CN115087727A - 用于癌症治疗的专性厌氧人肠道微生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型阿克曼氏菌种菌株及其用途。本发明提供的新型阿克曼氏菌种HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)缺乏毒性基因，因此在体内不会引起副作用，并且还具有优异的抗癌活性。因此，它可广泛用于开发用于预防或治疗癌症的药剂。

Description

用于癌症治疗的专性厌氧人肠道微生物及其用途
技术领域
本公开涉及属于疣微菌科的阿克曼氏菌属的新型阿克曼氏菌HB03菌株，其是专性厌氧人肠道微生物。
背景技术
阿克曼氏菌种菌株是革兰氏阴性、专性厌氧、人肠道黏蛋白降解细菌。已知阿克曼氏菌种菌株是不运动的、不形成孢子的(Yuji Naito等人，A next-generation beneficialmicrobe：Akkermansia muciniphila，J Clin Biochem Nutr.2018 Jul；63(1)：33-35.)和椭圆形。它可以使用黏蛋白作为唯一的碳源和氮源，并且可以在含有肠黏蛋白的培养基中在严格的厌氧条件下培养。此外，它可以在各种动物物种的胃肠道中增殖(定殖)。
众所周知，肠道微生物在针对各种类型肿瘤的免疫反应的调节中发挥着重要作用，并在肿瘤生态系统中具有抑制肿瘤细胞和增强免疫力的潜力。因此，它们可用于治疗肿瘤。
癌症是全球成年人死亡的主要原因之一。尽管随着外科技术的发展和抗癌放射疗法的引入，治疗性能有所提高，但大约一半的确诊患者仍死于癌症。因此，癌症在许多国家被认为是主要问题之一。因此，迫切需要开发治疗和预防癌症的方法。
公开
技术问题
本公开的发明人一直致力于发现属于阿克曼氏菌属的新型菌株。结果，他们在阿克曼氏菌属中发现了新型菌株，该菌株与先前已知的嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株不同，并通过鉴定该菌株与嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株相比表现出优异的抗癌活性来完成本公开。
技术方案
本公开涉及提供以保藏号KCCM12318P保藏的新型阿克曼氏菌HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)。
本公开还涉及提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其含有选自新型阿克曼氏菌HB03菌株、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组及其代谢组中的一种或多于一种。
本公开还涉及提供一种用于预防或治疗癌症的方法，其包括将所述药物组合物施用于个体的步骤。
本公开还涉及提供一种用于预防或缓解癌症的食品组合物，其含有选自新型阿克曼氏菌HB03菌株、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组及其代谢组中的一种或多于一种。
有利效果
本公开提供的新型阿克曼氏菌HB03菌株没有毒性基因，因此在体内不会引起副作用。并且，含有该菌株或囊泡、代谢组或源自该菌株的灭活菌株的组合物在与另一种抗癌剂，特别是免疫检查点抑制剂共同施用时表现出优异的抑制肿瘤生长的效果并且表现出显著优异的抗癌效果。此外，来自该菌株的蛋白质作为代谢组还表现出有效抑制癌细胞生长以及抑制肿瘤形成和进展的效果。因此，该菌株可广泛用于预防或治疗癌症的药剂的开发。
附图说明
图1示出了从NCBI搜索总共66个阿克曼氏菌种的基因组碱基序列以及使用dRep基于MASH基因组碱基序列的平均核苷酸同一性进行聚类的结果。
图2示出了绘制阿克曼氏菌菌株的近似极大似然树的结果。
图3示出了从基因存在/缺失图中提取120个菌株特异性基因的结果。
图4a和图4b示出了通过使用LS-BSR(大规模BLAS比对得分比率)计算BLAST比对得分比率(BSR)来检查基因存在的结果。
图5示出了鉴定HB03菌株中致病岛(PAI)的存在的结果。
图6示出了HB03菌株和嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835菌株在以7000rpm离心菌株培养物后的沉降程度的研究结果。虽然HB03菌株与上清液完全分离，但嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株并未分离。
图7示出了用HB03和HB03(P)对荷瘤小鼠进行后处理(肿瘤接种后施用)并分析与对照组的肿瘤生长差异的结果。(A)在用CT26结直肠癌细胞接种BALB/c，然后从第6天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。(B)在用LLC肺癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠，然后从第6天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。(C)在用B16F10黑色素瘤细胞接种C57BL/6 JAX小鼠，然后从第6天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。(D)在用Panc02胰腺癌细胞接种C57BL/6JAX小鼠，然后从第6天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。(E)在用GL261胶质瘤细胞接种C57BL/6 JAX小鼠，然后从第6天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。(F)在用MCA205肉瘤细胞接种C57BL/6 JAX小鼠，然后从第6天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。
图8示出了用HB03、嗜黏蛋白阿克曼氏菌或长双歧杆菌对荷瘤小鼠进行后处理(肿瘤接种后施用)并分析与对照组的肿瘤生长差异的结果。(A)在用CT26结直肠癌细胞接种BALB/c小鼠，然后从第5天至第16天每天用HB03、嗜黏蛋白阿克曼氏菌或长双歧杆菌处理后，观察的肿瘤生长动力学。(B)在用LLC肺癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠，然后从第5天至第16天每天用HB03、嗜黏蛋白阿克曼氏菌或长双歧杆菌处理后，观察的肿瘤生长动力学。(C)在用B16F10黑色素瘤细胞接种C57BL/6 JAX小鼠，然后从第5天至第14天每天用HB03、嗜黏蛋白阿克曼氏菌或长双歧杆菌处理后，观察的肿瘤生长动力学。
图9示出了用HB03和HB03(P)对荷瘤小鼠进行预处理(肿瘤接种前施用)并分析与对照组的肿瘤生长差异的结果。(A)在用CT26结直肠癌细胞接种BALB/c小鼠之前，从第7天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。(B)在用LLC肺癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠之前，从第7天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。(C)在用B16F10黑色素瘤细胞接种C57BL/6 JAX小鼠之前，从第7天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。(D)在用Panc02胰腺癌细胞接种C57BL/6JAX小鼠之前，从第7天至第18天每天用HB03和HB03(P)处理后，观察的肿瘤生长动力学。
图10示出了用HB03或嗜黏蛋白阿克曼氏菌(AKK P2261)对荷瘤小鼠进行后处理(肿瘤接种后施用)并分析与对照组的肿瘤生长差异的结果。在用MC38大肠癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠，然后从第5天至第14天每天用HB03或嗜黏蛋白阿克曼氏菌(AKK P2261)处理后，观察的肿瘤生长动力学。
