CN116200312B - 一种抗氧化、减脂和抑制肿瘤生长的广西阿克曼氏菌及其产品与应用 - Google Patents
一种抗氧化、减脂和抑制肿瘤生长的广西阿克曼氏菌及其产品与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗氧化、减脂和抑制肿瘤生长的广西阿克曼氏菌及其产品与应用，所述阿克曼氏菌为广西阿克曼氏菌N21116和N21169，保藏编号分别为：GDMCC No:62888和62889。本发明中的广西阿克曼氏菌N21116和N21169为阿克曼氏菌新种，具有极好的耐人工肠液效果，而且具备优异的抗氧化、抑制肿瘤细胞生长和减肥降脂功效，从而能够基于该菌株有效开发相关产品，具有极高的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种抗氧化、减脂和抑制肿瘤生长的广西阿克曼氏菌及其产品与应用。
背景技术
人口老龄化是21世纪最受重视也是最为重要的社会问题之一。据相关调查发现，预计到2050年，老龄化人口（65岁以上）所占比列将达到16%。世界各国均面临着老龄化问题，包括中国，当前，65岁及以上老年人口达2亿以上，占总人口的14.2%。预计到2035年左右，中国60岁及以上老年人口将突破4亿。
老龄化问题的凸显驱使全球日益关注健康和衰老问题。同时，随着世界经济水平的提高，追求更长的健康寿命已成为民众普遍的共识。目前，学术界普遍认为，长寿机制是具有一个复杂的系统，但与抗氧化机制、慢性炎症机制和代谢失调等机制有着密不可分的联系。因此，开发具有抗氧化、抑制炎症和改善代谢失调的药物或补充剂成为实现健康长寿的重要途径。
广西是中国长寿县最为密集分布的省份之一，其长寿老人和长寿现象的研究是当前的一个热点。尤其是研究长寿老人肠道菌群的特征，以及和老年慢性疾病关系成为当前的研究热点。肠道菌群与各类慢性疾病存在广泛的联系，不断涌现的证据表明肠道菌群在抗氧化、抑制炎症和改善代谢方面具有重要的、不可替代的作用。但目前可用的具有以上抗衰老功能的益生菌相对稀少，因此，开发新的来源于长寿老人的具有相关功能的益生菌对于人体抗衰产品的开发具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种具有抗氧化、减脂和抑制肿瘤效果的广西阿克曼氏菌和含有该菌的产品及其应用。本发明中的两株阿克曼氏菌分离自广西百岁老人粪便样本，并发现其相对于其他阿克曼氏菌具有更强的抗氧化能力、减脂能力和较强的抑制肿瘤细胞增殖的能力，具有极高的开发价值和实用价值，为抗氧化、抑制肿瘤和减脂类产品的开发与应用提供了新思路。
本发明的第一个方面，提供了一株阿克曼氏菌，所述阿克曼氏菌为广西阿克曼氏菌N21116，分类学命名为Akkermansia guangxiensissp.，于2022年12月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No: 62888。
本发明的第二个方面，提供了一株阿克曼氏菌，所述阿克曼氏菌为广西阿克曼氏菌N21169，分类学命名为Akkermansia guangxiensissp.，于2022年12月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No: 62889。
在本发明的一些实施方式中，所述阿克曼氏菌N21116和N21169均分离自广西百岁老人的粪便样本。
在本发明的一些实施方式中，所述广西阿克曼氏菌N21116和N21169的菌落形态均为圆形、凸起、光滑、边缘整齐的灰白色的菌落。
在本发明的一些实施方式中，所述广西阿克曼氏菌N21116的16S序列如SEQ IDNO:5所示。
在本发明的一些实施方式中，所述广西阿克曼氏菌N21169的16S序列如SEQ IDNO:6所示。
在本发明的一些实施方式中，所述广西阿克曼氏菌N21116和N21169的筛选分离方法为：取广西百岁老人的粪便样本至黏蛋白固体培养基中，在厌氧条件下培养3-6天，挑取培养基中菌落形态为圆形、凸起、光滑、边缘整齐的灰白色的菌落，经PCR扩增鉴定后，即得广西阿克曼氏菌N21116和N21169。
在本发明的一些实施方式中，所述广西阿克曼氏菌N21116和N21169的培养时间为40~72h。
在本发明的一些实施方式中，所述广西阿克曼氏菌N21116和N21169的培养温度为30℃~37℃，转速150rpm~220rpm。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增鉴定使用阿克曼氏菌特异性扩增引物。
在本发明的一些实施方式中，所述阿克曼氏菌特异性扩增引物如SEQ ID NO:1和2所示。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增鉴定的扩增体系如表1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增鉴定的热循环参数设定为：95℃预变性3 min；95℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃终延伸10min。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理调整PCR扩增体系中的含量与浓度，以及扩增程序，从而实现对于阿克曼氏菌的鉴定。
本发明的第三个方面，提供含有本发明第一和/或第二个方面所述阿克曼氏菌的产品，所述产品为药品。
