CN110448681A

CN110448681A - 一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物

Info

Publication number: CN110448681A
Application number: CN201910790508.9A
Authority: CN
Inventors: 刘智; 杨祥良; 石林林; 盛剑勇
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Junwei'an (Wuhan) Life Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: CN110448681B

Abstract

本发明公开一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，联合药物包括含有白细胞介素2的制剂，以及含有肠道益生菌的制剂；药理研究证实，本发明的联合药物具有降低肿瘤负荷，控制肿瘤生长的作用，能促进肿瘤组织细胞毒性T细胞的浸润以及树突状细胞的成熟分化，改善肿瘤免疫微环境，很好地弥补了白细胞介素2单独作用于肿瘤免疫微环境的不足，可应用于多种恶性肿瘤的免疫治疗。

Description

一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物。

背景技术

恶性肿瘤已经逐渐成为人类健康的重大威胁之一。目前传统治疗方法主要包括手术切除、放疗、化疗、肿瘤靶向药物、过继免疫治疗、肿瘤疫苗等。而传统的肿瘤疗法已显示出“天花板效应”，随着肿瘤免疫学、细胞生物学和分子技术等研究不断深入，肿瘤免疫治疗成为了几年来的研究热点，开辟了肿瘤治疗的新方向。肿瘤免疫治疗是通过主动或被动方式使机体产生肿瘤特异性免疫应答，恢复或提高机体免疫系统活性，充分发挥其抑制和杀伤肿瘤细胞的治疗方法。肿瘤免疫治疗主要包括免疫检测点阻断、过继性细胞输注、肿瘤疫苗等。然而，目前肿瘤免疫治疗领域仍然存在不少的挑战，包括无法及时预测患者治疗效果和临床反应、难以确定临床显著的生物标志物、缺乏对免疫疗法产生耐药机制的研究以及经过优化以确定疗效的临床研究设计等多种因素。

人类肠道微生物的数量庞大、种类繁多，被称为人类的“第二基因组”，它不仅参与形成肠道局部免疫屏障，还可诱导T细胞和B细胞活化，在多个层次上促进先天免疫和适应性免疫应答。肠道微生物对免疫系统的影响并不局限于肠内，在肠外诸多自身免疫疾病和慢性免疫疾病的病理发展中也都起着重要作用。研究表明，肠道微生态组成差异决定了机体免疫差异，从而决定肿瘤免疫治疗效果的差异。靶向肠道菌群能够预测肿瘤免疫治疗的效果，通过补充特定的有益肠道菌群及促使肠道微生态多样化在一定程度上有助于获得更好的临床响应率。

中国专利文献201310302102.4公开了多株肠道益生菌与复合药食两用真菌发酵联合药物及制备和应用，提供了一种联合药物在制备治疗肿瘤的药物或者保健品中的应用。中国专利CN201480014872.1公开了益生生物和/或治疗剂的靶向胃肠道递送，两者均利用肠道益生菌作为载体，中药或中药成分作为活性物质，以达到治疗肿瘤或抗癌的目的，但是，中药的作用机理尚不明确，针对性不强，且肠道益生菌作为载体与中药组合后，其本身具备的功能可能会受到抑制。中国专利CN00819253.7公开了含白细胞介素-2的药物联合药物在制药中的应用，中国专利CN200410025249.4公开肿瘤坏死治疗单抗-白细胞介素2的融合蛋白及其制法和用途，两者单独使用白细胞介素2治疗或者与载体蛋白融合治疗，单独使用白细胞介素2作用于肿瘤免疫微环境存在不足之处，融合蛋白虽然能够提高疗效，但是成本较高，且较易出现不完整的目的蛋白，增加获取难度的同时，影响其蛋白本身功能的发挥。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，能够降低肿瘤负荷、抑制肿瘤生长，激活T细胞相关抗肿瘤免疫应答，可应用于多种恶性肿瘤的免疫治疗。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，所述联合药物包括：含有白细胞介素2的制剂，以及含有肠道益生菌的制剂。

