내피 성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)의 HIF-1-매개 발현을 개선시킨다는 사실을 확인하였다(Jung JE, et al. FASEB J. 19, 1296-1298(2005)). 또한, 카페인산 유도체가 STAT3의 티로신-705의 활성을 억제함으로써 VEGF 유전자의 발현을 효과적으로 억제함을 보여주었다(Jung JE, et al. Carcinogenesis. 28, 1780-1787(2007)). 뿐만 아니라, 세포분열 및 세포증식을 조절하는 것으로 알려져 있는 사이클린 D1(cyclin D1)의 전사활성이 STAT3 티로신-705의 활성에 의존적으로 조절됨을 보여주었다(Won C, et al. Anticancer Res. 30, 481-488(2010)). 상기 사실은 STAT3가 고형암 세포에서 저산소-매개 VEGF 발현을 조절함으로써 암세포의 증식에 필수적인 혈관신생의 중요한 상향 조절자임을 입증하며, 암세포의 세포주기를 조절함으로써 암세포의 분열과 증식에 관여함을 입증한다.
STATs은 수용체 타이로신 카이네이즈(receptor tyrosine kinase)의 일종인 JAK(Januse Kinase), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor), 그리고 PDGFR (Platelet-derived Growth Factor Receptor) 등에 의하여 인산화됨으로써 활성화되는 전사인자이다(Darnell JE Jr. Science. 277, 1630-1635(1997)). 인산화에 의하여 활성화된 STATs는 이합체(dimer)를 형성하고, 핵 내부로 이동하여 표적 유전자의 프로모터 부근에 결합함으로써 질환과 관련된 다양한 유전자의 전사를 유도하는 것으로 알려져 있다(Darnell JE Jr. Science. 277, 1630-1635(1997); Bromberg JF, et al. Cell. 98, 295-303(1999)). STATs 단백질 부류의 하나인 STAT3는 혈액암과 고형암을 포함하는 다양한 종류의 인간 종양에서 과도하게 활성화되어 있는 것으로 알려져 있으며(Bromberg JF, et al. Cell. 98, 295-303(1999)), 과도하게 활성화된 STAT3는 암세포의 생존, 증식 및 성장과 관련된 Bcl-XL, c-myc, 그리고 사이클린 D1 등과 같은 표적 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 변이된 세포의 암세포화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Vera J, et al. Prog Biophys Mol Biol. 106, 426-434(2011); Turkson J. Expert Opin Ther Targets. 8, 409-422(2004)). 또한, 최근의 보고들은 STAT3 억제제가 잠재적인 항암제로서의 가능성을 시사하고 있다(Duan H, et al. Oncogene. 27, 6720-6728(2008); Bai L, et al. Int J Cancer. 130, 2693-2702(2012); Kan CE, et al. Cancer Res. 71, 6930-6939(2011)).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환과 같은 STAT3의 과도한 발현 혹은 활성화와 관련된 질환의 예방 및 치료를 위하여, STAT3에 대한 선택적인 억제활성을 갖는 새로운 화합물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 3-페녹시메틸-1,2,4-옥사디아졸 또는 3-페녹시메틸-1,2,4-티아디아졸을 골격구조로 갖는 유도체들이 STAT3의 활성화 억제, 즉 인산화를 억제하여 caspase-3와 PARP를 활성화시키고 MMPs의 활성은 억제하며, Twist 유전자의 발현을 효과적으로 억제함으로써 STAT3에 의하여 초래되는 질환에 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 STAT3 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 STAT3 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 제공한다:
화학식 1
Figure pat00001
상기 화학식에서, R1은 수소; 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬; C1-C6 알콕시; C2-C6 알케닐옥시; C2-C6 알키닐옥시; C1-C6 알킬카복스아미드; 비치환되거나 할로겐, 아민 및
Figure pat00002
로 구성된 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 6각-10각 고리의 아릴 또는 헤테로아릴; 또는
Figure pat00003
로 치환된 C1-C6 알콕시이고; R2 내지 R6은 각각 서로 독립적으로 수소; 할로겐; 니트로; C1-C6 알킬; 또는
Figure pat00004
이며; A는 산소; 또는 황이다.
본 발명자들은 STAT3의 과도한 발현 혹은 활성화로 초래되는 암, 자가면역 질환 및 염증성 질환을 포함하는 다양한 질환의 예방 및 치료를 위하여, STAT3에 대한 선택적인 억제활성을 갖는 새로운 화합물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 3-페녹시메틸-1,2,4-옥사디아졸 또는 3-페녹시메틸-1,2,4-티아디아졸을 골격구조로 갖는 유도체들이 STAT3의 활성화 억제, 즉 인산화를 억제하여 caspase-3와 PARP의 활성화 및 MMPs의 활성을 억제하고, Twist 유전자의 발현을 효과적으로 억제함으로써 STAT3 관련 질환에 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, STAT3의 활성을 효율적으로 억제하는 본 발명의 물질은 암, 당뇨병성 망막증, 당뇨병, 자가면역질환 및 염증성 질환 등의 다양한 STAT3 관련 질환에 대한 효율적인 예방 및 치료제가 될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "알킬"은 직쇄 또는 측쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 이소부틸, n-부틸, t-부틸, 펜틸 및 헥실 등을 포함한다. C1-C6 알킬은 탄소수 1 내지 6의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1-C6 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 하나의 특정예에서, R1 위치의 C1-C6 알킬은 C1-C4 알킬이다.
본 명세서에서 사용된 용어,"할로겐"은 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.
본 명세서에서 용어, "알콕시"는 알코올에서 수소가 제거되어 형성된 라디칼을 의미하며, C1-C6 알콕시가 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 알콕시의 예는 다음을 포함한다: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시, tert-펜틸옥시, 헥실옥시 및 이소헥실옥시. 하나의 특정예에 따르면, 화학식 1에서 R1 위치의 C1-C6 알콕시는 C1-C4 알콕시이다.
본 명세서에서 용어, "알케닐옥시" 및 "알키닐옥시"는 각각 알케닐 및 알키닐 부분을 나타내고, 이는 산소원자를 통해 인접 원자에 공유결합된다.
본 명세서에 용어, "알킬카복스아미드"는 화학식 -C(O)-NH(알킬)의 그룹을 의미한다. 하나의 특정예에서, 알킬 그룹은 1 내지 6개의 탄소를 갖는다.
