JP2019083819A - ヒト胚性幹細胞由来血管芽細胞からナチュラルキラー細胞および樹状細胞を生成する方法 - Google Patents
ヒト胚性幹細胞由来血管芽細胞からナチュラルキラー細胞および樹状細胞を生成する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
例えば、本発明は以下を提供する。
(項目1)
ナチュラルキラー(NK)細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、メチルセルロース、並びにIL2、IL3、IL6、IL7、IL15、SCF、およびFLを含む第1のサイトカイン混合物上で培養すること、
前記培養した細胞を回収すること、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにIL7、IL15、SCF、およびFLを含む第2のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してNK細胞を生成することを含む方法。
(項目2)
前記メチルセルロースが、H4236メチルセルロースである、項目1に記載の方法。(項目3)
前記メチルセルロースが、H4536メチルセルロースである、項目1に記載の方法。(項目4)
IL2の濃度が、約5〜10ng/mlであり、IL3が約1〜10ng/mlであり、IL6が約1〜10ng/mlであり、IL7が約5〜20ng/mlであり、IL15が約5〜10ng/mlであり、SCFが約10〜50ng/mlであり、FLが約10〜50ng/mlである、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記血管芽細胞の培養が、約6〜8日間である、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記回収した細胞の培養が、約14〜21日間である、項目1に記載の方法。
(項目7)
培地を週1回変更して、前記第2のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞(hESC)から分化する、項目1に記載の方法。(項目9)
前記血管芽細胞が、誘導多能性(iPS)細胞から分化する、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記NK細胞が、未熟NK細胞であり、CD56+およびCD16−である、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記NK細胞が、成熟NK細胞であり、CD56−およびCD16+であるか、またはCD56loおよびCD16+である、項目1に記載の方法。
(項目12)
項目1〜11のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー(NK)細胞。
(項目13)
項目12に記載のNK細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
(項目14)
ナチュラルキラー(NK)細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、並びにIL2、IL3、IL6、IL7、IL15、およびSCFを含む第1のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養すること、
前記培養した細胞を回収すること、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにIL7、IL15、SCF、およびFLを含む第2のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養して前記NKを生成することを含む方法。
(項目15)
IL2の濃度が、約5〜10ng/mlであり、IL3が約1〜10ng/mlであり、IL6が約1〜10ng/mlであり、IL7が約5〜20ng/mlであり、IL15が約5〜10ng/mlであり、SCFが約10〜50ng/mlであり、FLが約10〜50ng/mlである、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記血管芽細胞の培養が、約6〜8日間ある、項目14に記載の方法。
(項目17)
前記回収した細胞の培養が、約14〜21日間である、項目14に記載の方法。
(項目18)
培地を週1回変更して、前記第2のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含む、項目14に記載の方法。
(項目19)
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞(hESC)から分化する、項目14に記載の方法。
(項目20)
