CN111655272A - 活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的方法 - Google Patents

Abstract

提供一种在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(tumor‑infiltrating lymphocytes，TIL)的方法，具体而言是通过向该个体施用经由在培养基中共生微生物群发酵而产生的发酵组合物。

Description

活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的方法

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119主张于2018年1月9日申请的美国专利临时申请案第62/615,300号的权益，其全部内容以引用方式合并于本文。

技术领域

本发明涉及一种在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes，TILs)的方法，具体而言是通过向该个体施用经由在培养基中共生微生物群发酵而产生的发酵组合物。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)为免疫细胞族群，其被积极地招募到肿瘤部位以引发针对肿瘤生长及转移的免疫反应。已经显示肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)直接攻击肿瘤组织并且与对检查点阻塞的反应及有利的临床结果相关联。然而，在所有患者中，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的活化并非总是可行的或充分的。此外，据报导，癌细胞可引起微环境改变及抑制抗肿瘤免疫，导致对癌症药物/疗法的不敏感或耐受。需要活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)或增强个体的免疫疗法特别是对抗癌症的敏感性。

发明内容

本发明基于意外的发现，即本文所述的共生微生物群的发酵产物可有效活化肿瘤动物模型中的肿瘤浸润细胞(TILs)，具体而言是促进肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)迁移到肿瘤中并增加肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的数量，从而将冷肿瘤转化为热肿瘤并将免疫抑制性肿瘤微环境改变为免疫反应性肿瘤微环境，从而增强抗癌治疗效果，特别是与免疫检查点调节剂组合。还发现的是，在肿瘤内施用如本文所述的由共生微生物群产生的发酵产物提供了改善的治疗效果，其中给药量减少、给药过程缩短，甚至被认为无反应的远程部位的肿瘤也可以被成功地治疗。

因此，本发明的一方面为提供一种在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的方法，包括对该个体施用发酵组合物的量，该发酵组合物是经由在培养基中共生微生物群发酵而产生，其中该共生微生物群包括(i)至少二种或更多种乳酸菌菌株，或(ii)至少二种或更多种酵母菌株，或(iii)至少一种或更多种乳酸菌菌株与至少一种或更多种酵母菌株，该量有效于增加该个体中肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的产生或活性的量。

于某些具体实施例中，该用于发酵的培养基包含碳源、氮源，以及微量元素。

于某些具体实施例中，该培养基发酵组合物包含经由该发酵产生的多种代谢物。

于某些具体实施例中，该发酵组合物是通过包括下列的方法所制备：

(i)在允许发酵产生多种代谢物的条件下培养在该培养基中的共生微生物群；以及

(ii)收集从步骤(i)获得的该发酵组合物。

于某些具体实施例中，该制备方法进一步包括对从步骤(ii)获得的该发酵组合物进行灭菌、过滤及/或浓缩。

于某些具体实施例中，该发酵组合物有效地(i)改变肿瘤微环境以避免抑制抗肿瘤免疫，及/或(ii)改善化学疗法及/或癌症疗法的效果，及/或(iii)将冷肿瘤转化为热肿瘤，及/或(iv)提高反应率，及/或(v)减小肿瘤大小，及/或(vi)提高该个体的存活率。

于某些具体实施例中，该个体患有肿瘤疾病。

于某些具体实施例中，该个体患有癌症。

于某些具体实施例中，该个体患有细菌感染的肿瘤。

于某些具体实施例中，该癌症选自由下列所组成的群组：结肠癌、肺癌、乳癌、胰脏癌、皮肤癌、脑癌、卵巢癌、肾脏癌、胃癌、头颈癌、食道癌、膀胱癌、直肠癌、骨癌、子宫癌、前列腺癌，以及血液系统恶性肿瘤。

于某些具体实施例中，该个体已经历、正在经历或正计划进行针对肿瘤疾病的免疫疗法，例如，使用免疫检查点调节剂。

于某些具体实施例中，该方法包括在施用该发酵组合物之前选择有需要活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的个体。

于某些具体实施例中，该个体已经确定具有相较参考含量相对较低含量的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。

于某些具体实施例中，该肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)包括CD4⁺、CD8⁺，及/或CD86⁺树突细胞。

于某些具体实施例中，该发酵组合物经由口服施用或注射施用方式给药。于其他具体实施例中，该发酵组合物经由肿瘤内施用方式给药。

经由在如本文所述的培养基中共生微生物群的发酵产生的发酵组合物也在本发明的范围内，用于在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。本发明的特征还在于经由在如本文所述的培养基中共生微生物群发酵而产生的发酵组合物在制备用于在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的药物中的用途。本发明进一步提供了一种套组或组合，包含经由在如本文所述的培养基中共生微生物群发酵而产生的发酵组合物，任选地与免疫检查点调节剂组合，用于在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。于某些具体实施例中，该套组或组合可用于(i)改变肿瘤微环境以避免抑制抗肿瘤免疫，及/或(ii)改善化学疗法及/或癌症疗法的效果，及/或(iii)将冷肿瘤转化为热肿瘤，及/或(iv)提高反应率，及/或(v)减小肿瘤大小，及/或(vi)提高该个体的存活率。较佳地，该套组或组合提供协同效应。

于下列的描述中阐述了本发明之一或多个具体实施例的细节。由下列对数个具体实施例的详细描述以及由所附的申请权利要求书中，本发明的其他特征或优点将显而易见。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明的下列详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了目前较佳的具体实施例。然而，应当理解的是，本发明不限于所示的精确配置及手段。

于附图中：

图1所示为本发明的发酵组合物对骨髓树突细胞(bone marrow dendriticcells，BMDCs)成熟的刺激作用。培养该细胞并以抗CD83抗体检测。***P<0.001。**P<0.01。通过每个干预组及对照组的比较获得P值。