在本发明的一些实施方式中，所述产品还包括含有本发明第一和/或第二个方面所述阿克曼氏菌的菌剂、菌液或培养物的产品。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中的广西阿克曼氏菌的质量分数大于等于5%。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中的广西阿克曼氏菌的质量分数大于等于8%。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中的广西阿克曼氏菌的质量分数大于等于10%。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中的广西阿克曼氏菌的质量分数为5%～15%。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中还含有其他辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括药学上可接受的辅剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅剂包括但不限于稀释剂（如淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇等）、吸收剂（如硫酸钙、磷酸氢钙等）、润湿剂（如乙醇）、粘合剂（如羟丙甲纤维素、聚维酮等）、崩解剂（如羟甲基淀粉钠、交联聚维酮等）、润滑剂（如滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇等）、着色剂（如二氧化钛、亚甲蓝等）、包衣材料、溶剂、pH调节剂、抗菌剂（如亚硫酸钠、硫代硫酸钠等）、等渗调节剂（如葡萄糖、氯化钠等）、螯合剂（如EDTA二钠）。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中的广西阿克曼氏菌的形式包括冻干粉、菌液、颗粒接种菌剂。当然，需要理解的是，本领域技术人员也可以根据实际使用需求和现有的处理工艺，合理选择适当的阿克曼氏菌形式用于使用，包括但不限于上述的冻干粉、菌液、颗粒接种菌剂。
在本发明中，术语“冻干粉”是指采用冷冻干燥机的真空冷冻干燥法预先将药液或菌液里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将药液或菌液里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥而成的制品。
在本发明中，术语“颗粒接种菌剂”是指为了防止粉状菌剂在使用时直接与杀菌剂或化学化肥接触，导致效果降低而采用的菌剂，通常是指将菌液与颗粒状载体（如生物炭、蛭石等）混合后得到的菌剂类型。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中的广西阿克曼氏菌的有效菌活为107cfu/mL~109cfu/mL。
当然，本领域技术人员可以根据所述产品中的广西阿克曼氏菌的实际形式合理调整其活性，从而实现稳定的技术效果。
本发明的第四个方面，提供一种含有本发明第一和/或第二个方面所述阿克曼氏菌的产品，所述产品中包括有本发明第一和/或第二个方面所述阿克曼氏菌冻干粉、植物提取物、麦芽糊精和膳食纤维。
在本发明的一些实施方式中，所述植物提取物包括但不限于植物精油、皂苷、生物碱、多糖、多酚、黄酮类化合物。
在本发明的一些实施方式中，所述植物提取物为茶多酚和杨梅花青素提取物。
在本发明的一些实施方式中，所述膳食纤维包括可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维。
在本发明的一些实施方式中，所述膳食纤维为可溶性膳食纤维。
在本发明的一些实施方式中，按照质量百分比计，所述产品包括：5～15%本发明第一和/或第二个方面所述阿克曼氏菌冻干粉、15～40%植物提取物、40～60%淀粉水解多糖和5～15%膳食纤维。
在本发明的一些实施方式中，按照质量百分比计，所述产品包括：10%广西阿克曼氏菌N21116或N21169冻干粉，15%茶多酚，15%杨梅花青素提取物，50%麦芽糊精和10％可溶性膳食纤维。
在本发明的一些实施方式中，所述产品的制备方法为：将本发明第一和/或第二个方面所述阿克曼氏菌冻干粉、植物提取物、麦芽糊精和膳食纤维充分混合后即得。
本发明的第五个方面，提供本发明第一和/或第二个方面所述阿克曼氏菌在制备产品中的用途。
在本发明中，通过安全评估表明上述两株阿克曼氏菌不含致病基因和毒力基因，模拟胃肠道环境抗性实验表明两者均可以耐受胃肠道环境。综合以上特性，能够说明两株是具有抗氧化、减脂和抑制肿瘤增殖功效的益生菌。
在本发明的一些实施方式中，所述产品具有如下（1）～（3）中至少一种功能：
（1）抗氧化；
（2）减脂；
（3）抑制肿瘤增殖。
在本发明中，使用线虫（秀丽隐杆线虫）筛选平台来进行减脂效果的验证。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）构造简单、身体透明、便于观察、发育周期短、易于人工培养且信号通路高度保守,从而使得秀丽隐杆线虫模型效果验证准确率较高，实验成本低。而本发明中，通过基于秀丽隐杆线虫的减脂试验，有效证明了广西阿克曼氏菌N21116和N21169具有减肥降脂功效。