본 명세서에서 용어, "아릴"은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화되고 방향성(aromaticity)를 가지는 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "헤테로아릴"은 헤테로원자로서 고리 내에 산소, 황 또는 질소를 포함하는 헤테로사이클릭 방향족기를 의미한다. 일특정예에서 헤테로원자는 질소이다. 고리 내 헤테로원자의 개수는 1-4 또는 1-3이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 1 중 R1은 비치환되거나 할로겐으로 치환된 직쇄 또는 측쇄의 C1-C5 알킬; C1-C5 알콕시; 알릴옥시; 프로프-2-이닐옥시; 메틸카복스아미드; 할로겐, 아민 및
Figure pat00005
로 구성된 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 6각 고리의 아릴; 할로겐으로 치환된 10각 고리의 헤테로아릴; 또는
Figure pat00006
로 치환된 C1-C3 알콕시이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 1 중 R2 내지 R6은 수소 및 니트로이거나; 수소 및 할로겐이거나; 수소, 할로겐 및 C1-C3 알킬이거나; 수소, 할로겐 및
Figure pat00007
이거나;수소 및 C1-C3 알킬이다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 2 내지 15로 표시되는 화합물로부터 선택된다.
화학식 2
Figure pat00008
화학식 3
Figure pat00009
화학식 4
Figure pat00010
화학식 5
Figure pat00011
화학식 6
Figure pat00012
화학식 7
Figure pat00013
화학식 8
Figure pat00014
화학식 9
Figure pat00015
화학식 10
Figure pat00016
화학식 11
Figure pat00017
화학식 12
Figure pat00018
화학식 13
Figure pat00019
화학식 14
Figure pat00020
화학식 15
Figure pat00021
본 발명은 화학식 1의 화합물뿐만 아니라, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및 수화물도 포함한다.
본 명세서에서 용어, "약제학적으로 허용가능한 염"은, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약제학적 염은, 본 발명의 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 숙신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜, 암모니움 염, 나트륨 또는 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있다.
본 명세서에서 용어, "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미하고, 용어, "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 STAT3 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 STAT3 관련 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 용어 "치료"는 STAT3 관련 질환의 (i) 발전의 억제, (ii) 질환의 경감, 및 (iii) 질환의 제거를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "STAT3 관련 질환"은 그 발병, 진행, 예후 또는 치료 민감성에 있어서 STAT3의 과발현 및/또는 과활성화가 직간접적으로 영향을 미치는 질환을 의미한다. 상기 STAT3 관련 질환은 암, 당뇨병성 망막증, 당뇨병, 혈우병성 관절증, 아테롬성 동맥경화, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 자가면역 질환, 재발협착증, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관이식거부, 신사구체병증, 신경퇴행성 질환 및 염증성 질환을 포함한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 암은 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 백혈병, 림프종, 부신피질암, 부갑상선암, 요관암, 신경교종, 식도암, 소장암, 교모세포종, 뇌종양 및 신장암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 자가면역 질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판 감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염 (celiac sprue-dermatitis), 만성피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, 처그스트라우스 증후군(Churg-strauss syndrome), 반흥성 유천포창, 크레스트 증후군(CREST syndrome), 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성 복합 한냉 글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체 신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루프스, 메니어르병, 혼합성 연결조직질환, 다발성 경화증, 타입I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성빈혈, 결정성 다발동맥염, 바달연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성 근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마 글로불린혈증, 일차성 당증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증. 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루프스, 홍반성 루프스, 다가야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염(giant cell arteritis), 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 염증성 질환은 천식, 엔세필리티스(encephalitis), 염증성 장염, 류마티스 관절염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 아토피성 피부염, 건선, 폐혈병성 쇼크증, 페섬유증, 미분화 척추관절증, 크론씨병, 췌장염, 피부염, 미분화 관절병증, 관절염, 사구체신염, 기관지염, 염증성 골용해, 및 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성염증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 선택적으로 STAT3의 활성을 억제하며, 암세포의 전이를 억제한다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 caspase-3와 PARP의 활성화 및 MMPs의 활성 억제, 그리고 Twist 유전자의 발현을 효과적으로 억제하고, 따라서 인간 종양세포의 성장 및 전이를 효율적으로 억제한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화합물은 STAT3의 티로신 705 잔기와 세린 727 잔기의 인산화를 억제하여 STAT3의 신호전달 경로, STAT3 이합체의 핵으로의 이동을 억제하며, caspase-3와 PARP의 활성 억제에 의해 초래되는 암세포의 증식 및 암세포 사멸 억제 기전과 MMPs의 활성 억제와 Twist 유전자의 발현에 의해 유도되는 암세포의 이동 및 침윤과 종양의 성장 및 전이를 억제한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 STAT3 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 예를 들면, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 각 종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 STAT3 관련 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물(기능성 화장료 조성물)을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 유효성분 이외에 화장품 제조에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 STAT3 저해 활성을 갖는 신규한 화합물 및 이의 용도를 제공한다.