图11示出了单独或组合用免疫检查点抑制剂(aPD-1 mAb)和HB03处理荷瘤小鼠并分析肿瘤生长差异的结果。(A)用CT26结直肠癌细胞接种BALB/c小鼠并以2天的间隔施用mIgG或aPD-1 mAb 5次直至第16天，同时从第5天开始每天施用对照物质或HB03之后，观察的肿瘤生长动力学。(B)用LLC肺癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠并以2天的间隔施用mIgG或aPD-1 mAb 5次直至第16天，同时从第5天开始每天施用对照物质或HB03之后，观察的肿瘤生长动力学。(C)用B16F10黑色素瘤细胞接种C57BL/6 JAX小鼠并以2天的间隔施用mIgG或aPD-1 mAb 5次直至第15天，同时从第5天开始每天施用对照物质或HB03之后，观察的肿瘤生长动力学。(D)用GL261胶质瘤细胞接种C57BL/6 JAX小鼠并以2天的间隔施用mIgG或aPD-1 mAb 5次直至第15天，同时从第5天开始每天施用对照物质或HB03之后，观察的肿瘤生长动力学。
图12示出了单独或组合用免疫检查点抑制剂(aCTLA-4 mAb)和HB03处理荷瘤小鼠并分析肿瘤生长差异的结果。(A)用MCA205肉瘤细胞接种C57BL/6 JAX小鼠并以2天的间隔施用mIgG或aCTLA-4 mAb 5次直至第15天，同时从第5天开始每天施用对照物质或HB03之后，观察到肿瘤生长动力学。(B)用MC38结直肠癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠并以2天的间隔施用mIgG或aCTLA-4 mAb 5次直至第15天，同时从第5天开始每天施用对照物质或HB03之后，观察的肿瘤生长动力学。
图13示出了单独或组合用免疫检查点抑制剂(aPD-L1 mAb)和HB03处理荷瘤小鼠并分析肿瘤生长差异的结果。用MC38结直肠癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠并以2天的间隔施用mIgG或aPD-L1 mAb 5次直至第15天，同时从第5天开始每天施用对照物质或HB03之后，观察的肿瘤生长动力学。
图14示出了单独或组合用免疫检查点抑制剂(aPD-1 mAb)、HB03和长双歧杆菌处理由于抗生素施用而对免疫检查点抑制剂(aPD-1 mAb)具有耐药性的小鼠并分析了肿瘤生长差异的结果。(A)从给BALB/c小鼠接种CT26结直肠癌细胞前2周开始，给小鼠喂食抗生素和水。从接种后第3天开始仅给予水，48小时后(从接种后第5天开始)，以2天的间隔施用mIgG或aPD-1 mAb 5次直至第16天，同时每隔2天施用对照物质或HB03。然后，观察的肿瘤生长动力学。(B)从给C57BL/6 JAX小鼠接种B16F10黑色素瘤细胞前2周开始，给小鼠喂食抗生素和水。从接种后第3天开始仅给予水，48小时后(从接种后第5天开始)，以2天的间隔施用mIgG或aPD-1 mAb 5次直至第16天，同时每隔2天施用对照物质或HB03。然后，观察的肿瘤生长动力学。
图15示出了单独或组合用免疫检查点抑制剂(aCTLA-4 mAb)和HB03处理由于抗生素施用而对免疫检查点抑制剂(aCTLA-4 mAb)具有耐药性的小鼠并分析了肿瘤生长差异的结果。从给C57BL/6 JAX小鼠接种MC38结直肠癌细胞前2周开始，给小鼠喂食抗生素和水。从接种后第3天开始仅给予水，48小时后(从接种后第5天开始)，以2天的间隔施用mIgG或aCTLA-4 mAb 5次直至第16天，同时每隔2天施用对照物质或HB03。然后，观察的肿瘤生长动力学。
图16示出了单独或组合用抗癌剂(5-FU(5-氟尿嘧啶)或奥沙利铂)和HB03处理荷瘤小鼠并分析肿瘤生长差异的结果。用MC38结直肠癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠然后以2天的间隔施用PBS、5-FU或奥沙利铂5次直至第16天，同时从第5天开始每天施用对照物质或HB03之后，观察的肿瘤生长动力学。
图17示出了pET-30a载体。
图18示出了用HB03分泌的蛋白质处理肿瘤细胞并分析肿瘤生长和细胞凋亡的结果。在用不同浓度的衍生自HB03的蛋白质HB03-01，处理CT26结直肠癌细胞(A)和LLC肺癌细胞(B)48小时后，分析了细胞存活率。(C)用衍生自HB03的蛋白质HB03-01或HB03-03处理LLC肺癌细胞24小时后，研究是否基于调节细胞凋亡的蛋白质半胱天冬酶-3的激活诱导了细胞凋亡。
图19示出了用HB03分泌的蛋白质处理荷瘤小鼠并分析与对照组的肿瘤生长差异的结果。(A)用MC38结直肠癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠然后从第5天开始以2天的间隔施用对照物质或HB03-01(AT1)5次直至第16天，之后，观察的肿瘤生长动力学。(A)用MC38结直肠癌细胞接种C57BL/6 JAX小鼠然后从第5天开始以2天的间隔施用对照物质或HB03-03(AT3)5次直至第16天，之后，观察的肿瘤生长动力学。
最佳实施模式
在下文中，对本公开进行具体地描述。本公开中公开的说明和示例性实施方案也可以应用于其他说明和示例性实施方案。也就是说，本公开所公开的各种要素的所有组合都包含在本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下说明的限制。
在一方面，本公开提供了保藏号为KCCM12318P的新型阿克曼氏菌HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)。
在本公开中，术语“阿克曼氏菌菌株”是指一类降解人或动物肠道黏蛋白的细菌，其为革兰氏阴性且专性(严格)厌氧。阿克曼氏菌菌株可以使用黏蛋白作为唯一的碳源和氮源，并且可以在含有肠黏蛋白的培养基中在严格的厌氧条件下培养。此外，它可以在各种动物物种的胃肠道中增殖(定殖)。
本公开的发明人已经从健康韩国人的粪便样品中分离出新型阿克曼氏菌菌株(阿克曼氏菌种)，它是降解肠道黏蛋白的细菌，并被命名为阿克曼氏菌HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)。在本公开的一个实例中，为了研究分离的阿克曼氏菌菌株是否为新型菌株，将所分离菌株的基因组与先前已知的阿克曼氏菌菌株的基因组进行比较。具体地，基于MASH基因组碱基序列的平均核苷酸同一性，检索了总共66个阿克曼氏菌菌株(阿克曼氏菌种)的基因组碱基序列并进行了聚类(图1)(Matthew R Olm等人.dRep：a tool for fast andaccurate genome comparisons that enables improved genome recovery frommetagenomes through de-replication.ISME J.2017 Dec；11(12)：2864-2868.)。仅对属于单个物种聚类簇(聚类簇3)的44个菌株进行了后续分析。使用了高速独立的泛基因组管线Roary，该泛基因组管线采用Prokka制备的用GFF3格式注释的组装(Seemann T.Prokka：rapid prokaryotic genome annotation.Bioinformatics.2014 Jul 15；30(14)：2068-9.)并计算泛基因组。然后，使用FastTree2构建了近似极大似然树(Price MN，Dehal PS，Arkin AP.FastTree 2--approximately maximum-likelihood trees for largealignments.PLoS One.2010 Mar 10；5(3)：e9490.)图2)。从基因存在/缺失图(图3)中提取了120个菌株特异性基因，将该基因特异的菌株命名为“阿克曼氏菌HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)”。通过研究在HB03菌株的全基因组基因中是否存在表现致病性(毒性)所必需的基因群致病岛(PAI)，证实HB03菌株不存在致病岛(图5)。“阿克曼氏菌HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)”于2018年9月11日保藏在韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM12318P。
本公开的发明人提供的新型阿克曼氏菌菌株尚未作为普通菌株或专利菌株被报道或在微生物资源的保存和分配机构中保藏。它是首次从健康的韩国人的粪便中分离出来的，并由本公开的发明人作为专利菌株保藏。
已证实，与嗜黏蛋白阿克曼氏菌相比，新型阿克曼氏菌HB03菌株在本公开的改良BTTM培养基中表现出2倍或高于2倍的细胞产量(表1)。