前記血管芽細胞が、誘導多能性(iPS)細胞から分化する、項目14に記載の方法。(項目21)
前記NK細胞が、未熟NK細胞であり、CD56+およびCD16−である、項目14に記載の方法。
(項目22)
前記NK細胞が、成熟NK細胞であり、CD56−およびCD16+であるか、またはCD56loおよびCD16+である、項目14に記載の方法。
(項目23)
項目14〜22のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー(NK)細胞。
(項目24)
項目24に記載のNK細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
(項目25)
樹状細胞(DC)を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、SCF、FL、IL3、およびGM−CSFを含む液体培地中で培養すること、
前記液体培地にIL4を添加すること、および
前記血管芽細胞を更に培養して、前記DCを生成することを含む方法。
(項目26)
前記血管芽細胞の培養が、約7〜11日間ある、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記IL4添加の後の前記血管芽細胞の培養が、約8〜10日間である、項目25に記載の方法。
(項目28)
IL1b、TNFα、およびIL6を含むサイトカイン混合物を添加して、前記DCの成熟化を誘導することを更に含む、項目25に記載の方法。
(項目29)
前記サイトカイン混合物が、約48時間添加される、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記サイトカイン混合物が、PGE2、IFNα2b、Poly I:C、IFNγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、項目28に記載の方法。
(項目31)
LPS、IFNγ、および/またはS−28463を添加して、前記DCからのIL12p70産生および/または前記DCからのHLA−DR発現を刺激することを更に含む、項目25に記載の方法。
(項目32)
SCFの濃度が、約20〜100ng/mlであり、FLが約10〜50ng/mlであり、IL3が約5〜50ng/mlであり、GM−CSFが約50〜100ng/mlであり、IL4が約50〜100ng/mlである、項目25に記載の方法。
(項目33)
IL1bの濃度が、約10ng/mlであり、TNFγが、約10ng/mlであり、IL6が約150ng/mlである、項目28に記載の方法。
(項目34)
PGE2の濃度が、約1μg/mlであり、IFNα2bが約3000単位/mlであり、poly I:Cが約20μg/mlであり、IFNγが約20ng/mlである、項目30に記載の方法。
(項目35)
前記DCが、成熟DCであり、CD83を発現する、項目25に記載の方法。
(項目36)
前記DCが、成熟DCであり、CD209、HLA DR、および/またはCD11cの発現が増加される、項目25に記載の方法。
(項目37)
項目25〜36のいずれか一項に記載の方法により生成される樹状細胞(DC)細胞。(項目38)
項目37に記載のDC細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
初期分化
両細胞タイプの初期分化手順は同じであり、胚様体(EB)を生成するために、サイトカインを加えたStemline II(Sigma社製)中でhESCを4日間培養することを伴う。サイトカイン、VEGFおよびBMP4を、EB培養の全体にわたって使用し、bFGFを、最初の2日間の後に添加する。合計で4日後に、その結果生じたEBを、0.05%トリプシンで脱凝集し、その後トリプシンを血清含有培地で不活化する。その後、個々の細胞を40μM細胞ストレーナーでろ過し、計数し、TPO(50μg/ml)、VEGF(50μg/ml)、FL(50μg/ml)、およびbFGF(20〜50μg/ml)等のさらなるサイトカインを含有するH4436またはH4536メチルセルロース(Stem Cell Technologies社製)に播種する。NK分化の場合、サイトカインIL2(1〜10μg/ml)、IL7(1〜20μg/ml)、および/またはIL15(1〜10μg/ml)を、この段階で添加することもできる。血管芽細胞集団を産生および増殖させるために、1ml当たり50,000〜150,000細胞の濃度で、メチルセルロース培養物を播種する。芽球様細胞を、6〜10日目にメチルセルロースから回収し、下記の手順のうちの1つにより更に分化させる。
NK分化