(ii) 본 발명의 화합물을 유효성분으로 하여 약제학적, 기능성 화장료(cosmeceutical), 화장료, 기능성 식품(neutraceutical) 또는 식품 조성물을 제조할 수 있다.
(iii) 본 발명의 화합물은 다양한 질환과 관련된 STAT3의 비정상적인 활성을 효율적으로 저해시키므로 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 등과 관련된 다양한 STAT3 관련 질환에 대한 예방 및 치료 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 ODZ17690 화합물이 STAT3에 대한 선택적인 활성을 가지고 있음을 보여주는, 초파리 및 인간 유래 암세포와 STAT3가 결합하는 SH2 도메인에 대한 결합-분자구조모델을 이용한 모형을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 ODZ17690 화합물이 인간 유래 호지킨 림프암 세포주(L540 세포)에서 선택적으로 STAT3의 활성을 억제하는 작용이 우수함을 보여준다.
도 3은 3-페녹시메틸-1,2,4-옥사디아졸 또는 3-페녹시메틸-1,2,4-티아디아졸을 골격구조로 갖는 144종의 물질 중에서 STAT3를 억제하는 활성이 우수한 것으로 나타난 13종의 물질을 나타낸다.
도 4는 STAT3가 결합하는 SH2 도메인에 대한 ODZ10117 화합물의 결합-분자구조모델과 인간 유래 다양한 종류의 암세포에서 STAT3를 억제하는 작용을 보여준다.
도 5는 인간 유래 교모세포종(U87-MG) 세포와 유방암 세포(MDA-MB-231)에서 ODZ10117 화합물이 STAT3의 활성을 억제하였음을 보여준다.
도 6은 ODZ10117 화합물이 U87-MG 세포와 MDA-MB-231 세포의 증식을 억제하고, 세포사멸을 유도하였음을 보여준다.
도 7은 ODZ10117 화합물이 U87-MG 세포와 MDA-MB-231 세포의 이동과 침윤을 억제하였음을 보여준다.
도 8은 이종이식 마우스에서 ODZ10117 화합물이 성장하는 종양의 크기를 억제하였음을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
물질 시료
3-페녹시메틸-1,2,4-옥사디아졸을 골격구조로 갖는 5-tert-부틸-3-(3-니트로-페녹시메틸)-[1,2,4]옥사디아졸(ODZ17690), 3-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-5-트리클로로메틸-[1,2,4]옥사디아졸(ODZ10117), 5-sec-뷰톡시-3-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-[1,2,4]옥사디아졸(ODZ8292), 3-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-5-이소뷰톡시-[1,2,4]옥사디아졸(ODZ8293), 3-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-5-프로폭시-[1,2,4]옥사디아졸(ODZ10181), 3-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-5-프로프-2-이닐옥시-[1,2,4]옥사디아졸(ODZ8297), 5-알릴옥시-3-(4-클로로-2-메틸-페녹시메틸)-[1,2,4]옥사디아졸(ODZ8315), 3-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-[1,2,4]옥사디아졸-5-카복실산메틸아미드(ODZ10159), 3-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-5-에톡시-[1,2,4]옥사디아졸 (ODZ10177), 1-{4-클로로-5-[5-(2,4-디클로로-페닐)-[1,2,4]옥사디아졸-3-일메톡시]-2-플루오로-페닐}-3,4-디메틸-피롤-2,5-디온(ODZ11296), 3,6-디클로로-8-(3-m-토일옥시메틸-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-퀴놀린(ODZ16717), 1-페닐-3-[2-(3-m-토일옥시메틸-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-페닐]-우레아(ODZ16998), 3-클로로-2-(3-m-토일옥시메틸-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-페닐아민(ODZ16999), 및 3-페녹시메틸-1,2,4-티아디아졸을 골격구조로 갖는 2-{2-[3-(2-클로로-4-플루오로-페녹시메틸)-[1,2,4]티아디아졸-5-일옥시메틸]-페닐}-2-메톡시이미노-N-메틸-아세트아미드(ODZ9562)는 하기의 방법으로 제조하였으며, 100% 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 현탁하여 -20℃에서 보관하며 사용하였다.
화합물의 합성
제조예 1. 3-((2,4- 디클로로페녹시 ) 메틸 -5-( 트리클로로메틸 )-1,2,4-옥사디아졸(3-((2,4- dichlorophenoxy ) methyl )-5-( trichloromethyl )-1,2,4- oxadiazole ; ODZ 10117)의 제조
<1-1> 2-(2,4-디클로로페녹시)아세토나이트릴 제조
[반응식 1]
Figure pat00022
2,4-디클로로페놀(1g, 6.10 mmol)을 디메틸포름아마이드(8 ㎖)에 녹인 후 포타슘카보네이트(840 mg, 6.10 mmol)를 실온에서 추가한 다음, 브로모아세토나이트릴(0.44 ㎖, 6.10 mmol)을 디메틸포름아마이드(3 ㎖)에 녹여 천천히 떨어뜨려 주었다. 실온에서 24 시간 동안 교반한 뒤, 반응 혼합물에 물을 추가하고 에틸아세테이트로 추출하였다. 이후 유기층을 소디움설페이트 포화 수용액으로 세척하고 마그네슘 설페이트로 건조한 뒤, 용매를 감압, 제거한 다음 실리카겔 관 크로마토그래피(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 3 : 1)를 통해 목적 화합물(1.18g, 95%)을 수득하였다.
<1-2> 2-(2,4-디클로로페녹시)-N'-하이드록시아세트이미다마이드 제조
[반응식 2]
Figure pat00023
트리에틸아민(2.70 ㎖, 19.52 mmol)을 50% 에탄올 수용액(21 ㎖)에 녹인 다음 하이드록실아민 하이드로클로라이드(1.36g, 19.52 mmol)를 상온에서 추가하였다. 상온에서 5분간 교반한 뒤 얻어진 2-(2,4-디클로로페녹시)아세토나이트릴을 에탄올(83 ㎖)에 녹여 추가한 뒤 100℃에서 3시간 동안 환류하였다. 이후, 반응 혼합물을 물로 희석하고 여과, 다시 물로 세척한 뒤에 목적 화합물(2.71g, 77%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ4.58 (s, 2H), 4.85 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.96 (d, J=8.8 Hz,1H), 7.17 (dd, J=2.3 Hz, 8.8 Hz, 1H), 7.37 (d, J=2.4 Hz, 1H)
<1-3> 3-((2,4-디클로로페녹시)메틸-5-(트리클로로메틸)-1,2,4-옥사디아졸(ODZ10117) 제조
[반응식 3]
Figure pat00024