图2为用于在结肠癌小鼠模型中经由口服施用研究本发明的发酵组合物的效果的实验设计的示意图。将结肠癌CT26细胞移植到该小鼠中，并以该发酵组合物处理，任选地与抗-PD1抗体组合。

图3为显示来自结肠癌小鼠模型的肿瘤的免疫组织化学分析结果的图像，包括CD4T细胞、CD8 T细胞或CD86树突细胞的免疫荧光染色。将结肠癌CT26细胞移植到该小鼠中，并以载剂对照、组合物X，或组合物X与抗PD1抗体的组合处理。

图4为显示来自结肠癌小鼠模型的肿瘤的免疫组织化学分析结果的图像，包括CD4T细胞、CD8 T细胞，或CD86树突细胞的免疫荧光染色。将结肠癌CT26细胞移植到该小鼠中，并以载剂对照、抗PD1抗体、组合物LT12，或组合物LT12与抗PD1抗体的组合处理。从该小鼠获得肿瘤样品并进行免疫组织化学分析。

图5为显示结肠癌小鼠模型中肿瘤CD8 T细胞分析结果的图表。将结肠癌CT26细胞移植到该小鼠中，并以载剂对照、抗PD1抗体、组合物LT12，或组合物LT12与抗PD1抗体的组合处理。消化从小鼠获得的肿瘤样品以提供细胞悬浮液，包括解离的肿瘤细胞，将其定量以确定总肿瘤活细胞中CD8 T细胞的量。

图6包括显示结肠癌小鼠模型的存活率及肿瘤大小的图表。将结肠癌CT26细胞移植到该小鼠中，并以载剂对照、抗PD1抗体、组合物X，或组合物X与抗PD1抗体的组合处理。

图7包括显示结肠癌小鼠模型的存活率及肿瘤大小的图表。将结肠癌CT26细胞移植到该小鼠中，并以载剂对照、抗PD1抗体、组合物LT12，或组合物LT12与抗PD1抗体的组合处理。

图8包括用于在结肠癌小鼠模型中经由肿瘤内施用研究本发明的发酵组合物的效果的实验设计的示意图，以及显示结肠癌小鼠模型的肿瘤大小的图表。将结肠癌CT26细胞移植到该小鼠中，并以载剂对照、组合物X，或组合物X与抗PD1抗体的组合处理

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

如本文所用，冠词“一”以及“一个”是指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例而言，“一元素”表示一个元素或多于一个元素。

“包含(动词)”或“包含(动名词)”等词通常以包括(动词)/包括(动名词)的含义使用，其表示允许存在一种或多种特征、成分或组成分。“包含(动词)”或“包含(动名词)”等词包括术语“由......组成(动词)”或“由......组成(动名词)”。

如本文所用，“肿瘤疾病”一词是指由于瘤形成，即细胞的异常增殖导致的异常组织块。这些细胞的生长超过了它周围的正常组织。它通常但并非总是产生肿块或肿瘤。肿瘤性疾病可能为良性的、恶变前的，或恶性的。如本文所用，癌症是指由任何类型的恶性肿瘤引起的疾病的一般术语，包括任何阶段(第I期癌症、第II期癌症、第III期癌症、第IV期癌症)，等级(第I级癌症、第II级癌症、第III级癌症)，受影响组织的浸袭性、侵袭性或恶性，或细胞聚集。除非另外定义，否则“肿瘤疾病”、“肿瘤”以及“癌症”等词不限于任何组织或细胞类型，且包括原发性、继发性或转移性病变。

如本文所用，“肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)”是指肿瘤存在的环境，包括肿瘤细胞本身、周围的基质细胞以及非细胞组成分，例如细胞激素、化学激活素、胶原蛋白、弹性蛋白，以及生长因子。基质细胞包括纤维母细胞、上皮细胞、血管细胞、调节肿瘤细胞生长或存活的驻留及/或招募的发炎及免疫细胞(例如，巨噬细胞、树突细胞、颗粒性白血球、淋巴细胞等)。在肿瘤的早期或中期，一些肿瘤细胞获得突变，使其能够抵抗免疫破坏，但它们的增殖及扩散仍然受到免疫反应的限制。主要的抗肿瘤成分包括自然杀手(natural killer，NK)细胞、溶细胞性T淋巴细胞(cytolytic T lymphocytes，CTLs)、CD4⁺辅助T细胞、M1巨噬细胞，以及二种主要细胞激素：介白素-12(interleukin-12，IL-12)与干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)。然而，晚期肿瘤细胞经常改变肿瘤微环境，从免疫反应转变为免疫抑制，允许肿瘤细胞逃避宿主免疫监视并支持肿瘤生长、恶化及扩散。特定而言，在免疫抑制性肿瘤微环境中，尽管一些免疫细胞，如细胞毒性CTLs或辅助性T细胞可能仍然存在，但它们的功能大大地受抑制；IL-12的产量也大受抑制；与免疫抑制相关的细胞亚群如调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)、髓源性抑制细胞(myeloid derivedsuppressor cells，MDSC)与M2巨噬细胞被招募到肿瘤部位，导致免疫活性的抑制；另一方面，肿瘤细胞产生细胞激素，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrotic factor-α，TNFα)以及环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)，其促进慢性炎症以及促进血管生成的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，两者均导致显著的肿瘤生长。

