CN112458058B - 一种过表达traf6的dc细胞、dc细胞疫苗及构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种过表达TRAF6的DC细胞、DC细胞疫苗及构建方法和应用，属于DC疫苗技术领域。本发明成功构建了过表达TRAF6的DC细胞。本发明的过表达TRAF6的DC细胞更容易成熟，能够更好地提呈抗原，激发更强的抗原特异性的T细胞免疫应答，能够增强CD4+T细胞的增殖和诱导Th1型免疫应答，能够影响TRAF6信号通路下游的分子表达；所述过表达TRAF6的DC细胞能够负载肿瘤抗原，得到DC细胞疫苗，本发明的DC细胞疫苗，具有更好的肿瘤杀伤活性，能够显著提高肿瘤抑制率，能够增强抗肿瘤免疫应答，从而用于腺癌、肝癌、血液肿瘤等预防或治疗的用途，为广大癌症患者带来福音。

Description

一种过表达TRAF6的DC细胞、DC细胞疫苗及构建方法和应用
技术领域
本发明涉及DC疫苗技术领域，尤其涉及一种过表达TRAF6的DC细胞、DC细胞疫苗及构建方法和应用。
背景技术
DC细胞是重要的抗原提呈细胞，能摄取、加工抗原，向T淋巴细胞提呈抗原，启动患者自身特异性抗肿瘤免疫反应。
目前，已经开发了多种DC细胞免疫疗法，基于负载一种或多种特定肿瘤抗原的DC细胞疫苗已经在许多临床研究中证明是可行和安全的。神经胶质瘤相关肽脉冲后的DC细胞，可以提高神经胶质瘤模型大鼠的存活率，并且可以诱导特异性抗肿瘤免疫应答并增强CD4+和CD8+T淋巴细胞的浸润。使用离体负载肽的自体DC细胞(Sipuleucel-T)首次获FDA批准，用于抵抗前列腺癌。由于DC细胞的抗原交叉呈递及迁移至淋巴结的能力有限，DC疗法的改进对于成功的癌症免疫疗法至关重要。
肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6(TRAF6)是一种E3泛素连接酶，是IL-1R/TLR家族和TNFR超家族共有的信号转导分子，在调节先天和适应性免疫，胚胎发育，组织稳态和骨代谢中起着不可或缺的作用。TRAF6介导的信号转导对于DC细胞的发育，体内平衡和激活至关重要。TLR配体或CD40L在体外诱导野生型DC细胞上的表面分子(如MHC II类和B7.2)上调，在TRAF6缺陷型DC细胞中上调严重受损。同样，在野生型小鼠中，施用LPS或抗CD40抗体可以诱导DC细胞成熟，但在TRAF6基因敲除小鼠中则不会诱导DC细胞成熟。这些结果表明，TRAF6是体外和体内响应微生物成分(例如LPS或CD40L)的DC细胞成熟所必需的。此外，被各种TLR配体或CD40L激活的野生型DC细胞产生了大量的炎症细胞因子，例如IL-6和IL-12，但是TRAF6基因敲除小鼠产生的DC细胞却显示出严重的细胞因子产生缺陷。同样地，用LPS处理的野生型脾脏DC细胞刺激T细胞产生的IFN-γ显着增加。相反，用LPS处理或未处理的TRAF6敲除的脾脏DC细胞刺激T细胞分泌少量的IFN-γ。同样，对8周以上的TRAF6缺陷DC细胞的小鼠和同窝对照小鼠的小肠固有层基因表达进行分析后发现，Th1细胞相关因子IL-12和IFN-γ明显降低，而Th2细胞相关因子IL-13，IL-5和IL-4显着增加。肺部与肠道类似，与对照肺相比，TRAF6缺陷的DC细胞会导致肺中Th2相关免疫反应的自发产生，Th1相关细胞因子IL-12β的相对mRNA水平降低，而促纤维化因子Igf-1和Th2相关细胞因子IL-13和IL-5的mRNA水平升高。因此，TRAF6对于DC细胞的成熟和功能有重要的作用。现有技术中缺少一种能够过表达TRAF6的DC细胞及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种过表达TRAF6的DC细胞、DC细胞疫苗及构建方法和应用，本发明的方法能够实现TRAF6在DC细胞中成功过表达，并且过表达TRAF6的DC细胞更容易成熟，具有更高的诱导T细胞向Th1型极化的能力。此外，过表达TRAF6的DC细胞负载肿瘤抗原得到的DC细胞疫苗能够用于肿瘤的防治。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种过表达TRAF6的DC细胞，所述DC细胞经重组慢病毒载体转染得到；所述重组慢病毒载体中插入有TRAF6基因；所述TRAF6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述重组慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了上述方案所述的DC细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)将插入有TRAF6基因的重组慢病毒载体与pAX2和pMD2G骨架载体共转染293T细胞进行培养，收集共转染后的细胞培养液进行病毒浓缩，得到病毒转染液；
2)将待转染的DC细胞和所述病毒转染液混合，进行转染，得到过表达TRAF6的DC细胞。
本发明还提供了一种DC细胞疫苗，所述DC细胞疫苗由上述方案所述过表达TRAF6的DC细胞负载肿瘤抗原得到。
优选的，所述肿瘤抗原包括MUC1多肽。
优选的，所述MUC1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明还提供了上述方案所述DC细胞或者所述DC细胞疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
优选的，所述肿瘤包括腺癌、肝癌和血液肿瘤中的一种或几种。
本发明提供了一种过表达TRAF6的DC细胞，实现了TRAF6在DC细胞中成功过表达。本发明中，过表达TRAF6的DC细胞更容易成熟，能够更好地提呈抗原，激发更强的抗原特异性的T细胞免疫应答，能够增强CD4+T细胞的增殖和诱导Th1型免疫应答，能够影响TRAF6信号通路下游的分子表达；所述过表达TRAF6的DC细胞能够负载肿瘤抗原，得到DC细胞疫苗，本发明的DC细胞疫苗，具有更好的肿瘤杀伤活性，能够显著提高肿瘤抑制率，能够增强抗肿瘤免疫应答，从而用于腺癌、肝癌、血液肿瘤等预防或治疗的用途，为广大癌症患者带来福音。
附图说明
图1为TRAF6过表达重组慢病毒质粒图谱；
图2为过表达TRAF6的DC细胞；图2这种的A为荧光显微镜观察转染转染效率，荧光倍数(×200)，比例尺代表50μm；图2中的B为Western Blotting检测TRAF6的表达结果；*p＜0.05，**p＜0.01；
图3表示Western Blotting检测DC细胞中TRAF6对下游信号通路蛋白表达量的影响；
图4表示流式细胞术检测过表达TRAF6对DC细胞表面分子表达的影响；*p＜0.05，**p＜0.01；
图5表示ELISA检测过表达TRAF6的DC细胞分泌的IL-12；*p＜0.05，**p＜0.01；
图6表示过表达TRAF6的DC细胞对T细胞的影响；其中图6中的A表示WST-1检测过表达TRAF6的DC细胞对于T细胞增殖的影响(OD值)；图6中的B表示ELISA检测过表达TRAF6的DC细胞对T细胞IFN-γ分泌水平的影响；图6中的C表示ELISA检测过表达TRAF6的DC细胞对T细胞IL-4分泌水平的影响；*p＜0.05，**p＜0.01；