얻어진 2-(2,4-디클로로페녹시)-N'-하이드록시아세트이미다마이드(100 mg, 0.43 mmol)와 트리클로로아세토나이트릴(0.040 ㎖, 0.43 mmol)을 디메틸포름아마이드(1 ㎖)에 녹인 후 파라-톨루엔설포닉액시드(41 mg, 0.22 mmol)와 아연클로라이드(30 mg, 0.22 mmol)를 추가하였다. 다음 80℃로 16시간 동안 환류하고 얻어진 반응 화합물을 소디움 바이카보네이트로 유기층을 세척 및 마그네슘 설페이트로 건조하고 용매를 감압하에 제거하였다. 이후, 남은 잔류물을 실리카겔 관 크로마토그래피(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 10 : 1)를 통해 목적 화합물(81 mg, 53%)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ5.27 (s, 2H), 7.01 (d, J=8.8 Hz, 1H),7.20 (dd, J=2.5 Hz, 8.7 Hz, 1H),7.40 (d, J=2.6 Hz, 1H)
제조예 2. 3-((2,4- 디클로로페녹시 ) 메틸 )-5- 프로폭시 -1,2,4-옥사디아졸(3-((2,4-dichlorophenoxy)methyl)-5-propoxy-1,2,4-oxadiazole; ODZ10181 )의 제조
[반응식 4]
Figure pat00025
소디움 프로폭사이드(119 mg, 1.45 mmol)를 다이메틸포름아마이드(10 ㎖)에 녹인 후 얻어진 3-((2,4-디클로로페녹시)메틸-5-(트리클로로메틸)-1,2,4-옥사디아졸(350 mg, 0.97 mmol)을 실온에서 추가한 뒤 상온에서 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 소디움 설페이트 포화 수용액과 식염수로 세척한 뒤 유기층을 마그네슘 설페이트로 건조하였다. 이후, 감압하에서 용매를 제거하고 잔류물을 실리카겔 관 크로마토그래피(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 10 : 1)를 통해 목적 화합물 (64 mg, 22%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ1.02 (t, J=7.4 Hz, 3H), 1.85 (qd, J=7.0 Hz, 14.1 Hz, 2H), 4.47 (t, J=6.6 Hz, 2H), 5.05 (s, 2H), 7.00 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.17 (dd, J=2.0 Hz, 8.8 Hz, 1H), 7.37 (d, J=1.9 Hz, 1H)
제조예 3. 5-(이차- 뷰톡시 )-3-((2,4- 디클로로페녹시 ) 메틸 )-1,2,4-옥사디아졸(5-( sec - butoxy )-3-((2,4- dichlorophenoxy ) methyl )-1,2,4- oxadiazole ; ODZ8292 )의 제조
[반응식 5]
Figure pat00026
소디움 이차-브톡사이드(613 mg, 6.37 mmol)를 디메틸포름아마이드(20 ㎖) 에 녹인 다음 얻어진 3-((2,4-디클로로페녹시)메틸-5-(트리클로로메틸)-1,2,4-옥사디아졸(462 mg, 1.27 mmol)을 실온에서 넣고 10분 동안 상온에서 교반하였다. 이후, 얻어진 반응 혼합물에 소디움 설페이트 포화 수용액과 식염수로 세척한 뒤 에틸아세테이트로 추출한 유기층을 마그네슘 설페이트로 건조하였다. 다음, 감압 하에서 용매를 제거하고 잔류물을 실리카겔 관 크로마토그래피(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 15 : 1)를 통해 목적 화합물(78 mg, 19%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.97 (t, J=7.4 Hz, 3H), 1.42 (d, J=6.2 Hz, 3H), 1.67-1.87 (m, 2H), 5.05 (s, 2H), 7.00 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.17 (dd, J=2.0 Hz, 8.8 Hz, 1H), 7.37 (d, J=2.0 Hz, 1H)
초파리 세포 배양 및 발광 효소 분석
실험에 사용한 초파리 세포(S2-NP, 24 X 3)는 종전에 기재된 바와 같이 배양하였다(Kim BH, et al. Mol Cancer Ther. 7, 2672-2680(2008)). S2-NP(Drosophila Schneider cell) 세포는 초파리 유래 대식세포 유사세포로 Schneider's medium에서 배양하였으며, 24 X 3 세포는 S2-NP 세포에 리포터 컨스트럭트로 10XSTAT92E-루시퍼라제와 PolIII-Renilla 루시퍼라제가 표지된 플라스미드 DNA를 삽입하여 안정되게 발현시킨 세포주로 S2-NP와 같은 배지에 500 mmg/㎖의 제네티신(geneticin)을 첨가하여 배양하였다. 리간드로 unpaired(upd) 또는 HOPT Tum-l 을 발현시킨 S2-NP 세포와 리포터 컨스트럭트가 구축된 24 X 3 세포를 일정한 비율로 섞어 화합물의 존재 하에 24시간 배양하고, STAT92E의 발현 정도를 발광측정기로 측정하였으며, DMSO를 처리한 군과 비교하여 억제효과를 비교하였다.
인간 암세포 배양
실험에 사용한 인간 암세포주는 U87-MG(인간 교모세포종, human malignant glioblastoma)와 MDA-MB-231(인간 유방암, human malignant breast cancer) 세포주이며, 이를 비롯하여 다양한 종류의 인간 유래 혈액암 및 고형암 세포는 종전 기재된 바와 같이 배양하였다(Jung JE, et al. FASEB J. 19, 1296-1298(2005)).
결합-분자모델 설계
STAT3의 X-선 결정구조(PDB ID: 1BG1)에서 SH2 도메인에 해당하는 부분의 3차원적 구조를 이용하였으며(Becker S, et al. Nature. 394, 145-151(1998)), AMBER package(ver. 11)를 이용하여 최소에너지를 계산하였다(Case DA, et al. J Comput Chem. 26, 1668-1688(2005)). 또한, AMBER 프로그램과 더불어 ODZ10117을 포함하여 모든 화합물에 대하여 500개의 구조를 생성하고, 분자역동력 모형(molecular dynamics simulation)을 진행하였다.
세포증식 분석
세포증식 분석을 종래 기재된 바와 같이 실시하였다(Won C, et al. Anticancer Res. 30, 481-488(2010)). 세포의 증식율을 분석하기 위하여 U87-MG와 MDA-MB-231 세포주를 6-웰 배양접시에 분주하고, 다음날 DMSO와 ODZ10117을 처리하여 0시간, 24시간, 48시간, 그리고 72시간 뒤에 크리스탈바이올렛으로 염색하여 살아있는 세포(live cells)의 수를 혈구계수기(hemocytometer)를 이용하여 계산하였다.
형질전환 및 발광효소 분석
발광효소의 발현에 대한 분석을 종래 기재된 바와 같이 실시하였다(Jung JE, et al. FASEB J. 19, 1296-1298(2005)). 리포터 컨스트럭트로 STAT3-TA-루시퍼라제를 가지는 플라스미드 DNA를 리포펙타민 2000을 이용하여 HEK293T 세포에 일시적으로 발현되게 하고 ODZ10117을 처리하여 STAT3의 발현 정도를 발광측정기로 측정하였으며, DMSO 처리군과 비교하여 억제효과를 비교하였다.
실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)
RNA 분리와 실시간 중합효소 연쇄반응을 종래 기재된 바와 같이 실시하였다 (Jung JE, et al. FASEB J. 19, 1296-1298(2005)). 인간 유래 Bcl-XL, Bcl-2, Twist, 그리고 GADPH 유전자에 특이적인 프라이머와 QuantiFast SYBR Green PCR master mix를 섞어 Applied Biosystems 7300 실시간 PCR 시스템을 이용하여 각각의 유전자를 증폭시켜 발현 정도를 비교 확인하였다.
웨스턴 블랏 분석