如本文所用，“肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)”一词为与肿瘤组织相关的免疫细胞群体。更具体而言，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)为患有癌症的个体的淋巴细胞，其已经离开血流并且与肿瘤相关。因此，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)可能具有肿瘤特异性，且活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)可以允许更直接地控制肿瘤细胞的消除。肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的主要类型包括T细胞、B细胞，以及自然杀手(NK)细胞。细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxicity Tlymphocytes，CTLs)，具体而言是CD8⁺细胞，可以直接攻击并杀死肿瘤细胞。T辅助淋巴细胞(Th)，具体而言是CD4⁺细胞，能够分泌可以活化细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的各种细胞因子。肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)还包括骨髓细胞，例如树突细胞，具体而言是CD86⁺树突细胞。已知肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，具体而言是CD8⁺细胞的存在与免疫治疗的良好反应正相关，具体而言是使用免疫检查点调节剂，有利于将肿瘤微环境从免疫抑制转变为免疫刺激，将冷肿瘤转化为热肿瘤，并造成更好的临床结果。肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞(intratumoral TILs)可定义为肿瘤巢内的淋巴细胞，其具有细胞-对-细胞间的接触，而没有间隔基质并直接与肿瘤细胞相互作用，而基质肿瘤浸润淋巴细胞(stromal TILs)可以定义为分散在肿瘤细胞之间的基质中的淋巴细胞，且不直接接触肿瘤细胞。可以通过免疫组织化学分析及使用抗体标记的流式细胞仪分析来评估、鉴定、计算，及/或表型分类肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。国际肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)工作团队提出了一种方法，通过测量乳癌中苏木精及曙红(H-E)染色切片上基质区域上单核细胞占据的面积来测定肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的存在及数量，这也适用于结直肠癌。见Iseki等人，PLoS One.2018Apr 26；13(4)：e0192744。此外，可以使用液滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技术进行肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的定量。参见Robins等人，Sci Transl Med.2013Dec 4；5(214)：214ra169。

如本文所用，“活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)”或“肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的活化”等词可包括与参考或对照含量相比，增加来自癌症个体的肿瘤组织样品中肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的活性/数量/密度，例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或98％。参考或对照含量可以指在本文所述的治疗之前或不治疗之前在个体中测量的含量(或个体所组成的群体中的平均含量)。

如本文所用，“热肿瘤”或“发炎的肿瘤”等词是指肿瘤，其中存在相当多的抗肿瘤免疫细胞，尤其是肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，因此通常具有免疫刺激性。

如本文所用，“冷肿瘤”或“非发炎肿瘤”等词是指其中不存在或存在最少的抗肿瘤免疫细胞，尤其是肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，或相反地，含有与免疫抑制相关的细胞亚群，包括调节性T细胞(Treg)、髓源性抑制细胞(MDSCs)，以及M2巨噬细胞。特定而言，冷肿瘤的特征在于抗肿瘤免疫细胞的数量少或甚至没有渗透，这些细胞可能存在但仍黏在周围的基质中，因此不能定殖于肿瘤微环境以提供其抗肿瘤功能。

如本文所述，已知肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)在多种类型的癌症中对于直接攻击肿瘤细胞具有重要的作用，且许多研究已经证明肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的存在与癌症患者的治疗效果及增加的存活高度相关。意外地发现，通过如本文所述的培养基中的共生微生物群发酵所产生的发酵组合物在动物癌症模型中成功地活化了肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。于一些情况下，证明如本文所述的发酵组合物在以免疫调节剂治疗癌症中表现出协同效应。该研究的结果显示，如本文所述的发酵组合物可促进从抑制到增强抗肿瘤免疫力的转变，将冷肿瘤转化为热肿瘤，增加抗癌免疫疗法的反应率，例如，使用免疫检查点调节剂增加，减小肿瘤大小以及提高存活率。此外，于一些情况下，以如本文所述的由共生微生物群产生的发酵产物进行肿瘤内施用被证实提供改善的治疗效果，其中给药量减少、给药过程缩短，甚至认为无反应的远程部位的肿瘤也可被成功地治疗。

因此，本发明的一方面涉及一种在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的方法，包括对该个体施用经由在如本文所述的培养基中共生微生物群发酵而产生的发酵组合物。

发酵是一种代谢过程，其中微生物在厌氧条件下将碳水化合物转化为酸(例如，有机酸，例如乳酸)、醇类(例如，乙醇)，及/或其他代谢物。如本文所述的用于活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的发酵组合物为经由在一培养基中共生微生物群发酵而产生的一发酵产物。合适的微生物包括，但不限于，酵母及乳酸菌。特定而言，如本文中用于产生该发酵组合物的共生微生物群包含(i)至少二种或更多种乳酸菌菌株，或(ii)至少二种或更多种酵母菌株，或(iii)至少一种或更多种乳酸菌菌株以及至少一种或更多种酵母菌株。此外，该发酵组合物包含从该发酵产生的多种代谢物。于某些具体实施例中，该发酵组合物可包含乳酸、醋酸，以及3-异丁胺酸的组合(例如，二种或更多种)。于一实例中，该发酵组合物包含5-20重量％的乳酸(例如，5-10重量％、10-20重量％、5-15重量％，或15-20重量％)，小于5重量％的醋酸(例如，1-5重量％、0.5-5重量％、1-3重量％、0.5-3重量％，或3-5重量％)，以及小于5重量％的3-异丁胺酸(例如，1-5重量％、0.5-5重量％、1-3重量％、0.5-3重量％，或3-5重量％)。

乳酸菌的实例可包括属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌，例如嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckiibulgaricus)、乳酸乳酸杆菌(Lactobacillus lactis lactis)、克菲尔乳酸杆菌(Lactobacillus kefir)、克弗尔粒乳酸杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)；属于乳酸球菌属(Lactococcus)的细菌，例如乳酸乳酸球菌(Lactococcus lactis)、植物乳酸球菌(Lactococcus plantarum)，以及棉籽糖乳酸球菌(Lactococcus raffinolactis)；以及属于双歧杆菌属(Bifidobacterium)的细菌，例如短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。酵母菌的实例可包括属于酵母菌属(Saccharomyces)与念珠菌属(Candida)的酵母。