芽球細胞は、IL2(5〜10ng/ml)、IL3(1〜10ng/ml)、IL6(1〜10ng/ml)、IL7(5〜20ng/ml)、IL15(5〜10ng/ml)、SCF(10〜50ng/ml)、およびFL(10〜50ng/ml)を加えたH4236メチルセルロースに再播種してもよく、または同じサイトカインおよび10〜20%ヒト血清を含有する液体培養に再播種してもよい。6〜8日間の培養後、細胞を回収し、10〜20%ヒト血清並びにサイトカインIL7(5〜20ng/ml)、IL15(5〜10ng/ml)、SCF(10〜50ng/ml)、およびFL(10〜50ng/ml)を加えた液体培地(αMEMまたはDMEM:F12)に、更に14〜21日間再播種する。週1回の培地変更を使用して、サイトカイン混合物を新しくする。
DC分化
芽球細胞を、10〜20%ヒト血清並びにサイトカイン、SCF(20〜100ng/ml)、FL(10〜50ng/ml)、IL3(5〜50ng/ml)、およびGM−CSF(50〜100ng/ml)を加えた液体培地(αMEMまたはDMEM:F12)に播種する。7〜11日間の培養後、IL4(50〜100ng/ml)も培養物に添加し、細胞を更に8〜10日間増殖させる。培地変更は、6〜7日毎に実施する。DCの成熟化を誘導するために、さらなるサイトカイン混合物(10ng/ml IL1b、10ng/ml TNFγ、150ng/ml IL6)を、48時間培養物に添加することができる。
血管芽細胞増殖条件の変更
H4436メチルセルロースで増殖させた血管芽細胞を使用して、上記のNKおよびDC分化手順を実施した。しかしながら、H4536、Stem Cell Technologies社製の無エリトロポイエチンメチルセルロースを使用して、血管芽細胞を効率的に生成することもできる。これら「epoマイナス」血管芽細胞は、元々の「epoプラス」芽球と非常に類似しており、それらは、様々な造血細胞タイプおよび血管細胞タイプへと分化することが可能である。予備的な結果は、NK細胞およびDCを含む種々の造血系列へと血管芽細胞を分化させるためには、H4536の使用が、H4436メチルセルロースよりも著しい利点を提供することができることを示唆する。芽球増殖培地中にepoが存在しないことにより、赤血球マーカーCD235aを発現する細胞の割合を低減させ、CD34、CD45、およびCD41aを発現する細胞の割合を増加させることが見出された。細胞表面マーカー発現におけるこの違いのため、「epo−マイナス」増殖条件は、骨髄系列および/またはリンパ系列への分化を増強することができる。
iPS細胞からのMKの生成
OP9共培養系を使用して、本発明者らは、iPS細胞からMKを生成することができることを示す。数千個のCD41a+MKを、数十万個のiPS細胞から生成した。
ヒトESCからのNK細胞分化
分化手順を以下のように実施した:
H7 ESCを、胚様体(EB)へと4日間分化させた。EBを回収し、血管芽細胞を産生および増殖させるために、サイトカイン豊富なメチルセルロースに10〜15日間移した。血管芽細胞を回収し、10〜20%ヒトAB血清を加えた無フィーダー液体培地に一群のサイトカインと共に更に14〜17日間配置し、3〜4日毎に培地を半分変更した。
免疫表現型検査(フローサイトメトリーを使用):
未熟NK細胞は、CD56bright、CD16lo、KIRlo、CD117+、CD94−、NKG2D+だった。上記の手順の変法を使用することにより、32日間の分化後の生細胞の20〜30%が、CD56+CD16−だった。成熟NK細胞は、CD56dim、CD16hi、KIRhi、CD117lo/−、CD94+、NKG2D+だった。上記の手順を使用することにより、31日間の分化後の生細胞の20%が、CD56−CD16+であり、それらの5%が、CD56loCD16+だった。
ナチュラル細胞傷害性:成熟NK細胞は、ヒトK562赤白血病細胞、MCF7細胞、U87細胞、PC3細胞、NTERA2細胞等の標的細胞のアポトーシスを誘発することができる。「3FC」アッセイを使用して、細胞傷害性の効率を評価する。このアッセイは、51Cr放出アッセイと類似しているが、放射能を必要としない。Derby et al., Immunol. Letters 78: 35−39 (2001)を参照されたい。上述の成熟NK細胞の異種性集団(アイテムB2−a)が、標準的な4時間の実験で65〜70%のK562細胞にアポトーシスを誘発することが見出された。
血管芽細胞を骨髄再増殖細胞として使用することにより、またはそれらを樹状突起細胞、ナチュラルキラー細胞、T細胞、および/または間葉系幹細胞(MSC)へと分化させることにより、本発明者らは、癌、HIV、および/または自己免疫疾患(automimmune disease)と闘うための大規模で効果的な細胞に基づく療法を生み出すことができる。本発明者らは、hESCおよびiPS細胞の両方からの樹状細胞(DC)の分化を、40〜55%の効率で達成することができた。2つの新しい機能アッセイに加えて、ヒト骨髄に由来するDCと対照比較することにより、今や、hESC由来DCが、多くの同様な特徴をヒトBM由来DCと共有していることが確認され、さらなる最適化を必要とする分野も特定された。ナチュラルキラー細胞分化の場合、ヒト骨髄由来NK細胞と対照比較することにより、骨髄細胞供給源を使用した場合さえ、生体外NK細胞分化が、あまり効率的ではないことが確認された。本発明者らは、芽球由来NK細胞が、ナチュラル細胞傷害性能力を示すことを見出した。抗体依存性細胞傷害アッセイを実施する。T細胞分化の場合、本発明者らは、Notchシグナル伝達を刺激するためにヒトデルタリガンド発現OP9間質細胞系統の生成することに成功し、血管芽細胞のT細胞分化を刺激するために、この間質細胞系統を使用している。