特别是，嗜黏蛋白阿克曼氏菌存在离心和大规模生产困难的问题，因为它倾向于悬浮而不是沉淀，而HB03菌株由于易于离心而比其模式菌株更容易进行大规模生产和基因组编辑(图6)。此外，HB03菌株缺乏致病(毒性)基因，因此不会在体内引起副作用。此外，已证实，在无黏蛋白的培养基中的生长时，嗜黏蛋白阿克曼氏菌需要黏蛋白的降解产物L-苏氨酸，而HB03菌株可以在缺乏L-苏氨酸的培养基中生长至1.32x109个细胞/mL的浓度(表2)。
这表明与嗜黏蛋白阿克曼氏菌型菌株不同，HB03菌株可以通过使用黏蛋白或L-苏氨酸以外的各种碳源和氮源进行生长。
由于新型阿克曼氏菌HB03菌株表现出优异的抗癌活性，因此该新型阿克曼氏菌菌株、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组、其代谢组等可以用作用于预防或治疗癌症的活性成分。这将在后面详细描述。
例如，本公开的微生物可以是已经“基本上纯化”的微生物。表述“基本上纯化”是指已经从样品中基本上浓缩的菌株或菌株混合物。样品中的本公开的微生物可以通过浓缩至50％、60％、70％、80％、90％、95％或高于95％被基本上纯化。此外，样品可包含50％、40％、20％、15％、1％或少于1％的缺乏本公开的微生物的效果或具有不希望的效果的微生物，但不限于此。
例如，本公开的组合物中包含的微生物可以通过包衣被包覆以用于口服施用。包衣可以是防止微生物在肠道中降解的包衣，但不限于此。
例如，本公开的微生物或其培养物、囊泡、蛋白质组或代谢组可以是已分离的微生物。术语“分离的”是指存在于非自然发生的环境中的或未自然存在的物质。它包括与自然相关和在自然界中发现的物质的基本分离。所分离的物质可以是例如一种物质，其中一种或多于一种以自然状态相关的物质已被除去，其形式被改变或其量被改变，但不限于此。
另一方面，本公开提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含一种或多于一种选自新型阿克曼氏菌HB03菌株、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组及其代谢组中的一种或多于一种。
本文使用的术语与上述相同。
在本公开中，术语“癌症”包括实体癌和血癌，但不限于此。癌症包括各种类型的癌症，例如头、颈、眼、口、喉、食道、胸、骨、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、乳房、卵巢、肾、膀胱、肝、胰腺或脑的癌症，但不限于此。除非另有说明，否则癌症可包括原发性癌症和转移性癌症。癌症可以包括例如肺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、脑癌、乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、皮肤癌、前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、纤维肉瘤或宫颈癌。
为了本公开的目的，癌症可以包括对抗癌剂表现出耐药性的癌症，但不限于此。
抗癌剂可包括化学抗癌剂、靶向抗癌剂或免疫检查点抑制剂，但不限于此。
在本公开中，术语“化学抗癌剂”是指开发用于抑制癌细胞增殖的治疗剂。作用机制因抗癌剂而异，例如抑制DNA合成等，被用作抗癌剂反应良好的癌症的主要治疗工具，例如急性白血病、淋巴瘤、睾丸癌等。化学抗癌剂也称为细胞毒类抗癌剂。化学抗癌剂的实例包括吉西他滨、阿糖胞苷、卡铂(Paraplatin)、顺铂(Platinol，Platinol-AQ)、克唑替尼(赛可瑞)、环磷酰胺(Cytoxan、Neosar)、多西他赛(泰索帝)、多柔比星(阿霉素)、厄洛替尼(特罗凯)、依托泊苷(Vepesid)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康(开普拓)、脂质体包覆的多柔比星(Doxil)、甲氨蝶呤(Forlex、Mexate、氨甲蝶呤)、紫杉醇(Taxol、Abraxane)、拓扑替康(和美新)、曲贝替定(Yondelis)、长春新碱(Oncovin、VincasarPFS)、长春碱(Velban)等。
在本公开中，术语“靶向抗癌剂”是指仅通过识别癌细胞所具有的特定标志物来攻击癌细胞且不伤害正常细胞的抗癌剂。它对癌细胞的杀伤能力高出数倍。靶向抗癌剂的实例包括甲磺酸伊马替尼(格列卫)、西妥昔单抗(爱必妥)、吉非替尼(易瑞沙)、奥莫替尼(Olita)、奥希替尼(泰瑞沙)、贝伐单抗(阿瓦斯汀)、索拉非尼(多吉美)、奥沙利铂(乐沙定)、舒尼替尼(索坦)等。
在本公开中，术语“免疫检查点抑制剂”是指继第一代手术、化疗(化学抗癌剂)、放疗抗癌药和靶向治疗(第二代抗癌药或靶向抗癌药)之后，作为第三代抗癌剂出现的抗体治疗剂。它的优点在于通过激活免疫细胞的免疫功能而表现出强大的抗癌效果且适用于各种适应症。此外，它几乎没有副作用，因为它只在给定的时间段内发挥作用，以防止由于过度的免疫活动而对正常细胞造成损害。免疫检查点抑制剂的实例包括PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)、CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)、PD-L1(程序性死亡配体1)、PD-L2(程序性死亡配体2)、A2AR(腺苷A2A受体)、B7-J3(B7家族分子)、B7-H4(B7家族分子)、BTLA(B和T淋巴细胞衰减剂)、Kirs(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞激活基因3)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和含黏蛋白结构域蛋白-3)、HAVCR2(甲型肝炎病毒细胞受体2)、VISTA(T细胞激活的V结构域Ig抑制因子)等。
抑制剂可以是靶向上述物质的单克隆抗体(mAb)，例如针对PD-1的抗体(αPD-1mAb)、针对CTLA-4的抗体(αCTLA-4 mAb)或针对PD-L1的抗体(αPD-L1 mAb)，但不限于此。
在本公开中，术语“预防”是指通过施用根据本公开的药物组合物来抑制或延缓疾病发作的任意作用，并且术语“治疗”是指通过施用药物组合物来改善或有利地改变疾病症状的任意作用。
“预防或治疗癌症”可以指“抗癌”效果。
在本公开中，术语“抗癌”包括癌症的预防、治疗、症状的改善和缓解。
在本公开中，术语“抗肿瘤”是指减小或消除由实体癌产生的恶性肿瘤。
在本公开中，术语“灭活菌株”是指已被非功能化或被杀伤的菌株。用于非功能化或被杀伤的菌株的方法包括热灭活、pH灭活、化学灭活等。灭活菌株可以包括来自非功能化或被杀伤的菌株的细胞裂解物或细胞外产物。
在本公开中，灭活可以是通过加热进行的热灭活，但不限于此。
在本公开中，术语“培养物”可以包括通过培养菌株获得的培养物本身，或通过从培养物中除去菌株获得的上清液的浓缩物或冻干产物。
在本公开中，培养物是指通过培养新型阿克曼氏菌HB03菌株获得的产物。广义上，培养物可以是阿克曼氏菌菌株的全部培养物、培养物的上清液、培养物的裂解物、其级分等。上清液可以是通过对菌株的培养物进行离心获得的，裂解液可以是通过物理处理或超声菌株获得的，级分可以是通过对培养物、上清液、裂解液等进行离心、层析等获得的。
在本公开中，术语“培养”是指在人为控制的适当条件下使微生物生长的一系列动作。
在本公开中，培养可以理解为是指培养本公开提供的阿克曼氏菌菌株的方法。可以使用本领域广为人知的方法进行培养。具体地，可以通过分批、分批补料或重复分批补料过程连续进行培养。