图7表示过表达TRAF6的DC细胞疫苗对肿瘤生长的影响；图7中的A为小鼠肿瘤生长曲线；图7中的B为肿瘤抑制率；*p＜0.05，**p＜0.01；
图8表示过表达TRAF6的DC细胞疫苗对体内T细胞应答的影响；图8中的A为WST-1检测MUC1特异性的脾细胞增殖(OD值)；图8中的B为ELISA检测MUC1特异性的脾细胞IFN-γ分泌C.ELISA检测MUC1特异性的脾细胞IL-4分泌；*p＜0.05，**p＜0.01；
图9表示流式细胞术分析脾细胞中CD4+T，CD8+T细胞占脾细胞比例；图9中的A为设门方式；图9中的B为比例；*p＜0.05，**p＜0.01；
图10表示流式细胞术分析脾细胞中Th1细胞占CD4+T细胞比例和Tc1占CD8+T细胞的比例；图10中的A为Th1细胞占CD4+T细胞比例；图10中的B.为Tc1占CD8+T细胞的比例；*p＜0.05，**p＜0.01；图10中的C为Th1，Tc1表达IFN-γ的平均荧光强度；
图11表示流式细胞术分析淋巴结细胞中CD4+T，CD8+T细胞占淋巴结细胞的比例；图11中的A为设门方式；图11中的B为比例；*p＜0.05，**p＜0.01；
图12表示流式细胞术分析淋巴结细胞中Th1细胞占CD4+T细胞比例和Tc1占CD8+T细胞比例；图12中的A为Th1细胞占CD4+T细胞比例；图12中的B为Tc1占CD8+T细胞比例；*p＜0.05，**p＜0.01；图12中的C为Th1，Tc1表达IFN-γ的平均荧光强度；
图13表示流式细胞术分析肿瘤浸润的淋巴细胞中DC细胞及CD80+DC细胞的比例；图13中的A为DC细胞设门方式；图13中的B为CD80+DC细胞的设门方式；图13中的C为DC细胞的比例；图13中的D为CD80+DC细胞的比例，*p＜0.05，**p＜0.01；
图14表示小鼠的生存期曲线，**p＜0.01。
具体实施方式
本发明提供了一种过表达TRAF6的DC细胞，所述DC细胞经重组慢病毒载体转染得到；所述重组慢病毒载体中插入有TRAF6基因的编码蛋白的区域，即CCDS区，Genebank编号为CCDS16464.1，由江苏南京PPL公司合成；所述TRAF6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。在本发明中，所述的TRAF6基因优选的带有Flag标签，所述Flag标签优选的插入到TRAF6基因前面；所述Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明中，所述重组慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，总长度为9789bp；所述重组慢病毒载体pLenti-CMV-TRAF6-GFP-Puro以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro为原始载体；所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在本发明一个实施例中，所述重组慢病毒载体是将带有Flag标签的TRAF6基因片段插入慢病毒载体的EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点之间，构建得到重组慢病毒载体。本发明对所述插入的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
本发明还提供了上述方案所述的DC细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)将插入有TRAF6基因的重组慢病毒载体与pAX2和pMD2G骨架载体共转染293T细胞进行培养，收集共转染后的细胞培养液进行病毒浓缩，得到病毒转染液；
2)将待转染的DC细胞和所述病毒转染液混合，进行转染，得到过表达TRAF6的DC细胞。
本发明首先将上述方案所述重组慢病毒载体、pAX2、pMD2G骨架载体共转染293T细胞进行培养，收集共转染后的细胞培养液进行病毒浓缩，得到病毒转染液。在本发明中，所述重组慢病毒载体、pAX2和pMD2G的质量浓度比例优选为2：1：1，所述质量浓度的单位为μg/ml；本发明对所述293T细胞的数量没有特殊限制，采用本领域常规数量即可。在本发明中，所述共转染的时间优选为36～60h，进一步优选为48h；在本发明的一个实施例中，所述转染采用的容器为10cm培养皿；所述转染体系包括：5μg重组慢病毒载体、2.5μg pAX2载体、2.5μg pMD2G载体、500μl DMEM培养基和10μl NeofectTMDNA转染试剂(零客创智(北京)生物科技有限公司)；所述转染程序为：将DNA质粒用DMEM稀释，然后向DNA稀释液中加入转染试剂，室温20～30℃静置30min，将转染复合物加入细胞培养基中，轻柔混匀。
在本发明一个实施例中，所述病毒浓缩的方式为收集共转染后的细胞培养液中上清液，采用0.45μm的滤膜过滤所述上清液，得到粗滤液；对所述粗滤液进行超滤，收集超滤液，得到病毒转染液；所述超滤的离心力优选为3000～8000g，进一步优选为5000g；所述超滤的温度优选为0～4℃；所述超滤的时间优选为40～50min，进一步优选为45min；所述超滤优选的采用超滤管进行，病毒浓缩液将位于上层的filter device。在本发明中，所述病毒转染液的保存温度优选为-80℃。
得到过表达TRAF6的DC细胞后，本发明将待转染的DC细胞和所述病毒转染液混合，进行转染，得到过表达TRAF6的DC细胞。
在本发明中，所述待转染的DC细胞是由单个核细胞经20ng/ml的IL-4和20ng/ml的GM-CSF细胞因子刺激诱导得到；所述单个核细胞包括骨髓来源或者外周血来源的单个核细胞。在本发明中，所述诱导的时间优选为5～7h，进一步优选为6h。
在本发明中，所述转染的总时间优选为40～60h，进一步优选为48h；在所述转染进行16h后优选的进行培养液更换。本发明对所述转染过程中采用的培养液没有特殊限制，采用本领域常规培养液即可。
在本发明的一个实施例中，所述转染采用的容器为10cm培养皿；所述转染体系包括：5μg重组慢病毒载体、2.5μg pAX2载体、2.5μg pMD2G载体、500μl DMEM培养基和10μl转染试剂，所用转染试剂为NeofectTMDNA transfection reagent，购买于零客创智(北京)生物科技有限公司；所述转染程序为：将DNA质粒用DMEM稀释，然后向DNA稀释液中加入转染试剂，20～30℃静置30min，将转染复合物加入细胞培养基中，轻柔混匀。
本发明还提供了一种DC细胞疫苗，所述DC细胞疫苗由上述方案所述过表达TRAF6的DC细胞负载肿瘤抗原得到。
本发明所述负载肿瘤抗原的时间优选为制备过表达TRAF6的DC细胞过程中所述转染结束前4～8h，进一步优选为6h。
