CN100337686C - 从前体产生加载有抗原的树突细胞疫苗的快速一步法 - Google Patents
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Abstract
发现了从单核细胞离体产生加载有抗原的抗原呈递细胞的一步法，该方法包括将单核细胞与组合物接触，所述组合物包括优选与至少一种生长因子例如GM-CSF和至少一种可溶性或颗粒性抗原组合的激活剂如TNFα。根据本发明的方法，可以在少至三(3)天的时间内生成加载有抗原的树突细胞疫苗。在本发明的另一个方法中，在一个时间点将单核细胞与TNFα和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触以形成抗原呈递细胞，然后在第二个时间点将抗原呈递细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料接触以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，由此从单核细胞离体产生加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。本发明也包括疫苗，该疫苗包括单核细胞衍生的加载有抗原的抗原呈递细胞，其中抗原呈递细胞由两个或更多个亚群组成，所述亚群选自具有表面标志物(CD1a+CD207+)的朗格汉斯细胞；具有表面标志物(CD1a+CD207-)的间质树突细胞；具有表面标志物20(CD1a-CD14-)的双阴性树突细胞；以及具有表面标志物(CD14+CD1a-CD209+)的树突细胞。
Description
与有关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请No.60/430,791的利益，该临时申请于2002年12月4日提交。
发明技术领域
本发明涉及从前体(precursors)、特别是从单核细胞和可溶性或颗粒性抗原、更特别是从杀伤的肿瘤细胞快速产生加载有抗原的树突细胞的组合物和方法。
背景
在过去的十年中，癌症免疫治疗的观念通过人类癌症抗原的分子鉴定得到加强。允许大量树突细胞(DC)生成的体外培养方法的鉴定进一步促进了这些治疗途径，在所述树突细胞上，可以将癌症抗原呈递给T细胞。在动物中的大量研究证实，以在DC上送递的肿瘤抗原的免疫可诱导保护性抗肿瘤应答。开拓性的临床试验使用血液衍生的DC或单核细胞衍生的DC，并且显示一些临床反应应答以及更新近的免疫应答。(Bell等人，1999.“Dendritic cells，”Adv Immunol 72：255；Boczkowski等人，1996.“Dendritic cells pulsed with RNA arepotent antigen-presenting cells in vitro and in vivo，”J Exp Med 184：465-472；Celluzzi等人，1996.“Peptide-pulsed dendritic cells induceantigen-specific CTL-mediated protective tumor immunity，”J ExpMed 183：283-287；Flamand等人，1994.“Murine dendritic cells pulsedin vitro with tumor antigen induce tumor resistance in vivo，”Eur JImmunol 24：605-610；Gilboa等人，1998.“Immunotherapy of cancerwith dendritic-cell-based vaccines，”Cancer Immunol Immunother46：82；Gilboa，E.1999.“The makings of a tumor rejection antigen，”Immunity 11：263-270；Hsu等人，1996.“Vaccination of patients withB-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells，”NatMed 2：52；Mayordomo等人，1995.“Bone marrow-derived dendriticcells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective andtherapeutic antitumour immunity，”Nat Med 1：1297-1302；Mayordomo等人，1997.“Bone marrow-derived dendritic cells serve aspotent adjuvants for peptide-based antitumor vaccines，”Stem Cells15：94-103；Mukherji等人，1995.“Induction of antigen-specificcytolytic T cells in situ in human melanoma by immunization withsynthetic peptide-pulsed autologous antigen presenting cells，”ProcNatl Acad Sci USA 92：8078；Nestle等人，1998.“Vaccination ofmelanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendriticcells，”Nat Med 4：328；Porgador，A.和Gilboa，E.1995.“Bonemarrow-generated dendritic cells pulsed with a class I-restrictedpeptide are potent inducers of cytotoxic T lymphocytes，”J Exp Med182：255-260；Song等人，1997.“Dendritic cells genetically modifiedwith an adenovirus vector encoding the cDNA for a model antigeninduce protective and therapeutic antitumor immunity，”J Exp Med186：1247-1256；Song，J.A.1998.“Tumor immunology：the glass is halffull，”Immunity 9：757-763；Specht等人，1997.“Dendritic cellsretrovirally transduced with a model antigen gene are therapeuticallyeffective against established pulmonary metastases，”J Exp Med 186：1213-1221；Tjoa等人，1998.“Evaluation of phase I/II clinical trials inprostate cancer with dendritic cells and PSMA peptides，”Prostate36：39-44；Toes等人，1996.“Protective antitumor immunity inducedby immunization with completely allogeneic tumor cells，”Cancer Res56：3782-3787；Zitvogel等人，1996.“Therapy of murine tumors withtumor peptide-pulsed dendritic cells：dependence on T cells，B7costimulation，and T helper cell 1-associated cytokines，”J Exp Med183：87-97；Schuler-Thurner等人，2000.“Mage-3and influenza-matrixpeptide-specific cytotoxic T cells are inducible in terminal stage HLA-A2.1+melanoma patients by mature monocyte-derived dendriticcells，”J Immunol 165：3492-3496；Mackensen等人，2000.“Phase Istudy in melanoma patients of a vaccine with peptide-pulsed dendriticcells generated in vitro from CD34(+)hematopoietic progenitorcells，”Int J Cancer 86：385-392；Geiger等人，2001.“Vaccination ofpediatric solid tumor patients with tumor lysate-pulsed dendritic cellscan expand specific T cells and mediate tumor regression，”Cancer Res61：8513-8519；Heiser，2002.“Autologous dendritic cells transfectedwith prostate-specific antigen RNA stimulate CTL responses againstmetastatic prostate tumors，”J Clin Invest 109：409-417；Lodge等人，2000.“Dendritic cell-based immunotherapy of prostate cancer：immune monitoring of a phase II clinical trial，”Cancer Res 60：829-833；Fong等人，2001.“Dendritic cells injected via different routesinduce immunity in cancer patients，”J Immunol 166：4254-4259；以及Banchereau等人，2002.“Dendritic cells as vectors for therapy，”Cell 106：271-274)。尽管这些结果是有前途的，但需要确定DC接种的几个参数，其中包括DC的类型。