白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)是最早发现的细胞因子之一，又称T细胞生长因子(T cell growth factor,TCGF)，对T细胞的增殖、发育和分化具有重要作用。此外，IL-2还是细胞毒性T淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)和B淋巴细胞重要的生长和激活因子。IL-2的靶细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞及单核－巨噬细胞等，这些细胞表面均可表达IL-2R(白细胞介素2受体)，以自分泌和旁分泌方式发挥效应。IL-2的主要生物学功能包括：活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞，增强其抗原递呈能力及细胞毒性作用。由于IL-2能诱导和增强细胞毒活性，目前应用IL-2治疗某些疾病、特别是对恶性肿瘤治疗的研究得到了广泛开展。利用IL-2基因修饰的肿瘤细胞说明包含IL-2的外分泌体可以诱导抗原特异性的Th1方向的免疫应答，并且使效应T细胞发挥更有效的抗肿瘤免疫应答，从而对肿瘤的生长产生显著的抑制作用。

肠道益生菌的制剂对生物组织和细胞结构及特征的损伤较小，可提高机体免疫力，可充分保持肠道益生菌本身的性状和活性，同时可以常温放置，便于患者服用，增加患者的依从性，将肠道益生菌的制剂与白细胞介素2的制剂联合用于肿瘤免疫治疗，一方面可以有效降低肿瘤负荷，控制肿瘤生长，同时促进肿瘤组织细胞毒性T细胞的浸润以及树突状细胞的成熟分化，改善肿瘤免疫微环境，另一方面也降低了白细胞介素2的制剂单独作用于肿瘤免疫微环境的不足。

优选的，所述白细胞介素2为重组人白细胞介素2。

优选的，所述肠道益生菌为阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌中的一种。

优选的，所述联合药物包括：含有白细胞介素2，以及含有阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila的制剂。

本发明还提供了所述联合药物在恶性肿瘤免疫治疗中的应用，所述恶性肿瘤为黑色素瘤、结直肠癌、肺癌或乳腺癌。

进一步的，所述含有白细胞介素2制剂的剂量范围为：50-200万IU，含有肠道益生菌制剂的剂量范围为：5mg-5g。

进一步的，所述含有白细胞介素2制剂的剂量为：100万IU，含有肠道益生菌制剂的剂量范围为：500mg。

上述肠道益生菌制剂的制备方法如下：液体培养至对数期的菌体，常温离心，弃上清，用等体积及二分之一体积的生理盐水洗涤两次，常温离心，弃上清；用适量体积冷冻保护剂重悬处理好的菌体，低温冷冻真空干燥后，收集冻干的菌粉，灌封肠溶胶囊。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、白细胞介素2和肠道益生菌联合用药具有降低肿瘤负荷，控制肿瘤生长的作用。

2、白细胞介素2和肠道益生菌结合能促进肿瘤组织细胞毒性T细胞的浸润以及树突状细胞的成熟分化，改善肿瘤免疫微环境，很好地弥补了白细胞介素2单独作用于肿瘤免疫微环境的不足。

附图说明

图1为具体实施例不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线的影响；

图2为具体实施例不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠体重变化的影响；

图3为具体实施例不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠血清相关肿瘤免疫因子的影响；

图4为具体实施例不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境效应T淋巴细胞的影响；

图5为具体实施例不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境调节性T淋巴细胞的影响；

图6为具体实施例不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境树突状细胞的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，所述联合药物包括：含有白细胞介素2的制剂，以及含有肠道益生菌的制剂，所述含有白细胞介素2制剂的剂量范围为：50-200万IU，含有肠道益生菌制剂的剂量范围为：5mg-5g。

以下实施例中，所述白细胞介素2为重组人白细胞介素2，(德路生，100万IU/瓶)。

所述肠道益生菌为阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌中的一种。

所述联合药物包括：含有白细胞介素2的制剂；以及含有阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila的制剂。

实施例中所述阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila(ATCC BAA-835)的制剂来源于实验室自己培养，并制备成活菌冻干粉，灌封肠溶胶囊。

