KR20220098351A - 수지상 세포 및 T 세포의 활성화를 증진시키고 Th-1 면역 반응을 유도하기 위한 시험관내 방법 및 조성물 - Google Patents

수지상 세포 및 T 세포의 활성화를 증진시키고 Th-1 면역 반응을 유도하기 위한 시험관내 방법 및 조성물 Download PDF

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마닉스 레오 보쉬
린다 에프. 파워스
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노쓰웨스트 바이오써라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 증진된 항원 특이적 Th1 면역 반응을 수득하기 위한 조성물 및 시험관내 또는 생체외 방법을 제공한다. 상기 조성물은 시험관내에서 생산된 활성화 증진된 수지상 세포 또는 T 세포를 포함할 수 있다. 상기 방법은 미성숙한 수지상 세포를 수지상 세포 성숙화제, 인터페론 γ 및 과다활성화된 수지상 세포를 생산할 수 있는 염증-활성화 지질을 포함하는 성숙화제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 성숙화 동안 성숙화 중인 수지상 세포를 미리 결정된 항원과 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 과다활성 수지상 세포를 사용하여 나이브 T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 활성화된 T 세포는 이러한 치료를 필요로 하는 개체에게의 투여를 위해 제제화될 수 있는 것인 시험관내 또는 생체외 방법이 또한 제공된다.

Description

수지상 세포 및 T 세포의 활성화를 증진시키고 Th-1 면역 반응을 유도하기 위한 시험관내 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 10월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 62/912,005를 우선권 주장하며, 이 가출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 포함된다.
항원 제시 세포 (APC)는 효과적인 면역 반응을 도출하는데 중요하다. 이들은 항원-특이적 T 세포 수용체를 가진 T 세포에 항원을 제시할 뿐만 아니라, T 세포 활성화에 필요한 신호도 제공한다. 이들 신호는 불완전하게 정의된 상태로 남아 있으나 다양한 세포 표면 분자 뿐만 아니라 시토카인 또는 성장 인자를 수반한다. 나이브 또는 비분극화된 T 세포의 활성화에 필요한 인자는 기억 T 세포의 재활성화에 필요한 것들과 상이할 수 있다. 항원을 제시하면서 또한 T 세포 활성화를 위한 신호도 전달하는 APC의 능력은 통상 부수적인 세포 기능으로 지칭된다. 단핵구 및 B 세포가 적격 APC인 것으로 제시된 바 있지만, 그의 항원 제시 능력은 이전에 감작된 T 세포의 그의 활성화에 제한되는 것으로 보인다. 따라서, 이들은 기능적으로 나이브 또는 비프라이밍된 T 세포 집단을 직접적으로 활성화시킬 수는 없다.
수지상 세포 (DC)는 나이브 및 기억 T 세포 둘 다를 활성화시킬 수 있는 것으로 여겨지는 면역계의 전문적 항원 제시 세포이다. 수지상 세포는 면역요법, 특히 암의 면역요법에서 사용하기 위해 생체외에서 점점 더 제조되고 있다. 최적의 면역자극 특성을 가진 수지상 세포의 제조는 생체외 배양을 위한 이들 세포의 생물학에 대한 이해와 활용을 필요로 한다. 이들 세포의 배양을 위한 다양한 프로토콜이, 각각의 프로토콜로 인한 다양한 이점과 함께 기재되어 있다. 최근의 프로토콜은 무혈청 배지의 사용, 및 배양된 세포에 원하는 면역자극 특성을 부여하는 성숙화 조건의 이용을 포함한다.
수지상 세포의 성숙화는 피부 랑게르한스 세포와 표현형적으로 유사한 미성숙한 DC를 림프절로 이동할 수 있는 성숙한, 항원 제시 세포로 전환시키는 과정이다. 이 과정은 미성숙한 수지상 세포를 특성화하는 강력한 항원 흡수 능력의 상실, 및 공동-자극 세포 표면 분자 및 다양한 시토카인의 발현에서의 상향-조절을 초래한다.
많은 공지된 성숙화 프로토콜은 DC가 항원에 대한 노출 동안 또는 후에 직면하는 것으로 여겨지는 생체내 환경을 기반으로 한다. 이 접근법의 가장 좋은 예는 세포 배양 배지로서 단핵구 조건 배지 (MCM)의 사용이다. MCM은 단핵구를 배양함으로써 시험관내에서 생성되고 성숙화 인자의 공급원으로서 사용된다. 성숙화를 담당하는 MCM의 주요 구성요소는 (전)염증성 시토카인 인터류킨 1 베타 (IL-1β), 인터류킨 6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)인 것으로 보고된다. 다른 성숙화 인자는 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 폴리-dIdC, 장내혈관 펩티드 (VIP), 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS), 바실루스 칼메트-게랑(Bacillus Calmette-Guerin) (BCG), 뿐만 아니라 다른 미코박테리아 또는 미코박테리아의 구성요소, 예컨대 특이적 세포벽 구성성분을 포함한다.
수지상 세포에 의한 IL-12 생산의 증진은 인터페론 감마 (IFNγ)를 특정 수지상 세포 성숙화 인자, 예컨대 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS), BCG, 및 CD40L과 조합함으로써 보고된 바 있다. 그러나, LPS, BCG 및 CD40L은 성숙화 동안 소량의 IL-12를 유도하는 공지된 능력을 갖는다. 게다가, BCG는 상당한 양의 IL-10을 유도하는 것으로 제시된 바 있으며, 이와 같이 단독 사용 시 Th2 면역 반응을 유도하는 것으로 원래 생각되었다. 이제 IFNγ의 첨가는 시험관내에서 배양된 미성숙한 수지상 세포에 첨가되는 경우 LPS, BCG 또는 CD40L과 조합되는 경우 IL-12의 생산을 증진시키는 것으로 제시된 바 있다. 인터페론 감마 신호전달은 Jak2-Stat1 경로를 사용하며, 이 경로는 Stat1의 위치 701에 있는 티로신 잔기의 티로신 인산화를 핵으로의 그의 이동 전에 그리고 인터페론 감마-반응성 유전자의 전사의 뒤이은 증진을 포함한다. 그러나, 인간 단핵구-유래 수지상 세포의 신호 전달 경로에 대해서는 아직 공지된 바가 거의 없다. 이들 세포에서 IFNγ 작용에 대한 메커니즘은 완전히 확립된 바 없다.
최근에, 과다활성 DC는 생육력을 유지하면서 염증성 시토카인을 시토졸로부터 (예를 들어, IL-1β) 및 생합성 경로로부터 (예를 들어, TNFα) 분비하는 것으로 제시된 바 있다. 이들 속성은 산화된 인지질, 예컨대 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC)의 혼합물, 그의 치환기 및 유도체를 포함한, 다양한 미생물 또는 숙주-유래 산물에 의해 달성된 바 있다.
IL-1 및 IL-18을 포함한, 시토카인의 인터류킨-1 (IL-1) 패밀리는 일반적으로 T 세포 생물학, 특히 기억 T 세포 생성 및 CD8+ T 세포의 이펙터 기능에서 역할을 한다. 게다가, IL-1은 미리 수임된 T 헬퍼 (TH) 세포 계통에서 고유 IL-1 수용체 (IL-1R) 신호전달을 활성화시키고, 증가된 T 이펙터 시토카인 생산을 위한 신호로서 작용한다. IL-1 용법이 백신접종 보호 활성을 증가시키기 위해, 약하거나 비효율적인 백신에서 아주반트로서 제안된 바 있다. 따라서, 염증-활성화제 예컨대 산화된 인지질은 산화된 지질을 면역원을 가진 환자에게 투여하는 경우 수지상 세포의 과다활성화를 증진시키고 개선된 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 생체내 과다활성 수지상 세포의 유도제로서 조사된 바 있다.
본 발명의 내용란은 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 하기에 추가로 기재되는 단순화된 형태의 개념 선택을 도입하기 위해 제공된다. 본 발명의 내용란은 청구된 대상의 주요 특색을 확인하려고 하는 것도 아니며, 청구된 대상의 범주를 결정하는데 도움으로서 사용하려고 하는 것도 아니다.
본 발명은 광범위한 면역 자극을 동시에 제공하는 작용제의 조합 (즉, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 염증-활성화 지질과 조합된 수지상 세포 성숙화제)으로, 과다활성 성숙한 수지상 세포를 생산하기 위해 미성숙한 수지상 세포 (DC)의 시험관내 또는 생체외 성숙화를 유도하고, 이들 세포를 증진된 T 세포 반응, 증진된 Th1 반응, 및/또는 항원-특이적 세포독성 T 세포 반응을 포함한, 증진된 면역 반응을 위해 프라이밍하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 성숙한 과다활성 수지상 세포 집단을 생산하기 위한 방법으로서, 미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 및 미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시켜 과다활성 성숙한 수지상 세포 집단을 형성하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 성숙한 과다활성 수지상 세포 집단은 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 그리고 염증-활성화 지질 없이 단지 수지상 세포 성숙화제와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉된 성숙한 수지상 세포 집단에 의해 유도된 것보다 증가된 수준의 IL-1, 특히, IL-1β, 이펙터 및 기억 T 세포 생성에서의 증가, 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및 활성화에서의 증가를 생성한다. 유사하게, 과다활성화된 DC는 인터페론 γ와 조합하여 또는 그 없이 그리고 염증-활성화 지질 없이 단지 수지상 세포 성숙화제와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉된 성숙한 수지상 세포 집단에 의해 유도된 것보다 더 많은 양의 Th-1 자극 시토카인 및 더 적은 양의 Th-2 자극 시토카인을 생산한다.
미성숙한 수지상 세포는, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 접촉하기 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉될 수 있다. 미리 결정된 항원이 성숙화 후에 수지상 세포와 접촉되는 경우, 또는 항원 흡수가 실질적으로 감소된 경우, 항원은, 예를 들어, 삼투 로딩과 같은 공지된 수단에 의해 내재화될 수 있다.
미리 결정된 항원은, 예를 들어, 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 재조합 항원을 발현하는 형질전환된 또는 형질감염된 세포, 예컨대 종양 연관 종양 항원, 또는 종양 특이적 항원, 세포 용해물, 예컨대 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 종양 연관 또는 종양 특이적 항원, 펩티드 항원 (예를 들어, 합성 종양 연관, 또는 종양 특이적 펩티드 연관 또는 종양 특이적 항원), 또는 단리된 항원, 예를 들어, 단리된 박테리아, 바이러스, 종양 연관 또는 종양 특이적 항원일 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하거나 또는 풍부화하는 것; 및 전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 시험관내에서 또는 생체외에서 배양하여 미성숙한 수지상 세포의 집단을 형성하는 것을 임의로 추가로 포함한다. 적합한 수지상 세포 분화제는, 예를 들어, GM-CSF, 또는 GM-CSF와 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 13 (IL-13), 또는 인터류킨 15 (IL-15)의 조합을 포함한다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 인간 대상체로부터 단리될 수 있다.
또 다른 측면에서, 성숙한 과다활성 수지상 세포 집단을 생산하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법이 제공된다. 상기 방법은 일반적으로 미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 및 미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 유효량의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시켜 성숙한 과다활성 수지상 세포 집단을 형성하는 것을 포함한다. 생성된 성숙한 과다활성 수지상 세포 집단은 증진된 면역 반응을 생성한다. 증진된 면역 반응은 증진된 1형 면역 반응일 수 있다. 미성숙한 수지상 세포는 미성숙한 수지상 세포를, 인터페론 γ와 조합하여 또는 그 없이, 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 접촉시키기 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉될 수 있다. 항원이 완전 성숙화 후에 수지상 세포와 접촉되는 경우 또는 항원 흡수가 실질적으로 감소되는 경우, 항원은, 예를 들어, 삼투 로딩과 같은 공지된 수단에 의해 수지상 세포 내로 수송될 수 있다.
미리 결정된 항원은, 예를 들어, 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 재조합 항원을 발현하는 형질전환된 또는 형질감염된 세포, 예컨대 종양 연관 또는 종양 특이적 항원, 박테리아 항원, 또는 바이러스 항원, 세포 용해물, 예컨대 종양 세포 또는 박테리아 세포 용해물, 막 제제, 예컨대 종양 또는 박테리아 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 (즉, 합성 펩티드), 또는 단리된 항원일 수 있으며, 여기서 항원은 박테리아, 바이러스, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원이다.
특정 실시양태에서, 시험관내 또는 생체외 방법은 단핵구 수지상 세포 전구체가 풍부화된 세포 집단을 단리하거나 또는 제공하는 것; 및 전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 시험관내에서 또는 생체외에서 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것을 임의로 추가로 포함할 수 있다. 적합한 수지상 세포 분화제는, 예를 들어, GM-CSF, 또는 GM-CSF와 IL-4, IL-13 또는 IL-15의 조합을 포함한다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 인간 대상체로부터 단리될 수 있다.
또 다른 측면에서, T 세포를 활성화시키기 위한 조성물이 제공된다. 조성물은 성숙화에 적합한 조건 하에, 인터페론 γ (IFNγ)와 함께 또는 그 없이, 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질로 시험관내에서 또는 생체외에서 성숙화된 수지상 세포 집단; 및 미리 결정된 항원을 포함할 수 있다. 수지상 세포 집단은 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 그리고 염증-활성화 지질 없이 단지 수지상 세포 성숙화제와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉된 성숙한 수지상 세포 집단에 의해 유도된 것보다 증가된 수준의 IL-1, 특히, IL-1β, 증진된 면역 반응, 그리고 바람직하게는 Th1 반응에서의 증가, 그리고 보다 바람직하게는 이펙터 및 기억 T 세포 생성에서의 증가, 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및 활성화에서의 증가를 생성할 수 있다.
또 다른 측면에서, 단리된, 미성숙한 수지상 세포 집단을 포함하는 조성물이 제공된다. 세포 집단은 미성숙한 단핵구 수지상 세포, 및 미성숙한 수지상 세포의 성숙화를 유도하기 위한, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질을 포함한다. 생성된 성숙한 과다활성 수지상 세포는 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 그리고 염증-활성화 지질 없이 단지 수지상 세포 성숙화제와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉된 성숙한 수지상 세포 집단에 의해 유도된 것보다 증가된 수준의 IL-1, 특히, IL-1β, 이펙터 및 기억 T 세포 생성에서의 증가, 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및/또는 활성화에서의 증가를 생성한다. 세포 집단은 미리 결정된 항원 및/또는 단리된 T 세포, 예컨대 나이브 T 세포를 임의로 포함할 수 있다. T 세포는 단리된 림프구의 제제에 임의로 존재할 수 있다.
활성화된 T 세포를 생산하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 일반적으로 미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 미성숙한 수지상 세포를 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시키는 것; 및 미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 접촉시켜 성숙한 과다활성 수지상 세포를 형성하는 것을 포함한다. 성숙한 과다활성 수지상 세포는 나이브 T 세포와 접촉시켜 1형 (Th-1) 반응에 대해 분극화되고/거나 증진된 수준의 IFNγ를 생산하는 활성화된 T 세포를 형성할 수 있다. 적합한 항원은, 예를 들어, 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 재조합 항원을 발현하는 형질전환된 또는 형질감염된 세포, 예컨대 박테리아, 바이러스, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원, 세포 용해물, 예컨대 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 막 제제, 예컨대 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 (예를 들어, 합성 펩티드 항원), 또는 단리된 항원을 포함하며, 여기서 항원은 박테리아, 바이러스, 종양 연관 또는 종양 특이적 항원이다.
미성숙한 수지상 세포는 미리 결정된 항원, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 동시에 접촉될 수 있거나, 또는 상기 세포는, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 접촉하기 전에 미리 결정된 항원과 접촉될 수 있다. 수지상 세포는 또한, 예를 들어, 삼투 로딩과 같은 공지된 방법을 사용하여 증진된 완전 성숙화 및 항원 흡수 후에 항원과 접촉될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시험관내 또는 생체외 방법은 단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하는 것; 및 전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 시험관내에서 또는 생체외에서 배양하여 미성숙한 수지상 세포의 형성을 유도하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 수지상 세포 분화제는, 예를 들어, GM-CSF, 또는 GM-CSF와 IL-4, IL-13, 또는 IL-15의 조합을 포함한다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 인간 대상체로부터 임의로 단리될 수 있다. 특정한 실시양태에서 미성숙한 수지상 세포 및 T 세포는 서로에 대해 자가유래 또는 이종이다.
더 많은 IL-12를 생산하는 단리된 성숙한 과다활성 수지상 세포가 또한 제공된다. 성숙한 수지상 세포는 미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질을 포함하는 조성물로 시험관내에서 또는 생체외에서 성숙화함으로써 제공될 수 있다. 미리 결정된 항원이 단리된 성숙한 수지상 세포에 임의로 포함될 수 있다. 미리 결정된 항원이 로딩된 단리된 성숙한 과다활성 수지상 세포가 또한 제공된다. 수지상 세포는 성숙화 동안 박테리아, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 그리고 염증-활성화 지질 없이 수지상 세포 성숙화제의 존재 하에 배양된 유사한 미성숙한 수지상 세포 집단보다 더 많은 인터류킨 12 (IL-12) 및 IL-1β를 생산할 수 있다.
동물에서 1형 (Th-1) 면역 반응을 생성하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 일반적으로 미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 시험관내 또는 생체외 배양 조건 하에, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 유효량의 수지상 세포 성숙화제 및 염증-활성화 지질, 및 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시켜 성숙한 과다활성 수지상 세포를 형성하는 것을 포함한다. 성숙한 과다활성 수지상 세포는 동물에게 투여될 수 있거나 또는 나이브 T 세포와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시켜 증진된 수준의 인터페론 감마 (IFNγ) 및/또는 종양 괴사 인자 α. (TNFα.)의 생산을 특징으로 하는 활성화된 T 세포를 형성할 수 있다. 활성화된 T 세포는 특이적 항원에 대한 세포독성 T 세포 반응의 자극을 필요로 하는 동물에게 투여될 수 있다.
적합한 항원은, 예를 들어, 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 재조합 항원을 발현하는 형질전환된 또는 형질감염된 세포를 포함하며, 여기서 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 종양 연관 또는 종양 특이적 항원, 세포 용해물이며, 여기서 세포 용해물은 박테리아 세포 용해물 또는 종양 세포 용해물, 막 제제이며, 여기서 막 제제는 박테리아 세포 또는 종양 세포막 제제, 또는 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 (예를 들어, 합성 펩티드 항원), 또는 단리된 항원이며, 여기서 항원은 박테리아, 바이러스, 종양 연관 또는 종양 특이적 항원이다. 미성숙한 수지상 세포는 미리 결정된 항원, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 동시에 접촉될 수 있거나, 또는 미성숙한 수지상 세포는 상기 세포를, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 접촉하기 전에 또는 그 후에 미리 결정된 항원과 접촉될 수 있다.
특정 실시양태에서, 시험관내 또는 생체외 방법은 동물로부터 단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하는 것; 및 전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 수지상 세포 분화제는, 예를 들어, GM-CSF, 또는 GM-CSF와 IL-4, IL13, 또는 IL-15의 조합일 수 있다.
미성숙한 수지상 세포 및 T 세포는 동물에 대해 자가유래이거나, 동물에 대해 동종이계일 수 있다. 대안적으로, 미성숙한 수지상 세포 및 T 세포는 동물과 동일한 MHC 일배체형을 갖거나 또는 MHC 마커를 공유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 동물은 인간일 수 있거나, 또는 비-인간 동물일 수 있다.
또 다른 실시양태에서 항원을 흡수 및 프로세싱할 수 있고, 개체에게 투여한 후에 증진된 항종양 반응을 유도할 수 있는 성숙화 중인 단리된 과다활성화된 수지상 세포를 생산하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법이 제공된다. 상기 방법은 비-활성화된 미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화를 유도하기에 적합한 시험관내 또는 생체외 배양 조건 하에, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 유효량의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 접촉시키는 것; 및 성숙화 중인 수지상 세포를 완전 성숙화 전에 단리하는 것을 포함한다.
상기 방법의 특정 실시양태에서 방법에서 사용된 염증-활성화 지질은 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미틸-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (PAPC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PGPC), 및 1-팔미토일-2-[5-옥소발레로일]-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (POV-PC), 및 oxPAPC의 종 (예를 들어, 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상일 수 있다. 상기 방법은 단리된 성숙화 중인 수지상 세포를 완전 성숙화 전에 제제화하는 단계 후에 성숙화 중인 수지상 세포를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 성숙화 중인 수지상 세포를 동결보존하고 성숙화 중인 수지상 세포를 제제화 및 투여 전에 해동하는 것을 또한 임의로 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서 항원을 흡수 및 프로세싱할 수 있고 개체에게 투여한 후에 증진된 항종양 반응을 유도할 수 있는 성숙화 중인 단리된 과다활성화된 수지상 세포를 생산하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법이 제공된다. 상기 방법은 비-활성화된 미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화를 유도하기에 적합한 배양 조건 하에, 인터페론 γ와 조합하여 또는 그 없이, 유효량의 수지상 세포 성숙화제와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시키는 것; 및 성숙화 중인 수지상 세포를 완전 성숙화 전에 단리하는 것을 포함한다. 성숙화 중인 수지상 세포는 염증-활성화 지질과 함께, 개체, 예를 들어 고형 종양을 가진 개체에게의 투여를 위해 제제화된다. 성숙화 중인 수지상 세포는 동일한 제제로 염증-활성화 지질과 조합될 수 있거나 또는 이는 별도로 제제화될 수 있다. 별도로 제제화되는 경우, 성숙화 중인 수지상 세포 및 염증-활성화 지질을 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 염증-활성화 지질은 국소 투여를 위해 제제화될 수 있고, 예를 들어, 제제화된 성숙화 중인 수지상 세포가 투여될 피부 또는 점막의 영역에 적용될 수 있다.