于某些具体实施例中，使用乳酸菌的异质培养物进行发酵，例如乳酸杆菌属(Lactobacillus)，例如，具有二(2)种或更多如2、5、10、15、20、25或30种菌株的乳酸杆菌。可用于发酵的乳酸杆菌属(Lactobacillus)菌株包括，但不限于，嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)CCRC(中国台湾，食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心)10695、14026、14064、14065，及/或14079，德氏保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii bulgaricus)CCRC 10696、14007、14009、14010、14069、14071、14098，及/或16054，乳酸乳酸杆菌(Lactobacillus lactis lactis)CCRC 10791、12267、12306、12312、12315、12323、14016、14015，及/或14117，克菲尔乳酸杆菌(Lactobacillus kefir)CCRC14011，及/或克弗尔粒乳酸杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)CCRC 16059。其他乳酸菌例如乳酸杆菌可用于发酵，实例包括，但不限于，韩中大乳酸球菌(Lactococcuschungangensis)(DSM 22330)、福尔摩沙乳酸球菌(Lactococcus formosensis)(BCRC80576)、福建乳酸球菌(Lactococcus fujiensis)(DSM 27937)、乳酸链球菌(Lactococcusgarvieae)(BCRC17074T；ATCC 43921,49157)，拜氏乳酸乳酸球菌(Lactococcus lactisBeijerinck)(ATCC 49032)、乳酸乳酸球菌乳脂亚种(Lactococcus lactissubsp.Cremoris)(BCRC 12263、12264、12265、12277、12278、12303、12304、12586T；ATCC14365)，乳酸乳酸球菌霍氏亚种(Lactococcus lactis subsp.Hordniae)(BCRC 80474T、ATCC 29071)、乳酸乳酸球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)(BCRC 11068、12266、12312T、12322、14016、14105、14117、10791、12315)、乳酸乳酸球菌平截亚种(Lactococcus lactis subsp.Tructae)(BCRC 80475T)、鱼乳酸球菌(Lactococcuspiscium)(ATCC 700018T；DSM 6634)、植物乳酸球菌(Lactococcus plantarum)(ATCC43199)、棉籽糖乳酸球菌(Lactococcus raffinolactis)(BCRC 14039T；ACTT43920)、中国台湾乳酸球菌(Lactococcus taiwanensis)(BCRC 80460T)，以及乳酸球菌Lactococcushircilactis(DSM 28960)。于某些具体实施例中，使用酵母菌的异质培养物，如酵母菌属(Saccharomyces)进行发酵，例如，二(2)种或更多，例如，2、5、10、15、20、25或30或更多种酵母菌属的菌株。可用于发酵的酵母菌菌株包括，但不限于，啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)CCRC 20577、20578、20581、21494、21550、21779、21805、22138、22234、22337、22731，及/或22728，及/或乳酒念珠菌(Candida kefyr)CCRC 21269、21742，及/或22057。于某些具体实施例中，如本文所用的异质培养物包含至少一种或多种乳酸菌菌株以及至少一种或多种酵母菌菌株的混合物。于某些具体实施例中，如本文所用的异质培养物包含至少一种或多种乳酸杆菌属菌株、至少一种或多种乳酸球菌属菌株，以及至少一种或多种酵母菌菌株。

适合用于进行微生物发酵的培养基为本领域已知且为可获得的。典型的培养基包含碳源，例如右旋糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉、乳糖等，含氮物质(例如，酵母萃取物)，以及微量元素、矿物盐及/或其他可能的营养成分，例如那些衍生自可再生原料如玉米淀粉、糖以及大豆蛋白。

于某些具体实施例中，如本文所用的用于发酵的培养基可包含一植物材料，例如一豆科植物(例如，大豆)、其一部分(例如，种子)，或其萃取物。示例性豆科植物包括，但不限于，豆类、豌豆、苜蓿、红三叶草、蚕豆、紫云英，以及豇豆。具体而言，该豆科植物可为种子中具有相对高蛋白质含量的豆科植物，例如，大豆属(Glycine)，例如黄豆(Glycine max)，以及其他一些物种，包括野大豆(Glycine soja)、阔叶大豆(Glycine tomentella)、烟豆(Glycine tabacina Benth)、扁豆荚大豆(Glycine dolichocarpa)，或渗湖大豆(Glycineclandestine)。

如本文所用，用于发酵培养基的豆科植物材料可为植物本身或其部分(例如，叶、果实、种子等)或其萃取物。萃取物可指通过萃取材料获得的产物，其可以常规方式进行，通常通过将待萃取的材料浸泡或混合在溶剂中(任选地粉碎或研磨破碎)并获得所得滤液或从中浓缩。较佳地，本文所用的萃取物是指通过以水作为溶剂萃取材料制备的含水萃取物。于特定的具体实施例中，待萃取的材料与溶剂的比例可为，例如，约1：1至约1：100，约1：1至约1：50，约1：1至约1：25，约1：1至约1：15，约1：1至约1：10，或约1：1至约1：5(w/w，g/g)。萃取可在合适的温度下进行，例如，通过加热，例如70至100℃。于一具体实例中，如本文所用的“萃取物”为大豆植物种子的含水萃取物。

根据本发明，发酵可在允许培养基发酵的条件下进行，例如20-45℃(例如20-25℃、20-30℃、25-30℃、25-35℃、30-45℃，或30-40℃)适当的一段时间(例如2-10天、2-5天、4-8天，或5-10天)。具体而言，可以在发酵后进行一个或多个步骤，例如，灭菌、过滤、浓缩、冻干或其任何组合。更具体而言，灭菌通过例如发酵后加热进行，并可根据需要进行过滤及浓缩(例如，透析)以产生浓缩的发酵组合物溶液。此外，可进一步干燥发酵组合物溶液，例如通过冷冻干燥，以获得粉末形式的发酵组合物。