阿克曼氏菌菌株应在温度、pH等满足特定菌株要求的厌氧条件下，在含有黏蛋白、合适的碳源和氮源、氨基酸、维生素等的培养基中培养。作为碳源，可以使用黏蛋白或与N-乙酰葡糖胺、葡萄糖和木糖的混合物。此外，可以使用糖或碳水化合物如半乳糖胺、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油或脂肪如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油等，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸，醇如甘油、乙醇，有机酸如醋酸。这些物质可以单独使用或混合使用。作为氮源，可以使用无机氮源如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；或有机氮源如氨基酸例如谷氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺、大豆蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其降解产物、脱脂豆饼或其降解产物等。这些氮源可以单独使用或组合使用。培养基可以含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其含钠盐作为磷源。磷源包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其含钠盐。另外，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等无机化合物。最后，可以使用生长必需的物质，例如氨基酸和维生素。另外，为了防止起泡，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂。
在本公开的一个实例中，本公开的阿克曼氏菌HB03菌株和嗜黏蛋白阿克曼氏菌型菌株(ATCC BAA-835)使用温度保持在37℃的改良BTTM培养基进行培养，但不限于此。
在本公开中，术语“囊泡”是指存在于细胞中的结构，其呈相对较小的袋状并且包裹和运输化学物质。
在本公开中，术语“蛋白质组”是指由各种生物实体如特定细胞、组织、生物体等表达的全部蛋白质。
在本公开中，蛋白质组可以是源自例如HB03-01、HB03-02或HB03-03的新型阿克曼氏菌菌株的蛋白质，但不限于此。
在本公开中，术语“代谢组”是指存在于诸如细胞、组织、体液等生物样品中的全部代谢物的集合。通常由大小为1500道尔顿或小于1500道尔顿的物质组成，并且分为内源性代谢组(氨基酸、核酸、脂肪酸、糖类、胺类、糖脂、短肽、维生素、激素等)和外源性代谢组(如药物、食品、添加剂、有毒物质等)。通常，由DNA、RNA或蛋白质降解产生的靶物质也被归类为代谢组。由于代谢组每秒钟都在快速动态地变化，因此与基因组或蛋白质组相比，它立即反映了由于药物反应或食物摄入引起的表型变化(韩国生物化学和分子生物学学会)。
HB03-01可以由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成，HB03-03可以由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成。
尽管HB03-01或HB03-03蛋白在本公开中被定义为由SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成，但不排除通过在SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列之前或之后添加无关紧要的序列而可能发生的突变或其天然发生的突变或沉默突变。此外，对于本领域技术人员显而易见的是，具有与包括SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽相同或相当的活性的蛋白质对应于本公开的蛋白质。作为具体实例，本公开的蛋白质可以是由与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％的同源性或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。此外，显而易见的是，由具有这种同源性或同一性的氨基酸序列组成并表现出与蛋白质相当的效率的多肽，其中一些序列已被缺失、修饰、置换或添加，也包括在本公开的蛋白质的范围内。
也就是说，显而易见的是，即使在本公开中描述了“由具有特定序列号的氨基酸序列组成的多肽”，如果多肽具有相同或相当的活性，则可以使用该多肽，所述多肽的氨基酸序列组成为表现出与由具有特定序列号的氨基酸序列组成的其中序列的一些被缺失、修饰、置换或添加的多肽具有相当的效率。例如，“由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽”可以包括与“由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽”具有相同或相当活性的多肽。
多肽可以与另一个序列或接头缀合，用于多肽的鉴定、纯化或合成。
药物组合物可以包含来自新型阿克曼氏菌HB03菌株、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组及其代谢组的提取物、级分、悬浮液等，但不限于此。
在本公开中，术语“提取物”包括通过提取本公开提供的新型阿克曼氏菌菌株获得的提取物、提取物的稀释液或浓缩物、通过将提取物干燥获得的干燥物、提取物的粗提纯品或提纯品、其混合物等。用于获得该提取物的提取方法没有特别限制，可以使用本领域常用的方法。提取方法的非限制性实例包括热水提取、超声提取、过滤、回流提取等，并且它们可以单独进行或组合进行。用于获得提取物的提取溶剂没有特别限制，可以使用本领域已知的任意溶剂。提取溶剂的非限制性实例包括水、醇或其混合溶剂，并且它们可以单独使用或组合使用。
在本公开中，术语“级分”是指通过分级以从包含各种组分的混合物中分离特定组分或特定组分的组而获得的产物。用于得到级分的方法没有特别限制，可以使用本领域常用的方法。用于获得级分的分级溶剂没有特别限制，可以使用本领域已知的任意溶剂。分级溶剂的非限制性实例包括极性溶剂如水、醇等和非极性溶剂如己烷、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等。它们可以单独使用或组合使用。
在本公开中，术语“悬浮液”是指其中细固体颗粒均匀分散在液体中而不溶解的混合物。
在本公开中，悬浮液可以是其中指定数量的冻干菌株分散在水、PBS(磷酸盐缓冲盐水)或培养基(液体肉汤)中的悬浮液。术语“悬浮液”可以与“菌株组合物”互换使用。
在本公开中，根据本公开的药物组合物可以与抗癌剂共同施用。
在本公开中，术语“共同施用”是指将本公开的药物组合物与用于治疗癌症的抗癌剂一起以一定时间间隔同时或独立或非独立(混合)施用，用于预防、治疗或缓解或减轻癌症的症状。与单独施用本公开的药物组合物或抗癌剂相比，通过共同施用可以获得更高的抗癌活性。此外，与单独施用抗癌剂相比，对于表现出抗癌剂耐药性的癌症可以获得更高的抗癌活性。
抗癌剂可以是例如化学抗癌剂、靶向抗癌剂或免疫检查点抑制剂，但不限于此。化学抗癌剂、靶向抗癌剂或免疫检查点抑制剂与上述相同。然而，可以使用任意先前已知的抗癌剂而不限于此。
在本公开的一个实例中，与仅用免疫检查点抑制剂治疗时相比，将免疫检查点抑制剂(αPD-1 mAb、αCTLA-4 mAb或αPD-L1 mAb)和HB03共同施用于结直肠癌(CT26、MC38)、肺癌(LLC)、黑色素瘤(B16F10)、神经胶质瘤(GL261)和肉瘤(MCA205)使抗肿瘤效果显著增加(图11至图13)。
此外，在本公开的另一个实例中，与单独施用抗癌剂相比，将抗癌剂(5-FU(5-氟尿嘧啶)、奥沙利铂)和HB03共同施用于结直肠癌(MC38)动物模型使抗肿瘤效果显著增强(图16)。
这些结果表明，本公开的新型阿克曼氏菌菌株以其抗癌活性有效抑制肿瘤发生，同时减少抗癌剂的施用剂量。
在本公开中，根据本公开的药物组合物可以共同施用于对抗癌剂表现出耐药性的个体。
抗癌剂可包括免疫检查点抑制剂、化学抗癌剂或靶向抗癌剂，但不限于此。
免疫检查点抑制剂与上述相同。70％或多于70％的癌症患者对免疫检查点抑制剂没有反应或诱导产生了耐药性。
在本公开的一个实例中，当免疫检查点抑制剂(αPD-1 mAb或αCTLA-4 mAb)和HB03共同施用于对免疫检查点抑制剂耐药的结直肠癌(CT26、MC38)和黑色素瘤(B16F10)动物模型时，与单独施用αPD-1 mAb相比，αPD-1 mAb和HB03的共同施用使抗肿瘤效果显著增加，并且这种效果优于共同施用先前已知的嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株或长双歧杆菌菌株时的效果(图14)。此外，与αCTLA-4 mAb的单独施用相比，αCTLA-4 mAb和HB03的共同施用使抗肿瘤效果显著增加(图15)。
该结果表明，由于本公开的新型阿克曼氏菌菌株的抗癌活性，即使对于对免疫检查点抑制剂表现出耐药性的癌症，本公开的新型阿克曼氏菌菌株的共同施用也有效地抑制了肿瘤发生。