상기 시험관내 또는 생체외 방법의 특정 실시양태에서 수지상 세포 성숙화제는 톨-유사 수용체 효능제, 예컨대 TLR3, TLR4, TLR7 및/또는 TLR8, 또는 TLR9의 효능제 예컨대 예를 들어, 박테리아 LPS, BCG, 이미다조퀴놀린 화합물, 예를 들어, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 예컨대 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (837, 이미퀴모드), 및 그의 유도체, 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 예를 들어, 폴리 I:C, 또는 그의 유도체, 폴리[I]:폴리[C(12)U] 등, DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열 등, 또는 그의 임의의 조합이다.
상기 방법은 염증-활성화 지질로서, 예를 들어, 다가불포화 지방산 (PUFA)의 단편화 산물을 함유할 수 있는 생물활성 산화된 인지질, 예컨대 1-팔미토일-2-옥소발레로일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 및 2-리소-포스파티딜 콜린의 9-케토-10-도데센디오산 에스테르 (KOdiA-PC) 중 1종 이상을 포함한, 산화된 지질이 사용될 수 있다. 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (PAPC)의 산화에 의해 형성된 많은 산물의 크로마토그래피 분리는 염증의 효능있는 지질 매개체로서 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POVPC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC)의 확인을 야기하였다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 산화된 지질은 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PAPC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PGPC), 및 1-팔미토일-2-[5-옥소발레로일]-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (POVPC)의 혼합물인 oxPAPC, 및 oxPAPC의 종 (예를 들어, 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC), 뿐만 아니라 로도(Rhodo) LPS (LPS-RS 또는 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 LPS, 이는 이전에 카스파제 11-의존성 인플라마좀을 활성화시키는 것으로 입증되어 있음)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 방법에서 유용한 미리 결정된 항원은 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 재조합 단백질을 발현하는 형질전환된 또는 형질감염된 세포를 포함하며, 여기서 재조합 단백질은 박테리아, 바이러스, 종양 연관 또는 종양 특이적 단백질, 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 및 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원이며, 여기서 항원, 펩티드 항원 또는 단리된 항원은 박테리아, 바이러스, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원일 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 또는 단리된 항원은 박테리아, 바이러스, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원이다. 이들 실시양태에서 미리 결정된 항원 중 어느 것도 수지상 세포 성숙화제로 의도되지 않는다.
임의적 실시양태에서, 상기 방법은 단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하는 것; 및 전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 시험관내에서 또는 생체외에서 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 수지상 세포 분화제는 고농도의 동물 단백질, 예를 들어 소, 염소, 말, 원숭이, 유인원, 및/또는 인간 단백질과 함께 단독으로 사용되는 경우, 특히 높은 단백질 농도로 보충된 배양 배지와 조합하여 사용되는 경우 GM-CSF이거나, GM-CSF와 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 13 (IL-13), 또는 인터류킨 15 (IL-15)의 조합일 수 있다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 인간 대상체로부터 단리될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 항원에 대한 증진된 Th1 면역 반응을 생성하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 상기 방법은 미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에, 인터페론 감마 (IFNγ)와 함께 또는 그 없이, 유효량의 수지상 세포 성숙화제, 예컨대 TLR 효능제, 및 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시켜 성숙한 수지상 세포 집단을 형성하는 것; 여기서 성숙화 중인 수지상 세포는 성숙화 동안 항원을 흡수 및 프로세싱함; 성숙한 수지상 세포를 개체에게의 투여를 위해 제제화하는 것; 및 염증-활성화 지질 없이 투여된 제제화된 수지상 세포 조성물과 비교하여 미리 결정된 항원에 대한 증진된 Th1 면역 반응을 생성하기 위해 유효량의 염증-활성화 지질과 함께 성숙한 수지상 세포 제제를 투여하는 것을 포함한다.
이 실시양태에서, 수지상 세포 성숙화제는 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제 중 1종, 또는 그의 조합, 예컨대, TLR-3, TLR-4, TLR-7 및/또는 TLR-8, 및 TLR9의 효능제, 예를 들어 그리고 제한을 위한 것이 아니라, 박테리아 LPS, BCG, 이미다조퀴놀린 화합물, 예를 들어, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 예컨대 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837, 이미퀴모드), 및 그의 유도체, 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 예를 들어, 폴리 I:C, 또는 그의 유도체, 폴리[I]:폴리[C(12)U], DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 예를 들어, ODN 2216 (5'-ggGGGACGA:TCGTCgggggg-3'), 및 ODN2336 (5'-gggGGACGAC:GTCG TGgggggg-3') 등, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
이 방법에서 유용한 염증-활성화 지질은 1종 이상의 다가불포화 지방산 (PUFA)의 단편화 산물, 예컨대 1-팔미토일-2-옥소발레로일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 및 2-리소-포스파티딜 콜린의 9-케토-10-도데센디오산 에스테르 (KOdiA-PC)를 함유할 수 있는 생물활성 인지질일 수 있다. 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (PAPC)의 산화에 의해 형성된 많은 산물의 크로마토그래피 분리는 염증의 효능있는 지질 매개체로서 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC)의 확인을 야기하였다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서 산화된 지질은 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PAPC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PGPC), 및 1-팔미토일-2-[5-옥소발레로일]-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (POV-PC)의 혼합물인 oxPAPC, 및 oxPAPC의 종 (예를 들어, 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
게다가, 미리 결정된 항원은 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 재조합 단백질을 생산하는 형질전환된 또는 형질감염된 세포일 수 있으며, 여기서 재조합 단백질은 박테리아 단백질, 바이러스 단백질, 종양 특이적, 또는 종양 연관 단백질, 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원이다. 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 또는 단리된 항원은 박테리아, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원일 수 있다.
상기에 증진된 면역 반응을 생성하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법은, 단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하는 것 및 전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 시험관내에서 또는 생체외에서 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법에서 유용한 수지상 세포 분화제는, 예를 들어, GM-CSF, 또는 GM-CSF와 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 13 (IL-13), 또는 인터류킨 15 (IL-15)의 조합을 포함한다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 인간 대상체로부터 단리될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제제화된 성숙한 수지상 세포 및 염증-활성화 지질은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다.
또 다른 실시양태에서 시험관내 또는 생체외 방법은 미성숙한 수지상 세포 (DC)의 성숙화 및 수지상 세포 성숙화제의 사용 없이 이들 세포를 활성화시키는 것을 포함한다. 활성화된 DC가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 수득된 반응에서 Th-1 및/또는 Th-2 편향을 유도하기 위해, 지향성 성숙화제, 예컨대 인터페론 감마 (IFNγ)의 첨가를 포함할 수 있다. 이전 방법과 달리, 본 개시내용의 방법에서 미성숙한 수지상 세포의 활성화는 단리된 미성숙한 수지상 세포를 조직 배양 표면에 수지상 세포의 부착에 적합한 조건 하에 새롭고 깨끗한 미사용 조직 배양 기질 및 수지상 세포 분화 유도제와 접촉시킴으로써 개시되거나 촉발된다. 본 개시내용의 전형적인 방법에서, 활성화는 성숙화제의 첨가 없이 달성된다. 미성숙한 수지상 세포는 이전 배양 기질 또는 정제 배지로부터 제거되고 이전 배양 배지로부터 단리된다. 이어서 단리된 미성숙한 수지상 세포를 계수하고 나중에 사용하기 위해 동결시키거나 상기 과정의 나머지 부분에 대해 수지상 세포 성숙화 인자를 첨가하지 않고 신선한 배양 배지와 조합한다.
한 대안적인 방법에서, 지향성 성숙화제를 활성화 동안 첨가하여 수지상 세포를 편향시켜 이들이 Th-1 또는 Th-2 반응에 대한 T 세포 반응을 분극화할 수 있도록 할 수 있다. 예로서, 그러나 개시된 방법에 대한 제한으로서가 아니며, 사용된 작용제는 T 세포 반응을 Th-1 반응을 향하여 편향시키기 위해 첨가될 수 있는 IFNγ이다. 시험관내에서 또는 생체외에서 단핵구 수지상 세포 전구체 또는 미성숙한 DC에 첨가된 인터페론 감마 (IFNγ) 자체는 DC 분화 및/또는 성숙화를 유도하지 않는다.
이 실시양태의 방법에서 유용한 조직 배양 기질은 조직 배양 웰, 플라스크, 보틀, 백, 또는 생물반응기에서 사용되는 임의의 매트릭스, 예컨대 섬유, 비드, 플레이트 등을 포함할 수 있다. 전형적으로, 조직 배양 기질은 플라스틱, 예컨대 폴리스티렌, 테플론(Teflon)® (폴리테트라플루오로에틸렌, PTFE) 등을 포함한다. 이들 기질은 기질에 대한 다양한 세포의 결합을 증가시키기 위해 단백질 또는 다른 대체물로 코팅되지 않는다. 면역요법을 위한 수지상 세포의 생체외 배양에 가장 흔히 사용되는 그러한 조직 배양 기질은 조직 배양-플라스크, -백, 또는 플라스틱의 다중 적층화 층으로 구성된 세포 분획 등을 포함한다.
완전 성숙한 수지상 세포는 미성숙한 DC와 정성적으로 및 정량적으로 상이하다. 완전 성숙한 DC는 더 높은 수준의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 항원, 및 T 세포 공동자극 분자, 즉 CD80 및 CD86을 발현한다. 이들 변화는 전형적으로, 예를 들어, 세포 표면 상의 항원 밀도, 뿐만 아니라 T 세포 상의 공동자극 분자의 대응물, 예컨대 CD28을 통한 T 세포 활성화 신호를 증가시킴으로써, T 세포를 활성화시키는 수지상 세포의 능력을 증가시킨다. 게다가, 성숙한 DC는 T 세포 반응을 자극하고 지향하는 다량의 시토카인을 생산한다. 이들 시토카인 중 2종은 인터류킨 10 (IL-10) 및 인터류킨 (IL-12)이다. 이들 시토카인은 유도된 T 세포 반응의 방향에 반대 효과를 갖는다. IL-10 생산은 Th-2 유형 반응의 유도를 초래하며, 한편 IL-12 생산은 Th-1 유형 반응을 초래한다.
한 실시양태에서, 상기 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 과다활성 성숙한 수지상 세포는 암, 특히 고형 종양, 박테리아 감염, 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 의약을 제조하는데 사용된다. 의약은 치료 유효량의 세포를 포함하는 과다활성 성숙한 수지상 세포의 제제일 수 있다. 제제는 102개 초과의 세포, 103개 초과의 세포, 104개 초과의 세포, 105개 초과의 세포, 106개 초과의 세포, 107개 초과의 세포, 108개 초과의 세포, 109개 초과의 세포, 1010개 초과의 세포, 또는 심지어 1011개 초과를 포함할 수 있다. 조성물 및 그의 제제의 특정 실시양태는, 예를 들어, 주사, 주입, 관류, 또는 세척에 의한 투여에 적합화될 수 있고, 보다 특히, 예를 들어, 하나 이상의 수단 예컨대, 예를 들어, 정맥내, 피내, 동맥내, 결절내, 림프내, 복강내, 병변내, 전립선내, 질내, 직장내, 국소, 척추강내, 종양내, 근육내, 수포내, 및/또는 피하 주입 및/또는 볼루스 주사를 통한 투여를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 이들 및 다른 측면은 하기 상세한 설명을 참조하는 경우 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 보다 쉽게 명백해질 것이다.
본 개시내용은 미성숙한 수지상 세포 (DC)의 성숙화를 유도하고 이들 세포를 증진된 항원-특이적 세포독성 T 세포 반응 (Th-1 반응)을 위해 프라이밍하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 1형 시토카인 (예를 들어, IFNγ, TNFα, IL-1β, 및/또는 IL2)의 증진된 생산을 향하여 분극화된 T 세포 집단을 활성화시키고 제조하는데 유용한 수지상 세포 집단을 제공한다. 이러한 수지상 세포 집단은, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제, 예컨대, 예를 들어, 박테리아 리포폴리사카라이드, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) LPS, BCG, 폴리 I:C 및 그의 덜 독성 유도체, 및/또는 R848 또는 R837, 및 염증-활성화 지질과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉된 미성숙한 단핵구 수지상 세포를 포함한다. 임의로 DC는 또한 적합한 성숙화 조건 하에 미리 결정된 항원과 접촉될 수 있다. 미성숙한 수지상 세포는 성숙화와 동시에, 그 전에 또는 그 후에 항원과 접촉될 수 있다. 미리 결정된 항원과의 접촉이 성숙화 후에 일어나는 경우 또는 항원을 흡수하는 능력이 실질적으로 감소된 경우, 항원 흡수는 삼투 로딩과 같은 공지된 방법을 사용하여 증진될 수 있다.
대안적으로, (예를 들어, 생체내에서) 항원에 이미 노출된 미성숙한 단핵구 수지상 세포는 적합한 성숙화 조건 하에, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, TLR 효능제, 및 염증-활성화 지질과 접촉될 수 있다. 생성된 과다활성화된 성숙한 수지상 세포는 프라이밍되어 면역 반응을 활성화시키고 T 세포 (예를 들어, 나이브 T 세포)를 활성화시키고 1형 반응을 향하여 잠재적으로 분극화한다. 1형 반응은 1형 시토카인 (예를 들어, IFNγ, 및/또는 IL-2)의 생산, 더 많은 IL-12 p70의 생산, 세포독성 T 세포 반응, Th-1 세포의 생산, 이펙터 및 기억 T 세포에서의 증가, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및 활성화에서의 증가의 생산, 및 특정 유형의 항체의 생산을 포함한다. IL-1β 및 종양 괴사 인자 α (TNFα)의 상향조절이 또한 증진될 수 있다. 대조적으로, 2형 반응은 IL-4, IL-5 및 IL-10의 생산, IL-12 p70보다 더 많은 IL-10의 생산, Th-2 세포의 생산, 및 CTL 반응의 유도 부족을 특징으로 한다.
관련 측면에서, 미성숙한 수지상 세포, 예컨대 CD34+ 조혈 줄기 세포의 풍부화된 세포 집단, 또는 단핵구 수지상 세포 전구체를 포함하는 조성물이 제공되며, 이는 또한 증진된 1형 반응에 대해 이들 수지상 세포를 프라이밍할 수 있다. 이러한 성숙한, 프라이밍된 단핵구 수지상 세포는 미리 결정된 항원, 즉 미리 결정된 외인성 항원의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스-I 제시를 증가시킬 수 있다. 항원의 MHC 클래스 I (MHC-I) 제시는 세포독성 T 림프구 (CTL)의 분화 및 표적 세포의 항원-특이적 CTL-매개 용해의 자극을 유도하는 것이 바람직하다. 이러한 조성물은 미성숙한 수지상 세포를 성숙화하기 위해, 그리고 BCG의 경우에는, 미성숙한 수지상 세포와 BCG의 접촉에 의해 유도된 IL-10의 억제를 전환시키거나 극복하기 위해, 미성숙한 수지상 세포를 포함하는 세포 집단과 혼합될 수 있는 IFNγ와 함께 또는 그 없이, TLR 효능제, 예컨대, 예를 들어, LPS, BCG, 폴리 I:C 및 R848을 포함한다. 게다가, 이러한 조성물은 염증-활성화 지질을 포함할 수 있다. 이러한 조성물과 접촉된 미성숙한 수지상 세포는, IFNγ와 함께 또는 그 없이 그리고 염증-활성화 지질 없이, TLR 효능제, 예컨대 LPS, BCG, 폴리 I:C, 및/또는 R848과 접촉된 미성숙한 수지상 세포 집단과 비교하여 증진된 성숙화 및 활성화를 겪고 전형적으로 더 많은 양의 생물학적 활성 IL-12, TNFα, 및/또는 IL-1, (예를 들어, IL-1β)을 생산한다.
또 다른 측면에서, 대상체 또는 공여자로부터 수득된 단핵구 수지상 세포 전구체는 시토카인 (예를 들어, 고농도의, 예를 들어, 동물 단백질 (인간 혈청 알부민)을 가진 GM-CSF 단독, 또는 예를 들어, IL-4, IL-7, IL-13 또는 IL-15와 조합하여 GM-CSF)과 접촉시켜 미성숙한 수지상 세포를 수득할 수 있다. 이어서 미성숙한 수지상 세포는, 임의로 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이; TLR 효능제와 조합하여; 및 염증-활성화 지질 단독, 또는 추가 시토카인과 조합하여, 미리 결정된 항원과 접촉시켜, 수지상 세포를 성숙화하고 T 세포에서 증진된 1형 면역 반응을 유도하기 위해 상기 세포를 프라이밍할 수 있다. 특정 실시양태에서, MHC 클래스-I 항원 프로세싱이 자극되며, 이는 미리 결정된 항원을 디스플레이하는 세포에 대한 CTL 반응을 도출하는데 유용하다.
수지상 세포는 다양한 림프양 조직 및 비-림프양 조직에서 발견되는 다양한 항원 제시 세포 집단이다. (문헌 [Liu, Cell 106:259-62 (2001); Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-96 (1991)] 참조). 수지상 세포는 비장의 림프양 수지상 세포, 표피의 랑게르한스 세포, 및 혈액 순환에서의 베일드 세포를 포함한다. 총괄적으로, 수지상 세포는 그의 형태학, 높은 수준의 표면 MHC-클래스 II 발현, 및 T 세포, B 세포, 단핵구, 및 자연 살해 세포 상에서 발현되는 특정 다른 표면 마커의 부재를 기반으로 한 군으로서 분류된다. 특히, 단핵구-유래 수지상 세포 (단핵구 수지상 세포라고도 지칭됨)는 대개 CD11a, CD80, CD86을 발현하며 HLA-DR+이나, CD14-는 아니다.
대조적으로, 단핵구 수지상 세포 전구체 (전형적으로 단핵구)는 대개 CD14+이다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 이들이 상주하는 임의의 조직, 특히 림프양 조직 예컨대 비장, 골수, 림프절, 및 흉선으로부터 수득될 수 있다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 또한 순환계로부터 단리될 수 있다. 말초 혈액은 단핵구 수지상 세포 전구체의 쉽게 접근가능한 공급원이다. 제대혈은 단핵구 수지상 세포 전구체의 또 다른 공급원이다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 면역 반응이 도출될 수 있는 다양한 유기체로부터 풍부화되거나 또는 단리될 수 있다. 이러한 유기체는, 예를 들어, 인간, 및 비-인간 동물, 예컨대, 영장류, 포유동물 (개, 고양이, 마우스, 및 래트 포함), 새 (닭 포함)을 포함한 동물, 뿐만 아니라 그의 트랜스제닉 종을 포함한다.
특정 실시양태에서, 단핵구 수지상 세포 전구체 및/또는 미성숙한 수지상 세포는 건강한 대상체 또는 면역자극을 필요로 하는 대상체, 예컨대, 예를 들어, 암 환자 또는 세포성 면역자극이 유익하거나 바람직할 수 있는 다른 대상체 (즉, 박테리아 또는 바이러스 감염 등을 가진 대상체 등)로부터 풍부화되거나 또는 단리될 수 있다. 수지상 세포 전구체 및/또는 미성숙한 수지상 세포는 또한 면역자극을 필요로 하는 HLA-매칭된 대상체에게의 투여를 위해 HLA-매칭된 건강한 개체로부터 단리된 또는 풍부화된 세포 집단으로서 수득될 수 있다.
수지상 세포 전구체 및 미성숙한 수지상 세포
수지상 세포 전구체, 미성숙한 수지상 세포, 또는 심지어 성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단은 원하는 세포의 95% 내지 98% 초과 또는 그 초과를 포함하는 유의하게 풍부화된 세포 집단을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 풍부화된 세포 집단은 원래 세포 집단의 세포 수보다 5 내지 10% 초과로 원하는 세포를 증가시킨다. 풍부화된 세포 집단은 사용된 방법으로 가능한 한 많은 원하는 세포를 포함하는 것이 바람직하다.
혈액 및 골수를 포함한, 다양한 공급원으로부터 수지상 세포 전구체 및 미성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단을 수득하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 수지상 세포 전구체 및 미성숙한 수지상 세포의 풍부화된 세포 집단은 헤파린처리된 혈액의 수집에 의해, 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해, 버피 코트의 제조, 로제, 원심분리, 밀도 구배 원심분리 (예를 들어, 피콜(Ficoll) (예를 들어, 피콜-파크(FICOLL-PAQUE)®), 퍼콜(PERCOLL)® (비-투석가능한 폴리비닐피롤리돈 (PVP)으로 코팅된 콜로이드성 실리카 입자 (15-30 mm 직경)), 수크로스 등을 사용), 세포의 차등적 용해, 여과 등에 의해 단리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 백혈구 집단은, 예컨대, 예를 들어, 대상체로부터 혈액을 수집하고, 섬유소를 제거하여 혈소판을 제거하고 적혈구를 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 수지상 세포 전구체 및 미성숙한 수지상 세포는, 예를 들어, 퍼콜® 구배를 통한 원심분리에 의해 단핵구 수지상 세포 전구체가 임의로 풍부화될 수 있다.