实施例：不同组别用药的药理学试验

1.材料与方法

1.1活菌冻干粉的制备：

1)细菌复苏：将-80℃保存的菌种解冻，用接种环在液体培养基中接种。

2)细菌活化：待菌种活化后成功后，先进行平板划线，挑取肉眼可见的单菌落，进行扩大培养并培养至对数期。

3)细菌收集：液体培养至对数期的细菌，8000rpm常温离心5-10min，弃上清。

4)细菌洗涤：用等体积及二分之一体积的生理盐水分别洗涤一次，8000rpm常温离心5-10min，弃上清。

5)重悬装瓶：用适量体积(1：4)的冷冻保护剂重悬处理好的菌体，冷冻保护剂的配方为：称取脱脂奶粉100g，5g蔗糖，1g明胶溶于单蒸水中并定容至1000mL，115℃高温高压灭菌25min，室温保存。

6)分装标记：分装到干净的培养皿中，做好标记，转移至-80℃预冷12小时。

7)冷冻干燥：提前预热冻干机，将预冷的样品取出，取下皿盖，用保鲜膜封住培养皿，并预留小孔。冷冻真空干燥24小时后，收集冻干的菌粉常温保存。

8)冻干检测：取适量菌粉于无菌离心管中加入无菌蒸馏水，并梯度稀释，平板计数。计算冻干粉中活菌的数量，将冻干粉灌封肠溶胶囊。

1.2试验动物

动物：C57BL/6J小鼠，雌性，6～8周龄，18±2g。

1.3模型建立

取生长状态良好，对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞，用0.25％胰蛋白酶消化细胞使1成为单细胞，经PBS洗涤两次后，通过细胞记数法，用生理盐水调整细胞浓度为2×10⁶cell/ml，每只健康C57BL/6J雌性小鼠右侧腰背处皮下接种0.1ml(含2×10⁵个活细胞)，在饲养过程中，各组小鼠均同等饮食，动物房内保持相对湿度20～30％。

1.4分组及给药

对照组：生理盐水灌胃，每日一次，持续灌胃23天；

分组详情，表1：试验组及对照组的给药情况

本发明中白细胞介素2制剂均采用注射方式，阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌等制剂均采用灌胃形式。上述含有白细胞介素2的制剂以及含有阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌等制剂也可搭配药理学上可接受的盐或载体，其不影响本身药物的作用，其主要起到增强药物溶解性以及药物稳定性。

2.检测指标

2.1肿瘤体积生长曲线

当试验各组小鼠皮下瘤体积长至时80～100mm³时，各组小鼠开始给药。开始给药后，每隔2天测量肿瘤的长径和短径，同时按下面的公式计算肿瘤体积，并绘制肿瘤体积随时间变化的趋势图，即肿瘤体积生长曲线；瘤体积(mm³)＝(a×b²)/2，a为肿瘤最长径，b为肿瘤最短径。不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线的影响如图1所示，由图1可以看出，本发明中的药物均对肿瘤细胞具有抑制作用，且单组份用药时对肿瘤细胞体积的抑制效果要比双组份联合用药的抑制效果差，其中以D组(白细胞介素2用量100万IU+阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila用量500mg)的联合用药抑制效果最好。

2.2荷瘤小鼠的体重变化

开始给药后，每隔2天测量试验各组荷瘤小鼠的体重，绘制体重随时间变化曲线，评价给药后各组荷瘤小鼠的体重变化。不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠体重变化的影响如图2所示，由图2可知，本发明联合用药的情况下，小鼠体积下降的速率要明显低于单一组份用药，而H组联合用药虽然也有抑制肿瘤的作用，但是由于采用的是两种高剂量的药物，小鼠的体重下降的速率略快，综合而言，在D组剂量下的联合用药抑制肿瘤的效果最好。