在本发明中，所述肿瘤抗原优选的包括MUC1多肽；所述MUC1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在本发明的一个实施例中，将TRAF6过表达慢病毒转染液加入DC细胞，16h后更换培养液，继续培养总共培养48h，提前6h将1μg/ml的MUC1多肽加入过表达TRAF6的DC细胞中，使得DC细胞负载肿瘤抗原。
本发明还提供了上述方案所述DC细胞或者所述DC细胞疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤包括腺癌、肝癌和血液肿瘤中的一种或几种。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1
1.材料
实验试剂：GM-CSF、IL-4细胞因子购自PeproTech公司，LPS购自Sigma公司，无内毒素质粒提取试剂盒购自天根公司，GAPDH、TRAF6、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、IκB、p-IκB抗体购自CST公司，山羊抗小鼠IgG(H+L)、山羊抗兔IgG(H+L)购自Proteintech公司，ECL发光液购自Thermo公司。TRAF6敲除及过表达慢病毒载体由江苏南京PPL公司合成。实验动物及细胞系：C57 BL/6小鼠(SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～22g)购自辽宁长生生物技术有限公司，293T细胞为本实验室所有。
2.方法
2.1构建插入TRAF6基因片段的慢病毒载体
插入TRAF6基因片段的慢病毒载体是将带有Flag标签的TRAF6基因片段插入慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro的EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点之间，成功构建小鼠TRAF6过表达载体pLenti-CMV-TRAF6-GFP-Puro，总长度为9789bp，序列见SEQID NO：4所示。
2.2制备TRAF6过表达的慢病毒转染液
TRAF6敲除及过表达慢病毒载体保存于大肠杆菌，用无内毒素质粒提取试剂盒提取核心质粒及pAX2，pMD2G骨架质粒并测定浓度。按照核心质粒：pAX2质粒：pMD2G质粒为2：1：1的质量浓度比例(μg/ml)转染293T细胞。转染48h后，用荧光显微镜观察转染效率，转染效率达到80％以上，收取细胞上清液并用0.45μm的小滤器过滤。随后，将过滤后的上清液转移到超滤管中，高速离心5000g，4℃，45min，病毒浓缩液将位于上层的filter device中，经反复滴度测定，此时病毒滴度大约在109数量级，将浓缩好的TRAF6过表达病毒液保存于-80℃冰箱。
2.3取小鼠骨髓细胞并诱导成为DC细胞
小鼠安乐死，取股骨和胫骨，用1ml注射器冲洗骨髓腔3～4次，直至骨头发白，用滤网过滤上清，再加入3～4ml培养液，过滤上清，离心1500rpm，15min，加入红细胞裂解液5ml，离心1500rpm，10min，加入PBS 5ml，离心1500rpm，5min。细胞计数，用含有20ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4细胞因子的RPMI-1640完全培养基铺6孔板，1×106细胞/孔，第3天3/4换液，第5天3/4换液，第6天收细胞，APC-CD11c抗体标记细胞，流式检测。当CD11c比例达到80％以上时，符合要求，可以继续后续实验。
2.4检测TRAF6的过表达效率
为了验证TRAF6是否成功在DC细胞中过表达，用荧光显微镜观察转染效率并用Western Blotting方法检测TRAF6的表达。将过表达TRAF6慢病毒液转染DC细胞，同时将空白载体慢病毒转染液作为空白阴性对照。16h后更换培养液，继续总共培养48h。培养结束后，收集细胞并裂解提取蛋白质，测定浓度，然后采用Western Blotting方法检测蛋白的表达量。
2.5 TRAF6对DC细胞下游信号通路蛋白表达量的影响
为了进一步验证TRAF6成功在DC细胞中过表达及TRAF6对于信号通路下游分子的影响，用Western Blotting方法检测JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、IκB及p-IκB的表达。将上述诱导成功的DC细胞重新计数，用含有20ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4细胞因子的RPMI-1640完全培养基铺6孔板，1×106细胞/孔，设置阴性对照组(NC)、1μg/ml的LPS组(LPS)、TRAF6过表达组(TRAF6+)、1μg/ml的LPS和TRAF6过表达组(LPS+TRAF6+)、TRAF6敲除组(TRAF6-)、1μg/ml的LPS和TRAF6敲除组(LPS+TRAF6-)。48h后，收取细胞并裂解提取蛋白质，测定浓度，采用Western Blotting方法检测下游蛋白表达量。
3.结果
如图1所示，我们成功构建TRAF6过表达重组慢病毒载体。如图2A所示，TRAF6过表达重组慢病毒载体转染DC细胞的效率90％以上。如图2B所示，TRAF6成功在DC细胞中过表达，表明我们已经成功构建TRAF6过表达的DC细胞模型。如图3所示，在DC细胞中，与NC组相比，过表达TRAF6会使TRAF6下游的JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38和p-IκB表达升高，相反，敲除TRAF6会使下游的JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38和p-IκB表达下降。LPS刺激DC细胞后，会使TRAF6下游的JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38和p-IκB表达升高。与LPS组相比，LPS+TRAF6+组TRAF6下游的各种蛋白表达升高，LPS+TRAF6-组TRAF6下游的各种蛋白表达降低。
4.结论
在DC细胞中，TRAF6会影响信号通路下游的蛋白表达。过表达TRAF6会使TRAF6下游的JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38及p-IκB表达升高，相反，敲除TRAF6会使下游的JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38及p-IκB表达下降。这进一步表明TRAF6在DC细胞中成功过表达，并且通过激活TRAF6下游信号通路，调节DC细胞的功能。
实验例2
1.材料