웨스턴 블랏 분석을 종래 기재된 바와 같이 실시하였다(Jung JE, et al. FASEB J. 19, 1296-1298(2005)). 세포를 PBS로 2회 세척하고, 세포를 용해액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 350 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 1mM PMSF, 단백질 분해효소 및 인산화 억제제)에서 현탁하여 세포막과 핵막을 파쇄하여 세포를 용해하였다. 원심분리하여 불용성 단백질 분획을 제거하고 상층액을 SDS 전기영동 완충액과 혼합하여 전기영동(SDS-PAGE)하여 원하는 항체로 검출하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
상처 치료 분석(Wound healing assay)
상처 치료 분석을 종래 기재된 바와 같이 실시하였다(Jung JE, et al. FASEB J. 19, 1296-1298(2005)). 각 세포들을 12-웰 플레이트에(U87-MG: 5 X 105 세포/㎖; MDA-MB-231: 3 X 105 세포/㎖)로 분주하고, 세포가 90% 이상 증식할 때까지 배양하였다. 파이펫의 팁 끝부분으로 긁어 떨어진 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그리고, 24시간 이후에 세포가 제거된 부분에서 세포의 증식(침윤)을 현미경으로 관찰하고, 이미지를 촬영하였다.
마트리겔 침윤 분석
성장인자가 제거된 마트리겔(growth factor reduced matrigel)을 혈청이 포함되지 않은 배양액에 1:3 비율로 희석하고 24-웰 플레이트에 옮겨 37℃에서 5시간 동안 고형화하였다. 세포를 1% 혈청이 첨가된 배양액에 넣어 고형화된 마트리겔에 첨가한 뒤, 5 ㎕/㎖ 농도의 파이브로넥틴을 첨가한 10% 혈청이 포함된 배양액을 600 ㎕ 첨가하여 24시간 배양하였다. 그리고, Diffquick 용액을 첨가하여 세포를 고정하고 염색한 다음, Leica Application Suite 현미경으로 관찰하고 이미지를 촬영하였다.
유세포 분석(Flow-cytometry)
세포의 사멸 정도를 분석하기 위하여 각 세포들을 FACS 완충액으로 세척하고 2000 rpm에서 2분간 원심분리하였다. 세척한 세포들을 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)로 15분간 염색한 후 FACS Canto flow cytometry로 분석하여 Flow-Jo 소프트웨어로 분석하였다.
인간 종양세포의 이종이식
웅성 누드마우스(BALB/cAnNCrj-nu/nu)를 Charles River Japan Inc. (Shin-Yokohama, 일본)으로부터 구입하였다. 마우스를 온도와 습도가 일정하게 조절되는 무균실에서 사육하였으며, 사육과정은 서울대학교 실험동물 유지 매뉴얼에 기재된 방법에 따라 실시하였다. U87-MG 세포 또는 MDA-MB-231 세포를 PBS에 희석하여 25% 농도의 마트리겔 100 ㎕에 현탁하여 쥐의 등 뒤쪽에 주입하고 6주에서 10주간 사육하였다. 인간 종양의 성장은 세포 주입 2주 후부터 vernier caliper를 이용하여 격일로 측정하였다. 인간 종양세포 형성의 억제 정도는 40 μM ODZ10117을 종양세포 주입 4주차부터 0일, 3일 및 5일째 되는 날 인간 종양에 직접 주입하였으며, 7일째 되는 날 쥐를 희생하여 종양을 분리하고, 1% DMSO 처리한 대조군과 비교하여 약물의 종양세포 억제 효능을 측정하였다.
종양 조직학 및 p-STAT3, cleaved caspase-3, Bcl-XL, Ki67 및 MMP2의 면역염색
쥐로부터 분리해낸 종양을 포르말린으로 고정하고 파라핀으로 포매하여 각각의 파라핀 블록으로부터 절편을 절단하였다. 조직학적 평가를 위하여 절편을 헤마톡실린-에오신, phospho-STAT3, cleaved caspase-3, Bcl-XL, Ki67, 그리고 pro/active MMP-2를 이용하여 각각 염색하였다. 절편의 파라핀을 제거하고 알코올을 이용하여 수분을 제거한 다음 마이크로파로 5분 동안 10 mM 스트르산 나트륨 완충액(pH 6.0)에서 가열하였다. 2.5% 우혈청 알부민 및 2% 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS 용액으로 1시간 반응시켜 비특이적 결합을 제거하고 1:100으로 희석한 phospho-STAT3, cleaved caspase-3, Bcl-XL, Ki67, 그리고 pro/active MMP-2에 대한 항체와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 음성대조군으로는 일차항체가 없는 상태의 희석용액과 반응시켰다. 그 다음, 절편을 세척하고 적당한 바이오틴으로 표지된 이차항체와 반응시켰고, avidin-biotin-horseradish 복합제를 이용하여 결합된 항체의 위치와 발현을 확인하였다. 조직학적 평가를 위하여 각각의 염색 절편들을 100배와 400배의 배율에서 현미경으로 확인하였고, 소니 XC-77 CCD 카메라 및 마이크로컴퓨터 이미지 장치 모델4 이미지 분석 시스템을 이용하여 분석하였다.
통계적 분석
모든 데이터를 마이크로소프트 엑셀 2000 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 데이터는 평균값과 표준오차로 표현하였으며, 통계학적 중요도는 unpaired two-tailed Student's t-test(p < 0.05)로 계산하였다.
실험결과
선택적인 STAT3 억제 전구물질로 ODZ17690 동정
초파리 세포, 인간 호지킨 림포암 세포주(L540) 및 분자모델을 이용하여 3-페녹시메틸-1,2,4-옥사디아졸을 골격구조로 가지는 화합물인 ODZ17690 (5-tert-Butyl-3-(3-nitro-phenoxymethyl)-[1,2,4]oxadiazole)을 동정하였다(도 1의 A). 먼저 초파리 세포를 이용한 발광효소 분석(luciferase assay)에서 ODZ17690은 리간드인 upd 또는 STAT92E(포유동물의 STAT에 해당)의 상위단계인 Hop(포유동물의 JAK에 해당)의 활성에 의하여 활성화된 STAT92E의 발현을 효과적으로 억제하였다(도 1의 B 및 C). 인간 암세포인 L540 세포에서도 ODZ17690은 STAT3의 705번 티로신 잔기의 인산화와 하위 조절물질인 SOCS3의 발현을 효과적으로 억제하였다(도 1의 D). STAT3의 결합부위인 SH2 도메인에 대한 결합-분자모델에서 표준물질로 이미 알려진 STAT3 선택적 억제제인 NSC-628869와 NSC-74859의 pTyr-Leu 기질이 SH2 도메인에 선택적으로 억제하는 것을 확인하여 결합 분자모델이 잘 맞아 들어가는 것을 확인하였으며(도 1의 E), ODZ17690도 SH2 도메인에 잘 결합하며 결합에너지도 가장 낮았으며, 대조물질과 비슷하였다(도 1의 F).
ODZ17690의 선택적 STAT3 억제작용을 인간 암세포주에서 확인
ODZ17690의 인간 암세포주에서 선택적인 STAT3 활성 억제작용을 호지킨 림포암 세포주인 L540에서 확인하였다. ODZ17690은 STAT1 또는 STAT5보다 STAT3에 선택적으로 강한 억제작용을 보였다(도 2의 A). 또한, 상위 신호전달 과정의 JAK3에는 약한 억제작용을 보였지만, Src 패밀리 키나아제인 Lyn이나 ERK 신호전달 과정에는 억제작용을 보이지 않았다(도 2의 B). 이상의 결과를 통하여, 결합-분자모델과 초파리 세포에서 확인한 ODZ17690의 선택적 STAT3 억제작용이 인간 암세포에서도 작용함을 확인할 수 있었다.
ODZ17690 보다 효능이 우수한 유도체 확인
ODZ17690보다 선택적 STAT3 억제 효능이 우수한 화합물을 동정하기 위하여 3-페녹시메틸-1,2,4-옥사디아졸 또는 3-페녹시메틸-1,2,4-티아디아졸을 골격구조로 가진 144종의 화합물에서 초파리 세포와 STAT3-루시퍼라제 컨스트럭트를 구축하여 선택적으로 STAT3가 발현되게 만든 인간 유방암세포 유래 MDA-MB-231 세포에서 발광효소 분석을 실시하였다. 그 결과, 효능이 우수한 것으로 판단되는 13종의 화합물을 최종 후보자로 선정하였다(도 3의 A 및 B). 더불어 13종의 화합물을 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하여 STAT3 억제작용이 우수한 것으로 판단되는 화합물을 다시 확인하였으며, 그 중에서도 ODZ10117이 가장 우수한 것으로 판단되었다(도 3의 C).