基于组合物的总重量，本公开的药物组合物可以包含0-0001重量％至50重量％，具体地0.01重量％至10重量％的量的提取物，但不限于此。
根据本公开的药物组合物还可以含有通常用于制备药物组合物的适当的载体、赋形剂或稀释剂。具体地，药物组合物可以按照常用方法配制成例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂的口服剂型，外用剂型，栓剂或灭菌的注射液。在本公开中，药物组合物中可以包含的运载体、赋形剂或稀释剂可以是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。该剂型由常用的稀释剂或赋形剂如填充剂、增量剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等制成。用于口服的固体剂型包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，而固体剂型通过将提取物或其部分与至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等混合来制备。除了简单的赋形剂，还使用硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。用于口服施用的液体剂型包括混悬剂、内部溶液剂、乳剂、糖浆剂等。除了常用的简单稀释剂如水或液体石蜡外，还可含有各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的剂型包括无菌含水溶液、不含水溶液、混悬剂、乳剂、冻干剂型和栓剂。对于不含水溶液或悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、注射用酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
在本公开的一个实例中，作为预处理(肿瘤接种前施用)或后处理(肿瘤接种后施用)菌株组合物HB03或HB03(P)的结果，其中菌株组合物HB03通过将冻干的新型阿克曼氏菌HB03菌株重悬于液体培养基中制备，HB03(P)通过将HB03热灭活至结直肠癌(CT26)、肺癌(LLC)、胰腺癌(Panc02)、黑色素瘤(B16F10)、神经胶质瘤(GL261)和肉瘤(MCA205)的肿瘤动物模型中预定时间制备，肿瘤生长明显减少(图7和图9)，并且该抗肿瘤效果优于施用嗜黏蛋白阿克曼氏菌型菌株(ATCC BAA-835菌株)或长双歧杆菌菌株(ATCC BAA-999菌株)时的效果(图8)。并且，当在施用AKK p2261或HB03后比较抗癌效果时，施用HB03进一步增加了抗癌效果(图10)。由此确认HB03与其他32个菌株相比具有优异的抗癌效果。
在本公开的另一个实例中，HB03-01是衍生自HB03的蛋白质，它显著降低了结直肠癌和肺癌细胞的增殖(图18A和图18B)并与另一种蛋白质HB03-03一起激活肺癌细胞的凋亡调节酶(半胱天冬酶-3)(图18C)。该结果表明本公开的新型阿克曼氏菌菌株由于其抗癌活性可用于预防或治疗癌症。
在另一方面，本公开提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，其包括将所述药物组合物施用于个体的步骤。
以下使用的术语与上述相同。
在本公开中，术语“个体”是指表现出或具有表现出癌症症状的风险的任意动物。可通过向疑似患有癌症的个体施用本公开的药物组合物而使个体得到有效治疗。本公开的药物组合物可应用于任意个体以预防或治疗癌症，没有特别限制。例如，个体可以是人、非人哺乳动物如猴、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、绵羊、猪、山羊等，鸟类、鱼等。此外，它可以是非人类动物，但不限于此。
在本公开中，术语“施用”是指通过合适的方法将物质引入个体。
本公开的药物组合物可以药学有效量施用。在本公开中，术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗或预防的合理收益/风险比治疗或预防疾病的量。有效剂量水平可以根据疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康状况和性别、患者对药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄率、治疗持续时间、与本公开的组合物同时使用的药物以及医学领域中众所周知的其他因素来确定。本公开的药物组合物可以作为独立的治疗剂施用或与另一种治疗剂组合施用，并且可以与另一种治疗剂先后或同时施用。它也可以作为单剂型或多重剂型施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以表现出最大效果而不引起副作用的最小量施用组合物。
具体地，对于哺乳动物，根据本公开的药物组合物的施用剂量可以是例如每天约0.0001mg/kg至100mg/kg，特别是0.001mg/kg至10mg/kg。本公开的药物组合物的日剂量可以一天一次或数次施用，但不特别限于此。上述施用剂量不以任意方式限制本公开的范围。
本公开的药物组合物的施用途径或施用方式没有特别限制，可以采用任意施用途径或施用方式，只要能够将组合物递送至所需靶位即可。具体而言，该组合物可以通过口服或各种非肠道途径施用。施用途径的非限制性实例包括口服、直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、经皮或鼻内途径。对于局部治疗，必要时可通过包括病灶内施用在内的合适方法施用。此外，药物组合物可以通过能够将活性物质递送至靶细胞的任意装置来施用。
另一方面，本公开提供了用于预防或缓解癌症的食品组合物，其包含一种或多于一种选自新型阿克曼氏菌HB03菌株、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组及其代谢组中的一种或多于一种。
本文使用的术语与上述相同。
在本公开中，术语“缓解”是指通过施用组合物来改善或有利地改变疾病症状的任意作用。在本公开中，该疾病是指癌症。
在本公开中，术语“食品”包括任意普通含义的食品，例如肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、糖果、比萨饼、拉面、其他面条、口香糖、乳制品包括冰淇淋、汤、饮料、茶、饮料、酒精饮料、维生素复合物、功能性保健食品、保健食品等。
功能性保健食品与特殊保健用途食品(FoSHU)同称，是指经过加工，除营养外，还能有效发挥生物调节功能的具有高医疗效果的食品。在此，术语“功能性”是指获得有益于营养物质对人体结构和功能或卫生用途例如生理作用等的调节的效果。本公开的食品可以通过本领域常用的方法制备，也可以通过加入本领域常用的原料和配料制备。此外，食品可以制备成任意被认为是食品的剂型，但不限于此。本公开的食品组合物可以制备成各种剂型，其优点在于它没有在长期使用过程中可能出现的副作用，因为它包含不同于一般药物的食品原料并且具有优异的便携性。因此，本公开的食物可作为补充剂服用，以增强预防或缓解癌症的效果。
保健食品是指与普通食品相比具有维持或改善健康的积极效果的食品，是指保健食品或用于保健的食品。在一些情况下，术语功能性保健食品、保健食品和用于保健的食品可以互换使用。
具体而言，功能性保健食品是将本公开的组合物加入饮料、茶、香料、口香糖、糖果等食品原料中制成的食品或制成胶囊、散剂、悬浮液等的食品。摄入时，它对健康有特殊的效果。但是，由于与一般的药物不同，它以食品为原料，因此其优点在于没有长期使用药物时可能出现的副作用。
本公开的食品组合物可以非常有用地使用，因为它可以常规服用，因此可以预期预防或缓解癌症的高效果。
食品组合物还可包含生理上可接受的载体。载体的类型没有特别限制，可以使用本领域常用的任意载体。
此外，食品组合物可以包含食品组合物中通常含有的用于改善气味、味道、视觉外观等的另外的成分。例如，它可以包含维生素A、C、D、E、B1、B2、B6或B12、烟酸、生物素、叶酸、泛酸等。此外，还可包含锌(Zn)、铁(Fe)、钙(Ca)、铬(Cr)、镁(Mg)、锰(Mn)、铜(Cu)等矿物质。此外，还可包含赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等氨基酸。