实验试剂：GM-CSF、IL-4细胞因子购自PeproTech公司，LPS购自Sigma公司，CD16/32抗体购自eBioscience公司，CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ抗体购自三箭公司，无内毒素质粒提取试剂盒购自天根公司，IL-12p70检测试剂盒购自invitrogen公司，TRAF6过表达慢病毒载体由江苏南京PPL公司合成。实验动物及细胞系：C57 BL/6小鼠(SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～22g)购自辽宁长生生物技术有限公司。
2.方法
2.1过表达TRAF6对小鼠DC细胞表面分子表达的影响
将上述诱导成功的DC细胞重新计数，用含有20ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4细胞因子的RPMI-1640完全培养基铺6孔板，1×106细胞/孔，设置阴性对照组(NC)、1μg/ml的LPS组(LPS)、TRAF6过表达组(TRAF6+)、1μg/ml的LPS和TRAF6过表达组(LPS+TRAF6+)。48h后，收取细胞，流式细胞术检测CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ的表达。
2.2过表达TRAF6对小鼠DC细胞分泌IL-12的影响
按照invitrogen公司的ELISA检测试剂盒说明书进行操作。简而言之，首先将包被抗体(抗IL-12的抗体)包被96孔酶标板，每个样本设双复孔，4℃过夜。采用PBS-0.05％Tween-20洗板5次，加入封闭液封闭1h后，洗涤2次，加入标准品(IL-12：1000、500、250、125、62.5、32.5、15.6、7.8pg/ml)和样品，100μl/孔，4℃过夜。洗涤5次后，加入检测抗体室温孵育1h，洗涤5次，加入酶标抗体Avindin-HRP，室温孵育30min。洗7次，加TMB，室温15min。加硫酸终止后，采用酶标仪450nm波长测定吸光度值。
3.结果
MHC分子是参与抗原呈递的关键分子。T细胞通过T细胞受体(TCR)呈递的抗原肽-MHC分子复合物识别DC细胞。其中，MHC I类分子与CD8+T细胞的抗原识别有关，MHC II类分子与CD4+T细胞的抗原识别有关。共刺激分子CD80和CD86与幼稚CD4+T细胞上的CD28相互作用，以增强APC活性并刺激幼稚T细胞的增殖。然后，CD40与T细胞上的CD40L结合，将激活信号传递给T细胞。我们的结果发现，与NC组相比，TRAF6过表达组表面共刺激分子和MHC分子的表达均显著升高(如图4所示)。此外，LPS组能够明显提高表面共刺激分子和MHC分子表达，并且LPS+TRAF6过表达组与LPS组相比仍有不同程度的升高。
DC分泌的IL-12具有抗肿瘤作用。IL-12不仅诱导Th1分化，还抑制Th2的分化。IL-12通过增强IFN-γ和颗粒酶B的产生延长T细胞的存活。与NC组相比，TRAF6过表达组IL-12的分泌水平显著升高，LPS+TRAF6过表达组与LPS组相比，IL-12的分泌水平也显著上升(如图5所示)。
这些结果表明TRAF6对于DC细胞表面CD40、CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ的表达具有促进作用，并且能够大大提高IL-12的分泌水平，提示TRAF6能够促进DC细胞的成熟。
实验例3
1.材料
实验试剂：GM-CSF、IL-4细胞因子购自PeproTech公司，LPS购自Sigma公司，CD16/32抗体，FITC-CD3和APC-CD8抗体购自eBioscience公司，无内毒素质粒提取试剂盒购自天根公司，IFN-γ检测试剂盒和IL-4检测试剂盒购自invitrogen公司，TRAF6过表达慢病毒载体由江苏南京PPL公司合成。实验动物及细胞系：C57 BL/6小鼠(SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～22g)购自辽宁长生生物技术有限公司。
2.方法
2.1分离小鼠的单个核细胞并分选CD4+T细胞
小鼠安乐死，无菌取脾，将脾脏放入倒有5ml淋巴细胞分离液的纱布上，进行研磨，制备脾细胞悬液。向细胞悬液中覆盖1ml RPMI-1640培养基，保持液面分界明显。室温，水平转子800g，离心30min，设置升4，降4。离心后，吸出淋巴细胞层，再加10ml RPMI-1640培养基，颠倒洗涤。室温，300g离心10min收集细胞。倾倒上清液，用培养液重悬细胞，混匀，计数。加入FITC-CD3和APC-CD8抗体，吹悬，4℃避光孵育30min(每5min吹悬1次)。加入1ml冰冷FACS液洗涤细胞，1500rpm，离心5min，弃上清，用300目滤网过滤后，流式细胞仪进行分选，收集细胞，检测纯度，计算得率，并将收集的细胞1500rpm离心10min，含10％FBS双抗的RPMI-1640重悬，台盼蓝计数活细胞。
2.2过表达TRAF6的DC细胞对T细胞增殖的影响
将过表达TRAF6的DC细胞与上述分选的CD4+T细胞共培养。按照DC细胞：T细胞为1：50的比例铺96孔板，将DC细胞用RPMI-1640培养基调整细胞浓度为4×105个/ml，100μl/孔细胞悬液，将CD4+T细胞用RPMI-1640培养基调整细胞浓度为2×107个/ml，100μl/孔细胞悬液。继续培养48h。每孔收集100μl上清液，然后加入WST-110μl/孔，分别于1h和2h用酶标仪检测450nm/630nm波长处的吸光度值。
2.3过表达TRAF6的DC细胞对T细胞免疫应答的影响
按照invitrogen公司的ELISA检测试剂盒说明书进行操作。简而言之，首先将包被抗体(抗IFN-γ和IL-4的抗体)包被96孔酶标板，每个样本设双复孔，4℃过夜。采用PBS-0.05％Tween-20洗板5次，加入封闭液封闭1h后，洗涤2次，加入标准品(IFN-γ：2000、1000、500、250、125、62.5、32.5、15.625pg/ml；IL-4标准品配制：500、250、125、62.5、32.5、15.6、7.8、3.9pg/ml)和样品，100μl/孔，4℃过夜。洗涤5次后，加入检测抗体室温孵育1h，洗涤5次，加入酶标抗体Avindin-HRP，室温孵育30min。洗7次，加TMB，室温15min。加硫酸终止后，采用酶标仪450nm波长测定吸光度值波长450nm。按照标准品绘制的标准曲线，计算各样本浓度。
3.结果
3.1过表达TRAF6的DC细胞对T细胞增殖的影响
如图6中的A所示，与NC组相比，TARF6+组CD4+T细胞的增殖水平明显增高，具有显著性差异；与LPS组相比，LPS+TRAF6+组CD4+T细胞的增殖水平明显增高，具有显著性差异。
3.2过表达TRAF6的DC细胞对T细胞免疫应答的影响
ELISA检测细胞因子IFN-γ及IL-4，结果如图6中的B和图6中的C所示，与NC组相比，TARF6+组CD4+T细胞的IFN-γ的分泌水平明显增高，具有显著性差异；与LPS组相比，LPS+TRAF6+组CD4+T细胞的IFN-γ的分泌水平也明显增高，具有显著性差异。各组之间IL-4的分泌水平均无显著性差异。
4.结论