到目前为止，DC从造血祖先(progenitor)或从血液前体即单核细胞的长期培养产生。(Caux等人，1992.“GM-CSF and TNF-alphacooperate in the generation of dend ritic Langerhans cells，”Nature360：258-261；Romani等人，1994.“Proliferating dendritic cellprogenitors in human blood，”J Exp Med 180：83-93；Sallusto，F和Lanzavecchia，A.1994.“Efficient presentation of soluble antigen bycultured human dendritic cells is maintained bygranulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4and downregulated by tumor necrosis factor alpha，”J Exp Med 179：1109-1118；Reid等人，1992.“Interaction of tumor necrosis factor withgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor and other cytokinesin the regulation of dendritic cell growth in vitro form bipotent CD34+progenitors in human bone marrow，”J Immunol 149：2681-2688；Arrighi等人，1999.“Long-term culture of human CD34(+)progenitorswith FLT3-ligand，thrombopoietin，and stem cell factor inducesextensive amplification of a CD34(-)CD14(-)and a CD34(-)CD14(+)dendritic cell precursor，”Blood 93：2244-2252；Caux等人，1990.“Tumor necrosis factor α strongly potentiates interleukin-3 andgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor-inducedproliferation of human CD34+hematopoietic progenitor cells，”Blood75：2292-2298；Chang等人，2000.“Monocyte-derived CDla+andCDla-dendritic cell subsets differ in their cytokine production profiles，susceptibilities to transfection，and capacities to direct Th celldifferentiation，”Immunology 165：3584-3591；以及Weissman等人，2000.“HIV gag mRNA transfection of dendritic cells(DC)deliversencoded antigen to MHC class I and II molecules，causes DCmaturation，and induces a potent human in vitro primary immuneresponse，”Immunology 165：4710-4717)。
CD34+造血祖先细胞(HPCs)在用GM-CSF加TNF(GM-CSF/TNF)培养时产生DC制剂，该DC制剂由两个不同的DC亚群即朗格汉斯细胞(LC)和间质DC(intDCs)组成。这与将单核细胞用GM-CSF加IL-4(GM-CSF/IL-4)进行培养时产生的DC形成对照，后者含有与intDC类似的未成熟DC的均一群体。尽管GM-CSF/IL-4诱导的DC要求额外的成熟因子，但CD34-DC并不需要，因其是在DC激活因子TNFα的存在下产生的。美国专利No.6,004,807教导了使用补充了10％(v/v)热灭活胎牛血清的组织培养基从CD34造血祖先产生树突细胞。
从脐带血CD34+HPC培养物出现的具有不同生物学功能的两个DC亚群：早期研究以脐带血CD34+HPC进行，并通过用GM-CSF/TNF或IL-3/TNF培养使其分化偏转为DC。在这些培养条件中，TNF-α和GM-CSF/IL-3之间的协同作用对于DC从CD34+HPC的发育是关键的。事实上，尽管早期研究提示TNF为血细胞生成的抑制剂，但更近来观察到TNF是由IL-3或GM-CSF诱导的CD34+HPC增殖的刺激物。有限稀释分析显示，TNF增加IL-3应答细胞的频率和IL-3依赖性克隆的平均大小。12天的液体培养之后，用GM-CSF和TNF培养的CD34+HPC产生具有树突形态的贴壁或非贴壁细胞。对于DC的最佳产生，在培养的最初几天最需要TNF，其中TNF上调GM-CSF/IL-3/IL-5受体的通用链亚基的表达。TNF在CD34+HPC培养中作用的另一个重要的位点是粒细胞生成的分化和增殖的抑制。特别地，TNF在未定型CD13-CD15-母细胞水平上可逆地阻断粒细胞分化，未定型CD13-CD15-母细胞在TNF富集的培养物中积聚。此外，通过将细胞周期停滞于G0/G1来抑制定型粒细胞祖先(CD15+)的生长(Caux等人，1991.“Potentiation of early hematopoiesis by tumor necrosisfactor-alpha is followed by inhibition of granulopoietic differentiationand proliferation，”Blood 78：635-644；Jacobsen等人，1992.“Tumornecrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoieticprogenitor cell proliferation：role of colony-stimulating factor receptormodulation，”J Exp Med 175：1759-1772)。TNF在这些培养物中也阻断红细胞发生。TNF对生长的CD34+HPC的这些作用通过p55TNF受体介导(Rusten等人，1994.“Bifunctional effects of tumor necrosisfactor alpha(TNF alpha)on the growth of mature and primitivehuman hematopoietic progenitor cells：involvement of p55 and p75TNF receptors，”Blood 83：3152-3159)。
如上所述，在这些培养条件下，出现了CD1a+和CD14+两个前体亚群，它们可以分别分化为LC和intDC(Caux等人，1996.“CD34+hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate alongtwo independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNFalpha，”J Exp Med 184：695-706；Caux等人，1997.“CD34+hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate alongtwo independent dendritic cell pathways in response to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus tumor necrosis factoralpha：II.Functional analysis；”Blood 90：1458-1470)。两个前体亚群都在第12-14天成熟为具有典型形态学、表型(CD80、CD83、CD86、CD58、高HLA II类)和功能的DC。CD1a+前体产生具有朗格汉斯细胞特征(伯贝克颗粒、Lag抗原和E-钙粘着蛋白(E-cadherin))的细胞。不同的是，CD14+前体成熟为缺乏伯贝克颗粒、E-钙粘着蛋白和Lag抗原、但是表达皮肤树突细胞中描述的CD2、CD9、CD68和凝血因子XIIIa的CD1a+DC。有趣的是，CD14+前体，而非CD1a+前体，代表了双潜能细胞，其可以应答M-CSF、被诱导分化为缺乏对T细胞的附属功能的巨噬细胞样细胞。这些DC亚群差别在于(1)抗原捕获；intDC在葡聚糖摄取和结合免疫复合物中比LC更有效；(2)溶酶体活性，intDC表达较高水平的酶活性；(3)诱导原初B细胞分化的能力，intDC能够通过IL-12的分泌而独特地诱导原初B细胞的引发及其向分泌IgM的浆细胞的分化(Dubois等人，1997.“Dendritic cells enhance growth and differentiation of CD40-activated B lymphocytes，”J Exp Med 185：941-951；Dubois等人，1998.“Critical role of IL-12 in dendritic cell-induced differentiation ofnaive B lymphocytes，”J Immunol 161：2223-2231)；以及(4)尽管与CD40连接时两个亚群都表达IL-12，但仅仅intDC表达IL-10。尽管LC的独特功能有待确定，但有些报告提示，具有LC成分的CD34-DC在CD8T细胞引发中比单核细胞衍生的DC更有效(Mortarini等人，1997.“Autologous dendritic cells derived from CD34+progenitors and from monocytes are not functionally equivalentantigen-presenting cells in the induction of melan-A/Mart-1(27-35)-specific CTLs from peripheral blood lymphocytes of melanomapatients with low frequency of CTL precursors，”Cancer Res 57：5534-5541；以及Ferlazzo等人，2000.“Dendritic cells generated fromCD34+progenitor cells with flt3 ligand，c-kit ligand，GM-CSF，IL-4，and TNF-alpha are functional antigen-presenting cells resemblingmature monocyte-derived dendritic cells，”J Immunother 23：48-58)。这些观察在我们自己的研究当中得到证实，我们的研究证实，通过用GM-CSF和IL-15培养单核细胞诱导的具有朗罕氏细胞表型的DC，在CTL应答的体外诱导中，比GM-CSF/IL-4DC更有效(Mohamadzadeh等人，2001.“Interleukin 15 skews monocytedifferentiation into dendritic cells with features of Langerhans cells，”J Exp Med 194：1013-20)。在类似肿瘤特异性CTL的诱导的环境中，CD34-DC或含有朗格汉斯细胞的任何其他DC制剂因此可能是有利的。