此外，食品组合物中可以包含例如防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢乙酸钠等)、杀菌剂(漂白粉、高级漂白粉、次氯酸钠等)、抗氧化剂(丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)等)、染料(焦油颜料等)、着色剂(氮化钠、亚硝酸钠等)、漂白剂(亚硫酸钠)、香料增强剂(味精、谷氨酸钠等)、甜味剂(甘素、甜蜜素、糖精等)、调味剂(香草醛、内酯等)、膨胀剂(明矾、D-酒石酸钾等)、增强剂、乳化剂、增稠剂、包衣剂、胶基、消泡剂、溶剂、改良剂等食品添加剂。添加剂可根据食品种类选择，适量使用。
根据常用方法，本公开的组合物可以单独添加或与另一种食品或食品成分一起添加。活性成分的混合量可以根据使用目的(预防、保健或治疗)适当确定。通常，为了制备食品或饮料，本公开的食品组合物的添加量基于食品或饮料可以为50重量份或少于50重量份，特别是20重量份或少于20重量份。但是，如果出于健康或卫生改善的目的而长期摄入，则可以使用较少的量。并且，由于不存在安全问题，因此活性成分可以大量使用。
例如，本公开的食品组合物可以用作保健饮料组合物，在这种情况下，它还可以包含各种调味剂、天然碳水化合物等作为普通饮料。天然碳水化合物可以是单糖如葡萄糖或果糖，二糖如麦芽糖或蔗糖，多糖如糊精或环糊精，或糖醇如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。作为甜味剂，可以使用例如奇异果甜蛋白或甜叶菊提取物的天然甜味剂或例如糖精或阿斯巴甜的合成甜味剂。每100mL本公开的健康饮料组合物，天然碳水化合物的比例通常为约0.01g至0.04g，具体为约0.02g至0.03g。
此外，保健饮料组合物可以包含各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸、果胶酸盐、海藻酸、海藻酸盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸化剂等。此外，它可以包含用于制备天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例并不重要，但通常为每100重量份本公开的保健饮料组合物0.01重量份至0.1重量份。
本公开的食品组合物中活性成分的含量可以变化，只要能够达到预防或缓解癌症的效果即可。例如，基于食品组合物的总重量，根据本公开的菌株的含量可以为0.00001重量％至100重量％或0.01重量％至80重量％，但不限于此。
在另一方面，本公开提供了保藏号为KCCM12318P的新型阿克曼氏菌HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组或其代谢组用于预防或治疗癌症的用途。
本文使用的术语与上述相同。
发明实施方式
在下文中，通过实施例更具体地描述本公开。然而，提供这些实施例仅用于说明本公开并且本公开的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：通过基因组碱基测序鉴定新型菌株
从NCBI中搜索到总共66个阿克曼氏菌种，并使用dRep基于MASH基因组碱基序列的平均核苷酸同一性(ANI)进行聚类(图1)。(Matthew R Olm等人.dRep：a tool for fastand accurate genome comparisons that enables improved genome recovery frommetagenomes through de-replication.ISMEJ.2017 Dec；11(12)：2864-2868.)。仅对属于单个物种聚类簇(聚类簇3)的44个菌株进行了后续分析。
使用了高速独立的泛基因组管线Roary，该泛基因组管线采用Prokka制备的GFF3格式的注释的组装(Seemann T.Prokka：rapid prokaryotic genomeannotation.Bioinformatics.2014 Jul 15；30(14)：2068-2069.)并计算泛基因组。然后，使用FastTree2构建了近似极大似然树(Price MN，Dehal PS，Arkin AP.FastTree 2--approximately maximum-likelihood trees for large alignments.PLoS One.2010 Mar10；5(3)：e9490.)(图2)。从基因存在/缺失图中提取了120个菌株特异性基因(图3)。它们中的大多数是功能未知的假定蛋白。对这些基因特异的菌株被命名为“阿克曼氏菌HB03(阿克曼氏菌种HB03)”。
由于Roary依赖于从活性CDS(编码序列)翻译的蛋白质序列，因此将具有错误或有缺陷注释的基因组碱基序列排除在分析之外。因此，对Roary预测的HB03菌株特异性基因进行了基因组序列(不是蛋白质编码序列)的搜索，并确认它们不存在。通过使用LS-BSR(大规模BLAS比对得分比率)计算BLAST比对得分比率(BSR)来研究存在的基因(图4a和图4b)。
通过研究在HB03菌株的全基因组基因中是否存在表现致病性(毒性)所必需的基因群致病岛(PAI)，证实HB03菌株不存在致病岛(图5)。
作为与嗜黏蛋白阿克曼氏菌型菌株(ATCC BAA-835)的全基因组比较的结果，HB03菌株显示出8％的差异。即使对于基因组匹配的部分，ANI值也只有97％，这表明该菌株是一种不同于模式菌株的新型菌株。
实施例2：新菌株的培养特点
HB03菌株在改良的BTTM培养基(Nat.Med.2017.23.107-113)(BTTM中的N-乙酰氨基葡糖的含量降低至1/10，L-苏氨酸的含量降低至1/5)在37℃厌氧条件下培养。
结果，如表1所示，与嗜黏蛋白阿克曼氏菌相比，HB03菌株显示出2倍或高于2倍的细胞产量和2倍或高于2倍的生长速率。
[表1]
Figure BPA0000322245400000171
此外，嗜黏蛋白阿克曼氏菌存在离心和大规模生产困难的问题，因为它倾向于悬浮而不是沉淀，而HB03菌株由于易于离心而比其模式菌株更容易进行大规模生产和基因组编辑(图6)。
此外，当培养基中不存在氨基酸L-苏氨酸时，嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株不生长，而HB03菌株在缺乏L-苏氨酸的培养基中生长至1.0x109个细胞/mL的浓度(表2)。这意味着与嗜黏蛋白阿克曼氏菌型菌株不同，HB03菌株即使在没有黏蛋白或黏蛋白的降解产物L-苏氨酸的情况下也可以通过使用黏蛋白或L-苏氨酸以外的各种碳源和氮源作为营养素来生长。
[表2]
Figure BPA0000322245400000181
由此，确认了本公开的菌株具有与嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株不同的各种工业上有用的特征。本公开的菌株“阿克曼氏菌HB03(阿克曼氏菌种HB03)”于2018年9月11日保藏在韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM12318P。
实施例3：制备肿瘤动物模型及菌株组合物
3-1。肿瘤动物模型
使用从Daehan Biolink购买的6周龄至8周龄的雄性C57BL/6J JAX和BALB/c小鼠。将每只小鼠圈养在笼子中，并保持在受控环境(12小时光照/黑暗循环，晚上7点关灯)下，自由采食和饮水。通过注射胰腺癌细胞(Panc02)、黑色素瘤细胞(B16F10)、胶质瘤细胞(GL261)、肉瘤细胞(MCA205)、结直肠癌细胞(MC38)和肺癌细胞(LLC)至C57BL/6 JAX小鼠和注射结直肠癌细胞(CT26)至BALB/c小鼠诱导肿瘤发生。具体地，将1x107个细胞/100μLPanc02、2x105个细胞/100μL B16F10、5x105个细胞/100μL GL261、5x105个细胞/100μLMCA205、5x105个细胞/100μL MC38、5x105个细胞/100μL LLC或5x105个细胞/100μL CT26肿瘤细胞皮下注射至小鼠。以2天或3天的间隔测量肿瘤大小，直至实验结束，肿瘤体积计算为长度x宽度2x0.5。为了研究由于HB03及其片段引起的肿瘤大小和免疫环境的变化，回收肠内容物，浸入液氮中，然后保持在-80℃下。所有动物实验程序均经韩国生物科学与生物技术研究所动物护理和使用委员会批准。
3-2。菌株组合物