过表达TRAF6的DC细胞可以增加CD4+T细胞的增殖能力，并且使CD4+T细胞向Th1型极化。
实验例4
1.材料
实验试剂：GM-CSF、IL-4细胞因子购自PeproTech公司，CD16/32，BV421-FVS510，FITC-CD3，APC-CD8，FITC-CD80，APC-CD11c，PE/Cy7-IFN-γ抗体购自eBioscience公司，胶原酶IV和透明质酸酶购自Solarbio，小鼠淋巴细胞分离液购自达科为，MUC1多肽由上海紫域科技有限公司合成，TRAF6过表达慢病毒载体由江苏南京PPL公司合成。实验动物：C57BL/6小鼠(SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～22g)购自沈阳长生生物技术有限公司，B16-MUC1细胞为本实验室所有。
2.方法
2.1过表达TRAF6的DC细胞疫苗制备
取同种小鼠的骨髓细胞，用含有20ng/ml细胞因子IL-4和GM-CSF的RPMI-1640培养基重悬细胞并铺24孔板，1×106细胞/孔，第3天3/4换液，第5天3/4换液，第6天收细胞，诱导成为DC细胞，APC-CD11c抗体标记细胞，流式细胞术检测DC细胞的纯度，当CD11c比例达到80％以上时，符合要求，继续后续实验。细胞计数重新用含有20ng/ml细胞因子IL-4和GM-CSF的RPMI-1640培养基铺24孔板，1×106个细胞/孔。铺板后，按照分组将TRAF6过表达慢病毒转染液加入TRAF6过表达DC组，16h后更换培养液，继续培养总共培养48h，提前6h按照分组将1μg/ml的MUC1多肽加入负载MUC1多肽DC组。培养结束后，收集各组的DC细胞，计数，并用生理盐水调节浓度为2×107个细胞/ml，置于冰上，备用。
2.2小鼠荷瘤及免疫
将小鼠随机分为5组，每组5只鼠，分别是生理盐水对照组(NS)、未处理的DC细胞注射组(Control DC)、负载MUC1多肽DC细胞注射组(Control DC+MUC1)、TRAF6过表达DC细胞注射组(TRAF6+DC)、负载MUC1多肽并过表达TRAF6的DC细胞注射组(TRAF6+DC+MUC1)。在第0天荷瘤，右侧胁背部皮下注射，B16-MUC1肿瘤细胞5×104/只(用IMDM基础培养液稀释，总量100μl/只)。在第7天和14天尾静脉注射生理盐水或者不同处理的DC细胞，2×106个细胞/只(用NS稀释，总量100μl/只)。
2.3过表达TRAF6的DC细胞疫苗对B16-MUC1黑色素瘤的抑制作用
从荷瘤后第11天每隔两天测量肿瘤的大小，并绘制肿瘤生长曲线。于荷瘤后第19天，取淋巴结和脾脏后，剥离皮下肿瘤并称重，计算各组皮下黑色素移植瘤瘤重和肿瘤抑制率。公式如下：[肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％]。
2.4过表达TRAF6的DC细胞疫苗对MUC1特异性的脾细胞的增殖水平和细胞因子分泌水平的影响
根据细胞计数结果铺96孔板，设置五复孔，1×106个细胞/孔，实验设3组，分别为阴性对照组、IL-2单独刺激组(终浓度100U/ml)、MUC1多肽刺激组(MUC1多肽10μg/ml+IL-2100U/ml)，置于CO2孵箱中，5％CO2、37℃培养。铺板第三天，进行半量换液，继续置CO2孵箱中，5％CO2、37℃培养。脾细胞培养第五天时吸取100μl/well上清，五复孔收集在一起。取上清后向剩余培养液中加入WST-110μl/well，轻轻混匀后置于CO2培养箱中1h后检测450nm/630nm处测吸光度。此外，通过夹心ELISA方法检测上述收集到的上清液的IFN-γ和IL-4水平。
2.5肿瘤浸润淋巴细胞分离
处死小鼠后，剥离肿瘤组织，在培养皿中，用剪刀将肿瘤组织剪成1mm3小块，用IMDM培养基重悬组织，1000rpm离心10min弃上清。加入消化液，重悬组织，在37℃振荡培养箱中温育1小时，然后通过70μm细胞过滤器过滤；离心后用完全培养基重悬细胞并稀释为1×108/15ml离心管。再次离心后弃掉上清，加入淋巴细胞分离液重悬沉淀，沿着管壁缓慢加入1ml IMDM培养基；800g离心30min离心后缓慢取出离心管，将IMDM下层细胞吸出，细胞计数。
2.6脾脏淋巴细胞分离
处死小鼠后，取脾脏，在60×15mm培养皿加入5ml IMDM培养基磨碎脾脏，三层纱布过滤，移至15ml离心管中，并裂解红细胞。加入IMDM培养基重悬细胞，用300目滤网过滤至15ml离心管中，细胞计数。
2.7淋巴结细胞的获取
处死小鼠后，剥离淋巴结置于培养皿中，用镊子将淋巴结于300目滤网中磨碎，将细胞悬液吸取至15ml离心管中，离心，弃上清。加入IMDM培养基重悬细胞，用300目滤网过滤至15ml离心管中，细胞计数。
2.8流式细胞术检测T细胞亚群、DC细胞以及CD80+DC细胞的比例
将脾细胞和淋巴结细胞按照1×107个/孔铺24孔板，用工作浓度为2μl/ml的Cocktail刺激6h。刺激结束后，收集脾细胞、淋巴结细胞及肿瘤浸润的淋巴细胞进行随后的细胞染色。先加入FVS 510活死细胞染料和表面抗体冰上避光孵育染色30min后，固定破膜，再加上胞内抗体染色室温避光孵育30min。加入500μl PBS重悬，用300目滤网过滤后，流式细胞仪进行检测。
3.结果
3.1过表达TRAF6的DC细胞疫苗能够有效地抑制肿瘤生长
与生理盐水对照组相比，各组的肿瘤抑制率分别为：Control DC组为40.22％，Control DC+MUC1组为49.74％，TRAF6+DC组为69.31％，TRAF6+DC+MUC1组为83.79％(如表1和图7)。以上结果提示，过表达TRAF6的DC细胞疫苗能够有效抑制B16-MUC1黑色素瘤肿瘤生长。
表1小鼠肿瘤瘤重(mg)及肿瘤抑制率(％)
3.2过表达TRAF6的DC细胞疫苗能够增强MUC1特异性的脾细胞增殖水平
脾细胞增殖水平，如图8中的A所示，NS组和Control DC组脾细胞的增殖水平均较低，与Control DC组相比，TRAF6+DC组脾细胞的增殖水平显著升高(P＜0.01)，与ControlDC+MUC1组相比，TRAF6+DC+MUC1组脾细胞的增殖水平显著升高(P＜0.01)。结果提示，过表达TRAF6的DC细胞疫苗能够增强MUC1特异性的脾细胞增殖。
3.3过表达TRAF6的DC细胞疫苗能够提高MUC1特异性的脾细胞因子的分泌
IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2型免疫应答中的重要细胞因子。对于脾细胞培养上清IFN-γ的分泌水平，如图8中的B所示，NS组和Control DC组IFN-γ的分泌水平均较低，与Control DC组相比，TRAF6+DC组IFN-γ的分泌水平显著升高(P＜0.01)，与Control DC+MUC1组相比，TRAF6+DC+MUC1组IFN-γ的分泌水平显著升高(P＜0.01)。结果提示，过表达TRAF6的DC细胞疫苗能够增强MUC1特异性细胞免疫应答，并促进Th1型免疫应答。