수지상 세포 전구체 및 미성숙한 수지상 세포의 풍부화된 세포 집단은 폐쇄된, 무균 시스템에서 임의로 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폐쇄된, 무균 시스템" 또는 "폐쇄된 시스템"은 비-멸균의 주변, 또는 순환 공기 또는 다른 비-멸균 조건에 대한 노출이 최소화되거나 제거된 시스템을 지칭한다. 수지상 세포 전구체 및 미성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단을 단리하기 위한 폐쇄된 시스템은 일반적으로 개방형 상부 튜브에서의 밀도 구배 원심분리, 세포의 외기 전달, 조직 배양 플레이트 또는 밀봉되지 않은 플라스크에서의 세포 배양 등을 배제한다. 전형적인 실시양태에서, 폐쇄된 시스템은 비-멸균 공기에 대한 노출 없이 초기 수집 용기로부터 밀봉가능한 조직 배양 용기로 수지상 세포 전구체 및 미성숙한 수지상 세포의 무균 전달을 가능하게 한다.
특정 실시양태에서, 단핵구 수지상 세포 전구체가 풍부화된 세포 집단은, 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함된 WO 2003/010292에 개시된 바와 같이 단핵구-결합 기질에 대한 부착에 의해 단리된다. 예를 들어, 백혈구의 집단 (예를 들어, 백혈구성분채집술에 의해 단리됨)은 기질을 부착하는 단핵구 수지상 세포 전구체와 접촉될 수 있다. 백혈구의 집단이 기질과 접촉되는 경우, 백혈구 집단의 단핵구 수지상 세포 전구체는 우선적으로 기질에 부착한다. 다른 백혈구 (다른 잠재적인 수지상 세포 전구체 포함)는 기질에 대한 감소된 결합 친화도를 나타내며, 이로써 단핵구 수지상 세포 전구체가 기질의 표면 상에서 우선적으로 풍부화될 수 있도록 한다.
적합한 기질은, 예를 들어, 부피에 대한 큰 표면적 비를 갖는 것들을 포함한다. 이러한 기질은, 예를 들어, 미립자 또는 섬유상 기질일 수 있다. 적합한 미립자 기질은, 예를 들어, 유리 입자, 플라스틱 입자, 유리 코팅된 플라스틱 입자, 유리-코팅된 폴리스티렌 입자, 및 단백질 흡수에 적합한 다른 비드를 포함한다. 적합한 섬유상 기질은 미세모세관 및 미세융모막을 포함한다. 미립자 또는 섬유상 기질은 대개 부착된 세포의 생육력을 실질적으로 감소시키지 않으면서 부착된 단핵구 수지상 세포 전구체가 용리될 수 있도록 한다. 미립자 또는 섬유상 기질은 기질로부터 단핵구 수지상 세포 전구체 또는 수지상 세포의 용리를 용이하게 하기 위해 실질적으로 비다공성일 수 있다. "실질적으로 비-다공성" 기질은 기질에 존재하는 기공의 적어도 대부분이 기질에서 세포를 포획하는 것을 최소화하기 위해 세포보다 작은 기질을 포함한다.
기질에 대한 단핵구 수지상 세포 전구체의 부착은 결합 배지의 첨가에 의해 임의로 증진될 수 있다. 적합한 결합 배지는, 예를 들어, 시토카인 (예를 들어, 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 또는 인터류킨 13 (IL-13)), 혈장, 혈청 (예를 들어, 인간 혈청, 예컨대 자가유래 혈청 또는 동종이계 혈청), 정제된 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 2가 양이온 (예를 들어, 칼슘 및/또는 마그네슘 이온) 및 기질에 대한 단핵구 수지상 세포 전구체의 특이적 부착을 돕거나, 기질에 대한 비-단핵구 수지상 세포 전구체의 부착을 방지하는 다른 분자가, 개별적으로 또는 임의의 조합으로 보충된 단핵구 수지상 세포 전구체 배양 배지 (예를 들어, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® 등)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혈장 또는 혈청은 열-불활성화될 수 있다. 열-불활성화된 혈장은 백혈구에 대해 자가유래 또는 이종일 수 있다.
기질에의 단핵구 수지상 세포 전구체의 부착 후, 비-부착성 백혈구는 단핵구 수지상 세포 전구체/기질 복합체로부터 분리된다. 임의의 적합한 수단이 상기 복합체로부터 비-부착성 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-부착성 백혈구와 복합체의 혼합물은 침강될 수 있고, 비-부착성 백혈구 및 배지는 경사분리 또는 배수될 수 있다. 대안적으로, 상기 혼합물은 원심분리될 수 있고, 비-부착성 백혈구를 함유하는 상청액은 펠릿화된 복합체로부터 경사분리 또는 배수될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 단핵구 수지상 세포 전구체의 풍부화된 집단은 접선 유동 여과에 의해 수득될 수 있다. 그 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2004/000444를 참조한다. 이 방법을 사용하면, 단핵구 수지상 세포 전구체가 활성화되지 않고 특정 시토카인, 예컨대 IL-4가 시험관내 또는 생체외 배양 동안 단핵구 수지상 세포 전구체가 대식세포로 분화되는 것을 방지하기 위해 필요하지 않다.
수지상 세포 전구체가 풍부화된 세포 집단은 분화, 성숙화 및/또는 확장을 위해 시험관내에서 또는 생체외에서 배양될 수 있다. (본원에 사용된 바와 같이, 단리된 미성숙한 수지상 세포, 수지상 세포 전구체, T 세포, 및 다른 세포는, 인간의 손에 의해 그의 천연 환경과 떨어져 존재하므로, 자연의 산물이 아닌 세포를 지칭한다. 단리된 세포는 정제된 형태, 반-정제된 형태, 예컨대 풍부화된 세포 집단, 또는 비-천연 환경에 존재할 수 있다).
간단히 말해서, 시험관내 또는 생체외 분화는 전형적으로, 1종 이상의 분화제의 존재 하에, 수지상 세포 전구체, 또는 수지상 세포 전구체를 갖는 세포의 집단을 배양하는 것을 수반한다. 적합한 분화제는, 예를 들어, 세포 성장 인자 (예를 들어, 시토카인, 예컨대 (GM-CSF), 및 GM-CSF와 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 13 (IL-13), 또는 인터류킨 15 (IL-15)와의 조합)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단핵구 수지상 세포 전구체는 분화되어 단핵구-유래 미성숙한 수지상 세포를 형성한다.
수지상 세포 전구체는 적합한 시험관내 또는 생체외 배양 조건에서 배양 및 분화될 수 있다. 적합한 조직 배양 배지는 AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® 등을 포함한다. 조직 배양 배지는 수지상 세포 전구체의 분화를 촉진하기 위해, 혈청, 아미노산, 비타민, 시토카인, 예컨대 GM-CSF 또는 IL-4와 조합된 GM-CSF, 2가 양이온 등으로 보충될 수 있다. 특정 실시양태에서, 수지상 세포 전구체는 무혈청 배지에서 배양될 수 있다. 이러한 배양 조건은 임의의 동물-유래 산물을 임의로 배제할 수 있다. 전형적인 수지상 세포 배양 배지에서 전형적인 시토카인 조합은 GM-CSF 및 IL-4 각각 약 500 유닛/ml이다.
미성숙한 수지상 세포를 형성하도록 분화되는 경우 수지상 세포 전구체는 피부 랑게르한스 세포와 표현형적으로 유사하다. 미성숙한 수지상 세포는 전형적으로 CD14- 및 CD11c+이고, 낮은 수준의 CD86 및 CD83을 발현하며, 특수 세포내이입을 통해 가용성 항원을 포획 또는 흡수할 수 있다.
미성숙한 수지상 세포는 성숙화되어 성숙한 과다활성 수지상 세포를 형성할 수 있다. 성숙한 DC는 항원을 흡수하고 공동자극 세포 표면 분자와 다양한 시토카인의 상향-조절된 발현을 디스플레이하는 능력을 상실한다. 구체적으로, 성숙한 DC는 미성숙한 수지상 세포보다 더 높은 수준의 MHC 클래스 I 및 II 항원을 발현하고, 성숙한 수지상 세포는 일반적으로 CD80+, CD83+, CD86+ 및 CD14-인 것으로 확인된다. MHC 발현이 더 클수록 DC 표면 상의 항원 밀도에서의 증가를 야기하며, 한편, 공동자극 분자 CD80 및 CD86의 상향조절은 T 세포 상의 공동자극 분자의 대응물, 예컨대 CD28을 통해 T 세포 활성화 신호를 강화한다.
본 발명의 성숙한 과다활성 수지상 세포는 미성숙한 수지상 세포를, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, 유효량 또는 유효 농도의 TLR 효능제, 예컨대, 예를 들어, 박테리아 리포폴리사카라이드, 예컨대 LPS; 전체 바실루스 칼메트-게랑 (BCG) 또는 그의 유도체, 이중 가닥 RNA, 예컨대 폴리 I:C 또는 그의 덜 독성 유도체, 예컨대 폴리 I:C(12)U, 또는 R848과 접촉시킨 후 염증-활성화 지질로 활성화시킴으로써 제조될 수 있다 (즉, 성숙화될 수 있다). 유효량의 TLR 효능제, 예컨대 예를 들어 박테리아 BCG는, 전형적으로 조직 배양 배지의 밀리리터당 약 105 내지 107 cfu의 범위이다. 유효량의 IFNγ는 전형적으로 조직 배양 배지의 밀리리터당 약 100 - 1000 U 범위이다. 바실루스 칼메트-게랑 (BCG)은 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 비병독성 균주이다. 본원에 사용된 바와 같이, BCG는 전체 BCG 뿐만 아니라 세포벽 구성성분, BCG-유래 리포아라비도만난, 및 2형 면역 반응의 유도와 연관된 다른 BCG 구성요소를 지칭한다. 박테리아, 또는 박테리아 구성요소, 예컨대 BCG는 임의로 불활성화된, 예컨대 열-불활성화된 BCG, 포르말린-처리된 BCG 등이다.
미성숙한 수지상 세포를 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 TLR 효능제로 성숙화하고 염증-활성화 지질로 활성화시키는 것은 증진된 수준의 IL-12 및/또는 IL-1, 보다 구체적으로 IL-1β를 생산할 수 있는 과다활성 DC의 형성을 촉진하고, IL-10의 생산을 감소시키거나 억제하며, 이로써 1형 (Th-1) 반응을 유도하기 위해 성숙한 수지상 세포를 프라이밍한다.
미성숙한 DC는 전형적으로 약 1시간 내지 약 24시간 동안 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 유효량의 TLR 효능제와 접촉된다. 후속적으로 염증-활성화 지질이 첨가될 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 염증-활성화 지질은 성숙화 유도 후 약 3시간에 첨가되긴 하지만, 이 시간은 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 10시간 및 최대 24시간 또는 그 초과 시간까지 연장될 수 있다. 미성숙한 수지상 세포는 적합한 성숙화 배양 조건에서 배양 및 성숙화될 수 있다. 적합한 조직 배양 배지는 AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® 등을 포함한다. 조직 배양 배지는 상기 세포의 성숙화를 촉진하기 위해, 아미노산, 비타민, 시토카인, 예컨대 GM-CSF 및/또는 IL4, IL13, 또는 IL15, 2가 양이온 등으로 보충될 수 있다. 전형적인 시토카인 조합은 GM-CSF 및 IL-4 각각 약 500 유닛/ml이다.
미성숙한 수지상 세포의 형성을 유도하기 위한 또 다른 시험관내 또는 생체외 방법에서, 전구체가 풍부화된 세포 집단 내 단핵구 수지상 세포 전구체는 분화되어 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 미성숙한 수지상 세포를 형성한다. 이 실시양태에서, 미성숙한 수지상 세포는 조직 배양 시스템으로부터 수집되고, 세척되고, 계수되고, 새롭고 깨끗한 비코팅 조직 배양 용기에서 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 조합된다. 미성숙한 수지상 세포는 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 전형적인 수지상 세포 배양 배지에서 수지상 세포 유지에 전형적인 조건 하에 미리 결정된 가용성 또는 미립자 항원의 존재 하에 배양될 수 있다. 어떠한 수지상 세포 성숙화제도 배지에 첨가되지 않으며 어떠한 첨가된 미리 결정된 항원도 수지상 세포 성숙화제로 간주되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 세포의 성숙화는 성숙한 수지상 세포의 특징적인 세포 표면 마커의 존재를 결정하는 것을 포함한, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
세포 표면 마커는 관련 기술분야에 친숙한 검정, 예컨대 유동 세포측정, 면역 조직화학 등에서 검출될 수 있다. 세포는 또한 시토카인 생산에 대해 모니터링될 수 있다 (예를 들어, ELISA, FACS, 또는 또 다른 면역 검정에 의해). 본 발명에 따라 성숙화된 DC 집단에서, IL12 수준은 증진된 1형 (Th-1) 반응을 촉진하기 위해, IFNγ와 함께 또는 그 없이 염증-활성화 지질 없이 본 개시내용의 TLR 효능제에 의해 미성숙한 수지상 세포로부터 성숙화하도록 유도된 성숙한 수지상 세포에 의해 생산된 IL12 수준보다 더 높다. 예를 들어, 성숙한 과다활성 DC는 증진된 양의 생물학적 활성 IL12, IL-2, TNFα 및/또는 IL1 (IL-1β)을 생산할 수 있으며; CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및/또는 활성화에서의 증가, 및 이펙터 및 기억 T 세포에서의 증가를 나타낼 수 있다. 성숙한 DC는 또한 음세포작용에 의해 항원을 흡수하는 능력을 상실하며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙한 흡수 검정에 의해 분석될 수 있다.
항원으로 프라이밍되든 비프라이밍되든, 수지상 세포 전구체, 미성숙한 수지상 세포, 및 성숙한 수지상 세포는 나중에 사용하기 위해 동결보존될 수 있다. 동결보존 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,788,963을 참조한다.
TLR 효능제
본 개시내용의 활성화제는 패턴 인식 수용체 (PRR)-의존성 세포 반응을 자극하는 것들을 포함한다. 패턴 인식 수용체는 톨-유사 수용체 (TLR), RIG-1 유사 수용체 (RLR), NOD-유사 수용체 (NLR) 및 C-형 렉틴 수용체 (CLRS)를 포함한다. PRR은 광범위한 부류의 미생물에 공통적인 분자를 직접적으로 또는 간접적으로 검출하는 역할을 한다. 이들 분자는 통상적으로 병원체 연관 분자 패턴으로 지칭되며 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS), 박테리아 플라겔린, 또는 바이러스 이중 가닥 RNA와 같은 인자를 포함한다. 상기에서와 같은 TLR은 패턴 인식 수용체 (PRR)의 부류이며, 이는 통상적으로 병원체 연관 분자 패턴 (PAMP)으로 지칭되는 미생물 분자를 검출한다. TLR 면역 수용체는 수지상 세포를 포함한 백혈구의 막 상에서 발현되며, TLR 효능제의 결합은 면역 반응 및 항원-특이적 획득 면역을 야기할 수 있는 분자적 사건을 촉발한다. 많은 TLR 효능제는 또한 하기에 논의된 바와 같이 수지상 세포 성숙화제이다. 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS)는 가용성 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 능력을 가진 TLR4의 강력한 효능제이다. LPS는 통상의 PAMP를 인식하는, TLR4 경로에 의해 면역계 세포를 자극한다. 추가 TLR 효능제는 합성 분자, 예컨대 예를 들어, TLR3에 결합하는 폴리 I:C, TLR 2 및 TLR 6 경로에 결합하고 활성화시키는 Pam2CSK4 (Pam2), TLR 2 및 TLR1 경로에 결합하고 활성화시키는 Pam3CSK4 (Pam3), 및 TLR 7 및 TLR 8 경로에 결합하고 활성화시키는 이미다조퀴놀린인 R848 및 R837을 포함한다. 비메틸화된 CpG 모티프 서열 (특정 박테리아에 공통적인 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN))은 TLR9에 결합하고 활성화시킨다.
본원에 기재된 방법의 구체적 실시양태에서 TLR 효능제는 박테리아 또는 미생물 산물일 수 있고 박테리아 LPS, 예컨대, 예를 들어, 이. 콜라이 LPS 또는 LPS를 갖는 임의의 다른 박테리아로부터 유래되거나 단리된 LPS (예를 들어, 모노포스포릴 지질 A (MPLA)), 박테리아 세포막 또는 세포벽 골격 등일 수 있다. 박테리아 또는 박테리아 산물은 또한, 예를 들어, 또 다른 TLR4 효능제 BCG 또는, 예를 들어, 세포벽 구성성분, BCG-유래 리포아라비도만난, 및 다른 BCG 산물을 포함한 BCG의 산물일 수 있다. BCG는 임의로 불활성화된, 예컨대 열-불활성화된 BCG, 포르말린-처리된 BCG이거나, 열 및 다른 불활성화 방법의 조합에 의해 불활성화된다. 다른 예에서 TLR 효능제는 폴리 I:C, Pam2CSK4, Pam3CSK4, R848, R837, 또는 인간에 대한 최적의 CpG 모티프가 GTCGTT인 것으로 보이는 ODN일 수 있다.
수지상 세포 성숙화제
수지상 세포 성숙화제는, 예를 들어, 바람직하게는 TLR2, TLR4, TLR3, TLR7 및/또는 TLR8에 결합하는 TLR 효능제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. BCG는 TLR2 및 TLR4 효능제이고; LPS는 TLR4 효능제이고; 이미다조퀴놀린 화합물은 TLR7 및 TLR8 효능제이고; 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 예를 들어, 폴리 I:C 및 그의 유도체 폴리[I]:폴리[C(12)U]는 TLR3 효능제이다. 수지상 세포 성숙화제로 작용할 수 있는 이미다조퀴놀린 화합물은, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 예컨대 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848로 지정됨) 또는 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837로 지정됨), 및 그의 유도체 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 WO2000/47719를 참조함)를 포함한다. 미성숙한 수지상 세포의 성숙화를 유도할 수 있는 톨-유사 수용체 (TLR)의 다른 작용제는, 예를 들어, TLR9의 효능제, 예컨대, 예를 들어, DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산 서열을 포함한다. DC 성숙화를 유도할 수 있는 이러한 CpG 모티프의 예는, 예를 들어, ODN 2216 (5'-ggGGGACGA:TCGTCgggggg-3'), 및 ODN2336 (5'-gggGGACGAC:GTCG TGgggggg-3') 등, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
구체적 예로서, 유효량의 BCG는 전형적으로 탈활성화 전에 조직 배양 배지의 밀리리터당 약 105 내지 107 cfu에 상당하는 범위이다. 상기에서와 같이, BCG는 전체 BCG 뿐만 아니라 세포벽 구성성분, BCG-유래 리포아라비도만난, 및 다른 BCG 구성요소일 수 있다. BCG는 임의로 불활성화된, 예컨대 열-불활성화된 BCG, 포르말린-처리된 BCG이거나, 또는 열 및 다른 불활성화 방법의 조합 등에 의해 불활성화된다.
상기에서와 같이, 미성숙한 수지상 세포는 수지상 세포가 성숙화하기에 충분한 기간 동안 수지상 세포 성숙화제와 함께 배양될 수 있다. 수지상 세포가 완전 성숙화하면, 이들은 제시를 위해 항원을 효율적으로 흡수 및 프로세싱하는 능력을 상실한다. 게다가, 완전 성숙한 수지상 세포는 공동-자극 분자 CD80, CD86, CD83, MHC-I 및 MHC-II 등의 증가된 발현을 갖는다.
염증-활성화 지질
본원에 사용된 바와 같은 용어 "염증-활성화 지질"은, 세포의 카스파제 11 (인간의 경우 카스파제 4/5)-의존성 인플라마좀에서 염증 반응을 도출할 수 있는 지질을 지칭한다. 예시적인 염증-활성화 지질은 산화된 인지질을 포함한다. 산화된 인지질은 대개 sn-2 위치에서 인지질에 존재하는 다가불포화 지방산 잔기의 산화에 의해 생성된다. 인지질의 산화는 효소적으로 또는 활성 산소 종에 의해 개시될 수 있으며 지질 과산화 연쇄 반응의 통상적인 메커니즘을 통해 전파된다. 생물활성 산화된 인지질은 다가불포화 지방산 (PUFA)의 단편화 산물, 예컨대 1-팔미토일-2-옥소발레로일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 및 2-리소-포스파티딜 콜린의 9-케토-10-도데센디오산 에스테르 (KOdiA-PC)를 함유할 수 있다. 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (PAPC)의 산화에 의해 형성된 많은 산물의 크로마토그래피 분리는 염증의 효능있는 지질 매개체로서 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC)의 확인을 야기하였다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서 산화된 지질은 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PAPC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PGPC), 및 1-팔미토일-2-[5-옥소발레로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POVPC)의 혼합물인 oxPAPC, 및 oxPAPC의 종 (예를 들어, 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC), 뿐만 아니라 로도 LPS (LPS-RS 또는 로도박터 스페로이데스로부터의 LPS, 이는 이전에 카스파제 11-의존성 인플라마좀을 활성화시키는 것으로 입증되어 있음)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
염증-활성화 지질은 성숙화 중인 수지상 세포에 성숙화 유도 후 약 3시간에 첨가될 수 있긴 하지만, 이 시간은 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 10시간 및 최대 24시간 또는 그 초과 시간까지 연장될 수 있다. 염증-활성화 지질과의 인큐베이션은 적어도 약 5 내지 약 18시간 및 최대 약 48시간, 또는 그 초과일 수 있다. 전형적으로, 성숙화 중인 수지상 세포는 염증-활성화 지질과 함께 적어도 약 5시간 배양되고 약 18시간 내지 약 24시간, 또는 그 초과 동안일 수 있다. 지질은 적어도 1 μg/ml 및 최대 90 μg/ml 또는 그 초과의 농도로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서 염증-활성화 지질은 약 1 μg/ml, 약 3 μg/ml, 약 10 μg/ml, 약 25 μg/ml, 약 30 μg/ml, 약 90 μg/ml, 약 100 μg/ml, 또는 그 초과로 사용된다.