G-CSF动员的血液CD34+HPC也产生两个DC亚群：以G-CSF动员、并从晚期黑素瘤患者分离的外周血遵循对脐带血公认的分化途径，且在培养第九天，可以鉴定两个群体，即CD1a+CD14-LC和CD1a-CD14+intDC。然而，这些培养物中约50％的细胞保持在祖先/前体阶段，并可以在进一步培养中产生DC。因此，这些培养是不同步的，这是使用这些DC制剂作为疫苗时需要考虑的参数。两个亚群都为CD83low CD86+HLA-DR+、MHC I类+(intDC表达略高水平的I类)，LC表达较高水平的CD11c和CD80。通过共聚焦显微镜证实其朗格汉斯细胞表型，共聚焦显微镜显示了Lag表达和相应于伯贝克颗粒的细胞质结构，两者均为LC专有。从第九天培养物分选的LC和intDC显示如下确定的DC性质：1)形态学，其中吉姆萨染色显示不同的核以及具有显著树突的细胞质结构；2)抗原捕获，其中intDC比LC捕获多得多的FITC-葡聚糖；以及3)T细胞应答的诱导，其中尽管CD1a+CD14-和CD1a-CD14+细胞都可以诱导异源T细胞增殖，但分选的CD1a+细胞在诱导对TT的回忆应答(使用自身CD4T细胞)和异源CD8T细胞的增殖中，比CD14+细胞效率高很多。由CD40L、IFNα或合成的dsRNA(多聚I:C)诱导成熟的LC和intDC引起同等增加的增殖性T细胞应答。
加载有抗原的CD34+HPC衍生的DC引起免疫及临床反应：如国际申请No.PCT/US02/07232(WO 02/072013)中所公开的，将CD34+HPC衍生的DC用以下六个Ag进行脉冲，并用于接种十八个IV期黑素瘤的HLA A*0201+患者：流行性感冒基质肽(matrix peptide)(Flu-MP)、KLH，以及从四个黑素瘤Ag(MART-1/Melan A、gp100、酪氨酸酶和MAGE-3)衍生的肽。以KLH、Flu间质肽和HLA-A2结合肽对DC进行加载，并在六周内进行每两周一次的施用(四次皮下注射)，其中HLA-A2结合肽衍生自四个黑素瘤抗原MAGE-3、MART-1/MELAN A、GP-100和酪氨酸酶。如上所述，这些DC含有朗格汉斯细胞成分。用抗原脉冲的CD34-DC对晚期黑素瘤患者的接种，经证明是充分耐受的，并且引起对“非自身”(病毒肽和KLH蛋白)和“自身”(黑素瘤肽)抗原的加强的免疫性。观察到血液中的免疫应答水平与该肿瘤位点的早期结果相关，因此，为血液中免疫应答测量有助于评价疫苗功效的想法提供进一步的促进。事实上，抗原脉冲的CD34+HPC衍生的DC诱导可以直接在血液中检测的初次和回忆免疫应答。在18个患者的16个中观察到对对照抗原(KLH、Flu-MP)的免疫应答。在相同的16个患者中观察到对一个或多个黑素瘤抗原(MelAg)的加强的免疫应答，所述患者包括10个对＞2MelAg应答的患者。DC接种后引起的MelAg特异性T细胞在无需事先离体(ex vivo)扩增的效应T细胞试验中是有功能并且可检测的。在与加载有抗原的DC的短期(1周)共培养后，无需外源细胞因子或用抗原多次重复刺激，它们就也能够增殖并具有效应功能。未能对对照和肿瘤抗原应答的两个患者经历了快速肿瘤进展。患有可评价疾病的17个患者中，对两个或更少的MelAg具有免疫性的患者中，6/7在研究入组(study entry)后10周患有渐进性疾病，形成对比的是，对＞2个MelAg具有免疫性的患者中，仅1/10有肿瘤进展。在这些患者中的7个中观察到＞1个肿瘤转移的衰退。DC接种后对黑素瘤抗原的总体免疫性与临床结果有关(p＝0.015)。
血液免疫应答分析证实，Ag-脉冲的CD34-DC可以导致CD4+和CD8+T细胞免疫性的快速诱导。事实上，单次DC接种对于在6个患者中的KLH特异性应答和8个患者中的Flu-MP特异性应答的诱导是足够的。单独的DC疫苗足以在5个患者中诱导对≥1个黑素瘤抗原的肿瘤特异性效应物。这5个患者中无一显示早期疾病进展。具有快速KLH应答的患者仅1/6经历早期疾病进展。快速和慢速Flu-MP应答者在疾病进展方面没有区别。因此，患者对CD4表位或对黑素瘤Ag快速应答的能力可以成为基于DC的接种之后临床结果的早期指示。
十一个患者接受4个额外的“加强”注射。研究入组的总存活分析显示，在第一年12/18的患者存活，在第二年9/18的患者存活。研究入组的总存活与10周时(即最初的4次注射之后)检测到的疫苗特异性免疫应答水平有关，如通过(1)量级，即黑素瘤Ag-特异性IFNγELISPOTS的数量，以及(2)幅度，即T细胞应答的黑素瘤抗原的数量来测量。最后，长期肿瘤衰退与表位的扩展相关。因此，显示DC疫苗中的朗格汉斯细胞成分是有益的。
树突细胞越来越多地用作接种载体来诱导抗原特异性免疫应答，例如在癌症患者中。由于用送递到DC上的肿瘤抗原进行免疫可诱导保护性抗肿瘤应答，以及用加载有抗原的DC对患者接种可以引起对肿瘤抗原的增加的免疫应答的证据，对肿瘤和感染性剂的治疗推荐用加载有抗原的DC进行接种。因此，产生加载有抗原的DC的方法的改进有利于任何接种程序。DC疫苗离体生产的现有方法基于培养CD34+造血祖先(美国专利No.6,004,807)或单核细胞(与GM-CSF和IL-4，继之以成熟步骤)，这些细胞组成树突细胞前体。然而，这些培养是长期的，且对于祖先和前体，分别需要至少9天和7天。另外，产生树突细胞后，DC需要用抗原进行脉冲，这要求额外的培养。
发现了在少至三(3)天内快速产生加载有抗原的树突细胞疫苗的方法。通过该方法产生的加载有抗原的树突细胞可以用于任何治疗性、诊断性、预防性或研究程序中。
发明概述
在一方面，本发明是从单核细胞离体生产加载有抗原的抗原呈递细胞的方法，包括同时将单核细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触。加载有抗原的抗原呈递细胞优选在少于四天内产生。在本方法中有用的抗原性材料由一种或多种材料组成，该材料选自抗原性肽、肽模拟物(peptidemimetics)、蛋白、多蛋白、免疫复合物、完整垂死细胞体、垂死细胞体片段、病毒载体和脂质体。在优选的方法中，抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。在另一个优选的方法中，抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。在另一个优选的方法中，可以将加载有抗原的抗原呈递细胞分离为含有一个或多个亚群的级分，这些亚群选自具有表面标志物(CD1a+CD207+)的细胞；具有表面标志物(CD1a+CD207-)的细胞；具有表面标志物(CD1a-CD14-)的细胞；以及具有表面标志物(CD14+CD1a-CD209+)的细胞。
在另一方面，本发明是从单核细胞离体生产加载有抗原的抗原呈递细胞的方法，包括在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，以形成抗原呈递细胞，并在第二个时间点将抗原呈递细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。在本方法中有用的抗原性材料由一种或多种材料组成，该材料选自抗原性肽、肽模拟物、蛋白、多蛋白、免疫复合物、完整垂死细胞体、垂死细胞体片段、病毒载体和脂质体。在优选的方法中，抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。在另一个优选的方法中，抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。在另一个优选的方法中，可以将加载有抗原的抗原呈递细胞分离为含有一个或多个亚群的级分，这些亚群选自具有表面标志物(CD1a+CD207+)的细胞；具有表面标志物(CD1a+CD207-)的细胞；具有表面标志物(CD1a-CD14-)的细胞；以及具有表面标志物(CD14+CD1a-CD209+)的细胞。
在另一方面，本发明是包括加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，根据下列步骤制备该细胞：同时将单核细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞。加载有抗原的抗原呈递细胞优选在少于四天内产生。该疫苗中的抗原性材料由一种或多种材料组成，该材料选自抗原性肽、肽模拟物、蛋白、多蛋白、免疫复合物、完整垂死细胞体、垂死细胞体片段、病毒载体和脂质体。在优选的疫苗中，抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。在另一个优选的疫苗中，抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。
在另一方面，本发明是包括加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，根据下列步骤制备该细胞：在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成抗原呈递细胞，在第二个时间点将抗原呈递细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。该疫苗中的抗原性材料由一种或多种材料组成，该材料选自抗原性肽、肽模拟物、蛋白、多蛋白、免疫复合物、完整垂死细胞体、垂死细胞体片段、病毒载体和脂质体。在优选的疫苗中，抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。在另一个优选的疫苗中，抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。
在另一方面，本发明是包括单核细胞衍生的加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，其中所述抗原呈递细胞包括朗格汉斯细胞和间质树突细胞。
在另一方面，本发明是包括单核细胞衍生的加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，其中所述抗原呈递细胞两个或更多个亚群组成，该亚群选自具有表面标志物(CD1a+CD207+)的细胞；具有表面标志物(CD1a+CD207-)的细胞；具有表面标志物(CD1a-CD14-)的细胞；以及具有表面标志物(CD14+CD1a-CD209+)的细胞。
在另一方面，本发明是在肿瘤患者中诱导肿瘤特异性免疫应答的方法，包括(1)产生包括加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，其中加载有抗原的抗原呈递细胞通过同时将单核细胞与拥有至少一种肿瘤抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子接触，离体衍生自单核细胞；以及(2)将该疫苗施用于患者，其中患者的细胞在与疫苗中加载有抗原的抗原呈递细胞接触后成熟以形成对肿瘤细胞表现细胞毒性活性的细胞毒性细胞。在另一个实施方案中，通过在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成抗原呈递细胞，在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与拥有至少一种肿瘤抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，来制备加载有抗原的抗原呈递细胞，其中加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。在优选的方法中，抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。在另一个优选的方法中，抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。在另一个优选的方法中，靶向的细胞毒性细胞为CD4阳性。在另一个优选的方法中，靶向的细胞毒性细胞为CD8阳性。