对于脾细胞培养上清IL-4的分泌水平，如图8中的C所示，与Control DC组相比，TRAF6+DC组IL-4的分泌水平显著降低(P＜0.01)。同样地，与Control DC+MUC1组相比，TRAF6+DC+MUC1组IL-4的分泌水平显著降低(P＜0.01)。结果提示，过表达TRAF6的DC细胞疫苗能够抑制Th2型免疫应答。
3.4过表达TRAF6的DC细胞疫苗增加脾细胞及淋巴结细胞中CD4+T、CD8+T细胞比例
CD8+T细胞是肿瘤杀伤的主要效应细胞，在肿瘤免疫中发挥关键作用，通过检测CD8+T细胞的比例可以反映疫苗诱导的细胞免疫的强弱，因此我们通过流式细胞术检测了脾脏及肿瘤浸润的CD4+T、CD8+T细胞比例。由图9和图11可知，与NS组相比，Control DC组、Control DC+MUC1组、TRAF6+DC组及TRAF6+DC+MUC1组可以增加脾脏及淋巴结细胞中CD8+T及CD4+T细胞的比例，获得更强的细胞免疫作用。
3.5过表达TRAF6的DC细胞疫苗增强脾细胞和淋巴结细胞中Th1和Tc1占CD4+T及CD8+T细胞比例
Th1及Tc1可以通过分泌IFN-γ，促进CTL的成熟及活性，辅助CTL激活，参与肿瘤免疫反应。因此为了研究疫苗对Th1，Tc1的影响，通过流式细胞术检测了脾脏和淋巴结中Th1，Tc1占CD4+T细胞比例以及Th1，Tc1表达IFN-γ的平均荧光强度。我们发现与Control DC组相比，TRAF6+DC组Th1及Tc1比例升高，并且IFN-γ表达的平均荧光强度增强。与Control DC+MUC1组相比，TRAF6+DC+MUC1组增强Th1、Tc1比例及IFN-γ的平均荧光强度，增强抗肿瘤作用。(图10和图12)
3.6过表达TRAF6的DC细胞疫苗输入体内时，DC细胞大多存在肿瘤微环境中
为了检测过表达TRAF6的DC细胞疫苗输入荷瘤小鼠体内时聚集部位，我们通过流式检测了脾脏、淋巴结及肿瘤浸润的淋巴细胞中DC细胞的比例以及成熟DC的比例。我们通过流式分析发现，在肿瘤浸润的淋巴细胞中，与NS组相比，Control DC组、Control DC+MUC1组、TRAF6+DC组及TRAF6+DC+MUC1组的DC比例均显著升高。分析肿瘤浸润的淋巴细胞中成熟DC的比例，与Control DC组相比，TRAF6+DC组DC细胞成熟比例更高。与Control DC+MUC1组相比，TRAF6+DC+MUC1组DC细胞成熟比例更高(图13)。
4.结论
过表达TRAF6的DC细胞疫苗能够迁移至肿瘤周围，增强MUC1特异性免疫应答，使得免疫应答趋向Th1型，从而有效抑制B16-MUC1黑色素瘤肿瘤生长。
实验例5过表达TRAF6的DC细胞疫苗对治疗型荷瘤小鼠生存期的影响
1.材料实验试剂：GM-CSF、IL-4细胞因子购自PeproTech公司，MUC1多肽由上海紫域科技有限公司合成，TRAF6过表达慢病毒载体由江苏南京PPL公司合成。实验动物：C57BL/6小鼠(SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～22g)购自沈阳长生生物技术有限公司，B16-MUC1细胞为本实验室所有。
2.方法监测过表达TRAF6的DC细胞疫苗对小鼠生存期的影响
将小鼠随机分为5组，每组10只小鼠，分别是生理盐水对照组(NS)、未处理的DC细胞注射组(Control DC)、负载MUC1多肽DC细胞注射组(Control DC+MUC1)、TRAF6过表达DC细胞注射组(TRAF6+DC)、负载MUC1多肽并过表达TRAF6的DC细胞注射组(TRAF6+DC+MUC1)。在第0天荷瘤，皮下注射B16-MUC1肿瘤细胞5×104/只，100μl/只。在第7天和14天尾静脉注射生理盐水或者不同处理的DC细胞，2×106个细胞/只，100μl/只。观察小鼠的状态，成瘤情况，记录小鼠的死亡时间，绘制生存曲线。
3.结果为了验证过表达TRAF6的DC细胞疫苗在延长生存时间的作用，建立生存期模型，按照上述所述的免疫剂量和程序给小鼠荷瘤、免疫，观察肿瘤的生长情况及生存期，并按照生存率＝(初始动物数量-荷瘤后动物死亡数量)/初始动物数量×100％的公式计算生存率。结果见图14，荷瘤后40天生理盐水组全部死亡，Control DC组、Control DC+MUC1组、TRAF6+DC组及TRAF6+DC+MUC1组的生存率为分别为30％，40％、70％和90％。荷瘤后50天Control DC组小鼠全部死亡，此时Control DC+MUC1组、TRAF6+DC组及TRAF6+DC+MUC1组生存率为分别为10％、30％和50％。荷瘤后55天Control DC+MUC1组小鼠全部死亡，此时TRAF6+DC组和TRAF6+DC+MUC1组的生存率分别为10％和40％，具有显著性差异。
4.结论在生存期小鼠模型中，TRAF6过表达的DC细胞疫苗可以延长荷瘤小鼠的生存时间，提高生存率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 康九生物科技（长春）有限公司
<120> 一种过表达TRAF6的DC细胞、DC细胞疫苗及构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1593
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagtctct taaactgtga gaacagctgc gggtccagcc agtcgtccag tgactgctgc 60
gctgccatgg ccgcctcctg cagcgctgca gtgaaagatg acagcgtgag tggctctgcc 120
agcaccggga acctctccag ctccttcatg gaggagatcc agggctacga tgtggagttt 180
gacccacctc tggagagcaa gtatgagtgt cccatctgct tgatggcttt acgggaagca 240
gtgcaaacac catgtggcca caggttctgc aaagcctgca tcatcaaatc cataagggat 300
gcagggcaca agtgcccagt tgacaatgaa atactgctgg aaaatcaact gtttcccgac 360
aattttgcaa agcgagagat tctttccctg acggtaaagt gcccaaataa aggctgtttg 420
caaaagatgg aactgagaca tctcgaggat catcaagtac attgtgaatt tgctctagtg 480
aattgtcccc agtgccaacg tcctttccag aagtgccagg ttaatacaca cattattgag 540
gattgtccca ggaggcaggt ttcttgtgta aactgtgctg tgtccatggc atatgaagag 600
aaagagatcc atgatcaaag ctgtcctctg gcaaatatca tctgtgaata ctgtggtaca 660