于一些实例中，该发酵组合物可通过包括下列的方法制备：(i)在允许发酵产生多种代谢物的条件下培养共生微生物群，例如酵母菌、乳酸菌(例如，乳酸杆菌及/或乳酸球菌)，或其一组合；以及(ii)收集从步骤(i)获得的发酵组合物。任选地，该制备方法可进一步包括过滤该发酵组合物，对该发酵组合物进行灭菌，及/或浓缩该发酵组合物。

于一些实例中，该发酵组合物可通过包括下列的方法制备：(a)发酵含有碳源、氮源及微量元素的培养基，任选地，一种大豆水萃取物以及至少一种乳酸菌与至少一种酵母菌所一起形成发酵液；(b)对该发酵液进行灭菌；(c)过滤该无菌发酵液；以及(d)从该过滤的发酵液中除去水份，形成浓缩的发酵产物。

制备发酵组合物的方法也描述于，例如，美国专利号6,685,973、6,855,350、6,733,801，美国专利申请公开号US20120058104，以及US20170281760，为了本文引用的目的或主题，每个相关公开内容通过引用并入本文。

于某些具体实施例中，根据本发明的方法需要活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的个体包括将受益于肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的增强产生的患者。

于某些具体实施例中，该方法可包括选择需要活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的个体以及在有效活化个体中的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的条件下施用如本文所述的发酵组合物。

于某些具体实施例中，一有需要活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的个体包括一用于治疗肿瘤或癌症的过继性T细胞疗法的候选者。于某些实例中，相比于对照或标准含量，确定此类候选者具有相对低的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)百分比/密度。如本文所用，对照或标准含量可指患者群体的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)百分比/密度的平均值或截止含量。例如，Iseki等人所著的上文回顾了一组患有第II期或第III期结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的患者，并根据接受者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)分析将肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)占据的面积的截止百分比设定为42％，将患者分为高肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)组(>42％)与低肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)组(<42％)。肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的百分比/密度可通过本领域的常规方法测定，例如，通过免疫组织化学或HE染色以及自动影像软件程序。截止值可能随着不同类型的癌症及种族的患者群而变化。

于某些具体实施例中，该方法可包括测量来自患者的肿瘤样品中的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，将样品中肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的含量与对照或标准值进行比较，并确定患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)含量。于某些具体实施例中，基于比较，选择确定具有与对照或标准值相比较低含量的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的患者。于某些具体实施例中，基于比较，与对照或标准值相比，较低含量的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)进一步预测患者将具有冷肿瘤、抑制肿瘤微环境及/或对抗癌或抗肿瘤免疫治疗的不良反应。

于某些具体实施例中，该个体患有一肿瘤疾病。

于某些具体实施例中，该个体为一患有癌症的患者。

于某些具体实施例中，该个体为一患有细菌感染的癌症的患者。

于某些具体实施例中，待治疗的癌症包括，但不限于，结肠癌、肺癌、乳癌、胰脏癌、皮肤癌、脑癌、卵巢癌、肾脏癌、胃癌、头颈癌、食道癌、膀胱癌、直肠癌、骨癌、子宫癌、前列腺癌，以及血液系统恶性肿瘤。

于某些具体实施例中，该个体患有具有实体瘤的肿瘤疾病。实体瘤包括，但不限于，肉瘤、癌、淋巴瘤，以及其他实体瘤癌症，包括，但不限于，种系肿瘤、乳癌、膀胱癌、子宫颈癌、结肠癌、中枢神经系统、神经胶质瘤、肺癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、胰脏癌、胃癌，以及甲状腺癌。

于某些具体实施例中，本发明的方法包括在施用该发酵组合物之前及/或之后评估肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。例如，在该肿瘤中、该肿瘤的一或多个边缘及/或肿瘤附近的组织评估肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)(例如，存在、数量、活性)。

于某些具体实施例中，所选择的个体为已经历、正在经历或正计划进行抗癌疗法的个体，例如涉及免疫检查点调节剂的疗法。

于某些具体实施例中，本发明的方法包括在施用如本文所述的发酵组合物后给予有需要的个体一有效量的免疫检查点调节剂，其中该个体中的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)已经被活化。

如本文所用，“免疫检查点调节剂”是指相对于对照载剂改变在细胞中免疫检查点蛋白(例如，本文所述的任何一种)的活性的试剂。“调节剂”一词在本文中以最广泛的含义使用，并且包括部分或完全改变由一种或多种免疫检查点分子调节的讯息传递途径的任何分子，包括由本文所述分子调节的讯息传递途径。

用于本文的免疫检查点调节剂可为免疫检查点分子的调节剂(例如，抑制剂)，其可为PD1、CD28、CTLA-4、CD137、CD40、CD134、ICOS、KIR、LAG3、CD27、TIM-3、BTLA、GITR、TIGIT、CD96、CD226、KIR2DL、VISTA、HLLA2、TLIA、DNAM-1、CEACAM1、CD155、IDO(例如，IDO1)、TGF-β、IL-10、IL-2、IL-15、CSF-1、IL-6，以及腺苷A2A受体(adenosine A2A receptor，A2AR)，或其配体。于某些具体实施例中，该免疫检查点调节剂为对免疫检查点或其配体特异的抗体，例如，对PD1特异的抗体或其配体(PDL1或PDL2)。于某些实例中，该抗体可为人类抗体、人源化抗体，或嵌合抗体。

本发明还提供了一种套组或组合，包含如本文所述的发酵组合物，任选地与免疫检查点调节剂组合。这样的套组或组合可用于活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，也可有效地(i)改变肿瘤微环境以避免抑制抗肿瘤免疫，及/或(ii)改善化学疗法及/或癌症疗法的效果，及/或(iii)将冷肿瘤转化为热肿瘤，及/或(iv)提高反应率，及/或(v)减小肿瘤大小。较佳地，此类套组或组合协同地提供如本文所述的一种或多种效果。