在本发明中，通过抗氧化水平（羟基自由基清除率、过氧阴离子清除率和超氧化物歧化酶SOD活力）的测试，确定了本发明中的广西阿克曼氏菌N21116和N21169两株均具有超越同属菌株抗氧能力的效果，具有良好的抗氧化能力。
在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤为胃肠道肿瘤。
在本发明的一些实施方式中，所述胃肠道肿瘤包括结肠癌。
在本发明中，通过测试广西阿克曼氏菌N21116和N21169两株菌株对人结肠癌细胞株HCT116的生长的影响，证实了两株均可显著抑制人结肠癌细胞生长，具有了抑制肿瘤增殖潜力。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现了一种阿克曼氏菌新种，其具有极好的耐人工肠液效果，而且具备优异的抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖和减肥降脂功效，从而能够基于该菌株有效开发相关产品，具有极高的实用价值。本发明中的阿克曼氏菌新种相比于现有的阿克曼氏菌具有更强的定殖能力和抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖和减肥降脂功效，具有极高的应用价值和商业开发价值。
附图说明
图1为本发明实施例中的广西阿克曼氏菌N21116和N21169的进化发育树。
图2为本发明实施例中的广西阿克曼氏菌的ANI分析，其中，Agl[T]表示Akkermansia glycaniphilaPyt [T]；Amu[T]表示Akkermansia muciniphilaATCC BAA-835[T]；AmuYL44表示Akkermansia muciniphilaYL44；Amu22959表示：Akkermansia muciniphilaDSM 22959 [T]；AguN21116表示：Akkermansia guangxiensisN21116；AguN21169表示：Akkermansia guangxiensisN21169。
图3为本发明实施例中的广西阿克曼氏菌N21116和N21169对人工肠液的耐受性结果，其中，AmucT表示嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准株ATCC BAA-835。
图4为本发明实施例中的广西阿克曼氏菌N21116和N21169的抗氧化水平测试结果，其中，a为羟基自由基清除活力测试结果；b为超氧阴离子清除活力测试结果；c为超氧化物歧化酶SOD活力测试结果；AmucT表示嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准株ATCC BAA-835；A21028表示嗜黏蛋白阿克曼氏菌A21028。
图5为本发明实施例中的广西阿克曼氏菌N21116和N21169对线虫脂肪积累抑制效果，其中，AmucT表示嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准株ATCC BAA-835；A21028表示嗜黏蛋白阿克曼氏菌A21028。
图6为喂食不同阿克曼氏菌的线虫脂肪染色结果，其中，AmucT表示嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准株ATCC BAA-835；A21028表示嗜黏蛋白阿克曼氏菌A21028。
图7为本发明实施例中的广西阿克曼氏菌N21116和N21169对人结肠癌细胞株HCT116的抑制作用，其中，AmucT表示嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准株ATCC BAA-835。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
在下述实施例中，所用的黏蛋白固体培养基的组分及含量为：以终浓度计，含有BHI（脑浸心肉汤培养基）38 g/L，黏蛋白 4 g/L，琼脂 15 g/L。将上述组分按比例混合均匀后，经115 ℃高压灭菌20 min即得。
在下述实施例中，所用的合成液体培养基的组分及含量为：以终浓度计，含有BHI（脑浸心肉汤培养基）38 g/L，大豆蛋白胨 16 g/L，苏氨酸 4 g/L，葡萄糖 25 mM，N-乙酰葡萄糖胺25 mM。将上述组分按比例混合均匀后，经115 ℃高压灭菌20 min即得。
广西阿克曼氏菌N21116和N21169的分离与鉴定
本实施例中的广西阿克曼氏菌的分离与纯化步骤具体如下：
取广西两例百岁老人的粪便样本适量，经PBS稀释后，均匀涂布到黏蛋白固体培养基中，放置在厌氧工作站中。在气体条件为90%（v/v）N2和10%CO2，37℃培养两天。培养结束后，挑取平板中菌落形态为圆形、凸起、光滑、边缘整齐的灰白色的菌落，使用PCR扩增技术进行鉴定。
本实施例中的广西阿克曼氏菌的PCR鉴定方法为：
使用无菌牙签挑取符合上述阿克曼氏菌形态特征的菌落，转移至2×PCR预混液中，并依次加入上下游特异引物和无菌水（具体PCR扩增体系如表1所示）。热循环参数设定为：95℃预变性3 min；95℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃终延伸10min。
表1 阿克曼氏菌PCR扩增体系
其中，用于鉴定的阿克曼氏菌特异性扩增引物为：
上游引物F：5’-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3’（SEQ ID NO：1）；