atcctcatca gagaacagat gcctaatcat tatgatctgg actgcccaac agctccaatc 720
ccttgcacat tcagtgtttt tggctgtcat gaaaagatgc agaggaatca cttggcacga 780
cacttgcaag agaataccca gttgcacatg agactgttgg cccaggctgt tcataatgtt 840
aaccttgctt tgcgtccgtg cgatgccgcc tctccatccc ggggatgtcg tccagaggac 900
ccaaattatg aggaaactat caaacagttg gagagtcgcc tagtaagaca ggaccatcag 960
atccgggagc tgactgccaa aatggaaact cagagtatgt acgtgggcga gctcaaacgg 1020
accattcgga ccctggagga caaggttgcc gaaatggaag cacagcagtg taacgggatc 1080
tacatttgga agattggcaa ctttgggatg cacttgaaat cccaagaaga ggaaagacct 1140
gttgtcatcc atagccctgg attctacaca ggcagacctg ggtacaagct gtgcatgcgc 1200
ctgcatcttc agttaccgac agctcagcgc tgtgcaaact atatatccct ttttgtccac 1260
acaatgcaag gagaatatga cagccacctc ccctggccct tccagggtac aatacgcctt 1320
acaattctcg accagtctga agcacttata aggcaaaacc acgaagaggt catggacgcc 1380
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tatgtaacat ttatgcacct ggaagcctta agacagggaa ccttcattaa ggatgataca 1500
ttactagtgc gctgtgaagt ctctacccgc tttgacatgg gtggccttcg gaaggagggt 1560
ttccagccac gaagtactga tgcgggggtg tag 1593
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gattacaagg atgacgacga taag 24
<210> 3
<211> 8189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
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acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
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acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
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ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 6720
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<210> 4
<211> 9789
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
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gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc 6360
cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 6420
tctccgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg ccgcctcccc gcctggtacc 6480
tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg 6540
gggactggaa gggctaattc actcccaacg aaaataagat ctgctttttg cttgtactgg 6600
gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 6660
gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 6720
tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag 6780
tagtagttca tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga 6840
gagtgagagg aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 6900
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 6960
caatgtatct tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 7020
cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg 7080
gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctaga cttttgcaga 7140
gacggcccaa attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 7200
acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 7260
gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 7320
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 7380
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 7440
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 7500