구조-결합 분자모형과 인간 암세포에서 ODZ10117의 STAT3 활성 억제작용 확인
화합물 ODZ10117의 선택적 STAT3 억제 효능을 구조-결합 분자모형으로 확인하였다. SH2 도메인에 대한 인산화된 티로신 잔기의 결합을 모형으로 나타내었을 때, ODZ10117이 적합하게 결합하는 것을 확인하였다(청록색). SH2 도메인에 대한 결합은 선택적인 STAT3 억제물질로 알려진 NSC628869(노랑)와 NSC74859(핑크)와도 비슷하였으며, 자유결합에너지에서도 ODZ10117, NSC628869 및 NSC74859가 각각 -11.14 kcal/mol, -10.89 kcal/mol 및 -10.01 kcal/mol로 더 낮은 결합에너지를 보여 대조물질보다 결합능력이 우수한 것으로 확인되었다(도 4의 A와 C는 ODZ10117). X-ray complex 구조 복합체에서 Pro-pTyr-Leu의 SH2 도메인에 대한 결합은 녹색으로 표기되었다(도 4의 A 및 B).
STAT3가 과도하게 활성화된 다양한 종류의 인간 암세포주에서 ODZ10117의 STAT3 활성 억제작용을 확인하였다. 그 결과, ODZ10117은 실험에 사용한 모든 종류의 세포종에서 STAT3의 활성을 억제하였으며, 또한 IL-6로 유도한 STAT3의 활성도 효율적으로 억제하였다. 이상의 결과를 통하여, ODZ10117이 인간 암세포주에서 활성화된 STAT3를 우수하게 억제하는 작용이 있음을 확인할 수 있었다(도 4의 D).
인간 암세포주에서 ODZ10117의 선택적 STAT3 활성 억제작용 확인
인간 교모세포종과 유방암 세포주인 U87-MG와 MDA-MB-231 세포에서 화합물 ODZ10117의 STAT3에 대한 선택적 활성 억제작용을 확인하였다. 화합물 ODZ10117은 3-(2,4-Dichloro-phenoxymethyl)-5-trichloromethyl-[1,2,4]oxadiazole의 구조를 갖는 화합물이다(도 5의 A). 먼저 STAT3의 프로모터 활성을 확인하기 위하여 pSTAT3-TA-루시퍼라제 DNA 컨스트럭트를 HEK293T 세포주에 형질전환 시키고, ODZ10117의 효능을 확인하였다. 그 결과, ODZ10117은 STAT3의 프로모터 활성을 DMSO 처리군과 비교하여 유의적으로 감소시켰다(도 5의 B).
다음으로 STAT3 단백질의 티로신과 세린 잔기에 대한 활성 정도를 분석하기 위하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 그 결과, ODZ10117은 U87-MG와 MDA-MB-231 세포에서 STAT3의 티로신 705와 세린 727 잔기의 인산화를 현저하게 억제하였다(도 5의 C).
ODZ10117의 암세포 사멸 유도 작용 확인
암세포에서 활성화된 STAT3는 세포생존 및 세포주기와 관련된 단백질의 발현을 증가시켜 세포의 증식과 성장을 증가시킨다. 따라서, U87-MG와 MDA-MB-231 세포주의 세포증식에 따른 ODZ10117의 효과를 시간대별로 확인하였을 때 대조군으로 DMSO를 처리한 군과 비교하여 ODZ10117은 두 세포의 증식을 효과적으로 억제하였다 (도 6의 A).
다음으로 두 세포주에 대한 ODZ10117의 세포사멸 효과를 분석하기 위하여, 화합물을 48시간 동안 처리하고, PI(propidium iodide)와 Annexin V로 염색하여 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, ODZ10117은 U87-MG와 MDA-MB-231 세포주에 대하여 각각 약 15.3-26.7%와 40.2-43.0%의 세포사멸을 유도하였다(도 6의 B 및 C). 세포사멸에는 다양한 유전자의 발현이 관여하므로 웨스턴 블랏 분석을 통하여 세포사멸에 관여하는 대표적인 pro-apoptosis 유전자인 caspase-3와 PARP의 활성 정도를 분석하였다. ODZ10117은 조각난 caspase-3와 PARP 단백질의 양이 현저하게 증가하여 이들 단백질의 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이의 결과를 통하여, ODZ10117은 caspase-3와 PARP의 활성을 증가시켜 세포사멸을 유도한다는 것을 확인할 수 있었다(도 6의 D).
다음으로 항-아폽토시스 유전자인 Bcl-2와 Bcl-XL의 발현 정도를 실시간 중합효소 연쇄반응으로 분석하였다. 그 결과, ODZ10117은 이들 유전자의 발현을 효과적으로 억제하였다(도 6의 E). 이상의 결과를 통하여, ODZ10117은 pro-apoptosis 유전자의 활성은 증가시키고, 항-아폽토시스 유전자의 발현은 감소시켜 암세포의 세포사멸을 증가시키는 것으로 확인되었다.
ODZ10117의 세포이동과 침윤 억제 작용 확인
인간 종양세포의 전이와 관련된 세포이동성 및 침윤성에 대한 ODZ10117의 효능을 확인하였다. 먼저 세포이동성에 대한 효과를 확인하기 위하여 상처 치료 분석법을 수행하였다. U87-MG와 MDA-MB-231 세포에 화합물을 24시간 처리하고, 세포이동을 현미경으로 확인하였을 때 DMSO를 처리한 대조군은 세포이동이 활발하게 일어났지만, ODZ10117은 이들 세포의 이동을 현저하게 억제하였다(도 7의 A).
암세포의 세포침윤성에 대한 효과를 검증하기 위하여, 세포침윤 분석법 (invasion assay)을 수행하였다. U87-MG과 MDA-MB-231 세포를 마트리겔에 분주하고 하단 챔버에는 파이브로넥틴이 첨가된 배양액으로 채우고 ODZ10117을 처리하여 24시간 동안 배양한 다음, 아래 챔버로 세포의 침윤 정도를 현미경을 통하여 관찰하였다. 그 결과, ODZ10117은 DMSO를 처리한 대조군과 비교하여 두 세포에서 모두 세포의 침윤을 현저하게 감소시켰다(도 7의 B).
암세포의 이동과 침윤에는 다양한 인자들이 관여한다. 이에 따라, 세포의 이동과 침윤에 관여하는 대표적인 인자의 하나인 Twist의 발현과 MMP-2의 활성에 대한 ODZ10117의 효능을 확인하였다. 그 결과, ODZ10117을 24시간 처리하였을 때 U87-MG과 MDA-MB-231 세포에서 Twist의 발현과 MMP-2의 활성이 현저하게 감소되었다(도 7의 C 및 D).
인간 종양세포 이종이식에서 ODZ10117의 종양 성장 억제 효과 확인
STAT3 활성 억제에 대한 ODZ10117의 효능을 동물실험에서 확인하기 위하여, 인간 암세포주인 U87-MG와 MDA-MB-231 세포를 각각 25% 마트리겔에 섞어 면역결핍쥐(BALB/c nude mice)의 등 뒤쪽에 주입하고, 4주 후에 종양이 적정한 크기로 자란 쥐들을 선별하였다. 이들 쥐에 DMSO와 ODZ10117을 0일, 3일 및 5일에 종양덩어리에 주기로 직접 주입하고, 종양의 성장을 측정하였다. 그 결과, ODZ10117은 DMSO를 주입한 대조군과 비교하여 종양이 성장을 현저히 억제하였다(도 8의 A).
약물 투여한지 7일째 되는 날, 쥐를 마취하고 희생하여 종양 덩어리를 적출하였다. 종양 조직을 포르말린으로 고정하고, 파라핀으로 포매하여 절단한 조직 절편에서 STAT3의 티로신 705 잔기의 인산화, Ki67의 발현, caspase-3의 활성 및 Bcl-XL과 pro/activated MMP2의 발현을 분석하였다. 그 결과, ODZ10117을 주입한 종양조직에서는 DMSO를 주입한 대조군과 비교하여 STAT3의 인산화가 현저하게 감소하였다. 또한, 세포성장 인자 중의 하나인 Ki67, 세포사멸 저항과 관련된 Bcl-XL 및 세포 침윤과 관련된 pro/active MMP2의 발현을 현저하게 감소시켰다. 그리고, 세포사멸과 관련된 caspase-3의 활성을 증가시켰다(도 8의 B).
이러한 결과는 ODZ10117이 STAT3의 활성을 선택적으로 억제하여 종양 세포의 성장과 증식, 침윤 및 전이를 억제하고, 암세포의 사멸을 유도하며, 종양의 성장을 억제할 수 있음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물:
    화학식 1
    Figure pat00027