在另一方面，本发明是在肿瘤患者体内诱导肿瘤特异性应答的方法，包括(1)从患者分离单核细胞和细胞毒性细胞前体；(2)通过同时将所述单核细胞与拥有至少一种肿瘤抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，从患者的单核细胞产生加载有抗原的抗原呈递细胞；(3)将加载有抗原的抗原呈递细胞与分离的细胞毒性细胞前体在其可以成熟以形成细胞毒性细胞的条件下共培养；以及(4)将该细胞毒性细胞施用于患者，该细胞毒性细胞由此表现抗肿瘤细胞的细胞毒性活性。在另一个实施方案中，加载有抗原的抗原呈递细胞通过如下步骤产生：在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成抗原呈递细胞，在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与拥有至少一种肿瘤抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。在优选的方法中。在优选的方法中，抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。在另一个优选的方法中，抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。在一个优选的方法中，细胞毒性细胞为CD4阳性。在另一个优选的方法中，细胞毒性细胞为CD8阳性。
在另一方面，本发明是在患者体内诱导免疫应答的方法，包括：(1)产生包括加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，其中加载有抗原的抗原呈递细胞通过同时将单核细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，离体衍生于单核细胞；以及(2)将该疫苗施用于患者，其中患者的细胞在与疫苗中加载有抗原的抗原呈递细胞接触后成熟，以形成表现抗该抗原免疫活性的细胞。在优选的实施方案中，加载有抗原的抗原呈递细胞通过以下步骤制备：在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触以形成抗原呈递细胞，在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。在优选的实施方案中，该抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。在另一个优选的方法中，抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。在一个优选的方法中，靶向的细胞毒性细胞为CD4阳性。在另一个优选的方法中，靶向的细胞毒性细胞为CD8阳性。
在另一方面，本发明是确立(mount)由细胞毒性T细胞介导的免疫应答的方法，包括：(1)通过同时将单核细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，从单核细胞离体产生加载有抗原的抗原呈递细胞；(2)在T细胞可以成熟形成细胞毒性T细胞的条件下，将该加载有抗原的抗原呈递细胞与原初T细胞共培养；以及(3)将该细胞毒性T细胞与拥有该抗原的靶细胞接触，其中细胞毒性T细胞对拥有该抗原的靶细胞表现细胞毒活性。在另一个实施方案中，加载有抗原的抗原呈递细胞通过以下步骤制备：在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触以形成抗原呈递细胞，在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。在优选的实施方案中，该抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。在另一个优选的方法中，抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。在一个优选的方法中，细胞毒性细胞为CD4阳性。在另一个优选的方法中，细胞毒性细胞为CD8阳性。
在另一方面，本发明是修饰患者免疫应答的方法，包括：(1)产生加载有抗原的抗原呈递细胞，其中加载有抗原的抗原呈递细胞通过同时将单核细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，离体衍生于单核细胞；以及(2)将该抗原呈递细胞施用于患者，其中与加载有抗原的抗原呈递细胞接触的患者细胞被调节为不对该抗原表现免疫活性。
在另一个方面，本发明是产生由两个或更多个亚群组成的加载有抗原的抗原呈递细胞级分的方法，包括：(1)同时将单核细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞；(2)从该加载有抗原的抗原呈递细胞分离两个或更多个亚群，其中各亚群在施用于患者时，能引起不同的T细胞应答并确立不同的免疫应答；以及(3)联合两个或更多个亚群以形成加载有抗原的抗原呈递细胞级分。
附图简述
图1A-F描述与用GM-CSF/IL-4(图1D-1F)培养的单核细胞相比，用GM-CSF/TNFα(图1A-1C)培养第三天的单核细胞在FSC/SSC、CD1a/CD14和CD1a/HLA-DR方面的表型。如在用GM-CSF和IL-4的对照培养物中所预期的，细胞成为CD14阴性，且约50％的细胞获得与DC分化一致的CD1a表达(图1E)。然而，在用GM-CSF和TNFα的第三天培养物中，可见两个分离的群体：CD1a+CD14-(20％)细胞和CD1a-CD14+(24％)细胞(图1B)。
图2A和2B描述与用GM-CSF/IL-4(图2A)培养的单核细胞相比，以GM-CSF/TNFα(图2B)培养第三天的单核细胞在DC-SIGN和Langerin(分别为间质DC(intDC)和朗格汉斯细胞(LC)的表面标志物)方面的表型。TNF培养物含有差异地表达DC-SIGN和Langerin的细胞。与TNF-DC不同，IL4-DC是均一的，细胞大部分为与intDC分化一致的DC-SIGN+Langerin-。
图3A-3F描述与使用GM-CSF/IL-4处理方法制备的树突细胞相比，用GM-CSF/TNFα对单核细胞培养三天产生的树突细胞的抗原捕获效率。TNF-DC在捕获可溶性(FITC-葡聚糖)(图3A-3B)和颗粒性(杀伤的肿瘤细胞)抗原(图3C)中都和GM-CSF/IL-4DC(可溶性FITC-葡聚糖在图3D和3E中；颗粒性抗原在图3F中)一样有效。
图4描述与GM-CSF/IL-4DC相比，第三天的GM-CSF/TNF DC启动免疫应答的能力，如通过异源CD4T细胞增殖的诱导所证实的。第三天的GM-CSF/TNF DC和GM-CSF/IL-4DC都证实了诱导CD4T细胞增殖的能力。
图5描述与GM-CSF/IL-4DC相比，第三天的GM-CSF/TNF DC诱导异源CD8T细胞增殖的能力。第三天的GM-CSF/TNF DC和GM-CSF/IL-4DC都证实了诱导CD8T细胞增殖的能力。
图6A和6B描述单核细胞诱导异源CD4T细胞增殖的能力，所述单核细胞用或不用杀伤的肿瘤细胞以及GM-CSF/TNFα(图6B)或GM-CSF/IL-4(图6A)培养3天。第三天的GM-CSF/TNFα/杀伤的肿瘤细胞的一步疫苗(one-step vaccine)能够诱导异源CD4T细胞增殖。
图7A和7B描述单核细胞诱导异源CD8T细胞增殖的能力，所述单核细胞用或不用杀伤的肿瘤细胞以及GM-CSF/TNFα(图7B)或GM-CSF/IL-4(图7A)培养3天。第三天的GM-CSF/TNFα/杀伤的肿瘤细胞的一步疫苗能够诱导异源CD8T细胞增殖。
图8A和8B描述单核细胞向自身CD4T细胞呈递肿瘤细胞抗原的能力，所述单核细胞用或不用杀伤的肿瘤细胞以及GM-CSF/TNFα(图8B)或GM-CSF/IL-4(图8A)培养3天。如通过其诱导自身CD4T细胞增殖所证实的，第三天的GM-CSF/TNFα/杀伤的肿瘤细胞的一步疫苗能够向自身CD4T细胞呈递肿瘤细胞抗原。
图9A-9L描述单核细胞分化为树突细胞的两个亚群，即朗格汉斯细胞(Langerin+及DC-SIGN-)和间质树突细胞(Langerin-和DC-SIGN+)的能力，所述单核细胞用或不用杀伤的肿瘤细胞以及GM-CSF/TNFα培养3天。在单核细胞∶肿瘤体比率为1∶0.1时，肿瘤体的滴定显示最佳分化(图9L)。
图10A-10I描述单核细胞分化为树突细胞的两个亚群，即朗格汉斯细胞(Langerin+及DC-SIGN-)和间质树突细胞(Langerin-和DC-SIGN+)的能力，所述单核细胞用GM-CSF/TNFα培养3天，并在单核细胞培养第二天以分级剂量添加杀伤的肿瘤细胞来培养。
图11描述单核细胞向自身免疫效应细胞(外周血淋巴细胞)呈递肿瘤细胞抗原的能力，所述单核细胞用或不用杀伤的肿瘤细胞以及GM-CSF/TNFα培养3天。在单核细胞∶肿瘤体比率为1∶0.3时观察到最佳呈递。
图12A和12B描述单核细胞诱导自身CD8+T细胞分化为细胞毒性T细胞(CTL)的能力，该细胞毒性T细胞能够在已经培养2周之后杀伤黑素瘤细胞，所述单核细胞用(图12B)或不用(图12A)杀伤的肿瘤细胞以及GM-CSF/TNFα培养3天。
图13A和13B描述单核细胞诱导自身CD8+T细胞分化为细胞毒性T细胞(CTL)的能力，该细胞毒性T细胞能够在3次刺激之后杀伤黑素瘤细胞，所述单核细胞用(图13B)或不用(图13A)杀伤的肿瘤细胞以及GM-CSF/TNFα培养3天。
图14A和14B描述单核细胞诱导自身CD8+T细胞分化为细胞毒性T细胞(CTL)的能力，该细胞毒性T细胞能够在2次刺激之后杀伤黑素瘤细胞，所述单核细胞用(图14B)或不用(图14A)杀伤的肿瘤细胞以及GM-CSF/IL-4培养3天。
图15A-15D描述GM-CSF/TNFαDC诱导肽特异性回忆CD8T细胞应答的能力。将Flu-MP肽脉冲的GM-CSF/IL-4DC或GM-CSF/TNFαDC以1∶10的比例，与自身CD8T细胞和细胞因子补料(IL-7和IL-2，10U/ml)培养。在第10天，以抗-CD8(横坐标)和Flu-MP四聚物(纵坐标)标记T细胞，以确定特异性CD8T细胞的扩增。Flu-MP肽脉冲的GM-CSF/TNFαDC显示在10天培养物中可有效诱导Flu-MP特异性CD8T细胞的扩增。
图16描述在GM-CSF/TNFαDC不同亚群的表面表型方面的DC基因表达模式，显示CD14+intDC(水平条纹)、CD1a+LC(打点的)以及CD14-CD1a-DN-DC(垂直条纹)的指示基因(横坐标)的表达倍数(纵坐标)。呈递的基因CD1a、DC-SIGN(也被称为CD209)以及Langerin(也被称为CD207)选自这些DC亚群间统计学上显著的差异表达基因。CD14+亚群表达DC-SIGN，表示是intDC。CD1a+亚群表达Langerin，表示是LC。DN(双阴性)亚群不显著表达任何上述选择的标志物。