細胞表面マーカー:CD11c、45、209は、芽球由来DCおよびヒト骨髄由来DCでは同様の発現を示すが、HLA−DRは、芽球DCでは、ヒトBM DCよりもはるかに低いレベルで発現される。
臍帯血および末梢血単核細胞は両方とも、レスポンダーとして使用される。本発明者らは、陽性対照エフェクターとしてヒト骨髄由来DCを使用する。
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Claims (12)
- 血管芽細胞を提供する工程、
前記血管芽細胞を、メチルセルロース、並びにIL2、IL3、IL6、IL7、IL15、幹細胞因子(SCF)、およびfms関連チロシンキナーゼ3リガンド(FL)を含む第1のサイトカイン混合物上で培養する工程、
前記培養した細胞を回収する工程、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにIL7、IL15、幹細胞因子(SCF)、およびfms関連チロシンキナーゼ3リガンド(FL)を含む第2のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してナチュラルキラー(NK)細胞を生成する工程
を含む方法により生成されるナチュラルキラー(NK)細胞。 - 前記NK細胞が、未熟NK細胞であり、CD56+およびCD16−である、請求項1に記載のナチュラルキラー(NK)細胞。
- 前記NK細胞が、成熟NK細胞であり、CD56−およびCD16+であるか、またはCD56loおよびCD16+である、請求項1に記載のナチュラルキラー(NK)細胞。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のナチュラルキラー(NK)細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
- 血管芽細胞を提供する工程、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、並びにIL2、IL3、IL6、IL7、IL15、および幹細胞因子(SCF)を含む第1のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養する工程、
前記培養した細胞を回収する工程、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにIL7、IL15、幹細胞因子(SCF)、およびfms関連チロシンキナーゼ3リガンド(FL)を含む第2のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してナチュラルキラー(NK)細胞を生成する工程
を含む方法により生成されるナチュラルキラー(NK)細胞。 - 前記NK細胞が、未熟NK細胞であり、CD56+およびCD16−である、請求項5に記載のナチュラルキラー(NK)細胞。
- 前記NK細胞が、成熟NK細胞であり、CD56−およびCD16+であるか、またはCD56loおよびCD16+である、請求項5に記載のナチュラルキラー(NK)細胞。
- 請求項5〜7のいずれか1項に記載のNK細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
- 血管芽細胞を提供する工程、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、幹細胞因子(SCF)、fms関連チロシンキナーゼ3リガンド(FL)、IL3、およびGM−CSFを含む液体培地中で培養する工程、
前記液体培地にIL4を添加する工程、および
前記血管芽細胞を更に培養して、樹状細胞(DC)を生成する工程
を含む方法により生成される樹状細胞(DC)。 - 前記DCが、成熟DCであり、CD83を発現する、請求項9に記載の樹状細胞(DC)。
- 前記DCが、成熟DCであり、CD209、HLA DR、および/またはCD11cの発現が増加される、請求項9に記載の樹状細胞(DC)。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載の樹状細胞(DC)をある量含む薬学的に許容される組成物。
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