    상기 화학식에서,
    R1은 수소; 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬; C1-C6 알콕시; C2-C6 알케닐옥시; C2-C6 알키닐옥시; C1-C6 알킬카복스아미드; 비치환되거나 할로겐, 아민 및
    Figure pat00028
    로 구성된 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 6각-10각 고리의 아릴 또는 헤테로아릴; 또는
    Figure pat00029
    로 치환된 C1-C6 알콕시이고;
    R2 내지 R6은 각각 서로 독립적으로 수소; 할로겐; 니트로; C1-C6 알킬; 또는
    Figure pat00030
    이며;
    A는 산소; 또는 황이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 R1은 비치환되거나 할로겐으로 치환된 직쇄 또는 측쇄의 C1-C5 알킬; C1-C5 알콕시; 알릴옥시; 프로프-2-이닐옥시; 메틸카복스아미드; 할로겐, 아민 및
    Figure pat00031
    로 구성된 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 6각 고리의 아릴; 할로겐으로 치환된 10각 고리의 헤테로아릴; 또는
    Figure pat00032
    로 치환된 C1-C3 알콕시인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 R2 내지 R6은 수소 및 니트로이거나; 수소 및 할로겐이거나; 수소, 할로겐 및 C1-C3 알킬이거나; 수소, 할로겐 및
    Figure pat00033
    이거나; 수소 및 C1-C3 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 화학식 2 내지 15로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물.
    화학식 2
    Figure pat00034

