CN112779217A

CN112779217A - 一种高记忆表型肿瘤浸润t淋巴细胞的培养方法

Info

Publication number: CN112779217A
Application number: CN202110332346.1A
Authority: CN
Inventors: 顾建英; 周宇红; 卢莉莉; 孙磊; 吴伟忠; 卫传元; 高子煦; 肖淑秀; 宋正清; 白金金
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN112779217B

Abstract

本发明公开了一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法，包括：无菌切取肿瘤组织置于培养液中，在无菌冷链条件下将瘤体机械剪碎、消化，获取单细胞悬液，分离提取肿瘤浸润T淋巴细胞，加入到含有分离诱导培养液的培养基中进行体外扩增和诱导分化，培养7–21天得到高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞，分离诱导培养液为含有IL‑2、IL‑7、IL‑15浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的培养基。本发明通过分离诱导培养液对TIL细胞进行体外扩增和诱导分化，最大限度获得具有高效增殖活性及强大肿瘤杀伤能力的高记忆表型TILs，方法简单且高效，记忆表型T淋巴细胞占比高，可用于治疗晚期恶性黑色素瘤。

Description

一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞(TILs)的培养方法。

背景技术

恶性黑色素瘤(简称黑色素瘤)是恶性程度最高的皮肤肿瘤，近年来发病率以每年3％–5％的速度增长。手术可以切除早期黑色素瘤，但黑色素瘤发生远处转移后常规治疗有效率低，5年生存率仅为10％–20％，中位生存时间仅6–9个月，预后极差。黑色素瘤具有极高的突变负荷及免疫原性，免疫治疗在黑色素瘤中疗效尤为显著，然而超过50％的黑色素瘤患者仍对免疫治疗无应答，部分患者发生肿瘤爆发性进展，因此，优化免疫治疗手段、探索更佳联合治疗方案，具有重要的临床意义。

免疫治疗依赖于肿瘤细胞与其微环境内免疫细胞之间的相互作用。然而，肿瘤局部呈现出抑制性微环境，表现为效应淋巴细胞浸润减少及功能耗竭，对肿瘤细胞的杀伤活性大大降低，这就使得依赖于T细胞的免疫治疗药物无法发挥作用。因此，增加肿瘤微环境局部T细胞比例及改善其功能状态，尤其是增加记忆表型T细胞的比例，对于抵抗肿瘤发生发展及提高免疫治疗效果具有十分重要的作用。过继性免疫治疗(adoptiveimmunotherapy，AIT)是指将体外扩增的免疫细胞回输患者体内，以改善肿瘤局部的抑制性免疫微环境，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，从而抑制肿瘤进展或联合免疫治疗，它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，其中非特异激活是采用非特异性刺激因子(如IL-2、IFN-γ等)刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等。然而，效应T细胞寿命短，无法维持长时间的抗肿瘤免疫应答。

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)是从肿瘤组织中分离出的淋巴细胞，是一种特异性免疫活性细胞疗法。现有的TIL细胞分离培养技术，主要是机械处理和酶消化法、非连续密度梯度离心法等，从肿瘤局部分离出肿瘤浸润的淋巴细胞，再加入高剂量白细胞介素-2(IL-2)进行体外培养。与淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)相比，TIL具有更高的抗瘤效价，较LAK强50–100倍，在治疗中可以减少效应细胞和IL-2的用量；TIL主要由CD8+T细胞诱导而来，其杀伤肿瘤的作用具有特异性；消除宿主肿瘤免疫微环境的抑制状态有利于TIL的杀伤作用。TIL细胞作为一种特异性免疫细胞，用于肿瘤治疗已有数十年的历史。目前常用的TIL体外扩增技术是先从肿瘤组织中分离出TIL细胞后再进行诱导培养，存在扩增速度慢、记忆性淋巴细胞数量少等缺陷，并且为了快速获得更多的效应细胞，细胞因子(如IL-2)剂量较高，在治疗过程中容易使患者产生细胞因子风暴，不利于治疗，甚至对患者产生生命危险。Rosenberg指出，肿瘤组织中占比很小的记忆性T细胞维持肿瘤特异性突变抗原，是深入到敌军内部打击能力最强的免疫细胞。因此，可以在TIL体外扩增的过程中调整诱导因子的组合，使其向着记忆表型方向扩增，这种获得的TILs具有较高的记忆T细胞占比，因而具有强大而持久的抗肿瘤免疫应答能力。

发明内容

本发明的第一目的是，提供一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法，解决现有TIL细胞扩增方法存在操作程序繁杂、耗时长、活性不高、记忆性淋巴细胞占比较低等问题。

本发明的第二目的是，提供所述高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞在制备用于治疗晚期恶性黑色素瘤的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)无菌切取肿瘤组织置于培养液中，在无菌、冷链条件下保存；

(2)将步骤(1)所述肿瘤组织的瘤体机械剪碎、消化，获取单细胞悬液，分离提取肿瘤浸润T淋巴细胞；

(3)将步骤(2)所述肿瘤浸润T淋巴细胞加入到含有分离诱导培养液的培养基中进行体外扩增和诱导分化，培养7–21天后得到高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的细胞悬液；其中，所述分离诱导培养液为含有IL-2、IL-7、IL-15的培养基，且IL-2、IL-7、IL-15的浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、20ng/ml。