下游引物R：5’-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3’（SEQ ID NO：2）。
扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，当扩增片段长度符合预期即可初步判定分离菌株为疑似阿克曼氏菌属菌株。
进一步对PCR扩增鉴定为疑似阿克曼氏菌属的菌株进行16S rRNA分子鉴定。
16S rRNA分子鉴定体系同表1，热循环参数为：95℃预变性2min；95℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次；72℃终延伸10min。
其中，用于16S rRNA分子鉴定的特异性扩增引物为：
上游引物16S-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO：3）；
下游引物16S-R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’（SEQ ID NO：4）。
扩增产物送上海生工测序。
其中，测序得到的疑似阿克曼氏菌属菌株1（编号N21169）的16S序列如SEQ ID NO：5所示。疑似阿克曼氏菌属菌株2（编号N21116）的16S序列如SEQ ID NO：6所示。使用NCBIBLAST工具进行序列检索，发现二者与Akkermansia muciniphilaATCCBAA-835标准菌株的16S rRNA序列相似度分别为95.45%和95.53%，由此可见此二株可能为Akkermansia菌属未被发现的新菌种。
5’-GCGGGCGGGTGGAAGACATGCAAGTCGAACGGAAGAATGCTAGCTTGCTAATATTCTTCAGTGGCGCACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTACCTTCGAGTGGGGGATAGCCCCGGGAAACTGGGATTAATACCGCATGAGGTCGAAAGATCAAAGCAGCAATGCGCTTGAAGATGGGCTCGCGTCCTATTAGTTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGTCTGAGAGGATGTCCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACACCTACGGGTGGCAGCAGTCGAGAATCATTCACAATGGGGGCAACCCTGATGGTGCGACGCCGCGTGGGGGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAACCCCTGTCATGTGGGAGCAAGCAGCAATGTTGATAGTACCACAAGAGGAAGAGACGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGTCTCAAGCGTTGTTCGGAATCACTGGGCGTAAAGAGTACGTAGGCTGTTTTCTAAGTCAGGTGTGAAAGGCAGGGGCTCAACCCCTGGACTGCACATGATACTGGGAGACTGGAGTAATGGAGGGGGAACCGGAATTCTCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATCGAGAGGAACACTCGTGGCGAAGGCGGGTTCCTGGACATTAACTGACGCTGAGGTACGAAGGCCAGGGTAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTGGCAGTAAACGGTGCACGCTTGGTGTGAGGGGACTCGACCCCCCTCGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGCGTGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGCTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTAATGAACAACATGTGAAAGCATGCGACTCTTCGGAGGCGTTACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTTGGTTAAGTCCAGCAACGAGCGCAACCCCTGTGGCCAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGGACTCTGGCAAGACTGCCCAGATCAACTGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGGTCAGTATGGCCCTTATGCCCAGGGCTGCACACGTACTACAATGCCCAGAACAGAGGGGGCCGAAGCCGTGAGGCGGAGGAAATCCTGAAAACTGGGCCCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACCCGCCTACACGAAGCCGGAATCGCTAGTAATGGCGCATCAGCTACGGCGCCGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACATCATGGAAGCCGGTCGCACCCGAAGTATCTAGAGCCAACCGCAAGGAGGCAGGGTCCC-3’（SEQ ID NO：5）。