于一具体实施例中，组合中使用的药物或治疗方法可同时(平行)或依序使用。当药物以组合形式使用时，该药物可以相同的配方混合或分别放入不同的配方中，例如分开的胶囊、丸剂、片剂，以及注射剂。

例如，一组合物的制备可通过将活性成分与一生理学上或医药上可接受的载剂一起配制以使该组合物处于适当形式以供递送。本发明的组合物特别包含约0.1重量％至约100重量％的活性成分，其中该重量百分比为基于整个组合物的重量计算出来的。于某些具体实施例中，本发明的组合物可配制为用于治疗的医药组合物或药物。于某些具体实施例中，本发明的组合物可配制为一食品或膳食补充剂。

如本文所用，“生理学上(或医药上)可接受的”是指该载剂与该组合物中的活性成分兼容，且较佳地以稳定该活性成分并对接受治疗的个体而言是安全的。该载剂可为活性成分的稀释剂、载剂、赋形剂或基质。该组合物可另外包含润滑剂；润湿剂；乳化剂与悬浮剂；防腐剂；甜味剂；以及调味剂。本发明的组合物可在对患者施用后提供该活性成分的快速、持续或延迟释放的效果。

根据本发明，该组合物的形式可为片剂、丸剂、粉剂、含片、药包、锭剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、软及硬明胶胶囊、栓剂、液体，以及包装粉末。

本发明的组合物可通过任何生理学上可接受的途径递送，特别是口服。在无菌条件下制备合适的肠胃外组合物可以本领域技术人员熟知的标准药理学技术完成。

本文使用的“有效量”一词是指在一受治疗的个体或细胞中赋予所需生物效应的活性成分的量。该有效量可根据各种原因而改变，例如给药途径及频率，接受该药物的个体的体重及物种，以及给药的目的。本领域技术人员可以基于本文的公开内容、已建立的方法，及其自身经验确定每种情况下的剂量。

本文所用的“治疗”一词是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施用于患有障碍、症状或病症，或障碍、症状或病症的恶化或倾向的个体，目的为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进或影响该障碍、症状或病症、由疾病引起的障碍、症状或病症，或该障碍、症状或病症的恶化或倾向。

通过本文所述的方法治疗的个体可为哺乳动物，尤其为人类。哺乳动物的实例可包括啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、花栗鼠、草原土拨鼠、松鼠、海狸、地鼠、仓鼠、田鼠、沙鼠、豪猪、天竺鼠等)、牲畜(例如，猪、牛、山羊、鹿、绵羊、牦牛等)、伴侣动物(例如，猫、狗等)，或灵长类动物(例如，狐猴、猴子、猿、人类等)。具体而言，需要本文所述治疗方法的个体可为患有、怀疑患有，或有风险患有目标疾病/障碍/病症者，例如人类，其确定具有相对降低的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)含量或患有癌症并预测对癌症免疫疗法反应差者。

根据本发明的方法，可通过适当的途径将组合物施用于一有需要的个体。于一示例性的具体实施例中，经由口服途径施用该组合物(例如，通过一固体例如，丸剂、片剂，或胶囊，或通过液体)。可将该组合物递送至个体体内的一或多个区域。该区域可包括，但不限于，胃肠道系统内的区域，例如口腔、胃、小肠、大肠，或结肠。给药途径的实例包括，但不限于，直肠给药(例如，通过栓剂、灌肠、上内窥镜检查、上推肠镜检查，或结肠镜检查)，或通过鼻腔或口腔插管(例如，通过鼻胃管、鼻肠管，或鼻空肠管)。

在特定的具体实施例中，通过肿瘤内途径施用本文所述的组合物。肿瘤内给药可通过将如本文所述的组合物注射到该肿瘤块中、肿瘤的紧邻区域，及/或肿瘤浸润性生长到健康组织中的区域来进行。当递送组合物中的活性成分并活化抗肿瘤免疫反应时，单次肿瘤内注射到该肿瘤块中通常是有效的。然而，必要时，还可以考虑多次注射到该肿瘤的不同区域或不同的时间过程。于某些具体实施例中，出乎意料地发现，相比于全身给药，例如经由口服途径，如本文所述的组合物的肿瘤内给药提供了改善的治疗效果，其中给药量减少且给药过程缩短。还发现到的是，如本文所述的肿瘤内施用组合物可有效治疗远处部位的肿瘤。

通过以下实施例进一步说明本发明，提供这些实施例是为了说明而非限制。根据本发明公开内容，本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可以对所公开的特定具体实施例进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例

实施例1：由共生微生物群产生的发酵产物

组合物X为通过在培养基中共生微生物群的发酵所产生的发酵组合物。简言之，在允许微生物发酵以产生合适代谢物的条件下，将包含乳酸杆菌及酵母菌的共生微生物群在含有碳源、氮源与微量元素以及含水大豆萃取物的发酵培养基中培养。发酵进行约24至72小时。收集发酵液，过滤除去固体物质并灭菌。将由此制备的液体溶液浓缩，得到组合物X(液体形式)。每毫克组合物X含有约2.7g大豆的发酵液。在单独的发酵中，包括乳酸杆菌、酵母菌，以及乳酸球菌的共生微生物群被用于产生额外的发酵产物，组合物LT12、LT17、LT21、LT23，以及LT27。