图17描述GM-CSF/TNFαDC不同亚群的细胞因子mRNA的差异表达，显示CD14+intDC(水平条纹)、CD1a+LC(打点的)以及CD14-CD1a-DN-DC(垂直条纹)的指示基因(横坐标)的表达倍数(纵坐标)。DC亚群表现细胞因子IL-1、IL-15、IL-8、LTB(淋巴毒素β)和TGFA(转化生长因子α)的显著差异表达，CD14+亚群表达IL-1；CD1a+DC亚群主要表达TGFA和IL-8；以及DN亚群表达IL-15和LTB。
图18描述GM-CSF/TNFαDC亚群诱导原初异源CD4T细胞旺盛增殖的能力。将总DC培养物或分选的亚群以分级剂量(横坐标)与原初(CD45RA+CCR7+CD45RO-)CD4+T细胞平板接种。通过于第5天胸苷整合(纵坐标)来测量增殖。所有亚群能够引发原初CD4T细胞；然而，用intDC(CD14+)的培养物中的CD4T细胞增殖较不明显。
图19描述由GM-CSF/TNFαDC不同亚群引发的CD4T细胞中趋化因子受体的差异表达，显示用intDC(CD14，水平条纹)、CD1a DC(LC，打点的)或DN-DC(垂直条纹)的培养物中的表达倍数(纵坐标)。
详述
本发明涉及离体产生人类抗原呈递细胞的组合物和方法。本发明更特别地涉及使用激活剂产生抗原呈递细胞的方法和组合物，该激活剂包括但是不限于TNFα，优选与生长因子组合，该生长因子包括但是不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。本发明特别适于从血液前体离体产生树突细胞。
本发明是离体或体外从血液前体例如单核细胞生产抗原呈递细胞的方法，以用于治疗(疫苗)、诊断(免疫监控)和研究(肿瘤抗原的鉴定)目的，该方法包括将血液前体与组合物接触，所述组合物包括优选与至少一种生长因子(包括但是不限于GM-CSF)组合的激活剂，该激活剂包括但是不限于肿瘤坏死因子(TNF)α。如此处所使用，将TNFα定义为在本发明方法中起激活剂功能的TNFα或任何TNF或TNF样蛋白。与本发明有关的生长因子和/或激活因子的制剂包括但是不限于重组分子和/或病毒载体和/或类肽(peptoids)和/或任何可以触发前体进行生长因子和/或激活剂内源性释放的分子。这些包括间质DC和朗格汉斯细胞(LC)混合物的树突细胞可以对抗原进行致敏，并施用于患者以调节患者体内对该抗原的免疫应答。本发明也包括含有树突细胞的组合物，该树突细胞根据本方法产生。本发明中有用的抗原性材料包括可溶性或颗粒性抗原性材料。当使用完整肿瘤细胞作为抗原性材料时，该细胞既可以是死亡的也可以是垂死的，且如此处所使用，认为任一术语是等价的。
一方面，本发明是离体从单核细胞生产疫苗的一步法，包括将单核细胞与组合物接触，所述组合物包括例如优选与至少一种生长因子例如GM-CSF和至少一种可溶性或颗粒性抗原组合的TNFα。本发明也包括根据本方法产生的一步疫苗。根据本发明的方法，加载有抗原树突细胞疫苗可以在少至三(3)天之内产生。通过将单核细胞和可溶性或颗粒性抗原(例如杀伤的肿瘤细胞)与生长因子(例如GM-CSF)和激活剂(例如TNFα)培养，可制备这些树突细胞。重要的是，报道的作为癌症疫苗的单核细胞衍生的树突细胞的产生需要与白细胞介素4(IL-4)或IL-13组合的GM-CSF或IL-3的使用。这些细胞因子都与T细胞应答向2型或调节T细胞的极化强烈相关，这并非肿瘤疫苗接种的情况中所希望的。本发明因此有助于树突细胞疫苗的产生，且这类疫苗现在可以用于大规模临床试验。
目前发现，促炎细胞因子例如GM-CSF和TNFα将促进单核细胞向树突细胞的分化，树突细胞包括至少四个树突细胞亚群，即具有表面标志物(CD1a+CD 14-CD207+)的朗格汉斯细胞(LC)、具有表面标志物(CD1a+CD14+CD207-)的间质DC(intDC)、具有表面标志物(CD1a-CD14-)的双阴性DC(DN-DC)以及具有表面标志物(CD1a-CD14+CD209+)的第四个亚群。这些树突细胞前体可以捕获抗原并随后离体分化为可用于临床试验的加载有抗原的及抗原呈递的树突细胞。另外，现在发现产生树突细胞疫苗所需的三个因子，即树突细胞前体、抗原和细胞因子，可以同时置于一起以快速产生加载有抗原的树突细胞疫苗。和现有的耗时并且需要三个步骤的技术(即，从祖先或前体的树突细胞离体产生，分别用9和7天；随后的抗原加载，以及从单核细胞产生树突细胞时该细胞的活化)不同，本发明允许树突细胞的快速、一步产生，其中组合了所述过程中所有必需的因子。
根据本发明方法，该疫苗由血液白细胞提取法制备，其中通过粘附或通过排除或通过正选择分离单核细胞。然后在组织培养袋或塑料培养皿或Nunc Cell factories中培养这种分离的单核细胞。在第一天添加细胞因子；在第一天或第二天添加抗原，例如以杀伤的肿瘤细胞的形式；在第三天施用疫苗。
在本发明的另一方面，该疫苗为冷冻的，用于加强注射。另一方面，该疫苗用于制备用于加强注射的外来体。另一方面，由该疫苗制备的外来体用作抗原制剂，以与单核细胞和细胞因子混合以制备疫苗。
根据本发明的方法，该疫苗由血液单位制备，其中通过粘附或通过排除或通过正选择分离单核细胞。然后在组织培养袋或塑料培养皿或Nunc Cell factories中培养这种分离的单核细胞。在第一天添加细胞因子；在第一天或第二天添加抗原，例如以杀伤的肿瘤细胞的形式；在第三天施用疫苗。在本发明的这个实施方案中，为各注射新鲜制备该疫苗，并每月制备血液汲取物(draw)。
一方面，本发明是体外或离体产生抗原特异性CD4+T淋巴细胞的方法，包括提供抗原致敏的树突细胞，该细胞通过以下步骤制备：将血液前体与包括例如优选与至少一种生长因子如GM-CSF组合的TNFα的组合物接触，以形成树突细胞；使该树突细胞对至少一种可溶性或颗粒性抗原致敏以形成抗原致敏的树突细胞；将该抗原致敏的树突细胞与包括T淋巴细胞的细胞群体接触，以形成活化的抗原特异性CD4+T淋巴细胞。可以将这些抗原特异性CD4+T淋巴细胞施用于患者以调节该患者体内的免疫应答。本发明也包含包括抗原特异性CD4+T淋巴细胞的组合物，所述CD4+T淋巴细胞根据此方法产生。
一方面，本发明是体外或离体产生抗原特异性CD4+T淋巴细胞的方法，包括提供抗原致敏的树突细胞，该细胞通过以下步骤制备：将血液前体与包括例如优选与至少一种生长因子例如GM-CSF、以及可溶性或颗粒性抗原组合的TNFα的组合物接触，以形成抗原致敏的树突细胞；将该抗原致敏的树突细胞与包括T淋巴细胞的细胞群体接触，以形成活化的抗原特异性CD4+T淋巴细胞。可以将这些抗原特异性CD4+T淋巴细胞施用于患者以调节该患者体内的免疫应答。本发明也包含包括抗原特异性CD4+T淋巴细胞的组合物，所述CD4+T淋巴细胞根据此方法产生。
一方面，本发明是体外或离体产生抗原特异性CD8+T淋巴细胞的方法，包括提供抗原致敏的树突细胞，该细胞通过以下步骤制备：将血液前体与包括例如优选与至少一种生长因子例如GM-CSF组合的TNFα的组合物接触，以形成树突细胞；使该树突细胞对至少一种抗原致敏以形成抗原致敏的树突细胞；将该抗原致敏的树突细胞与包括T淋巴细胞的细胞群体接触，以形成活化的抗原特异性CD8+T淋巴细胞。可以将这些抗原特异性CD8+T淋巴细胞施用于患者以调节该患者体内的免疫应答。本发明也包含包括抗原特异性CD8+T淋巴细胞的组合物，所述CD8+T淋巴细胞根据此方法产生。
一方面，本发明是体外或离体产生抗原特异性CD8+T淋巴细胞的方法，包括提供抗原致敏的树突细胞，该细胞通过以下步骤制备：将血液前体与包括例如优选与至少一种生长因子例如GM-CSF、以及至少一种可溶性或颗粒性抗原组合的TNFα的组合物接触，以形成抗原致敏的树突细胞；将该抗原致敏的树突细胞与包括T淋巴细胞的细胞群体接触，以形成活化的抗原特异性CD8+T淋巴细胞。可以将这些抗原特异性CD8+T淋巴细胞施用于患者以调节该患者体内的免疫应答。本发明也包含包括抗原特异性CD8+T淋巴细胞的组合物，所述CD8+T淋巴细胞根据此方法产生。
通用方法：
此处所用本发明的加载有抗原的DC的快速生产方法在下面详细说明。应当理解，这些方法意为具有代表性的，并将诸如本领域所知的修改预期为本发明的部分。
细胞培养。使用Ficoll-Paque密度梯度离心，从健康志愿者或晚期黑素瘤患者的外周血分离单核的细胞。通过使用微珠进行排除或2小时塑料粘附方法富集单核细胞。将单核细胞以1×106细胞/孔、在3ml补充了2mM L-谷氨酰胺、200UI/ml青霉素、200μg/ml链霉素和10％FBS或5％自身血清的血清补料的RPMI 1640培养基中，接种于6孔板中。将杀伤的肿瘤细胞以1×106个死细胞/孔的密度加入6孔板中。将单核细胞用GM-CSF(100ng/ml，Immunex，Seattle，WA)和TNFα(20ng/ml，R&D)培养三天。
肿瘤细胞系的杀伤。
可以从多个癌细胞系制备杀伤的肿瘤细胞。肿瘤细胞来源包括但是不限于此处列出的那些，另外的细胞系的选择和杀伤这些细胞的方法的变化完全在本领域技术人员的知识之内。本发明中有用的杀伤癌细胞的方法包括但是不限于引起DNA损伤的条件例如辐射，或经Fas连接、TNF或TRAIL的受体介导的细胞死亡。下面提供示例性方法。
一旦汇合，就收获细胞系并以1×106细胞/ml的密度在小瓶中培养。对于1806乳腺癌细胞系和Colo 829黑素瘤细胞系，经过以TNF-α(以100ng/ml使用)的致敏步骤后，将细胞照射90分钟，并在无血清培养基中培养48小时。对于Me275黑素瘤细胞系，将细胞用桦木酸(BA)(10μg/ml，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)培养48小时。通过FITC-膜联蛋白V和碘化丙锭双染、以及通过锥虫蓝排除(＜25％生存力)评价细胞死亡。
流式细胞术(FACS)分析。
培养3天后，处理细胞以使用FITC-CD1a和PE-CD14、PE-CD80、PE-CD83或PE-CD86双染(于4℃进行30分钟)。
自身增殖测定。
培养3天后，使用该细胞作为自身CD4T细胞的刺激物。将分级剂量的刺激细胞与1×105个CD4+T细胞在含有10％人AB血清的完全RPMI 1640中接种于圆底微量(microtest)组织培养板中。温育4天后，细胞以1μCi[3H]胸苷脉冲过夜以测定T细胞增殖。
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生测定。
培养3天后，使用该细胞作为自身CD8T细胞和/或自身外周血淋巴细胞(PBL)的刺激物。每周对培养物重复刺激，并在第一周内补充IL-7，接下来的星期补充IL-2。在使用产生肿瘤体的黑素瘤细胞作为靶的标准铬释放测定中测试CTL活性。
疫苗的产生
本发明的疫苗可用于产生能够免疫应答的DC，是相对于已报导的要求多重步骤和长培养时间的方法的显著进步。下文描述了产生一步疫苗的详细示例性程序。应当理解，在本领域技术人员能力之内的培养条件和制备方法中的修改或变化被预期为本发明的部分。
从健康志愿者或晚期黑素瘤患者的外周血分离单核的细胞。血液采集之前，为了外周血干细胞的动员，任选地将重组的人类G-CSF(Amgen，Thousand Oaks，CA)施用于个体(Banchereau等人，2001)。使用Ficoll-Paque密度梯度离心收集单核细胞，并重悬于CM培养基中。可以通过在37℃将单核细胞在塑料皿上粘附2小时而对其进行富集(Falcon 6-well，Franklin Lakes，NJ)。作为选择，可以根据厂商程序使用DynalMonocyte Negative Isolation Kit(Dynal，LakeSuccess，NY)去除T细胞、B细胞、天然杀伤细胞和粒细胞，从而富集单核细胞。