2.3血清免疫因子

试验终点前，进行眼眶静脉丛取血，收集于离心管中，血液经4℃静置2小时后，3000rpm离心10分钟，吸取上清，分装，于-80℃冻存，准备后续分析；分别使用小鼠酶联免疫吸附测定试剂盒(Mouse IL-2Quantikine ELISA Kit，M2000，R&D Systems)测定试验各组小鼠血清中IL-2的含量，操作步骤按试剂盒操作说明。不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠血清相关肿瘤免疫因子的影响如图3所示，由图3可知，各组用药条件下，小鼠体内血清中IL-2的含量均有所提升，其中以D组血清中IL-2的含量提升最多，说明血清中IL-2的含量提升有助于小鼠肿瘤免疫治疗，随着含量升高，其治疗效果更好。

2.4流式分析

试验终点，剥离各组小鼠皮下肿瘤组织，剪碎后在含有I型胶原酶的RPMI 1640培养基中孵育90分钟，过200目尼龙网筛，制得单细胞悬液；1500rpm离心15分钟，弃上清，用PBS缓冲液(PH＝7.4)清洗2-3遍，1500rpm离心15分钟；得到淋巴细胞后，每管吸取100μL单细胞悬液，按照试剂盒(FITC anti-mouse CD3，APC anti-mouse CD8，PE anti-mouse IFN-γ，PC5.5anti-mouse CD4，APC anti-mouse CD25，APC anti-mouse CD11c，PE anti-mouseI-A/I-E,Biolegend)说明向各管中加入相应抗体，4℃避光孵育30分钟；结束后，每管加入1mL PBS重悬，1500rpm离心5分钟之后，加入300μL PBS重悬，用流式细胞仪进行检测。不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境效应T淋巴细胞的影响如图4所示，不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境调节性T淋巴细胞的影响如图5所示，不同组别联合药物对B16F10荷瘤小鼠肿瘤微环境树突状细胞的影响如图6所示，由图4、图5、图6的结果可知晓，各组用药对于小鼠的肿瘤微环境效应T淋巴细胞以及调节性T淋巴细胞均有促进作用，而且在双组份联合用药的情况下促进效果要明显优于单一组份用药。

3.结果

3.1肿瘤体积生长情况对比

试验23天时，对不同组别的肿瘤体积生长情况进行对比，如表2所示。

表2不同组别肿瘤体积生长情况对比

试验组	肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)
		A	2116.04±199.69
B	1859.87±147.03
		C	1352.92±161.52
D	702.92±129.69
		E	1197.43±186.92
F	1029.87±147.03
		G	984.51±146.93
H	825.37±134.56

由上表2的试验结果可知晓，在D组用药条件下，对小鼠肿瘤体积生长的抑制最为明显，即白细胞介素2(100万IU)+阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila(500mg)的用药情况下，对于小鼠肿瘤体积生长的抑制效果最好。

4.结论

本发明结合白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)和肠道益生菌(阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila等)的制剂联合治疗，具有降低肿瘤负荷，控制肿瘤生长的作用，能促进肿瘤组织细胞毒性T细胞的浸润以及树突状细胞的成熟分化，改善肿瘤免疫微环境，很好地弥补了白细胞介素2单独作用于肿瘤免疫微环境的不足。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，其特征在于，所述联合药物包括：含有白细胞介素2制剂，以及含有肠道益生菌的制剂。

2.如权利要求1所述的一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，其特征在于，所述白细胞介素2制剂为重组人白细胞介素2。

3.如权利要求1所述的一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，其特征在于，所述肠道益生菌为阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌中的一种。

4.如权利要求1所述的一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，其特征在于，所述联合药物包括：含有重组人白细胞介素2的制剂，以及含有阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila的制剂。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，其特征在于，所述恶性肿瘤为黑色素瘤、结直肠癌、肺癌或乳腺癌。

6.如权利要求1所述的一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，其特征在于，所述含有白细胞介素2制剂的剂量范围为：50-200万IU，含有肠道益生菌制剂的剂量范围为：5mg-5g。

7.如权利要求6所述的一种用于恶性肿瘤免疫治疗的联合药物，其特征在于，所述含有白细胞介素2制剂的剂量为：100万IU，含有肠道益生菌制剂的剂量范围为：500mg。