实施例2：鼠骨髓来源的树突细胞的活化

于第0天，将骨髓(bone marrow，BM)以2×10⁶个细胞/100mm培养盘的量接种在含有1％抗生素-抗真菌剂、10％FBS、20ng/ml rmGM-CSF的9ml RPMI-1640培养基中。于第3天，在培养盘中加入额外含有20ng/ml rmGM-CSF的9ml RPMI-1640培养基。于第8天，将BMDCs以2×10⁵个细胞/mL的密度接种，在含有0.1μg/mL脂多糖(LPS)或各种发酵产物(组合物X、LT12、LT17、LT21、LT23、LT27)的1000μL培养基中再悬浮24小时，于24孔盘上，在5％CO₂/95％空气的环境中。处理后，通过温和移液收集细胞，在室温下以250g离心5分钟。在含有0.5％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)中将细胞调整至1.5×10⁵个细胞/孔的浓度。将细胞悬浮液与抗体在4℃下培养30分钟。FITC-缀合的CD11c抗体、PE-缀合的CD83抗体，获自BDBiosciences公司。以FACSAria Fusion进行流式细胞仪分析。使用FlowJo v10软件分析流式细胞仪数据。

如图1所示，相比于对照组，以本发明的各种发酵产物处理后CD83表现量显著增加。这表示本发明的发酵组合物可有效刺激BMDC成熟。

实施例3：结肠癌小鼠模型与动物试验

于第0天，以2×10⁵个CT-26细胞皮下(subcutaneous，s.c.)植入到BALB/c小鼠。当肿瘤体积在第4天大约达到50mm³时，将小鼠随机分至治疗组或未治疗组(每组n＝3)。

3.1以组合物X处理

对于第2/3组，从第4天至第11天每天通过口服管饲法以15％组合物X(10mL/kg)处理小鼠。对于第1组，从第4天至第11天每天通过口服管饲法以ddH₂O(10mL/kg)处理小鼠。对于第3组，于第4天、第6天、第8天，以及第10天以腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)10mg/kg剂量的抗PD1抗体处理小鼠。每周二次测量肿瘤体积。并确定存活率。于第11天牺牲第1/2/3组小鼠并收集肿瘤。

3.2以组合物LT12处理

每天通过口服管饲法以15％组合物LT12(10mL/kg)处理小鼠直至第17天。每天通过口服管饲法以ddH₂O(灭菌，10mL/kg)处理小鼠直至第17天。于第6天、第8天、第10天、第12天、第14天，以及第16天以i.p.注射10mg/kg剂量的抗PD1抗体处理小鼠。每侧的肿瘤体积在第4、6、8、11、13、15以及18天测量。在第18天牺牲小鼠并收集肿瘤。图2所示为治疗方案。

3.3肿瘤的免疫组织化学分析

将肿瘤嵌入OCT化合物中并固定于液态氮内，并保持在-80℃。将肿瘤块切成5μm的大小并放置于载玻片上。将切片与冰冷的封闭溶液(含有5％山羊血清的PBS)作用30分钟，并与第一抗体(抗CD4抗体、抗CD8抗体，以及抗CD86抗体)于4℃下作用整夜，然后以PBS进行三次洗涤，最后与二抗山羊抗兔IgG H&L以及山羊抗大鼠IgG H&L作用1小时。以含有DAPI(Biotium公司)的EverBrite封固剂染色细胞核。

如图3所示，在第1组(载剂组)中，肿瘤浸润的CD4⁺/CD8⁺T细胞/CD86⁺树突细胞存在但失去活性(聚集在肿瘤外，未能迁移到肿瘤内)，而在第2组(组合物X组)以及第3组(组合物X与抗PD1抗体的组合)中，显著观察到迁移到肿瘤中的肿瘤浸润性CD4⁺/CD8⁺T细胞/CD86⁺树突细胞。

相似地，如图4所示，在载剂组中，肿瘤浸润的CD4⁺/CD8⁺T细胞存在但失去活性(聚集在肿瘤外，但不迁移到肿瘤中)；在单独的组合物LT12或单独的抗PD1抗体组中，迁移到肿瘤中的肿瘤浸润性CD4⁺/CD8⁺T细胞增加，具体而言是在组合物LT12与抗PD1抗体的组合中，显著观察到迁移到肿瘤中的肿瘤浸润的CD4⁺/CD8⁺T细胞。

3.3肿瘤CD8 T细胞的分析

萃取肿瘤并精细切碎。另外将肿瘤组织与温和的MACS解离剂(Miltenyi型号130-096-427)混合，并根据制造商的说明以针对小鼠的MACS Miltenyi肿瘤解离套组(MiltenyiBiotec型号130-096-730)消化。以RPMI培养基1640(Gibco型号11875-093)清洗解离的肿瘤细胞，并以RBC裂解液(Sigma型号R7757)裂解。在含有0.5％FBS的PBS中将细胞调整至4×10⁶个细胞/孔的浓度。将细胞悬浮液与抗体在4℃下作用30分钟。PE缀合的CD8α抗体(型号553033)获自BD Biosciences公司。以FACSAria Fusion(BD Biosciences公司)进行流式细胞仪分析。使用FlowJo v10软件(Tree Star公司，圣卡洛斯，加州)分析流式细胞仪数据。

如图5所示，在载剂组中，与肿瘤相关的CD8⁺T细胞的数量较少，而在单独组合物LT12以及单独使用抗PD1抗体的组别中，与肿瘤相关的CD8⁺T细胞数量较多，特别是在组合物LT12与抗PD1抗体的组合中，与肿瘤相关的CD8⁺T细胞的数量明显更高。

结果表示，本发明的发酵组合物可有效活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，促进肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)向肿瘤的迁移并增加肿瘤内CD8⁺T细胞的数量。

3.4肿瘤大小与存活率

如图6所示，相比于载剂组(8％)，单独的组合物X或单独的抗PD1抗体提高了动物存活率(25％或33.3％)；相比于载剂组、单独的组合物X，或单独的抗PD1抗体，组合物X与抗PD1抗体的组合显著改善动物存活率(75％)并减小肿瘤大小。相似地，图7所示为使用本发明的发酵组合物的癌症治疗的效果，该肿瘤大小减少作为单独使用组合物LT12或单独使用抗PD1抗体治疗肿瘤的结果，具体而言是肿瘤大小显著减少作为组合物LT12与抗PD1抗体的组合处理的结果。