通过培养每种菌株(阿克曼氏菌种HB03、嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835、长双歧杆菌ATCC BAA-999或嗜黏蛋白阿克曼氏菌p2261)来制备菌株组合物HB03(阿克曼氏菌种HB03的组合物)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835的组合物)、AKKp2261(嗜黏蛋白阿克曼氏菌p2261的组合物)和长双歧杆菌(长双歧杆菌ATCC BAA-999的组合物)，这些菌株保持在-70℃的20％甘油中，在37℃下重新悬浮在5.0x109CFU/mL液体培养物的培养基中。在下文中，除非另有说明，否则“嗜黏蛋白阿克曼氏菌”是指模式菌株嗜黏蛋白阿克曼氏菌BAA-835，“AKK p2261”是指嗜黏蛋白阿克曼氏菌p2261。HB03和嗜黏蛋白阿克曼氏菌使用实施例2的改良BTTM培养，AKK p2261使用COS培养基培养(Columbia培养基+5％绵羊血(BiomrieuxTM)；Columbia培养基：多聚蛋白胨17.0g/L，胰蛋白胨3.0g/L、自溶酵母提取物3.0g/L、玉米淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L)，长双歧杆菌使用MRS培养基(De Man、Rogosa和Sharpe(MRS)培养基)培养。
通过将HB03在70℃下煮沸30分钟来制备巴氏杀菌菌株组合物(HB03(P))。
实施例4：菌株组合物的施用
将实施例3-2的菌株组合物HB03、HB03(P)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、AKK p2261或长双歧杆菌各100μL从肿瘤接种前第7天或从第5天或第6天至第18天通过经口灌胃施用于实施例3-1的结直肠癌(CT26、MC38)、肺癌(LLC)和黑色素瘤(B16F10)的动物模型，从肿瘤接种前第7天或从第5天或第6天至第22天通过经口灌胃施用于胶质瘤(GL261)的动物模型，从肿瘤接种前第7天或从第5天或第6天至第16天通过经口灌胃施用于肉瘤(MCA205)的动物模型，从肿瘤接种前第7天或第6天至第30天通过经口灌胃施用于胰腺癌(Panc02)的动物模型。
实施例5：向肿瘤动物模型施用菌株组合物对抑制肿瘤生长的效果
在用HB03或HB03(P)对实施例3-1的肿瘤动物模型进行后处理(肿瘤接种后施用)后，比较与对照组的肿瘤生长的差异。结果示出于图7。
在用HB03、嗜黏蛋白阿克曼氏菌或长双歧杆菌对实施例3-1的肿瘤动物模型进行后处理(肿瘤接种后施用)后，比较与对照组的肿瘤生长的差异。结果示出于图8。
在用HB03或HB03(P)对实施例3-1的肿瘤动物模型进行预处理(肿瘤接种前施用)后，比较与对照组的肿瘤生长的差异。结果示出于图9。
在用HB03或AKK p2261对实施例3-1的肿瘤动物模型进行后处理(肿瘤接种后施用)后，比较与对照组(PBS)的肿瘤生长的差异。结果示出于图10。
如图7和图9所示，当在肿瘤细胞移植之前或之后施用HB03或HB03(P)一定时期时，肿瘤生长显著降低。
此外，如图8所示，当比较施用嗜黏蛋白阿克曼氏菌、长双歧杆菌或HB03后的抗癌效果时，施用HB03进一步增加了抗癌效果。并且，如图10所示，当比较施用AKK p2261或HB03后的抗癌效果时，施用HB03进一步增加了抗癌效果。由此，确认HB03比其他三种菌株表现出更高的抗癌效果。
由于该结果表明肠微生物HB03或HB03(P)作为癌症治疗剂抑制肿瘤生长，因此本公开的菌株HB03可用于治疗癌症。
实施例6：免疫检查点抑制剂与菌株组合物联合施用对肿瘤动物模型抑制肿瘤生 长的效果
在将免疫检查点抑制剂(aPD-1 mAb)和HB03共同施用于实施例3-1的肿瘤动物模型后，比较与未共同施用的对照组的肿瘤生长的差异。将mIgG(150μg/小鼠)和PBS(1001μL/小鼠)施用于对照组，并将αPD-1 mAb(150μg/小鼠)和PBS(100μL/小鼠)或αPD-1 mAb(150μg/小鼠)小鼠)和HB03(100μL/小鼠)施用于测试组。肿瘤接种后，将100μL mIgG或αPD-1 mAb静脉注射到结直肠癌(CT26)、肺癌(LLC)、黑色素瘤(B16F10)和神经胶质瘤(GL261)的动物模型中5次，间隔2天，从第5天到第16天，并且每天通过经口灌胃施用100μL PBS(对照，对照组)或HB03。比较第16天的肿瘤大小的结果如图11所示。
为了比较另一种免疫检查点抑制剂(αCTLA-4 mAb)和HB03联合施用组和非联合施用对照组之间的肿瘤生长差异，将mIgG(25μg/小鼠)和PBS(100μL/小鼠)施用于对照组，将αCTLA-4 mAb(25μg/小鼠)和PBS(100μL/小鼠)或αCTLA-4 mAb(25μg/小鼠)和HB03(100μL/小鼠)施用于测试组。肿瘤接种后，以2天的间隔从第5天至第16天向肉瘤(MCA205)和结直肠癌(MC38)动物模型静脉注射100μL mIgG或αCTLA-4 mAb 5次，100μL PBS(对照，对照组)或HB03每天通过经口灌胃施用。第16天的肿瘤大小的比较结果如图12所示。
此外，为了比较另一种免疫检查点抑制剂(αPD-L1 mAb)和HB03联合施用组和非联合施用对照组之间的肿瘤生长差异，将mIgG(100μg/小鼠)和PBS(100μL/小鼠)施用于对照组，将αPD-L1 mAb(100μg/小鼠)和PBS(100μL/小鼠)或αPD-L1 mAb(100μg/小鼠)和HB03(100μL/小鼠)施用于测试组。肿瘤接种后，以2天的间隔从第5天至第16天向结直肠癌(MC38)动物模型静脉注射100μL mIgG或αPD-L1 mAb 5次，100μL PBS(对照，对照组)或HB03每天通过经口灌胃施用。第16天的肿瘤大小的比较结果如图13所示。
如图11至图13所示，与单独施用免疫检查点抑制剂时相比，当免疫检查点抑制剂αPD-1 mAb、αCTLA-4 mAb或αPD-L1 mAb与HB03共同施用时，抗肿瘤作用显著增加。
该结果表明，肠道微生物HB03在癌症治疗期间通过降低免疫检查点抑制剂的浓度提供了抑制肿瘤生长的优势，从而增加了抗肿瘤效果，同时减少了副作用和耐药性。
实施例7：免疫检查点抑制剂与菌株组合物联合施用对耐药动物模型抑制肿瘤生 长的效果
通过将氨苄青霉素(1μg/mL)、链霉素(5μg/mL)和黏菌素(1μg/mL)溶解在饮用水中施用于实施例3-1的动物模型2周，然后接种肿瘤，之后，将饮用水用普通饮用水代替。48小时后，将免疫检查点抑制剂(αPD-1 mAb)与HB03或长双歧杆菌共同施用后，比较与非共同施用组的肿瘤生长的差异。肿瘤接种后，以2天的间隔从第5天至第16天将mIgG或αPD-1mAb静脉注射至结直肠癌(CT26)和黑色素瘤(B16F10)动物模型5次，每天通过经口灌胃施用100μL的PBS(对照，对照组)、HB03或长双歧杆菌。第16天的肿瘤大小的比较结果如图14所示。
此外，通过将氨苄青霉素(1μg/mL)、链霉素(5μg/mL)和黏菌素(1μg/mL)溶解在饮用水中施用于实施例3-1的动物模型2周，然后接种肿瘤，之后，将饮用水用普通饮用水代替。48小时后，将免疫检查点抑制剂(αCTLA-4 mAb)与HB03共同施用后，比较与非共同施用组的肿瘤生长的差异。肿瘤接种后，以2天的间隔从第5天至第16天向结直肠癌(MC38)动物模型静脉注射mIgG或αPD-1 mAb 5次，100μL的PBS(对照，对照组)或HB03每天通过经口灌胃施用。第16天的肿瘤大小的比较结果如图15所示。
如图14所示，当免疫检查点抑制剂αPD-1 mAb与HB03共同施用于因施用抗生素而对免疫检查点抑制剂产生耐药性的小鼠时，与单独使用免疫检查点抑制剂相比，抗肿瘤效果显著增加，并且这种效果优于与嗜黏蛋白阿克曼氏菌或长双歧杆菌共同施用的效果。
此外，如图15所示，当免疫检查点抑制剂αCTLA-4 mAb与HB03共同施用于因施用抗生素而对免疫检查点抑制剂产生耐药性的小鼠时，与单独使用免疫检查点抑制剂相比，抗肿瘤效果显著增加。
该结果表明，肠道微生物HB03克服了癌症治疗过程中对免疫检查点抑制剂的耐药性导致的抗癌效果降低的现象，从而提高了抗肿瘤效果并抑制了肿瘤的生长。
实施例8：抗癌药与菌株组合物联合施用于肿瘤动物模型对抑制肿瘤生长的效果