항원
본 개시내용에 따른 성숙한, 과다활성화된 수지상 세포는 항원을 T 세포에 제시할 수 있다. 성숙한, 과다활성화된 수지상 세포는 미성숙한 수지상 세포를 성숙화 전에, 그 동안 또는 그 후에 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시킴으로써 형성될 수 있다.
대안적으로, (예를 들어, 단리 전에 생체내에서) 항원과 이미 접촉된 미성숙한 수지상 세포는, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, TLR 효능제, 및 염증-활성화 지질을 포함하는 조성물과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시켜 증진된 1형 (Th-1) 반응을 유도하기 위해 프라이밍되고 과다활성화된 성숙한 수지상 세포를 형성할 수 있다.
적합한 미리 결정된 항원은 T-세포 활성화가 요구되는 임의의 항원을 포함할 수 있다. 이러한 항원은, 예를 들어, 박테리아 항원, 종양 특이적 또는 종양 연관 항원 (예를 들어, 전체 박테리아 또는 종양 세포, 종양 세포 용해물, 종양으로부터 단리된 항원, 융합 단백질, 리포솜 등), 바이러스 항원, 및 임의의 다른 항원 또는 항원의 단편, 예를 들어 종양 연관 또는 종양 특이적 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은, 예를 들어, 종양 세포 용해물, 신경교종 종양 항원, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 산 포스파타제 (PAP), 또는 전립선 특이적 항원 (PSA)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. (예를 들어, 문헌 [Pepsidero et al., Cancer Res. 40:2428-32 (1980); McCormack et al., Urology 45:729-44 (1995)] 참조.) 항원은 또한 박테리아 세포, 박테리아 용해물, 종양 또는 박테리아 세포 또는 세포 용해물로부터의 막 단편, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 공급원일 수 있다. 항원, 예컨대 종양, 박테리아, 또는 바이러스 항원은 재조합적으로 발현되거나 생산되거나, 또는 심지어 화학적으로 합성될 수 있다. 재조합 항원은 또한 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아, 효모, 곤충, 척추동물 또는 포유동물 세포)의 표면 상에서 발현될 수 있거나, 용해물에 존재할 수 있거나, 또는 용해물로부터 정제될 수 있다.
항원은 대상체로부터의 샘플에 또한 존재할 수 있다. 예를 들어, 대상체에서 과증식성 또는 다른 병태로부터의 조직 샘플이 항원의 공급원으로서 사용될 수 있다. 이러한 샘플은, 예를 들어, 생검 또는 외과적 절제에 의해 수득될 수 있다. 이러한 항원이 전체 세포, 세포 용해물, 세포막 제제로서, 또는 단리된 항원 제제로서 사용될 수 있다.
대안적으로, 대상체 (예를 들어, 암 환자)의 세포의 막 제제, 또는 확립된 세포주, 예컨대 종양 세포주가 또한 항원 또는 항원의 공급원으로서 사용될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 신경교종, 전립선, 유방, 결장, 췌장, 폐, 또는 다른 종양, 또는 수술 표본으로부터 회수된 다른 종양 세포가 항원의 공급원으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 생검 또는 외과적 절제에서 수득한 암 환자 자신의 종양 샘플은 수지상 세포에 항원을 제시하거나 또는 항원 제시를 위한 세포 용해물을 제공하는데 직접적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 암 환자의 종양 세포의 막 제제가 사용될 수 있다. 종양 세포는 전립선, 폐, 난소, 결장, 뇌, 흑색종, 또는 임의의 다른 유형의 종양 세포일 수 있다. 용해물 및 막 제제는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 단리된 종양 세포로부터 제조될 수 있다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 모노클로날 항체 7El 1-C.5와 특이적으로 반응하는, 정제된 또는 반-정제된 전립선 특이적 막 항원 (PSMA, PSM 항원으로도 공지됨)이 항원으로서 사용될 수 있다. (일반적으로 문헌 [Horoszewicz et al., Prag. Clin. Biol. Res. 37:115-32 (1983)], 미국 특허 번호 5,162,504; 미국 특허 번호 5,788,963; [Feng et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 32:(Abs. 1418)238 (1991)]를 참조하며; 상기 문헌들의 개시내용이 본원에 참조로 포함된다.) 또 다른 예시적인 실시양태에서, PSMA의 아미노산 잔기 4-12에 상응하는, 아미노산 잔기 서열 Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val (서열식별번호: 1) (PSM-Pl로 지정됨)을 갖는 항원성 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, PSMA의 아미노산 잔기 711-719에 상응하는, 아미노산 잔기 서열 Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val (서열식별번호: 2) (PSM-P2로 지정됨)을 갖는 항원성 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, Xaa가 임의의 아미노산 잔기를 나타내는, 아미노산 잔기 서열 Xaa Leu (또는 Met) Xaa Val (또는 Leu) (PSM-PX로 지정됨)을 갖는 항원성 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있다. 이 펩티드는 HLA-A0201 결합 모티프, 즉 HLA-A2 환자에서 발견되는 "앵커 잔기", 류신 및 발린을 가진 9-10개 아미노산 잔기의 결합 모티프와 비슷하다. (예를 들어, 문헌 [Grey et al., Cancer Surveys 22:37-49 (1995)] 참조.) 이 펩티드가 HLA-A2+ 환자의 항원으로서 사용될 수 있다(문헌 [Central Data Analysis Committee "Allele Frequencies", Section 6.3, Tsuji, K. et al. (eds.), Tokyo University Press, pp. 1066-1077] 참조). 유사하게, 다른 HLA 결합 모티프와 비슷한 펩티드가 사용될 수 있다.
전형적인 실시양태에서, 미성숙한 수지상 세포는 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 TLR 효능제의 존재 하에 시험관내에서 또는 생체외에서 배양되고 일정 기간 후에 염증-활성화 지질이 상기에 기재된 바와 같이, 수지상 세포 성숙화에 적합한 조건 하에 첨가된다. 미리 결정된 항원은 또한 적합한 성숙화 조건 하에 TLR 효능제 전에, 상기 효능제와 함께, 상기 효능제 후에 첨가될 수 있다.
임의로, 미성숙한 수지상 세포는 GM-CSF 및 IL-4 없이 전형적인 수지상 세포 배양 배지에서 미리 결정된 항원과 혼합될 수 있다. 항원과 함께 적어도 약 10분 내지 2일 배양한 후, 항원은 제거될 수 있고, 배양 배지는 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이 TLR 효능제로 보충될 수 있다. 염증-활성화 지질은 적절한 성숙화 기간 후에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 미성숙한 수지상 세포는 염증-활성화 지질을 첨가하기 전에 적어도 3시간 동안 성숙화될 수 있다. 염증-활성화 지질을 첨가하기 전의 시간은 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 10시간, 및 최대 적어도 24시간까지일 수 있다. 시토카인 (예를 들어, GM-CSF 및 IL-4)이 또한 성숙화 배지에 첨가될 수 있다. 수지상 세포를 항원과 접촉시키는 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. (일반적으로 문헌 [Steel and Nutman, J. Immunol. 160:351-360 (1998); Tao et al., J. Immunol. 158:4237-4244 (1997); Dozmorov and Miller, Cell. lmmunol. 178:187-196 (1997); Inaba et al., J. Exp. Med. 166:182-194 (1987); Macatonia et al., J. Exp. Med. 169:1255-1264 (1989); De Bruijn et al., Eur. J Immunol. 22:3013-3020 (1992)]을 참조하며; 상기 문헌들의 개시내용이 본원에 참조로 포함된다.)
이어서, 미리 결정된 항원을 제시하는 생성된 성숙한, 과다활성화된 수지상 세포는 개체에게의 투여를 위해 단리되고, 세척되고, 제제화될 수 있다. 임의적 실시양태에서, 성숙한, 과다활성화된 항원 제시 수지상 세포는 T 세포, 예컨대 나이브 T 세포와 함께 시험관내에서 또는 생체외에서 공동-인큐베이션될 수 있다. T 세포, 또는 T 세포의 서브세트는 반응자 세포로서 사용하기 위해 다양한 림프양 조직으로부터 수득된다. 이러한 조직은 비장, 림프절, 및/또는 말초 혈액을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 세포는 혼합된 T 세포 집단으로서 또는 정제된 T 세포 서브세트로서 성숙한, 프라이밍된 수지상 세포와 공동-배양될 수 있다. T 세포 정제 또는 풍부화는 CD2, CD3, CD4, CD8 등에 대한 항체의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는 양성, 또는 음성 선택에 의해 달성될 수 있다.
T 세포를 성숙한, 항원 제시, 과다활성화된 수지상 세포와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉시킴으로써, 항원-반응성, 또는 활성화된, 분극화된 T 세포 또는 T 림프구가 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분극화된"은 높은 수준의 IFNγ를 생산하거나 그렇지 않으면 1형 (Th-1) 반응을 유도하기 위해 프라이밍되는 T 세포를 지칭한다. 이러한 방법은 전형적으로 미성숙한 수지상 세포를 인터페론 γ 및 염증-활성화 지질과 조합하여 박테리아, 박테리아 구성요소, 또는 박테리아 리포폴리사카라이드와 접촉시켜 성숙한, 과다활성화된 항원 제시 수지상 세포를 제조하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 미성숙한 수지상 세포는 적절한 조건 하에 성숙화와 동시에, 그 전에, 그 후에 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉될 수 있다.
미성숙한 수지상 세포는 성숙화 동안 T 세포 (예를 들어, 나이브 T 세포)와 시험관내에서 또는 생체외에서 공동-배양되거나, 증진된 1형 반응을 유도하기 위해 수지상 세포의 성숙화 및 과다활성화 후에 T 세포 (예를 들어, 나이브 T 세포)와 공동-배양될 수 있다. 미성숙한 수지상 세포 또는 성숙한 수지상 세포는 성숙화 전에 추가로 풍부화될 수 있다. 게다가, T 세포는 수지상 세포와 접촉하기 전에 림프구 집단으로부터 풍부화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 풍부화된 또는 정제된 집단은 수지상 세포와 접촉된다. 성숙한, 프라이밍된 수지상 세포와 T 세포의 공동-배양은 항원-반응성 CD4+ T 세포 또는 항원-반응성 CD8+ T 세포로 성숙화하는 특이적 T 세포의 자극을 야기한다.
또 다른 측면에서, 1형 (Th1) T 세포 반응을 유도하는 쪽으로 프라이밍된 성숙한 과다활성 수지상 세포의 존재 하에 상기 세포를 배양함으로써, 시험관내 T 세포의 재-자극을 위한 방법이 제공된다. 이러한 T 세포는 피더 세포 상에서 임의로 배양될 수 있다. 성숙한, 프라이밍된 수지상 세포는 T 세포와 접촉하기 전에 임의로 방사선조사될 수 있다. 적합한 배양 조건은 1종 이상의 시토카인 (예를 들어, 정제된 IL-2, 콘카나발린 A-자극 비장 세포 상청액, 또는 인터류킨 15 (IL-15))을 포함할 수 있다. 미성숙한 수지상 세포의 첨가에 의한 T 세포의 시험관내 또는 생체외 재-자극에서, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, TLR 효능제, 및 염증-활성화 지질 및 미리 결정된 항원이 T 세포 집단의 확장을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
안정적인 항원 특이적, 분극화된 T 세포 배양물 또는 T 세포주는 주기적인 재-자극에 의해 장기간 동안 시험관내에서 유지될 수 있다. 이렇게 생성된 T 세포 배양물 또는 T 세포주는 저장될 수 있고, 보존된 경우 (예를 들어, 동결보존제를 사용한 제제화 및 동결에 의해) 활성화된, 분극화된 T 세포를 장기간 사용을 위해 원하는 간격으로 재공급하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 활성화된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포는 본 개시내용의 방법에 따라 생성될 수 있다. 전형적으로, 항원-반응성, 분극화된 T 세포를 생성하는데 사용되는 성숙한, 프라이밍된 수지상 세포는 이들이 투여될 대상체에 대해 동계이다 (예를 들어, 대상체로부터 수득됨). 대안적으로, 의도된 수용자 대상체와 동일한 HLA 일배체형을 갖는 수지상 세포는 HLA-매칭된 공여자로부터의 비-암성 세포 (예를 들어, 정상 세포)를 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 세포독성 T 림프구 (CTL) 및 Th1 세포를 포함한, 항원-반응성 T 세포는 면역자극을 위한 세포의 공급원으로서 시험관내에서 확장된다.
세포 집단의 생체내 투여
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 세포 집단의 투여를 위한 방법이 제공된다. 세포 집단은 면역자극을 필요로 하는 대상체에 대한, 성숙한, 과다활성화된 수지상 세포 또는 활성화된, 분극화된 T 세포, 또는 이러한 세포를 함유하는 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 세포 집단은 성숙한, 프라이밍된 수지상 세포 집단 및/또는 활성화된, 분극화된 T 세포 집단 둘 다를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 수지상 세포 전구체 또는 미성숙한 수지상 세포를 수득하고, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, TLR 효능제, 염증-활성화 지질, 및 미리 결정된 항원의 존재 하에 시험관내에서 또는 생체외에서 이들 세포를 분화 및 성숙화함으로써 수행하여 Th1 반응을 유도하는 쪽으로 프라이밍된 성숙한 과다활성화된 항원 제시 수지상 세포 집단을 형성한다. 미성숙한 수지상 세포는 적절한 조건 하에 성숙화 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉될 수 있다. 이러한 성숙한, 과다활성화된, 항원 제시 수지상 세포는 단리되고, 면역자극을 필요로 하는 대상체에게 직접적으로 투여하기 위해 제제화될 수 있다.
관련된 실시양태에서, 성숙한, 프라이밍된 수지상 세포는 대상체로부터의 림프구와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉되어 림프구 집단 내의 T 세포를 자극할 수 있다. 항원 반응성 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 세포 배양물에서 클론 확장이 임의로 뒤따르는 활성화된 분극화된 림프구는, 면역자극을 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성화된, 분극화된 T 세포는 대상체에 대해 자가유래이다.
또 다른 실시양태에서, 수지상 세포, T 세포, 및 수용자 대상체는 동일한 MHC (HLA) 일배체형을 갖는다. 대상체의 HLA 일배체형을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 관련된 실시양태에서, 수지상 세포 및/또는 T 세포는 수용자 대상체에 대해 동종이계이다. 예를 들어, 수지상 세포는 동일한 MHC (HLA) 일배체형을 갖는 T 세포 및 수용자에 대해 동종이계일 수 있다. 동종이계 세포는 전형적으로 적어도 하나의 MHC 대립유전자에 대해 매칭된다 (예를 들어, 모든 MHC 대립유전자가 아닌 적어도 하나를 공유함). 덜 전형적인 실시양태에서, 수지상 세포, T 세포 및 수용자 대상체는 서로에 대해 모두 동종이계이나, 모두 공통적으로 적어도 하나의 공통 MHC 대립유전자를 갖는다.
한 실시양태에 따르면, T 세포는 미성숙한 수지상 세포가 수득된 동일한 대상체로부터 수득된다. 시험관내에서 또는 생체외에서 성숙화 및 분극화 후, 자가유래 T 세포는 대상체에게 투여되어 기존 면역 반응을 유발 및/또는 증대시킨다. 예를 들어, T 세포는 정맥내 주입에 의해, 예를 들어, 체표면적의 약 108 -109개 세포/m2의 용량으로 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ridell et al., Science 257:238-241 (1992)]을 참조하며, 본원에 참조로 포함됨). 주입은 원하는 간격으로, 예를 들어, 매월 반복할 수 있다. 임의의 부작용의 증거에 대해 T 세포 주입 동안 및 후에 수용자를 모니터링할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 미성숙한 수지상 세포는 미성숙한 수지상 세포를 수지상 세포 성숙화제의 존재 없이 새롭고 깨끗한 미사용 조직 배양 기질과 접촉시키는 방법을 포함한 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 표준 방법에 의해 성숙화될 수 있다. 성숙화 동안, 성숙화 중인 수지상 세포는 미리 결정된 항원, 예컨대 종양 특이적 또는 종양 연관 항원과 접촉될 수 있다. 성숙화되면, 수지상 세포는 개체에게의 투여를 위해 제제화될 수 있고, 투여 시 성숙화된 수지상 세포 조성물은 염증-활성화 지질과 공동-투여된다.
본원에서 생산된 바와 같은 과다활성화된 성숙한 수지상 세포 및 활성화된 T 세포는 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법 및 조성물을 사용하여 생리학상 허용되는 담체, 부형제, 완충제 및/또는 희석제와 함께 제제화될 수 있다. 수지상 세포 또는 T 세포 조성물은 면역자극을 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 전형적으로, 약 102 내지 약 1010개의 세포가 제약상 허용되는 담체에 현탁된다.
성숙화된 수지상 세포 및 염증-활성화 지질은 동일한 제제로 투여될 수 있거나 또는 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 별도의 조성물로 투여되는 경우, 성숙화된 수지상 세포 및 염증-활성화 지질은 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 성숙한 또는 성숙화 중인 수지상 세포는 미성숙한 수지상 세포가 IFNγ와 함께 또는 그 없이 TLR 효능제와 접촉한 후 적어도 3시간까지 염증-활성화 지질과 접촉되지 않을 것이다. 특정 실시양태에서, 염증-활성화 지질은, 예를 들어, 주사에 의해 성숙화된 수지상 세포가 투여되는 영역에 국소적으로 투여된다.
본 개시내용의 조성물로 대상체를 치료하는 것은 치료 유효량을 전달하는 것을 포함한다. 치료 유효량은 유효량, 예방적 치료, 및/또는 치료적 치료를 제공하는 것들을 포함한다.
"유효량"은 대상체에서 원하는 생리학적 변화를 초래하는데 필요한 세포의 수이다. 유효량은 종종 연구 목적으로 투여된다. 본원에 개시된 유효량은, (i) 종양 또는 박테리아 세포 또는 바이러스 증식을 감소시킬 수 있거나 또는 종양 박테리아 세포 사멸 또는 바이러스 파괴를 유도할 수 있는 Th1 면역 반응을 유도하는 것 및 (ii) 항암 또는 항-감염 효과를 갖는 것 중 하나 이상을 한다.
"예방적 치료"는 개시된 조성물의 투여가 종양 또는 감염 발병 위험을 줄이거나, 예방하거나, 감소시키기 위한 목적이 되도록 치료될 종양의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 치료될 종양의 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에 대해 개시된 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 예방적 치료는 병태에 대한 예방적 치료로서 기능을 한다.
"치료적 치료"는 본원에 기재된 조성물이 병태의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 투여되고 병태의 중증도 또는 진행을 감소시킬 목적으로 대상체에게 투여되는 것을 포함한다.
특정한 대상체에게 투여되는 실제 투여량 및/또는 제공되는 투여 횟수는 예를 들어 목표; 체중; 병태의 유형; 병태의 중증도; 당면 관련 사건, 공지된 경우; 이전 또는 공동 치료 개입; 대상체의 특발성; 및 투여 경로를 포함한 신체적 및 생리학적 요인과 같은 파라미터를 고려하여 의사, 수의사, 또는 연구원에 의해 결정될 수 있다. 게다가, 시험관내 및 생체내 검정은 최적의 투여량 범위 및/또는 투여 횟수를 확인하는데 도움이 되도록 임의로 이용될 수 있다.
투여할 치료 유효량은 102개 초과의 세포, 103개 초과의 세포, 104개 초과의 세포, 105개 초과의 세포, 106개 초과의 세포, 107개 초과의 세포, 108개 초과의 세포, 109개 초과의 세포, 1010개 초과의 세포, 또는 심지어 1011개 초과를 포함할 수 있다.
나타낸 바와 같이, 본원에 개시된 조성물 및 제제는, 예를 들어, 주사, 주입, 관류, 또는 세척에 의해 투여될 수 있고, 보다 특히 하나 이상의 골수, 정맥내, 피내, 동맥내, 결절내, 림프내, 복강내, 병변내, 전립선내, 질내, 직장내, 국소, 척추강내, 종양내, 근육내, 수포내, 및/또는 피하 주입 및/또는 볼루스 주사를 통한 투여를 포함할 수 있다.
성숙화 중인 과다활성 수지상 세포의 투여
또 다른 실시양태에 따르면, 수지상 세포는, 수지상 세포 성숙화제, 예컨대, 예를 들어, 본 개시내용에 따라, 인터페론 γ와 함께 또는 그 없이, TLR 효능제, 및 염증-활성화 지질로 시험관내에서 또는 생체외에서 성숙화를 시작하도록 유도될 수 있다. 이 실시양태에서, 수지상 세포는 투여 전에 완전 성숙화하도록 허용되지는 않는다. 미성숙한 수지상 세포와 같은 이들 수지상 세포는 항원을 흡수 및 프로세싱하는 능력을 보유하고 완전 성숙한 수지상 세포와 같이 개체에게 투여한 후 증진된 항종양 반응을 유도할 수 있다.
완전 성숙한 수지상 세포는 미성숙한 DC와 정성적으로 및 정량적으로 상이하다. 완전 성숙화하면, DC는 더 높은 수준의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 항원, 및 더 높은 수준의 T 세포 공동-자극 분자, 예컨대 CD80 및 CD86을 발현한다. 이들 변화는, 예를 들어, 세포 표면 상의 항원 밀도, 뿐만 아니라 T 세포 상의 공동-자극 분자의 대응물, 예컨대 CD28 등을 통한 T 세포 활성화 신호를 증가시킴으로써, T 세포를 활성화시키는 수지상 세포의 능력을 증가시킨다. 게다가, 성숙한 DC는 T 세포 반응을 자극하고 분극화하는 다량의 시토카인을 생산한다. 이들 시토카인은 Th1-유형 면역 반응과 연관된 인터류킨 12 및 Th2-유형 면역 반응과 연관된 인터류킨-10 및 인터류킨-4를 포함한다. 전형적으로, 염증-활성화 지질은 부분적으로 성숙한 수지상 세포의 투여와 함께 또는 투여 후에 투여될 것이다.