将单核细胞以1×106细胞/孔、在3ml补充了2mM L-谷氨酰胺、200UI/ml青霉素、200μg/ml链霉素(均购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)和10％胎牛血清(FBS，Hyclone)或5％自身血清(R&D)的血清补料的RPMI 1640培养基中，接种于6孔板中(Falcon)。将单核细胞用100ng/ml的GM-CSF(Immunex，Seattle，WA)和20ng/ml的TNFα(R&D)培养三天。将杀伤的肿瘤细胞以1×106个死细胞/孔的密度加入6孔板中。在另一个实施方案中，在第二天而非第一天添加杀伤的肿瘤细胞，不影响DC的免疫应答能力。将培养物在37℃温育3天。
可以通过许多方法评价培养物：(1)检查DC的形态学；(2)通过下面描述的FACS分析细胞标志物的存在；(3)在下面自身增殖测定中描述的促进CD4+/CD8+T细胞增殖的能力；以及(4)在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生测定中描述的诱导细胞毒性T细胞诱导的裂解的能力。
实施例1：用GM-CSF和TNFα培养3天的单核细胞产生两个能够
捕获抗原并诱导免疫应答的树突细胞亚群
从用GM-CSF和TNFα培养3天的单核细胞产生的两个类型的DC
通过排除分离单核细胞，并用GM-CSF/IL-4或GM-CSF/TNFα培养三(3)天。GM-CSF/IL-4和GM-CSF/TNFα培养物都表现出典型的树突细胞形态学，当在相差显微镜下观察活体时，所述典型的树突细胞形态学以庞大精巧的从细胞体向许多方向突出的突起或盖膜(veils)为特征(Banchereau和Steinman，1998)。培养的单核细胞在细胞因子的刺激下发育出细胞标志物。可以通过使用荧光染料标记的单克隆抗体对细胞染色来观察这些新的细胞标志物，并在荧光显微镜下观察形态学和细胞分布。作为选择，可以如图1A-1F中通过流式细胞术分析具有某种类型标志物的群体中的细胞百分比。
如在用GM-CSF和IL-4进行的对照培养物(下文中称为GM-CSF/IL4-DC)中所预期，第三天的细胞成为CD14-(阴性)，且约50％的细胞获得与DC分化一致的CD1a表达(图1E)，其注定成为intDC。用GM-CSF和TNFα进行的第三天培养物(下文中称为GM-CSF/TNF-DC)则不同，观察到专有地表达CD1a或CD 14的两个分离的群体。CD1a+CD14-和CD1a-CD14+细胞分别代表约20％和24％的细胞群，分别代表朗格汉斯DC和intDC(图1B)。
可以使用另一套标志物区分朗格汉斯细胞和间质DC，即朗格汉斯细胞(LC)仅表达Langerin标志物，而间质DC(intDC)仅表达DC-SIGN。当以FITC标记的DC-SIGN或荧光染料PE-CD207染色时，可以对细胞群体检查这两种标志物的存在或不存在，辅助以流式细胞术时，可以计算其百分比。如图2B中所示，用GM-CSF/TNFα进行的第三天单核细胞培养物含有差异表达DC-SIGN(％)和Langerin(％)的细胞，显示朗格汉斯细胞和间质细胞两者的形成。相反地，在GM-CSF/IL4存在下培养的第三天单核细胞仅被FlTC-DC-SIGN染色，而不被PE-CD207/Langerin染色，显示仅产生朗格汉斯细胞(图2A)。上述结果显示，TNF诱导单核细胞分化为两个树突细胞亚群：朗格汉斯细胞和间质DC。
由GM-CSF/TNFα诱导的DC在抗原捕获中有效
本发明显示，在GM-CSF/TNFα存在下产生的树突细胞在抗原捕获中与目前使用GM-CSF/IL4的方法一样有效。
未成熟DC的主要功能是捕获抗原作为抗原捕获并将抗原呈递给细胞表面过程中起始的第一步骤。DC通过几个不同的方法捕获抗原，包括(1)能够捕获大颗粒的吞噬作用或(2)受体介导的胞吞作用。图3A-3F阐明了在GM-CSF/TNF或GM-CSF/IL-4存在下产生的树突细胞捕获可溶性抗原或大颗粒的能力。对于可溶性抗原，如先前所描述的使用FITC标记的葡聚糖(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)(Caux等人，1997.“CD34+hematopoietic progenitors fromhuman cord blood differentiate along two independent dendritic cellpathways in response to granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor plus tumor necrosis factor alpha：II.Functional analysis，”Blood90：1458-1470)。对于大的颗粒性抗原，收获垂死的肿瘤细胞(黑素瘤或乳腺癌)，以磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，并如先前所描述的以DNA特异性荧光染料7-氨基放线菌素(7-aminoactinomycin，7-AAD)(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)进行标记(Nouri-Shirazi等人，2000.“Dendritic cells capture tumor cell bodies and process/presenttheir antigens to elicit primary immune responses，”J Immunol 165：3797-3803；以及Berard等人，2000.“Priming of
CD8 T cellsagainst melanoma antigens using dendritic cells loaded with killedallogeneic melanoma cells，”J Exp Med 192：1535-1544)。收获、洗涤未成熟的DC，并以抗CD11c单克隆抗体进行标记，该抗体以荧光染料藻红蛋白(BDIS)使用常规程序进行标记。染色后，将DC洗涤并以2×105细胞/ml的浓度重悬。将FITC-葡聚糖以1mg/ml的浓度、在4℃或37℃与DC细胞进行共培养。同时将杀伤的肿瘤细胞与DC细胞以1∶1的比率于37℃共培养1小时。
使用流式细胞术，以对CD11c和葡聚糖(图3A、3B、3D和3E)或对CD11c和7-AAD(图3C和3F)双阳性的DC的百分比测量DC对FITC-葡聚糖或7-AAD标记的肿瘤细胞体的加载。与GM-CSF/IL-4-DC相比，第三天的GM-CSF/TNF-DC以相似的水平捕获可溶性(FITC-葡聚糖)和颗粒性(杀伤的肿瘤细胞)抗原。
经GM-CSF/TNF产生的第三天的DC有效地启动免疫反应
本发明显示，以GM-CSF/TNF方法产生的第三天的DC通过诱导CD4+和CD8+T细胞的增殖有效地启动免疫反应。
捕获和加工抗原后，未成熟DC成熟并获得诱导免疫应答的能力。DC可以刺激多种T细胞的向外生长(outgrowth)和活化，例如通过具有I类MHC的DC刺激CD8 T细胞进入细胞毒性T细胞，或者通过具有II类MHC的DC刺激CD4+T细胞进入辅助T细胞(Banchereau和Steinman，1998)。
在增殖测定中，将从GM-CSF/TNF或GM-CSF/IL4产生的第三天的DC以每孔0至2500个抗原呈递细胞(APC)的分级剂量接种于96孔板内。从Ficoll分离的健康个体的PBMC获得纯化的CD4+和CD8+细胞，通过多种单克隆抗体排除其他细胞类型(Nouri-Shirazi等人，2000.“Dendritic cells capture killed tumor cells and present theirantigens to elicit tumor-specific immune responses，”J Immunol 165：3797-3803)，并以5×104/孔/200μl加入含有DC的孔中。经过四天的温育，以1μCi/孔的活性加入含氚胸苷(Wallace，Inc.，Gaithersburg，MD)。将板于16小时后收获，根据厂商说明，通过液体闪烁照相术测量整合的放射性。
如图4所示，通过与GM-CSF/IL4DC同样有效的异源CD4T细胞增殖的诱导证实，第三天的GM-CSF/TNF-DC可以启动免疫反应，这种能力似乎是剂量依赖的。来自GM-CSF/TNFα和GM/CSF/IL4的DC都能够以相对少量的细胞刺激CD8型T细胞的增殖(图5)。
总而言之，本发明证实，用GM-CSF和TNFα培养三天的单核细胞产生朗格汉斯细胞和intDC，这些DC能够捕获抗原并诱导免疫应答。
实施例2：一步疫苗引起两个能够捕获抗原并诱导免疫应答的树突细
胞亚群
本发明提供了全新的、可以在仅三天之内产生能够免疫应答的DC细胞的一步法。与已报导的需要多重步骤和长期温育从单核细胞制备树突细胞的方法不同，本发明方法包括在GM-CSF/TNFα存在下同时将单核细胞与抗原性材料温育，将抗原呈递给在早期的DC。由几种量度标准认为以所述方法产生的DC是成熟的：(1)被捕获并加工的抗原；(2)诱导CD4和CD8细胞增殖的能力；以及(3)向T细胞呈递抗原的能力。下文描述该一步疫苗的不同方面。
将单核细胞与杀伤的肿瘤细胞混合，并在含有或不含有IL-4或TNFα的GM-CSF存在下培养3天，来证实该一步疫苗捕获抗原的能力。在第3天，吉姆萨染色的细胞显示杀伤的肿瘤细胞的捕获。特别是在第3天的GM-CSF/TNF培养物中，剩下很少的未捕获的肿瘤体。
与杀伤的肿瘤细胞培养的第3天的GM-CSF/TNF细胞保留DC特性，且它们能够诱导CD4(图6A和6B)和CD8型(图7A和7B)异源T细胞的增殖。与杀伤的肿瘤细胞培养的第3天的GM-CSF/TNF细胞比在不存在抗原时产生的DC更有能力刺激CD8型T细胞增殖(图7B)。更重要的是，如通过其诱导自身CD4T细胞增殖的能力所证实的，GM-CSF/TNF-DC可以呈递肿瘤细胞抗原(图8B)。通过该一步疫苗产生的已接触过抗原的那些DC，在向自身CD4 T细胞呈递肿瘤细胞抗原中大大优越。
用肿瘤体和GM-CSF/TNFα培养的单核细胞的详细表型分析显示，单核细胞保持其分化为树突细胞两个亚群(即朗格汉斯细胞和间质DC)的能力(图9A-9L)。在1∶0.1的单核细胞：杀伤的肿瘤细胞比率时见到最佳分化。在更高的单核细胞：肿瘤体比率例如1∶1和1∶0.3时，通过Langerin标志物减少的出现，证实朗格汉斯细胞比例。如图10A-10I所示，也可以在第2天向单核细胞培养物添加杀伤的肿瘤细胞，其中单核细胞在此分化为朗格汉斯细胞和间质DC。前向散射/侧向散射流式细胞术图显示，该细胞群体含有指示朗格汉斯和intDC的CD14+型和CD1a型(图10E-10F)。这些实验说明，在第1天或第2天添加抗原不影响产生这两种类型树突细胞的过程。另外，这些实验说明使用目前稀释滴度作为指南实验性确定特定抗原比率的需要。
一步疫苗的细胞也能够将肿瘤细胞抗原呈递给免疫效应物的混合物。实际上，如图11所示，用杀伤的肿瘤细胞和GM-CSF/TNFα培养3天的单核细胞能够诱导自身外周血淋巴细胞的增殖。在此情况下，单核细胞∶肿瘤体比率在1∶0.3最佳。
一步疫苗诱导细胞毒性T细胞杀伤黑素瘤