在将化学抗癌剂(5-FU：5-氟尿嘧啶)和靶向抗癌剂(奥沙利铂)与HB03共同施用于实施例3-1的肿瘤动物模型后，比较与非共同施用组的肿瘤生长的差异。将生理盐水(100μL/小鼠)和PBS(100μL/小鼠)施用于对照组，并将5-FU(2mg/kg)、奥沙利铂(20mg/kg)和生理盐水(100μL/小鼠)或5-FU(2mg/kg)、奥沙利铂(20mg/kg)和HB03(100μL/小鼠)施用于测试组。肿瘤接种后，以2天的间隔从第5天至第16天向结直肠癌(MC38)动物模型静脉注射100μL5-FU或奥沙利铂5次，100μL PBS(对照，对照组)或HB03每天通过经口灌胃施用。第16天的肿瘤大小的比较结果如图16所示。
如图16所示，与单独施用抗癌剂时相比，当抗癌剂5-FU和奥沙利铂与HB03共同施用于结直肠癌动物模型时，抗肿瘤效果显著增加。
实施例9：向肿瘤细胞施用菌株组合物对抑制肿瘤生长和诱导细胞凋亡的效果
通过PCR从HB03菌株的基因组DNA中扩增编码HB03菌株产生的蛋白质的基因HB03-01和HB03-03。然后，将扩增的基因克隆至pET-30a载体中(图17)，并在大肠杆菌中过表达。在离心，然后将菌株重悬于PBS缓冲液中后，通过超声裂解细菌。在再次离心并仅分离上清液后，使用His-taq柱从上清液中纯化HB03-01(SEQ ID NO 1)和HB03-03(SEQ ID NO 2)蛋白质。
然后，研究了纯化的HB03-01和HB03-03蛋白是否影响癌细胞的增殖或凋亡。具体地，在使用浓度为0μg/mL(未处理)、0.1μg/mL、1.0μg/mL或10μg/mL的HB03衍生蛋白HB03-01或使用10μg/mL的HB03-03处理结直肠癌细胞(CT26)和肺癌细胞(LLC)后，研究癌细胞的增殖和凋亡调节酶半胱天冬酶-3的活性。
进行MTT测定以研究癌细胞增殖的变化。在37℃的5％CO2培养箱中，使用DMEM培养基(Gibco，USA)在96孔板上以1x104个细胞/孔培养癌细胞24小时。通过用2-脱氧葡萄糖(2-DG)处理至20mM的最终浓度来维持低葡萄糖状态。培养6小时后，以0μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL或10μg/mL的浓度处理HB03-0148小时。加入10μL MTT溶液后，继续培养2小时。从96孔板中取出培养基并用100μL DMSO溶解板上形成的甲
Figure BPA0000322245400000221
后，使用ELISA读数器(680型，BioRad)在540nm处测量吸光度。对照组用0μg/mL HB03-01(未处理)处理，测量值表示为相对于对照组细胞数为100％的相对细胞存活率(％)。
进行蛋白质印迹以研究半胱天冬酶-3的活性水平。将用10μg/mL HB03-01或HB03-03处理24小时的肺癌细胞在包含2mM EDTA(乙二胺四乙酸)、0.5mM EGTA(乙二醇四乙酸)、300mM蔗糖和2mM PMSF(苯甲基磺酰氟)的冰冷20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中均质化。在15％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶上对50μg蛋白质进行电泳后，使用半干转移系统(Hoefer，Holliston，MA，USA)将它们转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。通过与5％脱脂奶粉一起孵育来阻断非特异性结合。在4℃下将膜与稀释至1∶500的一抗孵育过夜后，通过结合稀释至1∶1000的HRP(辣根过氧化物酶)与二抗孵育。使用ECL检测试剂盒(Amersham Biosciences Korea，Seoul，Korea)检测免疫复合物，并在X射线胶片上进行放射自显影。用于蛋白质印迹的抗体是肌动蛋白和半胱天冬酶-3。它们购自Santa CruzBiotechnolgy(Santa Cruz，CA)。
如图18A和图18B所示，HB03衍生蛋白HB03-01显著降低了结直肠癌和肺癌细胞的增殖。另外，如图18C所示，它与其他的HB03衍生蛋白HB03-03一起激活了肺癌细胞中的凋亡调节酶(半胱天冬酶-3)。
由此证明，衍生自肠道微生物HB03的蛋白质或代谢组创造了有利于癌症治疗或抑制肿瘤生长的环境。
实施例10：向肿瘤动物模型施用菌株组合物对抑制肿瘤生长的效果
在用HB03-01(AT1)或HB03-03(AT3)对实施例3-1的肿瘤动物模型进行后处理(肿瘤接种后施用)后，比较与对照组的肿瘤生长的差异。结果示出于图19。
结果证实，与未用HB03-01(AT1)或HB03-03(AT3)处理的对照组相比，HB03-01(AT1)和HB03-03(AT3)显著抑制肿瘤生长。
该结果表明衍生自肠微生物HB03的蛋白质作为癌症治疗剂有利地抑制肿瘤生长。因此，本公开的HB03菌株的蛋白质可用于治疗癌症。
上述实施例的结果表明有用的肠道微生物的存在或增加的水平以及微生物的活化或灭活水平影响癌症治疗和肿瘤生长。
具体地，本公开已经证明，特定微生物的施用，即本公开的新型有益微生物，通过降低或抑制其他免疫反应来调节肠道微生物，促进肿瘤的治疗和抑制肿瘤生长。具体地，本公开公开的新型有益微生物创造了有利于癌症治疗的环境，并通过分泌代谢物(如细胞、组织或体液中存在的氨基酸、核酸、脂肪酸、糖类、胺类、糖脂、短肽、维生素、激素等)或蛋白质组来抑制肿瘤生长。
表格和图表中的数据表示为平均值±SEM。通过t检验(Excel软件)估计用于研究肿瘤生长测量的统计差异的P值。P＜0.05被认为具有统计学意义：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
本公开所属领域的技术人员应当理解，本公开可以在不改变技术思想或基本特征的情况下以不同的形式实施。在这点上，应当理解，所有上述实施例都是说明性的，而不是限制性的。应当理解，源自所附权利要求及其等同物的所有变化和修改都包括在本公开的范围内。
Figure BPA0000322245400000241
上面的翻译证明与原文内容没有区别。
2019年9月25日
专利代理人孙民
Figure IPA0000322245340000011
Figure IPA0000322245340000021
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Claims (13)

1.一种新型阿克曼氏菌HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)，其保藏号为KCCM12318P。
2.一种药物组合物，其用于预防或治疗癌症，包含选自根据权利要求1所述的阿克曼氏菌菌株、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组及其代谢组中的一种或多于一种。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中灭活是通过加热进行的热灭活。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中药物组合物与抗癌剂一起施用。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中抗癌剂为选自化学抗癌剂、靶向抗癌剂和免疫检查点抑制剂中的一种或多于一种。
6.根据权利要求2所述的药物组合物，其中癌症是对抗癌剂表现出耐药性的癌症。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中抗癌剂为免疫检查点抑制剂。
8.根据权利要求2所述的药物组合物，其中蛋白质组为HB03-01和HB03-03中的一种或多于一种蛋白质。
9.一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括将根据权利要求2至8中任一项所述的药物组合物施用于个体的步骤。
10.一种用于预防或缓解癌症的食品组合物，其包含选自根据权利要求1所述的阿克曼氏菌菌株、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组及其代谢组中的一种或多于一种。
11.根据权利要求10所述的食品组合物，其中灭活是通过加热进行的热灭活。
12.根据权利要求10所述的食品组合物，其中蛋白质组为HB03-01和HB03-03中的一种或多于一种蛋白质。
13.保藏号为KCCM12318P的新型阿克曼氏菌HB03菌株(阿克曼氏菌种HB03)、其灭活菌株、其培养物、其囊泡、其蛋白质组或其代谢组用于预防或治疗癌症的用途。
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