일반적으로, 상기 개시된 바와 같은 생체외 DC 생성 방법은 대상체로부터 DC 전구체 세포가 풍부화된 세포 집단을 수득한 다음에 DC 전구체 세포를 시험관내에서 또는 생체외에서 분화시켜 미성숙한 수지상 세포를 형성하고 미성숙한 수지상 세포를 완전 성숙한 DC로 성숙화하도록 유도하는 것을 포함한다. 전형적으로, 이 과정 동안, 성숙화 중인 DC는 DC가 성숙화해짐에 따라 흡수 및 프로세싱을 위해 미리 결정된 항원과 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉된다. 일부는 DC가 말기에 분화되어야 하며, 그렇지 않으면 이들이 단핵구/대식세포로 다시 탈분화되어 그의 면역-강화 능력을 많이 상실할 것으로 여긴다. 단핵구로부터 생성된 DC의 생체외 성숙화는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 상기에 추가로 기재된 방법 및 작용제를 사용하여 성공적으로 완수된 바 있다. 본 실시양태에서, 성숙화 중인 수지상 세포가 바람직하며, 그 이유는 성숙화 중인 수지상 세포가 환자에게 투여되고 생체내에서 항원을 흡수 및 프로세싱하며 한편 투여 후 완전 성숙화하고 나이브 T 세포와의 접촉을 위해 림프절로 전이되기 때문이다.
본원에서 생산된 바와 같은 성숙화 중인 수지상 세포는 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법 및 조성물을 사용하여 생리학상 허용되는 담체, 부형제, 완충제 및/또는 희석제와 함께 제제화될 수 있다. 성숙화 중인 수지상 세포는 면역자극을 필요로 하는 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 약 102 내지 약 1010개의 세포가 제약상 허용되는 담체에 현탁된다. 세포는 종양에 직접적으로 주사되거나 종양 또는 종양층에 가깝거나, 인접하거나, 순환계 또는 림프계 접촉 부위에 주사하여 세포가 종양 항원에 반드시 접근할 수 있도록 한다.
예를 들어, 그러나 이에 제한되는 것은 아니며, 세포는 종양에 직접적으로, 종양의 외과적 제거 또는 절제 후에 종양층에, 종양 주위로, 종양과의 직접적인 접촉으로 배수 림프절에, 종양 또는 종양에 걸린 기관을 유도하거나 공급하는 혈관 또는 림프관, 예를 들어, 문맥 또는 폐 정맥 또는 동맥 등에 투여할 수 있다. 성숙화 중인 수지상 세포의 투여는 종양에 대한 다른 치료, 예컨대 별도의 조성물, 화학요법 또는 방사선 요법으로서 투여되는 경우 염증-활성화 지질의 투여와 동시 또는 그 후일 수 있다. 추가로, 성숙화 중인 수지상 세포는 또 다른 작용제와 공동-투여될 수 있고, 염증-활성화 지질과 같은 이 작용제는 수지상 세포의 성숙화 및/또는 종양내의 또는 종양에 가깝거나 인접한 영역 내의 항원의 프로세싱에 대한 아주반트로서 작용한다. 게다가, 수지상 세포는 또한 종양 항원과의 접촉을 위해 세포가 서서히 종양, 또는 종양층 내로 방출되도록 종양 또는 종양층 내의 또는 주위의 영역으로의 이식을 위한 서방성 매트릭스로 제제화되거나 또는 배합될 수 있다.
성숙화 중인 수지상 세포는 제제화 및 투여 방식에 적절한 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포는 제약상 허용되는 담체와 조합되어 시린지, 카테터, 캐뉼라 등으로 투여될 수 있다. 상기에서와 같이, 세포는 서방성 매트릭스로 제제화될 수 있다. 이러한 방식으로 투여되는 경우, 제제는 사용되는 매트릭스에 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 본 개시내용에 적용할 수 있는 다른 방법 및 투여 방식은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 성숙화 중인 수지상 세포 및 수용자 대상체는 동일한 MHC (HLA) 일배체형을 갖는다. 대상체의 HLA 일배체형을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 관련된 실시양태에서, 성숙화 중인 수지상 세포는 수용자 대상체에 대해 동종이계이다. 동종이계 세포는 전형적으로 적어도 하나의 MHC 대립유전자에 대해 일치한다 (예를 들어, 모든 MHC 대립유전자가 아닌 적어도 하나를 공유함). 덜 전형적인 실시양태에서, 성숙화 중인 수지상 세포 및 수용자 대상체는 서로에 대해 모두 동종이계이나, 모두 공통적으로 적어도 하나의 MHC 대립유전자를 갖는다.
한 실시양태에서, 상기 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 성숙화 중인 수지상 세포는 방사선 요법, 화학요법, 또는 그의 조합에 대한 아주반트로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 성숙화 중인 과다활성화된 수지상 세포는 방사선 요법, 화학요법, 또는 그의 조합 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 성숙화를 시작하도록 유도되고, 인터페론 γ (IFNγ)와 함께 또는 그 없이, TLR 효능제, 및 염증-활성화 지질로 시험관내에서 과다활성화되는 인간 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 증진된 항종양 면역 반응 및/또는 임상 반응을 생성하는 방법이 제공된다. 성숙화 중인 과다활성화된 수지상 세포는 단리되고 제약상 허용되는 담체와 조합되며; 여기서 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 개체에서 종양, 종양층 또는 종양 주변 조직 영역에 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 미성숙한 수지상 세포는, IFNγ와 조합된, 수지상 세포 성숙화제, 예를 들어, 열 불활성화된 BCG로 성숙화를 시작하도록 유도된다. 완전하고 완료된 성숙화 전에, 성숙화 중인 수지상 세포는 단리되고 개체에게의 투여를 위해 제제화된다. 제제는 염증-활성화 지질을 포함할 수 있거나 또는 염증-활성화 지질은 성숙화 중인 수지상 세포를 포함하는 조성물과 공동-투여되는 별도의 조성물일 수 있다. 염증-활성화 지질을 포함하는 조성물은 성숙화 중인 수지상 세포의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 이 실시양태에서, 염증-활성화 지질은 개체에 대한 그의 투여 후 성숙화 중인 수지상 세포에 대한 아주반트로서 작용한다. 항원은 투여 후 생체내에서 또는 생체외에서 활성화된 성숙화 중인 수지상 세포에 의해 흡수되고 개체의 체내에서 T 세포에 제시하기 위해 프로세싱된다. 상기에서와 같이, 활성화된 성숙화 중인 수지상 세포 및 염증-활성화 지질은 이러한 치료를 필요로 하는 개체에서 종양, 종양층 또는 종양 주변 조직 영역에 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 미성숙한 수지상 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 미리 결정된 항원과 함께 성숙화될 수 있다. 예를 들어, 미성숙한 수지상 세포는 종양 용해물과 함께 TLR 효능제 예컨대 BCG 및 IFNγ의 조합으로 성숙화될 수 있다. 성숙화 중인 수지상 세포는 성숙화 동안 종양 항원을 흡수 및 프로세싱하며, 이 항원은 종양이 절제된 개체에게 투여 시 나이브 T 세포에 디스플레이될 수 있다. 완전 성숙화하면, 이제 항원을 제시하는 수지상 세포가 단리되고 개체에게의 투여를 위해 제제화된다. 제제화된 성숙한 수지상 세포는 단독 투여되는 경우 제제화된 성숙한 수지상 세포와 비교하여 증진된 종양 특이적 Th1 면역 반응을 유도하기 위해, 염증-활성화 지질, 예를 들어, oxPAPC와 함께 투여될 수 있다. 이 실시양태에서 염증-활성화 지질은 성숙한 수지상 세포와 함께 제제화될 수 있거나 또는 별도의 조성물로 제제화될 수 있다. 별도의 조성물로 제제화되는 경우 제제화된 성숙한 수지상 세포 및 염증-활성화 지질은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서 염증-활성화 지질은 제제화된 성숙한 수지상 세포가 투여되는 부위 또는 피부 또는 점막에 국소 조성물로서 투여될 수 있다. 제제화된 성숙한 수지상 세포와 염증-활성화 지질의 조합은 단독 투여 시 제제화된 성숙한 수지상 세포와 비교하여 미리 결정된 항원에 대한 증진된 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.
과다활성 성숙한 수지상 세포 조성물, 성숙화 중인 수지상 세포 조성물, 및 활성화된 T 세포 조성물 등을 포함한, 상기 기재된 모든 조성물은 종양을 치료하기 위한 임의의 다른 방법과 조합하여 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 종양의 외과적 절제, 화학요법 (세포독성 약물, 아폽토시스제, 항체 등), 방사선 요법, 동결요법, 근접요법, 면역 요법 (항원 특이적 성숙한 활성화된 수지상 세포, NK 세포, 종양 항원에 특이적인 항체 등의 투여) 등과 조합하여 사용될 수 있다. 모든 상기 방법은 또한 임의의 조합으로도 사용될 수 있다. 조합 치료는 공동이거나 순차적일 수 있으며 치료 의사가 결정한 바와 같은 임의의 순서로 투여될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 단지 본원에 기재된 조성물 및 방법의 다양한 측면의 실례로서 제공되며 어떠한 방식으로도 본 개시내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 단핵구 수지상 세포 전구체의 분화 및 성숙화
첫 번째 연구에서, 인간 단핵구 수지상 세포 전구체가 풍부화된 세포 집단은 수지상 세포 분화제와의 접촉에 의해 미성숙한 수지상 세포로 시험관내에서 또는 생체외에서 분화하도록 유도되고 이는 차례로 상기에 정의된 바와 같이 수지상 세포 성숙화제 및 염증-활성화 지질과 상기 전구체의 접촉에 의해 성숙화하도록 유도된다. 이 실시예에서, 수지상 세포 분화제는 GM-CSF와 2% 인간 혈청 알부민의 조합이다. 유사한 결과, 미성숙한 수지상 세포로의 단핵구 수지상 세포 전구체의 분화가 IL-4, IL-7, IL-13 또는 IL-15와 조합하여 GM-CSF를 사용하여 달성될 수 있다. 수지상 세포 분화 후, 미성숙한 수지상 세포의 풍부화된 집단이 성숙화하도록 유도되고 수지상 세포 성숙화제 및 수지상 세포 과다활성화제 (염증-활성화 지질)로 과다활성화되며, 여기서 수지상 세포 성숙화제는 톨-유사 수용체의 효능제이다. 이 특정한 예에서, 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 효능제 LPS가 사용되고 또한 박테리아, 박테리아 산물 또는 LPS의 구성요소, 또는 또 다른 박테리아 LPS를 포함할 수 있다. 수지상 세포의 성숙화는 인터페론 γ (IFNγ)의 첨가로 Th1 반응을 유도하도록 편향된다. 과다활성화는 oxPAPC와 같은 염증-활성화 지질로 유도된다.
구체적으로, 인간 단핵구 수지상 세포 전구체의 풍부화된 세포 집단을 2% 인간 혈청 알부민과 함께 GM-CSF와 함께 배양하여 미성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단을 생산한다. 미성숙한 수지상 세포의 풍부화된 집단은 LPS로 성숙화 및 활성화를 시작하도록 유도되고 염증-활성화 지질은 동시에 또는 1 내지 12시간 후에 첨가되어 완전 성숙화 및 과다활성화를 유도한다. 성숙한 수지상 세포의 상태는, 예를 들어, IL-12, TNFα, 및/또는 IL-1β의 생산을 결정함으로써 확인할 수 있다. 게다가, 성숙한 과다활성화된 수지상 세포의 이펙터 및 기억 T 세포의 생산을 유도하거나 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및/또는 활성화에 대한 능력은 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 단핵구 수지상 세포 전구체를 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 세포 배양 배지에서 배양하여 분화를 유도하여 미성숙한 수지상 세포를 형성한 후에, 미성숙한 수지상 세포를 수지상 세포를 완전 성숙화하기에 충분한 기간 동안 TLR 효능제, 예컨대 BCG 또는 R848의 조합으로, 그리고 IFNγ와 함께 또는 그 없이 배양하였다. 과다활성화는 성숙화 중인 그리고 활성화 중인 수지상 세포를 염증-활성화 지질과 수지상 세포 성숙화제/TLR 효능제와 동시에 또는 순차적으로 접촉시킴으로써 유도된다. 염증-활성화 지질은 수지상 세포 성숙화제와 동시에 또는 성숙화 개시 후 1 내지 20시간 또는 그 초과 후에 배양물에 첨가될 수 있다.
한 실시양태에서, 미리 결정된 항원은 미성숙한 수지상 세포를 TLR 효능제, 예컨대 박테리아 LPS, R848, 또는 본원에 개시된 또 다른 수지상 세포 성숙화제와 접촉시키기 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 미성숙한 수지상 세포와 접촉된다. TLR 효능제는 IFNγ와 조합될 수 있고 또한 IFNγ와 함께 염증-활성화 지질과 조합하여 또는 그 없이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 종양 세포 용해물은 수지상 세포 분화 및/또는 성숙화의 기간 동안 배양물에 첨가된다. 성숙화 후에 첨가되는 경우, 항원 흡수는, 예를 들어, 삼투압 로딩과 같은 공지된 방법을 사용하여 증진될 수 있다.
임의적 실시양태에서, 단핵구 수지상 세포 전구체는 수지상 세포 성숙화제 및 IFNγ와만 접촉되고, 염증-활성화 지질은 포함되지 않았다. 대신에, 완전 성숙화된 경우 성숙한 수지상 세포는 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화되고 염증-활성화 지질과 함께 투여된다. 염증-활성화 지질은 단일 제제로 성숙한 수지상 세포와 조합되거나, 별도로 조합될 수 있다. 임의로, 염증-활성화 지질은 별도의 조성물로 제제화되고 성숙한 수지상 세포의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여된다.
IL-12, IL-2, TNFα 및 IL-1β, 또는 다른 염증성 시토카인의 양은 ELISA 또는 다중 검정과 같은 상업적으로 이용가능한 시험을 사용하여 결정될 수 있다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및 이펙터 및 기억 T 세포의 수준은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
실시예 2: 과다활성 수지상 세포의 생산 및 성숙화
이 실시예에서, 미성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단은 관련 기술분야에 널리 공지된 수단에 의해 수득된다. 미성숙한 수지상 세포의 풍부화된 세포 집단은 12 내지 24시간 동안, 또는 미성숙한 수지상 세포가 완전 성숙화할 때까지, IFNγ와 함께 또는 그 없이, BCG, 또는 R848, 및 oxPAPC의 조합과 함께 배양된다. 이어서 완전 성숙한 수지상 세포는 IL-2, IL-12 p70, TNFα 및/또는 IL-1β의 생산에 대해 검정된다. 게다가, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및/또는 활성화 및 이펙터 및 기억 T 세포의 수준을 유도하는 완전 성숙화된 수지상 세포의 능력은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 결정된다.
별도의 연구에서, 종양 세포 용해물은 흡수 및 프로세싱을 위해 성숙화 중인 수지상 세포에 첨가된다. 성숙화 중인 수지상 세포는 이들이 완전 성숙화할 때까지 배양되고, 이어서 성숙한 과다활성화된 수지상 세포의 샘플은 상기에서와 같이 시험된다.
게다가, 완전 성숙한 수지상 세포가 또한 단리되고, 예를 들어 PBS 또는 신선한 배양 배지로 세척된다. 이어서, 단리된 과다활성화된 수지상 세포는 투여를 위해 제제화되거나 또는 나중에 사용하기 위해 동결보존될 수 있다.
실시예 3: 인간 말초 혈액으로부터 시험관내 과다활성 수지상 세포의 생성
이 실시예에서, 수지상 세포 (DC)는 건강한 인간 공여자의 PBMC로부터 시험관내에서 생성되었고, DC는 톨-유사 수용체 (TLR)의 효능제 및 염증-활성화 지질로성숙화 및 활성화되도록 유도되어 과다활성 성숙한 수지상 세포를 생성하였다. 이 실시예에서 사용된 염증-활성화 지질은 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC)이었다. 이 실시예에서 다음을 포함한 4가지 TLR 효능제가 시험되었다: 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS) (TLR4), 합성 디아실화 리포펩티드 Pam2CSK4 (Pam2; TLR2/TLR6), 합성 트리아실화 리포펩티드 Pam3CSK4 (Pam3; TLR2/TLR1) 및 합성 이중-가닥 RNA 유사체 폴리이노신-폴리시티딜산 (폴리 I:C) (TLR3). 다양한 TLR 효능제로 DC를 활성화시킨 후 시험 중인 염증-활성화 지질로 자극하여 어느 것이 이들 세포의 과다활성화를 야기하는지를 결정하였다. 과다활성화된 그러한 수지상 세포는 종양-보유 동물 및 인간을 치료하는데 더 효과적일 것으로 예상된다.
TLR은 패턴-인식 수용체 (PRR)의 부류이며, 이는 통상적으로 병원체 연관 분자 패턴 (PAMP)으로 지칭되는 미생물 분자를 검출한다. TLR 면역 수용체는 수지상 세포를 포함한 백혈구의 막 상에서 발현되며, TLR 효능제의 결합은 면역 반응 및 항원-특이적 획득 면역을 야기할 수 있는 분자적 사건을 촉발한다. 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS)는 가용성 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 능력을 가진 TLR4의 강력한 효능제이다. LPS는 통상의 PAMP를 인식하는, TLR4 경로에 의해 면역계 세포를 자극한다. Pam2는 합성 리포펩티드 (LP)이다. 이러한 리포펩티드는 감염 후 초기 선천성 숙주 반응을 활성화시키는 강력한 면역 조정제인 박테리아 리포단백질을 모방한다. Pam2는 TLR2 및 TLR6 경로를 통해 신호전달을 유도할 수 있으며 또한 TLR6-비의존적 방식으로도 그렇게 할 수 있다. Pam3은 또 다른 합성 LP이며 TLR2/TLR1 리간드이다. 폴리 I:C는 바이러스 감염과 연관된 분자 패턴인 이중-가닥 RNA의 합성 유사체이다. 폴리 I:C는 TLR3에 의해 인식된다.
방법
동결보존된 PBMC (헤마케어(Hemacare), 캘리포니아주 로스앤젤레스)로부터 유래된 DC를 500 U/ml의 재조합 인간 GM-CSF 및 500 U/ml의 재조합 인간 IL-4가 보충된 페놀 레드 미함유 RPMI-1640/10% 인간 열-불활성화된 AB 혈청에서 6웰 조직 배양 플레이트의 모든 웰에 플레이팅하고 균등하게 분포시켰다. 배양 개시 2일 후에 GM-CSF/IL4가 보충된 추가 배양 배지를 첨가하였다. 8일차에, 미성숙한 DC를 수확하고 (현탁액, 부착성 세포 및 비-부착성 분획) 96웰 평평한 바닥 조직 배양 플레이트에 2 x 105개 세포/웰로 삼중으로 플레이팅하였다. 미성숙한 DC의 샘플을 1 μg/ml의 LPS (시그마(Sigma)), 1 μg/ml의 Pam2 (인비보겐(Invivogen)), 1 μg/ml의 Pam3 (인비보겐), 또는 25 μg/ml의 폴리 I:C HMW (인비보겐)로 3시간 동안 자극하였다. 적정 농도의 oxPAPC (인비보겐) - 1 μg/ml, 3 μg/ml, 10 μg/ml, 30 μg/ml, 및 90 μg/ml에서 -를 적절한 샘플에 첨가하고 세포를 추가의 18시간 동안 배양하였다. DC 자극이 적절한 수확을 위해 너무 단단히 부착된 활성화된 DC를 초래한 경우 차가운 PBS 인큐베이션을 수행하였다.
DC를 염색하고 유동 세포측정 분석을 수행하여 하기 수지상 세포 표면 마커: CD1c, CD11b, CD40, CD80, CD86, CD123, CD141, MHC-I, MHC-II의 발현, 및 생존 또는 사멸 세포의 백분율을 평가하였다.
100 μl의 배양 배지에서의 시토카인 생산을 제조사의 지침을 사용하여 루미넥스(Luminex) 면역검정 시스템을 사용하여, 34개의 단백질 표적 (에오탁신(Eotaxin)/CCL11; GM-CSF; GROα/CXCL1; conIFNα; IFNγ; IL1β; IL1α; IL1RA; IL2; IL4; IL5; IL6; IL7; IL8/CXCL8; IL9; IL10; IL12 p70; IL13; IL15; IL17A; IL18; IL21; IL22; IL23; IL27; IL31; IP10/CXCL10; MCP1/CCL2; MIP1α/CCL3; MIP1β/CCL4; RANTES/CCL5; SDF1α/CXCL12; TNFα; TNFβ/LTA)에 걸쳐, 마우스 시토카인 및 케모카인 패널에 의해 평가하였다. 루미넥스 시스템은 단일 샘플에서 많은 표적을 동시에 검출할 수 있다.
논의
본 발명자들의 관찰을 기반으로 특정 TLR 효능제로 성숙화되고 염증-활성화 지질 oxPAPC로 과다활성화된 인간 DC가 Th1 반응을 유도할 수 있는 시토카인의 생산을 촉진하여, 이펙터 (예를 들어, CD8+ 세포독성 T-세포) 및 기억 T-세포에서의 증가를 야기할 것으로 예상되었다.