本发明的一步疫苗证实诱导抗黑素瘤的细胞毒性作用的能力。该一步疫苗的产生如实施例1和2中所描述，只是除了杀伤的黑素瘤Colo829细胞作为抗原性材料存在于单核细胞培养物中。
一旦汇合，收获Colo 829黑素瘤细胞系，并以1×106细胞/ml的密度在小瓶中培养。用TNF-α(100ng/ml)的致敏步骤之后，将细胞照射90分钟，并在无血清培养基中培养48小时。通过FITC-膜联蛋白V和碘化丙锭双染以及锥虫蓝排除(＜25％生存力)评价细胞死亡。
CTL产生测定
培养3天后，使用该细胞作为自身CD8T细胞和/或自身外周血淋巴细胞(PBL)的刺激物。每周对培养物重复刺激，并在第一周内补充IL-7，接下来的星期补充IL-2。在使用产生肿瘤体的黑素瘤细胞作为靶的标准铬释放测定中测试CTL活性。
最后，一步疫苗的细胞诱导自身CD8T细胞分化为能够杀伤用作抗原的黑素瘤细胞的CTL(图12A、12B、13A、13B、14A和14B)。没有以抗原(杀伤的Colo 829黑素瘤细胞)脉冲的疫苗不能诱导细胞毒性T细胞介导的K562和Colo黑素瘤肿瘤细胞的裂解。以杀伤的Colo 829黑素瘤细胞脉冲的一步疫苗，通过细胞毒性T细胞的刺激选择性地引起黑素瘤肿瘤细胞而不是对照肿瘤细胞系K562的裂解。刺激细胞毒性T细胞两次与三次刺激一样有效(图13B和14B)。另外，该一步疫苗诱导细胞毒性T细胞介导的黑素瘤细胞的能力与先前报导方法中的GM-CSF/IL-4疫苗相似。
使用此处说明的方法，可以使用其他类型的肿瘤细胞脉冲DC细胞，可以使用此处概括的测定来测量对这些肿瘤的毒性，且可以使用此处概括的方法和范围实验性确定效应物对靶比率的最佳比率。总之，此处提供的数据证实了一步疫苗在治疗和根除黑素瘤中抗黑素瘤的能力。另外，使用此处概括的方法，证实了该方法在治疗其他类型癌症中的潜力。
实施例3：从用GM-CSF和TNFα培养3天的单核细胞衍生树突细胞
的进一步表征
在另一个研究中，通过排除分离单核细胞并用GM-CSF/TNFα培养3天。产生的GM-CSF/TNF-DC能够向自身T细胞呈递抗原。如图15D所示，Flu-MP肽脉冲的GM-CSF/TNF-DC在一周培养中对诱导Flu-MP特异性CD8T细胞的扩增有效。
在进一步的检查中，发现GM-CSF/TNF-DC由具有不同生物学特性的不同亚群组成：LC(CD1a+CD14-CD207+)，intDC(CD1a+CD14+CD207-)以及DN-DC(CD1a-CD14-)。使用抗指出的表面标志物CD1a(Biosource)、CD207(Beckman-Coulter)、CD14(BDIS)抗体的表面染色，并使用流式细胞术(FACSVantage，BDIS)分选之后，亚群得以分离。微阵列分析证实，这些DC亚群显示独特的可以转化为独特的生物学功能的分子特征。特定基因家族的预分析显示抗原加工性分子、趋化因子及其受体、细胞因子及其受体和粘附分子的差异表达。在图16和17中给出少数差异表达的实例。如图16所示，与表面表型一致，GM-CSF/TNF-DC的CD1a+亚群表达指示朗格汉斯细胞分化的高水平CD1a和Langerin mRNA(CD207+)。CD14+亚群表达与间质DC分化一致的DC-SIGN mRNA(CD209+)。DN-DC不显著地表达任何选择的标志物。如图17所示，三个亚群表达不同的细胞因子，即CD1a+DC主要表达TGF-α和IL-8，而CD14+DC表达IL-1。有趣的是，DN-DC表达高水平的淋巴毒素β(LTB)mRNA和IL-15，IL-15是CD8+效应/记忆T细胞成熟所必需的细胞因子。
GM-CSF/TNF-DC的不同亚群诱导不同的T细胞应答，从而表现不同的功能。与原初的异源CD8或CD4T细胞培养未活化GM-CSF/TNF-DC的分选的亚群。在两个水平分析T细胞应答：(a)培养5天后的增殖(含氚胸苷整合)，以及(b)使用Affymetrix微阵列芯片的总体mRNA分析。GM-CSF/TNF-DC的所有亚群诱导原初异源CD8T细胞的旺盛增殖。所有亚群也能够引发原初CD4T细胞；然而，在与intDC(CD14+)的培养物中，CD4T细胞增殖较不明显(图18)。与其他GM-CSF/TNF-DC亚群相比，CD4T细胞中的总体mRNA表达分析显示出对intDC(CD14+)的CD4T细胞应答的惊人差异。例如，我们观察到由不同GM-CSF/TNF-DC亚群引发的趋化因子受体(CXCR4、CCR5、CCR2和CCR7)在CD4T细胞中的差异表达(图19)，显示这些T细胞可以表现不同的迁移能力。
在GM-CSF/TNF-DC的进一步研究中，第四个亚群特征为(CD1a-CD14+CD209+)。
实施例4：以单核细胞衍生疫苗治疗黑素瘤患者
为了证明以本发明的单核细胞衍生疫苗对黑素瘤患者的治疗，以与CD34+祖先衍生的DC的试验相似的程序，将疫苗施用于经活组织检查证实为IV期黑素瘤的患者(Banchereau等人，2001.“Immune andclinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+)progenitor-derived dendritic cell vaccine，”Cancer Res 61：6451-6458)。
为了制备疫苗，也通过Ficoll-Paque密度梯度离心从每个患者的外周血分离单核细胞，通过排除或粘附方法富集，并接种到具有培养基的微量培养板上，该培养基含有GM-CSF和TNFα。通过下列方法之一制备疫苗：(1)在第1天，以本领域公知的优选方法杀伤黑素瘤细胞(来自细胞系Colo 829或来自每个单独患者)，并添加到具有单核细胞和GM-CSF/TNFα的培养基中；(2)在第1天，将所有细胞暴露于匙孔血蓝蛋白(KLH)，用限制的流行性感冒基质肽(Flu-MP)脉冲细胞亚群，即20％，用衍生于四个黑素瘤抗原的肽，例如MalanA/MART-1、酪氨酸酶、MAGE-3和gp100，脉冲剩余的细胞(即80％)；(3)在第2天，通过照射杀伤黑素瘤细胞(来自细胞系Colo 829或来自每个单独患者)，并添加到具有单核细胞和GM-CSF/TNFα的培养基中；或(4)在第2天，将所有细胞暴露于匙孔血蓝蛋白(KLH)，用限制的流行性感冒基质肽(Flu-MP)脉冲细胞亚群，即20％，用衍生于四个黑素瘤抗原的肽，例如MalanA/MART-1、酪氨酸酶、MAGE-3和gp100，脉冲剩余的细胞(即80％)。在培养第3天，收获并洗涤加载有抗原的抗原呈递细胞，并配制为疫苗。然后使用标准评价疫苗，该标准包括但是不限于使用下列在实施例1和2中充分说明的程序：DC形态学；通过表型分析确定的细胞制剂中至少20％DC的最小值(剩余部分含有DC前体等)；和/或与一个单克隆抗体实验组的反应性，以确定细胞标志物，和/或在患者体内使用之前刺激淋巴细胞反应的能力。
以本发明的疫苗在6周长的门诊病人疗程中治疗患者，每14天进行接种，总共4次接种。将疫苗在包括大腿和上臂的三个注射位点施用于患者。在接种前至少两个时间点、以及每次接种后5和/或14天和第四次接种后14或28天进行免疫学监控。所有患者在试验前以及第四次接种后四周经受肿瘤状况评价。将靶损害增加高于25％和/或出现新的损害定义为疾病进展。将患者应答的分析分成几组，即对至少一种黑素瘤抗原的应答；对多个黑素瘤抗原的应答；对杀伤的完整黑素瘤细胞的应答；以及对对照抗原例如KLH和Flu-MP的应答。免疫学应答与肿瘤进展数据相关。
实施例5：以单核细胞衍生的加载有抗原的抗原呈递细胞诱导抗原特
异的无应答性
用抗原性材料加载根据本发明制备的树突细胞，T细胞对该抗原性材料可表现无反应性。在本方法中，将T细胞暴露于GM-CFS和TNFα产生的加载有抗原的DC的CD14+CD1a-亚群。这样，T细胞可以识别抗原，但是在用相同抗原重复刺激时，变得无反应性，不能增殖。
从由Ficoll分离的健康志愿者PBMC获得纯化的CD4+T细胞，并使用CD8(B9.11)、CD14(RMO52)、CD16(3G8)、CD19(J4.119)、CD56(NKH-1)、抗-HLA-DR(B8.12.2)、抗血型糖蛋白A(D2.10)单克隆抗体(mAbs)(Beckman-Coulter，Miami，FL)和山羊抗小鼠IgG Dynabeads(Dynal，Lake Success，NY)排除其他细胞。富集群体的纯度＞90％。如此处所描述的制备加载有抗原的DC并用于刺激原初CD4 T细胞。
可以进行耐受测定，其中在24孔板中将纯化的CD4+T细胞(106/孔)与单核细胞衍生的DC的CD14+CD1a-亚群共培养，该亚群是如此处所述用TNFα和GM-CSF制备的。五天后，收获并洗涤T细胞，并静置额外2天。在增殖测定中以适宜的抗原重新攻击来自原代培养物的T细胞，其中通过含氚胸苷的摄入(最后16小时中1μCi/孔)测定增殖。
总体而言，本发明是在三天内制备树突细胞疫苗的方法。在优选的方法中，用可用的加载有抗原的树突细胞疫苗在三天内以一个步骤产生树突细胞并向其加载抗原。在另一个方法中，用可用的加载有抗原的树突细胞疫苗在三天内以两个步骤产生树突细胞并向其加载抗原。在优选的方法中，从血液白细胞提取法制备树突细胞疫苗。在另一个优选的方法中，从血液单位中制备疫苗。在优选的方法中，通过将前体暴露于化学物/肽/模拟细胞因子的类肽来制备疫苗。在另一个优选的方法中，可以使用触发细胞因子从单核细胞释放的分子和/或颗粒制备疫苗。根据本发明的优选方法制备的树突细胞疫苗使用优选与生长因子组合的激活剂衍生自单核细胞，所述激活剂包括但是不限于TNFα，所述生长因子包括但是不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，而不使用白细胞介素4也不使用白细胞介素13。根据本发明优选方法制备的树突细胞疫苗优选含有朗格汉斯细胞，并使用优选与生长因子组合的激活剂衍生自单核细胞，所述激活剂包括但是不限于TNFα，所述生长因子包括但是不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，而不使用白细胞介素4、转化生长因子β或白细胞介素15。关于抗原的加载，优选以可溶性或颗粒性抗原性材料加载本发明的树突细胞疫苗，所述抗原性材料包括但是不限于可溶性蛋白例如免疫复合物或杀伤的肿瘤细胞。在另一个方法中，使用外来体加载本发明的树突细胞疫苗。
根据这些方法，产生的疫苗优选由来自血液前体的树突细胞的两个亚群组成，包括但是不限于朗格汉斯细胞和间质树突细胞。根据本发明方法制备的树突细胞疫苗可以用于多种目的，包括但是不限于下列：(1)疾病的治疗，包括但是不限于癌症、感染性疾病、病毒性疾病以及自身免疫病；(2)产生外来体；(3)在体外测定中监控肿瘤特异性免疫应答；以及(4)在体外测定中监控抗原特异性免疫应答。
本发明也是使用一步三天树突细胞疫苗在体外或体内诱导抗肿瘤细胞的细胞毒性免疫应答的方法。根据本发明的方法，可以诱导抗共有的肿瘤抗原或抗多个肿瘤抗原的细胞毒性免疫应答。产生的免疫效应细胞可以是CD4阳性细胞、CD8阳性细胞、天然杀伤细胞或天然杀伤T细胞。在优选的方法中，在体内产生免疫效应细胞。在另一个优选方法中，离体产生免疫效应细胞，并施用于患者。在另一个优选方法中，为体外研究目的产生免疫效应细胞。
Claims (37)
1.从单核细胞离体生产加载有抗原的抗原呈递细胞的方法，包括同时将所述单核细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触。
2.权利要求1的方法，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。