优选地，步骤(1)中，所述肿瘤组织来源于黑色素瘤，瘤体大小≥1cm³。

更优选地，步骤(1)中，所述肿瘤组织来源于黑色素瘤浸润淋巴结。

为实现上述第二目的，本发明采用的技术方案是：

所述高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞在制备用于治疗晚期恶性黑色素瘤的药物中的用途。

优选地，所述药物为高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞浓度为1×10⁷–1×10⁸细胞/ml的细胞悬液注射液。

优选地，所述的给药方式为静脉滴注。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用优化浓度组合的IL-2、IL-7和IL-15分离诱导培养液对TIL细胞进行体外扩增及诱导分化，维持T细胞的扩增能力和记忆T细胞的状态，可以最大限度获得具有高效增殖活性及强大肿瘤杀伤能力的高记忆表型TILs，方法简单且高效，记忆表型T淋巴细胞占比高。

(2)本发明将高记忆表型TILs回输至黑色素瘤患者体内，观察其用于治疗晚期黑色素瘤患者的安全性、耐受性以及抗肿瘤疗效，证明TILs可以用于治疗晚期恶性黑色素瘤，因其具有强大而持久的抗肿瘤免疫应答能力，可以改善肿瘤局部的抑制性免疫微环境，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，发挥TIL细胞的抗肿瘤活性，为其在抗肿瘤临床应用提供良好的基础。

参考以下详细说明更易于理解本申请的上述以及其他特征、方面和优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：

图1是黑色素瘤TILs体外培养及扩增的照片。

图2是体外培养获取高记忆表型的TILs。

图3是黑色素瘤TILs体外培养后细胞活性及功能。

图4是体外高记忆表型TILs与肿瘤细胞共培养后对肿瘤细胞的杀伤率。

图5是构建皮下移植瘤模型检测TILs体内环境下对肿瘤的影响。

图6是体外高记忆表型TILs细胞冻存复苏前后的活性。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞培养方法，包括以下步骤：

(2)将步骤(1)肿瘤组织的瘤体机械剪碎、消化，获取单细胞悬液，分离提取肿瘤浸润T淋巴细胞；

(3)将步骤(2)肿瘤浸润T淋巴细胞加入到含有分离诱导培养液的培养基中进行体外扩增和诱导分化，培养7–21天后得到高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的细胞悬液；其中，分离诱导培养液为含有IL-2、IL-7、IL-15浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的培养基。

步骤(1)中，肿瘤组织可来源于黑色素瘤，瘤体大小≥1cm³。

步骤(1)中，所述肿瘤组织也可以来源于黑色素瘤浸润淋巴结。

实施例1高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞培养

培养高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞，步骤如下：无菌切取来源于晚期黑色素瘤患者的肿瘤组织,瘤体大小≥1cm³,置于培养液中，在无菌、冷链条件下将上述瘤体机械剪碎、消化，获取单细胞悬液，分离提取肿瘤浸润T淋巴细胞后，加入到含有分离诱导培养液的培养基中进行体外扩增和诱导分化，培养14天后得到高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的细胞悬液，分离诱导培养液为含有IL-2、IL-7、IL-15浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的培养基，可以先分别配置10ug/ml、10ug/ml、20ug/ml的IL-2、IL-7、IL-15然后按照1:1000稀释至上述浓度使用。

通过对实施例1中不同培养阶段的TILs进行显微镜下观察，可以看到TILs迅速扩增、明显的聚集成团现象，说明细胞被激活、处于活化的状态(图1)。进一步分析记忆性T细胞(CCR7+/-CD45RA-)比例，可以看到记忆性CD8+T细胞占据CD8+T细胞总量的93.12％，而记忆性CD4+T细胞占据CD4+T细胞总量的92.26％(图2)，最终获得高记忆表型TILs。

通过流式细胞术对实施例1中扩增的高记忆表型TILs细胞进行功能检测，发现PD-1阳性T细胞占据19.2％，并且4-1BB阳性T细胞占据66.5％，该结果提示优化的TILs被高效激活，高活化状态下的TILs联合PD-1单抗才可能发挥强大持久的抗黑色素瘤效果(图3)。

实施例2细胞实验

将实施例1中得到的高记忆表型TILs细胞与肿瘤细胞体外共培养来模拟体内TILs对肿瘤细胞杀伤能力，通过CFSE-PI双染标记法，体外共培养4-6小时后，经流式检测PI+的肿瘤细胞比例，发现肿瘤细胞发生了明显的凋亡，杀伤率高达67.8％，相比传统TILs提高15％，提示高记忆表型TILs具有强大的肿瘤杀伤能力(图4)。

实施例3动物实验

构建免疫缺陷鼠皮下移植瘤模型，尾静脉注射TILs观察小鼠安全性、耐受性，以及肿瘤的进展情况，发现小鼠在注射TILs后体重较对照组无明显改变(图5A)，提示对该TILs产品耐受性较好；同时，可以观察注射TILs组小鼠皮下瘤明显减小(图5B)。

另外，实施例1中得到的高记忆表型TILs细胞产品液氮冻存，复苏后细胞制剂活性仍维持在90％以上，具有较好的稳定性(图6)。

按照实施例1的步骤制备不同批次的高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞，对不同批次的TILs进行检测结果如表1所示，可见不同批次具有较好的一致性。

表1

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肿瘤组织来源于黑色素瘤，瘤体大小≥1cm³。

3.根据权利要求2所述高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肿瘤组织来源于黑色素瘤浸润淋巴结。

4.权利要求1至3任一项所述高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞在制备用于治疗晚期恶性黑色素瘤的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物为高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞浓度为1×10⁷–1×10⁸细胞/ml的细胞悬液注射液。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的给药方式为静脉滴注。