이 실시예에서, TLR-처리된 미성숙한 수지상 세포에 증가하는 농도로 oxPAPC를 도입하는 것은 전형적으로 DC 성숙화와 연관된 세포 표면 마커, 예컨대 CD69 및 CD83, 및 공동자극 분자 예컨대 CD86 및 MHC-II의 증진된 발현을 초래하였으며, 이는 증진된 T-세포 자극을 초래할 것이다. 시토카인 분석은 대부분의 TLR에 대해 더 높은 농도의 oxPAPC에서 더 낮은 농도로 IL-10의 조정을 나타냈으며, IL-5 및 IL-27 생산 (예를 들어, LPS)의 일부 동시 조정이 있었다. IL-10 감소는 조절 T 세포의 유도를 방지하여, 더 강력한 Th1 면역 반응이 일어나도록 할 수 있다.
실시예 4: 뮤린 골수 유래 수지상 세포에 의한 시토카인 생산의 시험관내 연구
배경
이 실시예에서, 미성숙한 수지상 세포 (DC)는 C57BL/6 및 BALB/c 마우스의 골수 유래 전구체로부터 시험관내에서 생성되었다. 풍부화된 미성숙한 수지상 세포 집단은 염증-활성화 지질 및 톨-유사 수용체 (TLR)의 효능제로 성숙화 및 활성화되도록 유도되어 과다활성 성숙한 수지상 세포를 생성하였다. 이전 실시예에서와 같이, 동일한 4가지 TLR 효능제: LPS, Pam2, Pam3, 및 폴리 I:C가 사용되었다. 염증-활성화 지질 oxPAPC는 성숙화 중인 수지상 세포를 과다활성화시키는데 사용되었다. 뮤린 골수-유래 DC의 활성화에 이어서 염증-활성화 지질로의 자극은 이들 세포의 과다활성화를 야기할 것이고, 이러한 과다활성화된 DC는 종양-보유 동물 및 인간을 치료하는데 더 효과적일 것으로 예상되었다.
방법
골수 세포는 C57BL/6 및 Balb/c 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 단리하였다. 계통 음성 전구체는 계통 세포 고갈 키트 (밀테니(Miltenyi))를 사용하여 풍부화하였다. 수지상 세포 전구체를 3 ml/웰로 GM-CSF (10 ng/ml) 및 IL-4 (10 ng/ml)가 보충된 RPMI 1640/10% 우태아혈청 (FBS)/페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민/2-머캅토에탄올 (2-ME)의 6웰 조직 배양 (TC) 플레이트의 모든 웰에 플레이팅하고 균등하게 분포시켰다. 배양 2일차에, 비-부착성 세포를 수확하고 새로운 플레이트에 다시 플레이팅하였다. GM-CSF/IL-4가 보충된 추가 배양 배지를 배양 4일차 및 6일차에 첨가하였다. 8일차에, 미성숙한 DC를 수확하고 (현탁액 및 느슨한 부착성 세포만) 96웰 평평한 바닥 TC 플레이트에 2 x 105개 세포/웰로 삼중으로 플레이팅하였다. DC를 1 μg/ml의 LPS (시그마), 1 μg/ml의 Pam2 (인비보겐), 1 μg/ml의 Pam3 (인비보겐), 또는 1 μg/ml의 폴리 I:C HMW (인비보겐)로 3시간 동안 자극하였다. 이어서, 적정 농도의 oxPAPC (인비보겐) - 1 μg/ml, 3 μg/ml, 10 μg/ml, 30 μg/ml, 및 90 μg/ml에서 -를 적절한 샘플에 첨가하고 추가의 18시간 동안 배양을 계속하였다. DC 자극이 적절한 수확을 위해 너무 단단히 부착된 활성화된 DC를 초래한 경우 차가운 PBS 인큐베이션을 수행하였다.
유동 세포측정 분석을 수행하여 수지상 세포 표면 마커의 발현을 평가하였다 (CD11c, CD11b, CD80, CD83, CD69, CD86, CD40, MHC-I, MHC-II, CD205, 그리고 생존/사멸 세포의 백분율을 결정하였다). 성숙한 과다활성화된 수지상 세포는, 예를 들어, CD80, CD86, CD83, CD40, MHC-1 및/또는 MHC-II에서의 증가를 나타낼 것으로 예상되었다.
100 μl의 배양 배지에서의 시토카인 생산을 단일 샘플에서 많은 표적을 동시에 검출할 수 있는 면역검정 시스템인 루미넥스 xMAP® 기술을 사용하여, 26개의 단백질 표적 (IFNγ; IL12 p70; IL13; IL1β; IL2; IL4; IL5; IL6; TNFα; GM-CSF; IL18; IL10; IL17A; IL22; IL23; IL27; IL9; GROα; IP10; MCP1; MCP3; MIP1α; MIP1β; MIP2; RANTES; 및 에오탁신)에 걸쳐, 마우스 시토카인 및 케모카인 패널에 의해 평가하였다. oxPAPC 및 TLR 효능제에 의한 자극은, 예를 들어, IL1β, TNFα, IL-2 및/또는 IL12 p70을 포함한 적어도 다수의 염증성 시토카인을 상향조절할 것으로 예상되었다.
논의
이 실시예에서 TLR 효능제로 성숙화되고 염증-활성화 지질 oxPAPC로 과다활성화된 뮤린 기원의 DC는 Th1 반응을 유도하는 시토카인을 생산하여, 궁극적으로 이펙터 (예를 들어, CD8+ 세포독성 T-세포) 및 기억 T-세포를 상향조절하는 적응 면역 반응을 야기할 것으로 예상되었다.
이 실시예에서, oxPAPC의 농도를 증가시키는 것은 IL-12 p70의 일부 상향조절을 초래하였다 (LPS, Pam2, 및 Pam3 처리군에서). 또한, 특별히 LPS 및 Pam3 처리군에서 더 높은 oxPAPC 농도에서 IL-13 생산의 일부 조절이 있었으며, 이는 또한 IL-10의 일부 하향조절을 나타냈다. IL-10의 하향조절은 전형적으로 Th2 반응의 억제를 초래하며, 이는, IL-12 p70의 증가된 생산과 함께, 면역 치료적 치료에 유리한 조건을 나타낼 수 있다.
실시예 5: 동결보존된 풍부화된 뮤린 미성숙한 DC의 시험관내 연구
이 실시예에서, 동결보존된 C57BL/6 및 BALB/c 미성숙한 DC를 톨-유사 수용체 (TLR)의 효능제 및 염증-활성화 지질로 시험관내에서 자극하여 과다활성 성숙한 수지상 세포를 생성하였다. 미성숙한 DC는 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS; TLR4), 열 불활성화된 바실루스 칼메트-게랑 (hBCG; TLR2/TLR4), 폴리이노신-폴리시티딜산 (폴리 I:C; TLR3), 및 1-(4-아미노-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-2-메틸프로판-2-올 (R-848; TLR7/TLR8)을 포함한 4가지 TLR 효능제로 자극하였다. 이전 실시예에서와 같이, Pam 2 (TLR2/TLR6) 및 Pam3 (TLR2/TLR1)은 연구 전반에 걸친 비교를 위해, 처리되지 않고 가장 높은 염증-활성화 지질 농도에서만 포함되었다. 또한, 이전 실시예에서와 같이, 염증-활성화 지질 oxPAPC를 사용하였으며, 게다가 oxPAPC로부터 유래된 구성요소인 1-팔미토일-2-글루타릴 포스파티딜콜린 (PGPC; 케이맨(Cayman))을 포함시켰다. TLR 효능제로의 뮤린 골수-유래 미성숙한 DC의 활성화에 이어서 염증-활성화 지질로의 자극은 이들 세포의 과다활성화를 야기하고, 이러한 과다활성화된 DC는 종양-보유 동물 및 인간을 치료하는데 더 효과적일 것으로 예상되었다.
방법
미성숙한 동결보존된 C57BL/6 및 BALB/c DC (셀레로(Cellero))를 37℃의 수조에서 급속 해동하고 세포를 RPMI 1640/10% FBS/페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민/2-ME의 부피의 10배로 재현탁하였다. 세포를 완전 배지를 사용하여 2회 세척하였다.
해동된 세포를 96-웰 평평한 바닥 TC 플레이트에 2 x 105개 세포/웰로 삼중으로 플레이팅하였다. DC는 1 μg/ml의 LPS (시그마 알드리치), hBCG (오르가논 테크니카(Organon Teknika)/코그네이트(Cognate))의 1:400 희석액, 1 μg/ml의 R848 (시그마 알드리치), 1 μg/ml Pam2 (인비보겐), 1 μg/ml Pam3 (인비보겐), 및 25 μg/ml의 폴리 I:C HMW ("고분자량"; 인비보겐)로 3시간 동안 프라이밍하였다. 적정 농도의 oxPAPC (인비보겐) 또느 PGPC (케이맨) - 1 μg/ml, 3 μg/ml, 10 μg/ml, 30 μg/ml, 및 90 μg/ml에서 -를 적절한 샘플에 첨가하고 추가의 48시간 동안 배양하였다.
활성화되고 성숙화된 DC가 TLR 및 염증-활성화 지질로 자극한 후 단단히 부착된 경우, 비-부착성 세포를 가진 상청액을 제거하고 이 현탁액을 얼음 위에 두었다. 차가운 PBS를 웰에 첨가하고 플레이트를 30분 동안 냉장고에 두어 부착성 세포가 방출되도록 하였다. 부착성 세포 및 비-부착성 세포를 PBS로 수집하고 얼음 위에 유지된 이전에 수확한 세포에 첨가하였다. 세포를 유동 세포측정 표현형결정 전에 HBSS 또는 DPBS로 1회 세척하고, 유동 세포측정 분석을 위해 삼중으로 웰을 합하였다.
DC를 표지된 모노클로날 항체로 염색하고 유동 세포측정 분석을 수행하여 하기 수지상 세포 표면 마커: CD11b, CD11c, CD14, CD40, CD69, CD80, CD83, CD86, CD205, MHCI, MHCII의 발현을 평가하고, 세포가 생존 또는 사멸하였는지를 결정하였다.
100 μl의 배양 배지에서의 시토카인 생산을 제조사의 지침을 사용하여 루미넥스 xMAP® 멀티플렉스 기술을 사용하여, 26개의 단백질 표적 (IFNγ; IL12 p70; IL13; IL1β; IL2; IL4; IL5; IL6; TNFα; GM-CSF; IL18; IL10; IL17A; IL22; IL23; IL27; IL9; GROα; IP10; MCP1; MCP3; MIP1α; MIP1β; MIP2; RANTES; 및 에오탁신)에 걸쳐, 마우스 시토카인 및 케모카인 패널에 의해 평가하였다. xMAP 시스템은 단일 샘플에서 많은 표적을 동시에 검출할 수 있는 면역검정 시스템이다.
논의
이 실시예에서 미성숙한 뮤린 DC는 TLR 효능제로 성숙화되고 염증-활성화 지질 oxPAPC 또는 그의 구성요소 지질인 PGPC로 과다활성화되었으며, 이전에서와 같이, 이들 지질이 Th1 반응을 향하여 시토카인 생산을 증진시킬 것인지를 알아보기 위해 주의를 기울였다. oxPAPC 및 PGPC 둘 다의 농도를 증가시키면서 처리된 자극된 DC는 IL-1β의 생산을 상향조절하였다. IL-1β에서의 이러한 증가는 DC 과다활성화의 특징이다.
실시예 6: 동결보존된 인간 수지상 세포 전구체의 분화, 성숙화, 및 과다활성화에 대한 시험관내 연구
이 실시예에서, 미성숙한 DC의 풍부화된 세포 집단은 동결된 인간 PBMC를 사용하여 시험관내에서 생성되었다. 풍부화된 인간 미성숙한 DC의 수득된 세포 집단은 다양한 톨-유사 수용체 (TLR)의 효능제로 활성화되고 성숙화된 후에 염증-활성화 지질로 추가로 활성화되어 과다활성 성숙한 수지상 세포를 생성하였다. 미성숙한 DC가 풍부화된 세포 집단은 실시예 5에서 사용된 TLR 효능제 중 4가지, 즉 LPS, 열 불활성화된 BCG, 폴리 I:C, 및 R848로 성숙화 및 활성화되도록 유도되었다. 또한, 실시예 5에서와 같이, DC는 염증-활성화 지질 oxPAPC 및 PGPC로 추가로 자극되었다.
방법
동결된 인간 PBMC (헤마케어, 캘리포니아주 로스앤젤레스)를 해동하고 세척한 다음에, T75 TC 플라스크 (대략 2 x 106개 세포/ml)에 37℃에서 적어도 2시간 동안 플레이팅하였다. 조직 배양 기질 표면에 단핵구가 부착된 후, 비-부착성 세포를 제거하고, 플라스크를 따뜻한 완전 배지로 부드럽게 헹구었다. 부착성 단핵구를 500 U/ml의 재조합 인간 GM-CSF 및 500 U/ml의 재조합 인간 IL-4가 보충된 페놀 레드 미함유 RPMI-1640/10% 인간 열-불활성화된 AB 혈청에서 7일 동안 배양하였다. 배양 개시 2일 후에 배양 배지에 GM-CSF/IL-4를 보충하였다.
8일차에, 현탁액, 부착성 세포 및 비-부착성 분획의 수집에 의해 미성숙한 DC의 풍부화된 집단을 수확하고, 세포를 96웰 평평한 바닥 TC 플레이트에 2 x 105개 세포/웰로 삼중으로 플레이팅하였다. 풍부화된 미성숙한 DC를 다양한 TLR: 1 μg/ml의 LPS (시그마 알드리치), 25 g/ml의 폴리 I:C HMW ("고분자량"; 인비보겐), 열-불활성화된 BCG (오르가논 테크니카/코그네이트)의 1:400 희석액 및 1 μg/ml의 R848 (시그마 알드리치)로 3시간 동안 자극하였다. 적정 농도의 염증-활성화 지질 oxPAPC (인비보겐) 또는 PGPC (케이맨) - 1 μg/ml, 3 μg/ml, 10 μg/ml, 30 μg/ml, 및 90 μg/ml를 적절한 샘플에 첨가하고 추가의 18시간 동안 배양하였다.
TLR 및 염증-활성화 지질로 자극한 후, 활성화된 DC가 조직 배양 기질 표면에 단단히 부착된 경우, 비-부착성 세포를 가진 상청액을 제거하고 현탁액을 얼음 위에 두었다. 차가운 PBS를 웰에 첨가하고 플레이트를 30분 동안 냉장고에 두어 부착성 세포가 조직 배양 기질로부터 방출되도록 하였다. PBS에서 수집된 세포를 수집하고 얼음 위에 유지된 이전에 수확한 세포에 첨가하였다. 수집된 세포를 HBSS 또는 DPBS로 1회 세척한 후에 유동 세포측정 표현형결정 및 분석을 위해 삼중으로 웰을 합하였다.
DC를 염색하고 유동 세포측정 분석을 수행하여 하기 수지상 세포 표면 마커: CD1c, CD11c, CD40, CD69, CD80, CD83, CD86, CD123, CD141, MHC-I, MHC-II의 발현, 및 생존 및 사멸 세포에 대해 평가하였다.
상기에서와 같이, 100 μl의 배양 배지에서의 시토카인 생산을 제조사에 의해 지시된 바와 같이 루미넥스 xMAP® 면역검정 시스템을 사용하여, 34개의 단백질 표적 (에오탁신/CCL11; GM-CSF; GROα/CXCL1; IFNα; IFNγ; IL1β; IL1α; IL1 RA; IL2; IL4; IL5; IL6; IL7; IL8/CXCL8; IL9; IL10; IL12 p70; IL13; IL15; IL17 A; IL18; IL21; IL22; IL23; IL27; IL31; IP10/CXCL10; MCP1/CCL2; MIP1α/CCL3; MIP1β/CCL4; RANTES/CCL5; SDF1α/CXCL12; TNFα; TNFβ/LTA)에 걸쳐, 마우스 시토카인 및 케모카인 패널에 의해 평가하였다. 루미넥스 xMAP® 시스템은 단일 샘플에서 많은 표적을 동시에 검출할 수 있다.
논의
TLR 효능제로 성숙화되고 염증-활성화 지질 oxPAPC, 뿐만 아니라 그의 구성요소 지질인 PGPC로 과다활성화된 인간 기원의 DC는 Th1 반응을 유도하는데 도움이 되는 시토카인 생산을 촉진하여, 이펙터 (예를 들어, CD8+ 세포독성 T-세포) 및 기억 T-세포에서의 증가를 야기할 것이다. T-세포 자극을 증진시키는 DC 성숙화 및 공동자극 분자와 전형적으로 연관된 세포 표면 마커는 이 환경에서 상향조절될 것이다. IL-1 패밀리 시토카인 (IL-1β 포함) 및 IL-12의 생산은, IL-10 억제와 동시에 일어나, T-세포 매개 적응 면역 반응에 유리한 환경을 생성할 것이다.
실시예 7: 과다활성화된 수지상 세포를 투여한 동계 종양 세포 - CT26, 4T1, 매디슨(Madison) 109, 및 A20의 생체내 연구
이 실시예에서, 과다활성화된 DC를 생성하기 위해, TLR, 플러스 IFNγ (일부 경우에), 및 염증-활성화 지질의 다양한 조합을 사용하여 생체외에서 생산된 종양 용해물-로딩된 성숙한 뮤린 DC를 동계 마우스에 투여하여, 과다활성 DC 중 어느 것이 종양-보유 동물에서 종양 성장을 늦추는데 더 효과적이었는지를 결정하였다. DC에 다양한 동계 BALB/c 암종 모델 세포주로부터의 종양 세포 용해물을 로딩하고 TLR, 플러스 IFNγ, 및 염증-활성화 지질과 추가로 조합하여, 과다활성 DC를 생성하였으며, 이는 암컷 BALB/c 마우스에 전신 투여되었다. 사용된 염증-활성화 지질은 다시 산화된 산화된 1- 팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC; 인비보겐) 및 1-팔미토일-2-글루타릴 포스파티딜콜린 (PGPC; 케이맨)이었다. 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC; 케이맨)이 또한 이 연구에 포함되었다. PGPC 및 POVPC는 oxPAPC로부터 유래된 구성요소이다.
풍부화된 미성숙한 수지상 세포의 성숙화를 유도하기 위해 이 실시예에서 사용된 3가지 TLR 효능제는 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS; TLR4), 폴리이노신-폴리시티딜산 (폴리 I:C; TLR3), 및 1-(4-아미노-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-2-메틸프로판-2-올 (R848, 시그마 알드리치)산이었다. R848은 TLR7/TLR8의 강력한 합성 효능제이며 전형적으로 TNF-α, IL-6 및 IFN-α의 시토카인 수준을 증가시킨다. 따라서, 이 실시예에 포함된 3개의 상이한 TLR 중에서, TLR3, TLR4, 및 TLR7/TLR8을 증진된 면역 반응을 유도하는 성공적인 DC 성숙화 및 과다활성화의 과정에 영향을 미칠 수 있는 경로로서 탐구하였다.
4가지의 상이한 동계 암종 마우스 모델 세포주를 이 실시예에서 종양 세포 용해물의 공급원으로 선택하였다. 동계 마우스 모델은 기원 균주로부터 유래된 종양을 보유하는 면역적격 마우스를 활용한다. 성장 역학 및 표준 치료 작용제 (예를 들어, 항-CTLA4 및 PD-1 체크포인트 억제제)에 대한 반응을 기재하는 이용가능한 데이터를 가진 면역원성 마우스 모델이 선택하였으며 그 이유는 이들 모델은 승인된 작용제에 더 양호한 비교 공급원을 제공할 수 있기 때문이다.
본 개시내용의 방법 및 조성물이 상이한 암에 광범위한 이용가능성을 가짐을을 제시하기 위해, 이 실시예는 종양 조직형 및 반응 특성의 다양성을 나타내는 마우스 모델을 포함하였다. 하기 4가지 마우스 모델이 선택되었다: 매디슨 109 (폐 암종), CT26 (결장 암종), 4T-1 (유방 암종), 및 A20 (림프종). CT26 및 A20 모델은 "반응성" 모델이고, 4T-1 및 매디슨 109 모델은 "난치성" 모델이다. 모든 이들 모델은 BALB/c 마우스로부터 유래되었으며 그와 동계이다.
종양 세포 용해물의 제조
각각의 세포주 (CT26, 매디슨 109, 4T-1, 및 A20)로부터 적어도 2 x 109개 종양 세포를 대수기에서 수확하였다. 부착성 세포를 효소 세포 해리 방법을 피하면서 베르센(Versene) (또는 등가물) 세포 해리 용액으로 수확하였다. 세포를 빙냉 DPBS로 2회 헹구어 세포로부터 혈청을 제거하였다.
세포를 각각의 세척 후 5분 동안 400 x g에서 펠릿화하였다. 원심분리 후, 세척 상청액을 제거하고 폐기하였다. 종양 펠릿을 페놀 레드가 없는 적절한 부피의 RPMI-1640 (1억 5천만 내지 3억개 세포/ml)에 재현탁하고 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 이어서 세포 현탁액 튜브를 -80℃에서 1시간 초과 동안 동결한 다음에 실온에서 해동하였다. 대안적으로, 종양 펠릿을 액체 질소에서 급속-동결하고, 37℃ 건조 수조에서 급속 (< 5분) 해동하였다.