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 7560
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 7620
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 7680
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 7740
ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 7800
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 7860
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 7920
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 7980
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 8040
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 8100
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 8160
cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 8220
ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 8280
tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 8340
agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 8400
gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 8460
ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 8520
gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 8580
cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 8640
acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 8700
cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 8760
cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 8820
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 8880
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 8940
atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 9000
tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 9060
actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 9120
aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 9180
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 9240
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 9300
cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 9360
aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 9420
cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 9480
gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca 9540
tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta 9600
aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg 9660
cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg 9720
cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt 9780
gccaagctg 9789
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg
20 25 30

Claims (5)

1.一种DC细胞疫苗，其特征在于，所述DC细胞疫苗由过表达TRAF6的DC细胞负载肿瘤抗原得到；
所述过表达TRAF6的DC细胞经重组慢病毒载体转染得到；所述重组慢病毒载体中插入有TRAF6基因；所述TRAF6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述肿瘤抗原为MUC1多肽；所述MUC1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的DC细胞疫苗，其特征在于，所述重组慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求1所述的DC细胞疫苗，其特征在于，所述的DC细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)将插入有TRAF6基因的重组慢病毒载体与pAX2和pMD2G骨架载体共转染293T细胞进行培养，收集共转染后的细胞培养液进行病毒浓缩，得到病毒转染液；
2)将待转染的DC细胞和所述病毒转染液混合，进行转染，得到过表达TRAF6的DC细胞。
4.权利要求1～3任意一项所述DC细胞疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括腺癌、肝癌和血液肿瘤中的一种或几种。
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