    화학식 3
    Figure pat00035

    화학식 4
    Figure pat00036

    화학식 5
    Figure pat00037

    화학식 6
    Figure pat00038

    화학식 7
    Figure pat00039

    화학식 8
    Figure pat00040

    화학식 9
    Figure pat00041

    화학식 10
    Figure pat00042

    화학식 11
    Figure pat00043

    화학식 12
    Figure pat00044

    화학식 13
    Figure pat00045

    화학식 14
    Figure pat00046

    화학식 15
    Figure pat00047

  5. (a) 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암, 당뇨병성 망막증, 당뇨병, 혈우병성 관절증, 아테롬성 동맥경화, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 자가면역질환, 재발협착증, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관이식거부, 신사구체병증, 신경퇴행성 질환 및 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 STAT3 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
    화학식 1
    Figure pat00048

    상기 화학식에서,
    R1은 수소; 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬; C1-C6 알콕시; C2-C6 알케닐옥시; C2-C6 알키닐옥시; C1-C6 알킬카복스아미드; 비치환되거나 할로겐, 아민 및
    Figure pat00049
    로 구성된 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 6각-10각 고리의 아릴 또는 헤테로아릴; 또는
    Figure pat00050
    로 치환된 C1-C6 알콕시이고;
    R2 내지 R6은 각각 서로 독립적으로 수소; 할로겐; 니트로; C1-C6 알킬; 또는
    Figure pat00051
    이며;
    A는 산소; 또는 황이다.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 선택적으로 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 STAT3 관련 질환은 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 백혈병, 림프종, 부신피질암, 부갑상선암, 요관암, 신경교종, 식도암, 소장암, 교모세포종, 뇌종양 및 신장암으로 구성된 군으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 STAT3 관련 질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판 감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염 (celiac sprue-dermatitis), 만성피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, 처그스트라우스 증후군(Churg-strauss syndrome), 반흥성 유천포창, 크레스트 증후군(CREST syndrome), 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성 복합 한냉 글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체 신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, Ig A 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루프스, 메니어르병, 혼합성 연결조직질환, 다발성 경화증, 타입I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성빈혈, 결정성 다발동맥염, 바달연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성 근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마 글로불린혈증, 일차성 당증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증. 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루프스, 홍반성 루프스, 다가야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염(giant cell arteritis), 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증으로 구성된 군으로부터 선택되는 자가면역 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 STAT3 관련 질환은 천식, 엔세필리티스(encephalitis), 염증성 장염, 류마티스 관절염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 아토피성 피부염, 건선, 폐혈병성 쇼크증, 페섬유증, 미분화 척추관절증, 크론씨병, 췌장염, 피부염, 미분화 관절병증, 관절염, 사구체신염, 기관지염, 염증성 골용해, 및 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성염증으로 구성된 군으로부터 선택되는 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암, 당뇨병성 망막증, 당뇨병, 혈우병성 관절증, 아테롬성 동맥경화, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 자가면역질환, 재발협착증, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관이식거부, 신사구체병증, 신경퇴행성 질환 및 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 STAT3 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    화학식 1
    Figure pat00052

    상기 화학식에서,
    R1은 수소; 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬; C1-C6 알콕시; C2-C6 알케닐옥시; C2-C6 알키닐옥시; C1-C6 알킬카복스아미드; 비치환되거나 할로겐, 아민 및
    Figure pat00053
    로 구성된 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 6각-10각 고리의 아릴 또는 헤테로아릴; 또는
    Figure pat00054
    로 치환된 C1-C6 알콕시이고;
    R2 내지 R6은 각각 서로 독립적으로 수소; 할로겐; 니트로; C1-C6 알킬; 또는
    Figure pat00055
    이며;
    A는 산소; 또는 황이다.
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