동결 해동 과정은 종양 세포를 효과적으로 용해시키기 위해 총 6회의 동결-해동 주기에 대해 추가로 5회 반복하였다. 종양 세포의 프로세싱은 동결-해동 과정의 동결 단계 동안 물질을 동결된 상태로 두는 능력의 결과로서 연장된 기간 - 최대 수일 -에 걸쳐 임의로 수행하였다. 점성인 경우, 용해물을 얼음 위에서 30초 동안 초음파처리하였다. 해동되고 용해된 세포 현탁액을 함유하는 튜브를 탁상용 원심분리기 상에서 3분 동안 최고 속도로 원심분리하였다. 종양 용해물 (상청액)을 멸균 50 ml 원심분리 튜브에 풀링하고 DC 단백질 검정을 사용하여 단백질 농도 결정을 위해 샘플링하였다. 최대 2 mg/ml의 총 단백질을 조정하고 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다. 여과된 용해물을 내부 트레딩된 표지된 저온바이알에 분취하고 단단히 마개를 씌웠다. 표준 비색 단백질 검정 (바이오라드(BioRad))을 사용하여 여과된 용해물의 최종 단백질 농도를 확인하였다. 각각의 종양 세포주의 종양 용해물을 사용할 준비가 될 때까지 -80℃에서 보관하였다.
양성 대조군으로서 미성숙한 DC로부터 수지상 세포의 제조
미성숙한 DC를 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 0.1% 0.1M 2-ME 및 10 ng/ml의 뮤린 재조합 GM-CSF가 보충된 RPMI-1640에서 100 μg/ml로 희석된 종양 용해물로 구성된 종양 용해물 배지와 함께 인큐베이션하였다. DC를 1.0 x 106개 세포/ml 내지 1.5 x 106개 세포/ml에서 재현탁하였다. 이어서, 종양 세포 용해물 배지 세포 현탁액을 이들 첨가를 반영하도록 표지된 새로운 배양 플라스크에 두고 14시간 내지 20시간 동안 인큐베이터에 다시 두었다. 이 인큐베이션 기간 후, 부착성 및 비-부착성 세포를 수확하였다.
비-부착성 세포로 이루어진 상청액을 제거하고, 현탁액을 얼음 위에 두었다. 차가운 PBS를 웰에 첨가하고 플레이트를 30분 동안 냉장고에 두어 부착성 세포가 방출되도록 하였다. 세포 스크레이퍼를 차가운 PBS 처리 후에 여전히 붙어 있는 세포를 제거하기 위해 재량에 따라 사용하였다. PBS를 가진 세포를 수집하고 얼음 위에서 이전에 수확한 세포에 첨가하였다. 세포를 주사용으로 재현탁하기 전에 RPMI (첨가제 없음)로 1회 세척하였다.
DC의 펄싱 및 동결보존
이 실시예에서의 각각의 연구에 대해 충분한 동결보존 BALB/c DC (셀레로)를 해동하고 10% FBS, 1% L 글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 및 0.1% 0.1 M 2-ME가 보충된 RPMI-1640으로 2회 헹구었다 (총 동결보존 횟수 및 동결 시기는 로트마다 달라짐). 10 ng/ml의 뮤린 재조합 GM-CSF를 배지에 새로 첨가하여 미성숙한 DC를 생성하였다. 세포를 4분 동안 400 x g에서 펠릿화하였다. 유동 세포측정 표현형결정 분석을, 살아있는 % 세포, 뿐만 아니라 하기 세포 표면 마커를 살피면서 수행하였다: CD11b, CD11c, CD14, CD40, CD69, CD80, CD83, CD205, MHC I, MHC II. 이어서 나머지 세포를 100 μg/ml의 종양 용해물을 함유하고 GM-CSF가 보충된 DC 배지를 사용하여 1 x 106개 세포/ml에서 재현탁하였다. 이어서 세포를 T225 또는 T125 조직 배양 플라스크에 플레이팅하고 37℃에서 20 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다.
이어서 TLR 효능제 및 IFNγ를, 적절한 경우, 표 1에 특정된 바와 같이 각각의 웰에 3시간 동안 첨가하고, 이 시점에서 적절한 염증-활성화 지질을 120 μM의 농도로 배양 배지에 직접적으로 첨가하였다. 플라스크를 부드럽게 흔들어 혼합하고 37℃에서 추가 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 비-부착성 및 느슨한 부착성 세포를 배양 배지로 부드럽게 헹구어 수확하였다. 세포 현탁액을 얼음 위에 두었다. 이어서 빙냉 DPBS를 플라스크에 첨가하고, 임의의 나머지 세포를 2 내지 8℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트에 부착된 세포를 세포 스크레이퍼로 부드럽게 스크레이핑하였다. 세포를 수집하고 비-부착성 분획과 합하였다. 세포를 HBSS로 2회 헹구었다. 세척 완충제를 흡인하여 추가 완충제를 제거하였다. 세포는 이전과 같이 유동 세포측정에 의해 다시 분석하였다. 나머지 세포를 5 x 106개 세포/ml의 세포 밀도로 크리오스타(Cryostar)® 동결 배지 (바이오라이프(Biolife))에 재현탁하였다. 세포를 투여 제제에 나중에 사용하기 위해 10% DSMO (크리오스토르(CryoStor))를 가진 동결보존 배지에서 동결보존하였다.
표 1: 자극 조건, 종양 용해물-펄싱된 과다활성화된 DC의 전신 투여
Figure pct00001
연구 절차
마우스를 4개의 별도의 연구로 나누고, 여기서 각각의 연구는 상이한 동계 마우스 모델 세포주를 수반하였다. 연구 시작에서, 마우스 연령을 매칭시켰다 (8주 내지 12주). 성장 역학 및 예상되는 이식률은 마우스에 주사된 종양 세포의 수에 영향을 미쳤으며, CT26 마우스는 매트리겔(Matrigel)® 중 3 x 105개 세포의 0.1 ml 주사를 받았고 다른 세 연구 (즉, 4T-1, A20, 및 매디슨 109)에서의 마우스는 매트리겔® 중 1 x 106개 종양 세포의 0.1 ml 주사를 받았다. 모든 종양 세포 주사는 오른쪽 옆구리에 피하 투여되었다. 종양이 80 내지 120 mm3의 평균 크기에 도달한 경우 쌍-매칭을 수행하였으며, 이 시점에서 치료가 시작되었다. 각각의 연구는 최대 8마리의 암컷 BALB/c 마우스의 16개 군을 함유하였으며, 이들 군 중 둘은 양성 및 음성 대조군으로서 지정되었다.
1일차, 8일차 및 15일차에, 표 1의 군 각각으로부터 동결보존된 자극된 DC를 해동하고 각각의 개별 치료적 주사에 대해 1 x 106개 세포/50 μl의 목표 밀도로 RPMI-1640 (첨가제 없음)에 재현탁하였다. 마우스는 종양 세포가 주사된 옆구리 반대편의 왼쪽 옆구리에 0.05 ml/마우스의 부피로, 3 x 105 내지 1 x 106개 세포 (뱃치 수율에 따라, 수가 달라짐)의 성숙한 활성화된 DC를 피내로 주사받았다. 체중을 처음 5일 동안 매일 기록하였고, 이어서 연구 종료 때까지 주당 2회 기록하였다. 종양을 연구 종료 때까지 주당 2회 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 성장 지연 (TGD)은 연구 종점이었고, 여기서 종양이 미리 특정된 크기 (4T-1 모델에서 1,000 mm3, 및 CT-26, A20, 및 매디슨 109 모델에서 2,000 mm3)에 도달한 경우, 또는 45일이 경과한 경우 중 어느 쪽이든 먼저 발생한 시점에 연구가 종료되었다.
논의
이들 연구는 동계 종양 세포 용해물로 펄싱되고 상이한 자극 조건 (즉, TLR 효능제 및/또는 IFNγ 및/또는 염증-활성화 지질)으로 성숙화된 BALB/c DC로 치료적으로 처리된 BALB/c 마우스 군이 종양 성장 지연 (TGD)의 연구 종점에 도달하는 것과 관련하여 상이한 결과를 생성할 것임을 제시한다. TLR 효능제 및 염증-활성화 지질로 DC를 자극하는 것은 과다활성화된 DC를 주사 부위로 전달할 수 있게 하며, 여기서 DC는 배수 림프절로 이동하고 지속적인 기간 동안 계내에서 증가된 수준의 전염증성 시토카인 (예를 들어, IL-1β)을 분비하여, 피롭토시스를 회피하며, 증진된 T-세포 매개 염증 반응을 생성할 것이다. T-세포 반응은 일부 경우에 종양 성장을 지연 및/또는 역전시키고 수명을 연장할 만큼 충분히 강력할 수 있다.
실시예 8: 생체내 종양내 연구 - CT26, 4T-1, 매디슨 109, A20 동계 종양 세포주
이 실시예에서, BALB/c 마우스 DC를 TLR 및 IFN-γ의 다양한 조합으로 생체외에서 자극한 후, 염증-활성화 지질로 활성화시켜, 과다활성화된 DC를 생성하였다. DC가 종양 세포 증식 및 종양 성장을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해 종양의 크기를 측정하였다.
상기의, 실시예 7에서와 같이, 동일한 3개의 TLR 효능제 (즉, LPS, 폴리 I:C, 및 R848) 및 동일한 3개의 염증-활성화 지질 (즉, oxPAPC, PGPC, 및 POV-PC)을 이 실시예에서 탐구하였다. 상기에서 선택한 바와 동일한 4개의 동계 암종 마우스 세포주로부터 유래된 종양이 BALB/c 마우스에서 개시되었다.
상기에 실시예 7과 비교하여 이 실시예는 상이한 투여 방식 (종양내 대 전신 전달), 및 DC에 의한 항원 흡수 및 프로세싱의 위치/부위 (생체내 대 생체외)의 사용을 포함한다. 실시예 7에서, DC를 생체외에서 종양 용해물로 펄싱하고, IFNγ와 조합된 TLR, 및 염증-활성화 지질로 추가로 자극한 다음에, 전신적으로 (피내로) 주사하였다. 이 실시예에서, DC는 생체외에 있는 동안 종양 세포에 대해 나이브하며, 이들은 IFNγ와 조합된 TLR로 자극된 다음에, 염증-활성화 지질로 활성화된다. 항원을 DC에 제시하고, 흡수 및 프로세싱하며, 여기서 DC가 후속적으로 배수 림프절로 이동하여 나이브 T 세포에 항원을 제시하여 항원 특이적 면역 반응을 탑재하는 계내에서 종양 덩어리에 직접적으로 주사하기 위해 DC를 수집 및 제제화한다.
이 실시예에서 모든 4개의 종양내 연구는 DC 전구체 세포의 출발 물질로서 "신선한" BALB/c 골수-유래 세포를 사용하여 수행하였다. 모든 4개의 연구의 세포는 셀레로에 의해 제조하였다. DC는 다양한 종양내 주사를 위한 제조에서, 7일간 DC 배양 및 TLR 및 염증-활성화 지질로의 후속 자극 후, 세포 자극 과정의 종료 시, 단지 1회 동결보존하였다.
이 실시예의 4개의 연구 중 3개 (즉, A20, 매디슨 109, 및 4T-1 세포주 사용)에 대한 치료적 종양내 DC 백신접종은 종양이 대략 60 내지 80 mm3에 도달한 경우 시작될 것이다. CT26 종양내 투여 연구를 위한 시작 종양 부피는 대략 80-120 mm3일 것이다.
방법
단핵 세포를 BALB/c 골수 (셀레로)로부터 단리하고 배양하여 상기에 기재된 바와 같이, 미성숙한 DC를 생성하였다. 마커 패널: CD11b, CD11c, CD14, CD40, CD69, CD80, CD83, CD86, CD205, MHC-I, MHC-II를 살피면서, 미성숙한 DC의 샘플에서 유동 세포측정 표현형결정 분석을 수행하였다. 나머지 세포를 GM-CSF가 보충된 DC 배지로 1 x 106/ml로 재현탁하고 T225 또는 T125 조직 배양 플라스크에 첨가하고 37℃에서 20 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다.
TLR 효능제 및 IFN-γ의 동일한 부피의 2 x 칵테일을, 해당하는 경우, GM-CSF가 보충된 DC 배지에서 배양물에 직접적으로 첨가하고, 플라스크를 부드럽게 흔들어 혼합하였다. 3시간 후, 표 2에 따라, 해당하는 경우, 120 μM의 염증-활성화 지질을 첨가하였다. 플라스크를 부드럽게 흔들어 혼합하고 37℃에서 추가 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 비-부착성 및 느슨한 부착성 세포를 배양 배지로 부드럽게 헹구어 수확하고, 세포 현탁액을 얼음 위에 두었다. 빙냉 DPBS를 플라스크에 첨가하고 2-8℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트에 부착된 세포를 세포 스크레이퍼로 부드럽게 스크레이핑하고, 세포를 수집하고 비-부착성 분획과 합하였다. 세포를 HBSS로 2회 헹구었다. 세척 완충제를 흡인하여 추가 완충제를 제거하였다. 세포는, 이전과 같이, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 나머지 세포는 ml당 5 x 106개 세포의 세포 밀도로 크리오스타® 동결 배지 (바이오라이프)에 재현탁하였다. 세포는 종양내 투여 연구에서 나중에 사용하기 위해 10% DSMO (크리오스토르)를 가진 동결보존 배지에서 동결보존하였다.
표 2: 자극 조건, 과다활성화된 DC의 종양내 투여
Figure pct00002
양성 대조군의 제조
R848 (1 μg/ml) 및 IFNγ (최대 1,000 U/ml)를 BALB/c DC 세포 현탁액에 3시간 동안 첨가하고, 이 시점 후 세포를 TC 플라스크에 플레이팅하고 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 부착성 및 비-부착성 세포를 수확하였다. 비-부착성 세포를 가진 상청액을 제거하고 현탁액을 얼음 위에 두었다. 차가운 PBS를 웰에 첨가하고, 플레이트를 냉장고에 30분 동안 두어 임의의 남아 있는 부착성 세포가 방출되도록 하였다. 세포 스크레이퍼를 여전히 플레이트에 달라붙어 있는 세포에 사용하였다. 이어서 PBS를 가진 세포 현탁액을 수집하고 얼음 위에 유지된 이전에 수확한 세포에 첨가하였다. 전체 수집된 세포를 주사용으로 재현탁하기 전에 RPMI 또는 HBSS로 1회 세척하였다.
상기에서와 같이, 자극 후 유동 세포측정 분석을 수행하였다.
연구 절차
마우스를 4개의 별도의 연구로 나누고, 여기서 각각의 연구는 상이한 동계 마우스 모델 세포주를 수반하였다. 연구 시작에서, 마우스 연령을 매칭시켰다 (8주 내지 12주). 성장 역학 및 예상되는 이식률은 마우스에 주사된 종양 세포의 수에 영향을 미쳤으며, CT26 마우스는 매트리겔® 중 3 x 105개 세포의 0.1 ml 주사를 받았고 다른 세 연구 (즉, 4T-1, A20, 및 매디슨 109 세포주 연구)에서의 마우스는 매트리겔® 중 1 x 106개 종양 세포의 0.1 ml 주사를 받았다. 그의 종양이 60 내지 80 mm3 (즉, A20, 매디슨 109, 및 4T-1 세포주 연구의 경우) 또는 약 80 내지 120 mm3 (CT26 연구의 경우)의 평균 크기에 도달한 경우 마우스 중에서 쌍-매칭을 수행하여 이들을 처리군으로 분할하였으며, 이 시점에서 치료가 시작되었다. 각각의 연구는 최대 8마리의 암컷 BALB/c 마우스의, 양성 및 음성 대조군을 포함한 16개 군을 함유하였다.
마우스의 각각의 군에 대한 DC를 주사 전에 해동하고, 해동 시, 표 Y로부터의 DC의 각각의 개별 군을 주사 전에 1x106개 세포/50 μl의 목표 밀도로 RPMI-1640 (첨가제 없음)에 재현탁하였다. 마우스는 1일차, 2일차, 3일차, 및 7일차에, 용량당 50 ml의 DC 백신을 4회 받았다. 표 2에서의 군-특이적 자극 조건에 따라, 마우스에 이들 DC를 종양내 주사하였다.
체중을 처음 5일 동안 매일 기록하였고, 이어서 연구 종료 때까지 주당 2회 기록하였다. 종양을 연구 종료 때까지 주당 2회 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 성장 지연 (TGD)은 연구 종점이었고, 여기서 종양이 미리 특정된 크기 (4T-1 연구에서 약 1,000 mm3; 다른 3개의 연구에서 약 2,000 mm3)에 도달한 경우, 또는 45일이 경과한 경우 중 어느 쪽이든 먼저 발생한 시점에 연구가 종료되었다.
결과
이들 연구는 상이한 자극 조건 (즉, TLR 효능제 및/또는 IFNγ 및/또는 염증-활성화 지질)으로 성숙화된 BALB/c DC로 치료적으로 처리된 BALB/c 마우스 군이 종양 성장 지연 (TGD)의 연구 종점에 도달하는 것과 관련하여 상이한 결과를 생성할 것임을 제시한다. TLR 효능제 및 염증-활성화 지질로 DC를 자극하는 것은 DC를 과다활성화시킬 것이며, 이들 DC는 계내에서 종양 특이적 항원을 선택하고, 나중에 배수 림프절로 이동하여 항원-특이적 메시지를 T-세포에 전달할 것이다. 주사 직후 및 그 후, 이들 과다활성, 비-피롭토시스성 DC는 염증-활성화 지질로 자극되지 않았은 경우 달리 가능했을 것보다 더 오랫동안 계내에서 증가된 수준의 전염증성 시토카인 (예를 들어, IL-1β)을 분비할 것이다. 염증 반응은 일부 경우에 종양 성장을 지연 및/또는 역전시키고 결과적으로 마우스가 더 오래 생존할 만큼 충분히 강력할 수 있다.
실시예 9: 항원 특이적 T-세포의 시험관내 또는 생체외 자극
이 실시예에서, 종양 용해물의 존재 하에 IFNγ 및 염증-활성화 지질과 조합하여, TLR 효능제의 존재 하에 성숙화된 미성숙한 DC는 항원-특이적 T 세포에 의한 증진된 수준의 IFNγ 생산을 자극하는 것으로 제시되었다.
T 세포는, 예를 들어, 말초 혈액로부터 단리되거나, 단리 없이 혈액 구성성분의 세포 집단에서 자극될 수 있다. T 세포는 미성숙한 DC와, TLR 효능제, 예컨대 LPS, BCG, 폴리 I:C, 및/또는 R848, 및 IFNγ로 성숙화된 DC와, 또는 TLR 효능제 IFNγ, 및 염증-활성화 지질, 예컨대, 예를 들어, oxPAPC로 성숙화된 DC와 공동-배양된다. 적절한 기간 후에, 활성화된 T 세포를 단리하고 상업적으로 이용가능한 ELISA 검정을 사용하여 IFNγ 생산에 대해 검정할 수 있다.
결과는 IFNγ와 조합된 TLR 효능제, 예컨대 예를 들어, LPS 또는 BCG로 자극되고 염증-활성화 지질, 예컨대, oxPAPC로 활성화된 DC가 항원 특이적 T 세포의 우수한 자극제임을 나타낼 것이다. 미성숙한 DC와 공동-배양된 T 세포는 IFNγ를 거의 생산하지 않을 것으로 예상되며, 한편 IFNγ와 조합된 BCG를 사용하여 성숙화된 DC와 공동-배양된 T 세포는 IFNγ의 중간 생산자가 될 것으로 예상된다. IFNγ와 조합된 TLR 효능제, 예컨대 BCG를 사용하여 성숙화되고 후속적으로 염증-활성화 지질, 예컨대 oxPAPC로 활성화된 DC와 공동-배양된 T 세포는 최고 수준의 IFNγ를 생산할 것으로 예상될 것이다. 따라서, 예를 들어 IFNγ와 조합된 BCG로 성숙화되고 oxPAPC로 후속적으로 활성화된 DC는 항원-특이적 T 세포의 더 양호한 자극제이다.
이 방법에 의해 생산된 활성화된 T 세포는 T 세포를 개체에게의 투여를 위해 제제화하기 전에 단리되고 세척될 수 있다. T 세포는 또한 나중에 사용하기 위해 동결보존되고 투여 전에 해동될 수 있다.
실시예 10: 항원 제시 성숙한 수지상 세포의 투여
미성숙한 수지상 세포는 임의의 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 미성숙한 수지상 세포는 성숙화제로서 BCG 및 IFNγ와 시험관내에서 또는 생체외에서 접촉될 수 있다. 미성숙한 DC는 1% 인간 혈장이 보충된 옵티MEM(OptiMEM)® 배지 (깁코(Gibco)-BRL)의 존재 하에 말초혈액 단핵구를 플라스틱과 접촉시킴으로써 제조될 수 있다. 미결합 단핵구 및 다른 세포는 세척에 의해 제거될 수 있다. 결합된 단핵구는, 예를 들어, 미성숙한 수지상 세포를 형성하기 위해 6일 동안 밀리리터당 500 U GM CSF 및 500 U IL-4의 존재 하에 X-VIVO 15® 배지에서 배양될 수 있다.