实施例4：组合物X的肿瘤内施用

于第0天分别在BALB/c小鼠的右侧腹侧及左侧腹侧皮下注射(subcutaneous，s.c.)植入2×10⁵个CT-26细胞。当肿瘤体积在第5天大约达到50mm³时，将小鼠随机分至治疗组或未治疗组(每组n＝3)。于第5、7以及9天(三个剂量)通过肿瘤内注射以10％组合物X(10ml/kg)处理小鼠。通过肿瘤内注射以ddH₂O(灭菌，10mL/kg)处理小鼠作为空白对照组。于第6、8，及10天通过肿瘤内注射以4μg抗OX40抗体处理小鼠。每侧的肿瘤体积在第5、8、11、13、15、18，以及20天测量。于第25天牺牲小鼠。

如图8所示，在治疗侧，相比于载剂组，肿瘤体积显著减少，其为肿瘤内单独施用10％组合物X(通过仅以较低剂量三次注射来施用，相比于在实施例3中以较高剂量15％组合物X每日口服施用)或与抗OX40抗体组合的结果；且令人惊讶的是，在未处理的一侧也观察到了治疗效果。该结果显示，本发明的发酵组合物的肿瘤内给药，任选地与免疫检查点调节剂组合，提供了有利的治疗效果，包括每次注射较低的剂量、减少给药的次数，以及远处(未治疗)部位的成功肿瘤反应。

在该研究中，发现如本文所述的共生微生物群的发酵产物可有效活化肿瘤动物模型中的肿瘤浸润细胞，进而在减小肿瘤大小与提高存活率方面提供优异的治疗效果，尤其是与免疫检查点调节剂的组合。还发现到，通过肿瘤内施用如本文所述的共生微生物群产生的发酵产物提供了优异的治疗效果，其中施用量减少、施用过程缩短，甚至认为无反应的远程部位的肿瘤现在也可以成功地被治疗。

Claims (22)

1.一种在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes，TILs)的方法，包括对该个体施用发酵组合物的量，该发酵组合物是经由在培养基中共生微生物群发酵而产生的，其中该共生微生物群包括(i)至少二种或更多种乳酸菌菌株，或(ii)至少二种或更多种酵母菌株，或(iii)至少一种或更多种乳酸菌菌株与至少一种或更多种酵母菌株，该量有效于增加该个体中肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的产生或活性。

2.如权利要求1的方法，其中该培养基包括碳源、氮源，以及微量元素。

3.如权利要求1的方法，其中该发酵组合物包括经由该发酵产生的多种代谢物。

4.如权利要求1的方法，其中该发酵组合物是通过包括下列的方法所制备：

(i)在允许发酵产生多种代谢物的条件下培养在该培养基中的共生微生物群；以及

(ii)收集从步骤(i)获得的该发酵组合物。

5.如权利要求1的方法，其中该制备方法进一步包括对从步骤(ii)获得的该发酵组合物进行灭菌、过滤及/或浓缩。

6.如权利要求1的方法，其中该发酵组合物的量是有效于(i)改变肿瘤微环境以避免抑制抗肿瘤免疫，及/或(ii)改善化学疗法及/或癌症疗法的效果，及/或(iii)将冷肿瘤转化为热肿瘤，及/或(iv)提高反应率，及/或(v)减小肿瘤大小，及/或(vi)提高该个体的存活率。

7.如权利要求1的方法，其中该个体患有肿瘤疾病。

8.如权利要求1的方法，其中该个体患有癌症。

9.如权利要求1的方法，其中该个体患有细菌感染的肿瘤。

10.如权利要求8的方法，其中该癌症选自由下列所组成的群组：结肠癌、肺癌、乳癌、胰脏癌、皮肤癌、脑癌、卵巢癌、肾脏癌、胃癌、头颈癌、食道癌、膀胱癌、直肠癌、骨癌、子宫癌、前列腺癌，以及血液系统恶性肿瘤。

11.如权利要求1的方法，其中该个体已经历、正在经历或正计划进行针对肿瘤疾病的免疫疗法。

12.如权利要求1的方法，其中该方法包括在施用该发酵组合物之前选择有需要活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的个体。

13.如权利要求12的方法，其中该个体已经确定具有相较参考含量较低含量的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。

14.如权利要求1的方法，其中该肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)包括CD4+、CD8+，及/或CD86+树突细胞。

15.如权利要求1的方法，其中该肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)包括肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)、基质肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)或两者。

16.如权利要求1的方法，其中该组合物经由口服施用或注射施用方式给药。

17.如权利要求1的方法，其中该组合物经由肿瘤内施用方式给药。

18.一种如权利要求1至6中任一权利要求所定义的发酵组合物在制备用于在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的药物中的用途。

19.如权利要求18的用途，其中该药物有效于(i)改变肿瘤微环境以避免抑制抗肿瘤免疫，及/或(ii)改善化学疗法及/或癌症疗法的效果，及/或(iii)将冷肿瘤转化为热肿瘤，及/或(iv)提高反应率，及/或(v)减小肿瘤大小，及/或(vi)提高该受试者的存活率。

20.一种如权利要求1至6中任一权利要求所定义的发酵组合物用于在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的用途。

21.一种用于在有需要的个体中活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的套组或组合，包括一种如权利要求1至6中任一权利要求所定义的发酵组合物，任选地与免疫检查点调节剂组合。

22.一种如权利要求20的发酵组合物或一种如权利要求21的套组或组合，其可用于(i)改变肿瘤微环境以避免抑制抗肿瘤免疫，及/或(ii)改善化学疗法及/或癌症疗法的效果，及/或(iii)将冷肿瘤转化为热肿瘤，及/或(iv)提高反应率，及/或(v)减小肿瘤大小，及/或(vi)提高该个体的存活率。

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