3.从单核细胞离体生产加载有抗原的抗原呈递细胞的方法，包括在一个时间点将所述单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，以形成抗原呈递细胞，并在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述抗原性材料由一种或多种材料组成，该材料选自抗原性肽、肽模拟物、蛋白、多蛋白、免疫复合物、完整垂死细胞体、垂死细胞体片段、病毒载体和脂质体。
5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。
6.权利要求1-3任一项的方法，其中所述抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。
7.权利要求1、2、3、4、5和6任一项的方法，进一步包括将所述加载有抗原的抗原呈递细胞分离为包含一个或多个亚群的级分，所述亚群选自具有表面标志物(CD1a+CD207+)的细胞；具有表面标志物(CD1a+CD207-)的细胞；具有表面标志物(CD1a-CD14-)的细胞；以及具有表面标志物(CD14+CD1a-CD209+)的细胞。
8.包括加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，所述加载有抗原的抗原呈递细胞按照如下步骤制备：同时将所述单核细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原提呈细胞在少于四天内产生。
9.包括加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，所述加载有抗原的抗原呈递细胞按照如下步骤制备：在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成抗原呈递细胞，并在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。
10.权利要求8或9的疫苗，其中所述抗原性材料由一种或多种材料组成，该材料选自抗原性肽、肽模拟物、蛋白、多蛋白、完整垂死细胞体和垂死细胞体片段。
11.权利要求8或9的疫苗，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。
12.权利要求8或9的疫苗，其中所述抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。
13.包括单核细胞衍生的加载有抗原的抗原呈递细胞的疫苗，其中所述抗原呈递细胞由一个或多个亚群组成，该亚群选自具有表面标志物(CD1a+CD207+)的细胞；具有表面标志物(CD1a+CD207-)的细胞；具有表面标志物(CD1a-CD14-)的细胞；以及具有表面标志物(CD14+CD1a-CD209+)的细胞。
14.通过同时将单核细胞与拥有至少一种肿瘤抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触制得的加载有抗原的抗原呈递细胞在制备治疗患者肿瘤的疫苗中的用途。其中所述患者的细胞在与所述疫苗中所述加载的抗原呈递细胞接触后成熟，形成表现抗所述肿瘤细胞的细胞毒性活性的细胞毒性细胞。
15.权利要求14的用途，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。
16.通过在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触形成抗原呈递细胞，并在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与拥有至少一种肿瘤抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料接触形成的加载有抗原的抗原呈递细胞在制备治疗患者肿瘤的疫苗中的用途，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生，以及
其中所述患者的细胞在与所述疫苗中所述加载的抗原呈递细胞接触后成熟，形成表现抗所述肿瘤细胞的细胞毒性活性的细胞毒性细胞。
17.生产对来自肿瘤患者的肿瘤细胞表达细胞毒性活性的细胞毒性细胞的方法，包括：
通过同时将分离自所述患者的单核细胞与拥有至少一种肿瘤抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，从所述单核细胞制备所述加载有抗原的抗原呈递细胞；
将该加载有抗原的抗原呈递细胞与分离自所述患者的细胞毒性细胞前体在适合其成熟的条件下共培养以形成细胞毒性细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。
19.按照权利要求17的方法产生的细胞毒性细胞在制备诱导肿瘤特异性免疫反应的药物中的用途。
20.生产对来自肿瘤患者的肿瘤细胞表达细胞毒性活性的细胞毒性细胞的方法，包括：
在一个时间点将分离自所述患者的单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，以形成抗原呈递细胞，并在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与拥有至少一种肿瘤抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生；
将该加载有抗原的抗原呈递细胞与分离自所述患者的细胞毒性细胞前体在适合其成熟的条件下共培养以形成细胞毒性细胞。
21.按照权利要求20的方法产生的细胞毒性细胞在制备诱导肿瘤特异性免疫反应的药物中的用途。
22.通过同时将单核细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，从所述单核细胞离体制备的加载有抗原的抗原呈递细胞在制备在患者中诱导免疫反应的疫苗中的用途；
其中所述患者的细胞在与所述疫苗中所述加载的抗原呈递细胞接触后成熟，形成表现抗所述抗原的免疫活性的细胞。
23.权利要求22的用途，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。
24.通过在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成抗原呈递细胞，并在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料接触而形成的加载有抗原的抗原呈递细胞在制备在患者中诱导免疫反应的疫苗中的用途，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生；
其中所述患者的细胞在与所述疫苗中所述加载的抗原呈递细胞接触后成熟，形成表现抗所述抗原的免疫活性的细胞。
25.确立由细胞毒性T细胞介导的免疫应答的体外方法，包括：
通过同时将单核细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，从所述单核细胞离体产生加载有抗原的抗原呈递细胞；
将所述加载有抗原的抗原呈递细胞与原初T细胞在适合T细胞成熟的条件下共培养以形成细胞毒性T细胞；以及
将所述细胞毒性T细胞与拥有所述抗原的靶细胞接触，
其中所述细胞毒性T细胞表现对所述拥有所述抗原的靶细胞的细胞毒性活性。
26.权利要求25的方法，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生。
27.确立由细胞毒性T细胞介导的免疫应答的体外方法，包括：
产生包括加载有抗原的抗原呈递细胞，所述加载有抗原的抗原呈递细胞通过如下步骤制备：在一个时间点将单核细胞与肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成抗原呈递细胞，并在第二个时间点将所述抗原呈递细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞，其中所述加载有抗原的抗原呈递细胞在少于四天内产生；
将所述加载有抗原的抗原呈递细胞与原初T细胞在适合T细胞成熟的条件下共培养以形成细胞毒性T细胞；以及
将所述细胞毒性T细胞与拥有所述抗原的靶细胞接触，
其中所述细胞毒性T细胞表现对所述拥有所述抗原的靶细胞的细胞毒性活性。
28.权利要求17-18、20和25-27任一项的方法，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。
29.权利要求14-16、19和21-24任一项的用途，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料组成。
30.权利要求17-18、20和25-27任一项的方法，其中所述抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。
31.权利要求14-16、19和21-24任一项的用途，其中所述抗原性材料由完整垂死细胞体、垂死细胞体片段或两者组成。
32.权利要求17-18、20、25-27、28和30任一项的方法，其中细胞毒性细胞为CD4阳性。
33.权利要求14-16、19、21-24、29和31任一项的用途，其中细胞毒性细胞为CD4阳性。
34.权利要求17-18、20、25-27、28和30任一项的方法，其中细胞毒性细胞为CD8阳性。
35.权利要求14-16、19、21-24、29和31任一项的用途，其中细胞毒性细胞为CD8阳性。
36.通过同时将单核细胞与拥有至少一种免疫应答所需抗原的可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子接触，从单核细胞离体衍生的加载有抗原的抗原呈递细胞在制备在患者中修饰免疫反应的药物中的用途；
其中该患者的细胞在与所述加载的抗原呈递细胞接触后被调节为不表现抗所述抗原的免疫学活性。
37.产生由两个或更多个亚群组成的加载有抗原的抗原呈递细胞级分的方法，包括
同时将单核细胞与可溶性或颗粒性抗原性材料、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子离体接触，以形成加载有抗原的抗原呈递细胞；
从所述加载有抗原的抗原呈递细胞分离两个或更多个亚群，其中各亚群能够在施用于患者时引起不同的T细胞应答并确立不同的免疫应答；
组合两个或更多个所述亚群以形成所述加载有抗原的抗原呈递细胞级分。
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- 2013-06-19 JP JP2013128381A patent/JP5919226B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
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| blood dendritic c ells multi potential differentiation orco mmitted subsets PALUCKA A K et al,blood,Vol.94 No.10 1999 * |
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