후속적으로 미성숙한 수지상 세포는 수지상 세포를 완전 성숙화하기에 충분한 기간 동안 IFNγ와 조합된 불활성화된 BCG와 함께 배양되고 그로 성숙화될 수 있다. 성숙화 동안, 성숙화 중인 수지상 세포는 종양 용해물, 예를 들어, 환자로부터 단리된 신경교종으로부터의 용해물과 접촉되어 종양 항원 제시 활성화된 성숙한 수지상 세포를 형성한다. 종양 항원 제시 활성화된 성숙한 수지상 세포는 염증-활성화 지질, 예를 들어 oxPAPC와 함께 또는 그 없이 투여를 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, oxPAPC와 함께 제제화되는 경우, 조성물은 비경구적으로, 예를 들어, 전신 주사에 의해 정맥내, 근육내, 피하, 또는 종양내로 종양 또는 주변 종양층으로 투여될 수 있다. 별도의 조성물로 제제화되는 경우, 종양 항원 제시 활성화된 성숙한 수지상 세포를 포함하는 조성물 및 oxPAPC를 포함하는 조성물은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 한 방법에서 oxPAPC는 종양 항원 제시 활성화된 성숙한 수지상 세포를 포함하는 조성물의 투여 전에 주사 영역에 먼저 국소적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, oxPAPC를 포함하는 조성물은 수지상 세포 조성물의 주사 부위 주변 영역에 국소적으로 적용될 수 있다.
실시예 11: oxPAPC와 함께 및 그 없이 성숙화 중인 수지상 세포의 투여
이 실시예에서, 성숙화 중인 수지상 세포는, oxPAPC와 함께 또는 그 없이, BCG, IFNγ의 조합으로 성숙화하도록 유도될 수 있다. 완전 성숙화 전에, 전형적으로 6 내지 20시간의 배양 후에, 수지상 세포는 단리되고, 세척되고, 개체에게의 투여를 위해 제제화되거나, 추후 투여를 위해 DMSO 및 인간 혈청 또는 혈장에서 동결보존을 위해 제조된다. 동결보존된 경우, 조성물은 신속하게 해동되고 필요한 경우 환자에게의 투여를 위한 용량으로 희석된다.
고형 종양으로 진단된 환자는 화학요법, 방사선 요법, 동결요법, 또는 근접 요법으로 치료받고 후속적으로 성숙화 중인 수지상 세포 조성물을 종양내 투여받는다. 투여된 조성물이 oxPAPC의 존재 하에 수지상 세포가 성숙화하도록 유도된 조성물인 경우, 투여는 종양 또는 종양 주변 종양층 내로 직접적일 수 있다. oxPAPC가 사용되지 않은 성숙화 중인 수지상 세포를 포함하는 조성물의 경우. oxPAPC는 개별적으로 또는 성숙화 중인 수지상 세포와 함께 제제화될 수 있다. 대상체에게의 투여를 위해 별도로 제제화되는 경우, 2종의 조성물은 동일한 또는 별도의 부위에서 동시에 투여될 수 있거나, 또는 상기 조성물은 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, oxPAPC 및 성숙화 중인 수지상 세포가 별도의 투여용으로 제제화되는 경우, oxPAPC는 국소 투여용으로 제제화되고 투여 전에 성숙화 중인 수지상 세포의 투여 부위에 적용된다.
이전 실시예는 청구된 발명의 범주를 예시하기 위해 제공되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 다른 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 명백할 것이고 첨부된 청구범위에 의해 포괄될 것이다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 또한 포함된다.
예시적 실시양태가 예시되고 기재되었지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 거기서 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
배타적 재산 또는 특권이 주장되는 발명의 실시양태는 다음과 같이 정의된다.

Claims (97)

  1. 미리 결정된 항원에 대한 증진된 면역 반응을 생성하는 과다활성 성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단을 생산하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 및
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에 성숙한 수지상 세포를 형성하기에 충분한 기간 동안, 인터페론 감마 (IFNγ)와 함께 또는 그 없이, 유효량의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질과 접촉시키는 것
    을 포함하며;
    여기서 성숙한 수지상 세포 집단은 나이브 T 세포와 접촉 시 항원에 대한 증진된 Th1 반응을 생성하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포가 염증-활성화 지질의 첨가 전 적어도 약 3시간 동안 수지상 세포 성숙화제와 접촉되고, 수지상 세포가 추가의 약 1 내지 24시간, 또는 그 초과 동안 배양되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포를, IFNγ와 함께 또는 그 없이, 수지상 세포 성숙화제, 및 산화된 염증-활성화 지질과 접촉시키기 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 성숙화 중인 수지상 세포를 미리 결정된 항원과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 미리 결정된 항원이 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원이 박테리아, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단핵구 수지상 세포 전구체가 풍부화된 세포 집단을 수득하는 것; 및
    전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것
    을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 수지상 세포 분화제가 GM-CSF, 또는 GM-CSF와 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 13 (IL-13), 또는 인터류킨 15 (IL-15)의 조합인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 단핵구 수지상 세포 전구체가 인간 대상체로부터 단리되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 증진된 면역 반응이 Th1 반응인 방법.
  12. 항원에 대한 증진된 면역 반응을 생성하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것;
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에, 인터페론 감마 (IFNγ)와 함께 또는 그 없이, 유효량의 수지상 세포 성숙화제, 및 미리 결정된 항원과 접촉시켜 성숙한 수지상 세포 집단을 형성하는 것;
    여기서 성숙화 중인 수지상 세포는 성숙화 동안 항원을 흡수 및 프로세싱함;
    성숙한 수지상 세포를 개체에게의 투여를 위해 제제화하는 것;
    염증-활성화 지질 없이 투여된 제제화된 수지상 세포 조성물과 비교하여 미리 결정된 항원에 대한 증진된 Th1 면역 반응을 생성하기 위해 유효량의 염증-활성화 지질과 함께 성숙한 수지상 세포 제제를 투여하는 것
    을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 미리 결정된 항원이 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 또는 단리된 항원이 박테리아, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원인 방법.
  17. 제12항에 있어서,
    단핵구 수지상 세포 전구체가 풍부화된 세포 집단을 수득하는 것; 및
    전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것
    을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 수지상 세포 분화제가 GM-CSF, 또는 GM-CSF와 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 13 (IL-13), 또는 인터류킨 15 (IL-15)의 조합인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 단핵구 수지상 세포 전구체가 인간 대상체로부터 단리되는 것인 방법.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제제화된 성숙한 수지상 세포 및 염증-활성화 지질이 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여되는 것인 방법.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 증진된 면역 반응이 Th1 반응인 방법.
  22. 과다활성화된 성숙한 수지상 세포 집단을 생산하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단을 제공하는 것; 및
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에 과다활성화된 성숙한 수지상 세포 집단을 형성하기에 충분한 기간 동안, 인터페론 감마 (IFNγ)와 함께 또는 그 없이; 유효량의 수지상 세포 성숙화제; 및 염증-활성화 지질과 접촉시키는 것
    을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포를, 인터페론 감마 (IFNγ)와 함께 또는 그 없이; 수지상 세포 성숙화제; 또는 염증-활성화 지질과 접촉시키기 전에 또는 그와 동시에 미리 결정된 항원과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포를 미리 결정된 항원과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 미리 결정된 항원이 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 항원을 발현하는 재조합 세포이며, 여기서 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 종양 연관 항원, 또는 종양 특이적 항원, 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원이며, 여기서 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 또는 단리된 항원은 박테리아, 바이러스, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원인 방법.
  28. 제22항에 있어서, 단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하는 것; 및 전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 수지상 세포 분화제가 GM-CSF, 또는 GM-CSF와 IL-4, IL-13, 또는 IL-15의 조합인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 단핵구 수지상 세포 전구체가 인간 대상체로부터 단리되는 것인 방법.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙한 수지상 세포의 활성이 Th1 반응에서의 증가에 의해 측정되며, 바람직하게는 여기서 Th1에서의 증가는 성숙한 수지상 세포에 의해 유도된 이펙터 및 기억 T 세포 생성에서의 증가; 성숙한 수지상 세포에 의해 유도된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및/또는 활성화에서의 증가; 및 성숙한 수지상 세포에 의한 IL1β, IL-2, 및/또는 TNFα의 분비에서의 증가에 의해 측정되는 것인 방법.
  32. 암, 박테리아 감염, 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 의약을 제조하는데 있어서, 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 과다활성화된 수지상 세포의 용도.
  33. 하기를 포함하는, 항원 특이적 T 세포를 활성화시키기 위한 조성물로서:
    미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에 그리고 과다활성 성숙한 수지상 세포를 형성하기에 충분한 기간 동안, IFNγ와 함께 또는 그 없이, 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제, 및 염증-활성화 지질로 성숙화된 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단; 및
    미리 결정된 항원;
    여기서 과다활성 성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단은, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 그리고 염증-활성화 지질 없이; 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제로 성숙화된 성숙한 수지상 세포와 비교하여 증진된 T 세포 반응을 생성하며, 바람직하게는 여기서 증진된 T 세포 반응은 Th1 반응인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 과다활성 성숙한 수지상 세포가 풍부화된 세포 집단이 시험관내 및 생체외에서 측정 시 증진된 항원 특이적 Th1 반응을 생성하며, 여기서 증진된 Th 세포 반응은 이펙터 및 기억 T 세포 생성에서의 증가; CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및/또는 활성화에서의 증가; 및/또는 IL1β, IL-2, 및/또는 TNFα의 분비에서의 증가인 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 조성물.
  36. 제33항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 조성물.
  37. 제33항에 있어서, 미리 결정된 항원이 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 항원을 발현하는 재조합 세포, 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원이며, 여기서 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 또는 단리된 항원은 박테리아, 바이러스, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원인 조성물.
  38. 하기를 포함하는, 단리된 과다활성 성숙한 수지상 세포 집단으로서:
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에 과다활성 성숙한 수지상 세포를 형성하기에 충분한 기간 동안, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제; 및 염증-활성화 지질과 접촉시킴으로써 생산된, 단리된 과다활성 성숙한 수지상 세포;
    여기서 과다활성 성숙한 수지상 세포는 증진된 T 세포 반응을 생성하며, 바람직하게는 여기서 증진된 T 세포 반응은 나이브 T 세포와 접촉 시 이펙터 및 기억 T 세포 생성에서의 증가; CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및/또는 활성화에서의 증가; 및 IL1β의 분비에서의 증가인 세포 집단.
  39. 제38항에 있어서, 미리 결정된 항원을 추가로 포함하는 세포 집단.
  40. 제38항에 있어서, 단리된 T 세포를 추가로 포함하는 세포 집단.
  41. 제40항에 있어서, T 세포가 나이브 T 세포인 세포 집단.
  42. 제38항에 있어서, 단리된 림프구를 추가로 포함하는 세포 집단.
  43. 제38항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 세포 집단.
  44. 제38항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 세포 집단.
  45. 활성화된 항원 특이적 T 세포를 생산하기 위한 시험관내 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것;
    미성숙한 수지상 세포를 미리 결정된 항원과 접촉시키는 것;
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에 과다활성 성숙한 수지상 세포 집단을 형성하기에 충분한 기간 동안, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제; 및 염증-활성화 지질과 접촉시키는 것; 및
    과다활성 성숙한 수지상 세포를 나이브 T 세포와 접촉시켜 IFNγ와 함께 또는 그 없이 그리고 염증-활성화 지질 없이 수지상 세포 성숙화제로 활성화된 T 세포와 비교하여 증가된 양의 IFNγ를 생산하는 활성화된 항원 특이적 T 세포를 형성하는 것
    을 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 시험관내 방법.
  47. 제45항에 있어서, 염증-활성화 지질이 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 시험관내 방법.
  48. 제45항에 있어서, 미리 결정된 항원이 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 항원을 발현하는 재조합 세포이며, 여기서 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 종양 연관 항원, 또는 종양 특이적 항원; 세포 용해물이며, 여기서 세포 용해물은 박테리아 또는 종양 세포 용해물; 막 제제이며, 여기서 막 제제는 박테리아 또는 종양 세포막 제제; 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원이며, 여기서 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 및 단리된 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 종양 연관 항원 또는 종양 특이적 항원인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포가, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 수지상 세포 성숙화제; 및 염증-활성화 지질 전에 또는 그와 동시에 미리 결정된 항원과 접촉되는 것인 방법.
  50. 제45항에 있어서,
    단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하는 것; 및
    전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것
    을 추가로 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 수지상 세포 분화제가 GM-CSF, 또는 GM-CSF와 IL-4, IL-7, IL-13, 또는 IL-15의 조합인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 단핵구 수지상 세포 전구체가 인간 대상체로부터 단리되는 것인 방법.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포와 T 세포가 서로 자가유래인 방법.
  54. 단리된 또는 풍부화된 과다활성 성숙한 수지상 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서, 여기서 과다활성 성숙한 수지상 세포는 수지상 세포의 성숙화에 적합한 조건 하에, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 염증-활성화 지질 없이; 유효 농도의 수지상 세포 성숙화제를 포함하는 조성물로의 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 의해 제조된 성숙한 수지상 세포보다 더 많은 IL-1β를 생산하고, 이펙터 및 기억 T 세포에서의 증가를 생성하고; CD4+ 및 CD8+ T 세포의 말단 분화 및/또는 활성화에서의 증가를 생성하는 것인 조성물.
  55. 동물에서 증진된 면역 반응을 생성하는 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것;
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 충분한 배양 조건 하에, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 유효량의 수지상 세포 성숙화제; 및 염증-활성화 지질, 및 미리 결정된 항원과 접촉시켜 성숙한 수지상 세포를 형성하는 것;
    성숙한 수지상 세포를 나이브 T 세포와 접촉시켜 염증-활성화 지질 없이 수지상 세포 성숙화제 및 IFNγ로 활성화된 T 세포와 비교하여 증가된 양의 IFNγ 및/또는 IL-1β를 생산하는 활성화된 T 세포를 형성하는 것; 및
    과다활성화된 T 세포를 동물에게 투여하는 것
    을 포함하며;
    여기서 증진된 면역 반응은 바람직하게는 Th1 반응인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 시험관내 방법.
  58. 제55항에 있어서, 미리 결정된 항원이 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 항원을 발현하는 재조합 세포이며, 여기서 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 종양 연관 항원, 또는 종양 특이적 항원, 세포 용해물이며, 여기서 세포 용해물은 박테리아 세포 용해물 또는 종양 세포 용해물, 막 제제이며, 여기서 막 제제는 종양 세포 또는 박테리아세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원이며, 여기서 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 및 단리된 항원은 박테리아, 바이러스, 또는 종양에 특이적인 또는 이와 연관된 에피토프를 갖는 것인 방법.
  59. 제55항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포가, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 수지상 세포 성숙화제; 및 염증-활성화 지질 전에 또는 그와 동시에 미리 결정된 항원과 접촉되는 것인 방법.
  60. 제55항에 있어서,
    동물로부터 단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하는 것; 및 전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것
    을 추가로 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 수지상 세포 분화제가 GM-CSF, 또는 GM-CSF와 IL-4, IL-13, 또는 IL-15의 조합인 방법.
  62. 제55항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포 및 T 세포가 동물에 대해 자가유래 또는 동종이계인 방법.
  63. 제55항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포 및 T 세포가 동일한 MHC 일배체형을 갖는 것인 방법.
  64. 제55항에 있어서, 동물이 인간인 방법.
  65. 제55항에 있어서, 투여가 비경구인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 비경구 투여가 정맥내, 피내, 피하, 경구, 경피, 경점막, 종양내, 또는 직장인 방법.
  67. 제55항에 있어서, 염증-활성화 지질이 투여 부위에 적용되는 것인 방법.
  68. 항종양 면역 반응을 생성하기 위한 시험관내 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것;
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화를 유도하기에 적합한 배양 조건 하에, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 유효량의 수지상 세포 성숙화제와 접촉시키는 것; 및
    성숙화 중인 수지상 세포를 완전 성숙화 전에 단리하는 것;
    성숙화 중인 수지상 세포를 투여를 위해 제제화하는 것;
    성숙화 중인 수지상 세포를 종양내 투여하는 것; 및
    염증-활성화 지질을 종양내 또는 전신 투여하는 것
    을 포함하는 방법.
  69. 제66항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  70. 제65항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 시험관내 방법.
  71. 제68항에 있어서, 수지상 세포가 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 제대혈, 또는 말초 혈액으로부터 수득되는 것인 방법.
  72. 제68항에 있어서, 수지상 세포가 치료될 개체로부터 또는 치료될 개체에 HLA-매칭된 건강한 개체로부터 수득되는 것인 방법.
  73. 개체에서 항종양 면역 반응을 생성하는 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것;
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화를 유도하기에 적합한 배양 조건 하에 그리고 수지상 세포가 미리 결정된 항원을 흡수 및 프로세싱하고 수지상 세포를 성숙화하기에 충분한 시간 동안, 미리 결정된 항원; IFNγ와 함께 또는 그 없이; 유효량의 수지상 세포 성숙화제; 및 염증-활성화 지질과 접촉시키는 것;
    성숙한 수지상 세포를 단리하는 것;
    단리된 성숙화 중인 수지상 세포를 개체에게의 투여를 위해 제제화하는 것; 및
    성숙화 중인 수지상 세포를 종양에 직접적으로 종양내 투여하는 것
    을 포함하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 시험관내 방법.
  76. 제73항에 있어서, 수지상 세포가 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 제대혈, 또는 말초 혈액으로부터 수득되는 것인 방법.
  77. 제73항에 있어서, 수지상 세포가 치료될 개체로부터 또는 치료될 개체에 HLA-매칭된 건강한 개체로부터 수득되는 것인 방법.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙한 수지상 세포가 동결보존되고 투여 전에 해동되는 것인 방법.
  79. 개체에서 증진된 항종양 면역 반응을 생성하는 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것;
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화를 유도하기에 적합한 배양 조건 하에, IFNγ와 함께 또는 그 없이; 유효량의 수지상 세포 성숙화제와 접촉시키는 것;
    성숙화 중인 수지상 세포를 완전 성숙화 전에 단리하는 것;
    단리된 성숙화 중인 수지상 세포를 개체에게의 투여를 위해 제제화하는 것; 및
    성숙화 중인 수지상 세포를 염증-활성화 지질과 함께 개체에게 공동-투여하는 것
    을 포함하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  81. 제76항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 시험관내 방법.
  82. 제79항에 있어서, 수지상 세포가 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 제대혈, 또는 말초 혈액으로부터 수득되는 것인 방법.
  83. 제79항에 있어서, 수지상 세포가 치료될 개체로부터 또는 치료될 개체에 HLA-매칭된 건강한 개체로부터 수득되는 것인 방법.
  84. 제79항에 있어서, 단리된 성숙화 중인 수지상 세포가 동결보존되고 투여 전에 해동되는 것인 방법.
  85. 제79항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 성숙화 중인 수지상 세포 및 염증-활성화 지질이 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여되는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 염증-활성화 지질이 동일한 조성물, 또는 별도의 조성물에 있는 것인 방법.
  87. 제85항에 있어서, 염증-활성화 지질이 별도의 조성물에 있으며 투여 부위에 국소적으로 적용되는 것인 방법.
  88. 항원에 대한 증진된 Th1 반응을 생성하는 성숙한 수지상 세포 집단을 생산하기 위한 시험관내 방법으로서,
    미성숙한 수지상 세포를 제공하는 것; 및
    미성숙한 수지상 세포를 미성숙한 수지상 세포의 성숙화에 적합한 배양 조건 하에 성숙한 수지상 세포 집단을 형성하기에 충분한 기간 동안, 인터페론 감마 (IFNγ)와 함께 또는 그 없이; 유효량의 수지상 세포 성숙화제; 및 염증-활성화 지질과 접촉시키는 것
    을 포함하며;
    여기서 성숙한 수지상 세포 집단은 나이브 T 세포와 접촉 시 항원에 대한 증진된 Th1 반응을 생성하는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 수지상 세포 성숙화제가 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이며, 바람직하게는 여기서 TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR7 효능제, 및/또는 TLR8 효능제, 또는 TLR9이며, 보다 바람직하게는 여기서 TLR4 효능제는 LPS, 또는 BCG이며, TLR7 및/또는 TLR8 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 보다 바람직하게는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 (R848) 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R837), 및 그의 유도체이며, TLR3 효능제는 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리 I:C 또는 폴리[I]:폴리[C(12)U]이거나, 또는 TLR9 효능제는 DC의 성숙화를 유도하는 것으로 공지된 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 핵산의 서열, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  90. 제85항에 있어서, 염증-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), 1-팔미토일-2-(5-옥소발레로일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POV-PC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PGPC) 및 1-팔미토일-2-(5,6-에폭시이소프로판 E2)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (PEIPC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-6-옥텐디오일) sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-케토-6-옥텐-디오일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소옥트-6-에노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (HOOA-PC), 1-팔미토일-(5-케토-8-옥소-6-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (KOOA-PC) 중 1종 이상인 방법.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포를 미리 결정된 항원과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 미리 결정된 항원이 종양 특이적 항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 세포, 박테리아 세포, 박테리아 또는 종양 세포 용해물, 박테리아 또는 종양 세포막 제제, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 재조합적으로 생산된 항원, 펩티드 항원 또는 단리된 항원이 박테리아, 종양 연관, 또는 종양 특이적 항원, 펩티드 항원, 또는 단리된 항원인 방법.
  94. 제88항에 있어서, 미성숙한 수지상 세포를, IFNγ와 함께 또는 그 없이, 수지상 세포 성숙화제, 및 산화된 염증-활성화 지질과 접촉시키기 전에 또는 그와 동시에 미성숙한 수지상 세포를 미리 결정된 항원과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  95. 제88항에 있어서,
    단핵구 수지상 세포 전구체를 단리하는 것; 및
    전구체를 수지상 세포 분화제의 존재 하에 배양하여 미성숙한 수지상 세포를 형성하는 것
    을 추가로 포함하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 수지상 세포 분화제가 GM-CSF, 또는 GM-CSF와 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 13 (IL-13), 또는 인터류킨 15 (IL-15)의 조합인 방법.
  97. 제95항에 있어서, 단핵구 수지상 세포 전구체가 인간 대상체로부터 단리되는 것인 방법.
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