5’-GCGGGGCGCGTGCAAAAGACATGCAAGTCGAACGGAAGAATGCTAGCTTGCTAATATTCTTCAGTGGCGCACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTACCTTCGAGTGGGGGATAGCCCCGGGAAACTGGGATTAATACCGCATGAGGTCGAAAGATCAAAGCAGCAATGCGCTTGAAGATGGGCTCGCGTCCTATTAGTTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGTCTGAGAGGATGTCCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACACCTACGGGTGGCAGCAGTCGAGAATCATTCACAATGGGGGCAACCCTGATGGTGCGACGCCGCGTGGGGGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAACCCCTGTCATGTGGGAGCAAGCAGCAATGTTGATAGTACCACAAGAGGAAGAGACGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGTCTCAAGCGTTGTTCGGAATCACTGGGCGTAAAGAGTACGTAGGCTGTTTTCTAAGTCAGGTGTGAAAGGCAGGGGCTCAACCCCTGGACTGCACATGATACTGGGAGACTGGAGTAATGGAGGGGGAACCGGAATTCTCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATCGAGAGGAACACTCGTGGCGAAGGCGGGTTCCTGGACATTAACTGACGCTGAGGTACGAAGGCCAGGGTAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTGGCAGTAAACGGTGCACGCTTGGTGTGAGGGGACTCGACCCCCCTCGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGCGTGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGCTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTAATGAACAACATGTGAAAGCATGCGACTCTTCGGAGGCGTTACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTTGGTTAAGTCCAGCAACGAGCGCAACCCCTGTGGCCAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGGACTCTGGCAAGACTGCCCAGATCAACTGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGGTCAGTATGGCCCTTATGCCCAGGGCTGCACACGTACTACAATGCCCAGAACAGAGGGGGCCGAAGCCGTGAGGCGGAGGAAATCCTGAAAACTGGGCCCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACCCGCCTACACGAAGCCGGAATCGCTAGTAATGGCGCATCAGCTACGGCGCCGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACATCATGGAAGCCGGTCGCACCCGAAGTATCTAGAGCCAACCGCAAGGAGGCAGGGTCCTAAGGGT-3’（SEQ ID NO：6）。
为了进一步确定上述菌株的进化关系，对两株疑似菌株进行了全基因组测序，并将其与阿克曼氏菌属目前仅有的两个成员进行了ANI分析。
结果如图1和图2所示。
结果显示，N21116与阿克曼氏菌属的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansia muciniphilaATCC BAA-835T以及分离自蟒蛇的嗜糖阿克曼氏菌PyT的ANI值分别为68.95%和68.34%，N21169与阿克曼氏菌属的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansia muciniphilaATCCBAA-835T以及分离自蟒蛇的嗜糖阿克曼氏菌PyT的ANI值分别为68.83%和68.49%，满足新物种划分的ANI评判标准（95%-96%）。另外，N21116与N21169之间的序列一致性为98.59%。可见，二者归属为同一菌种。
考虑到两株微生物分离自广西，发明人将其暂命名为广西阿克曼氏菌，拉丁名暂定为Akkermansia guangxiensissp. nov.。
基于本实施例分离的两株广西阿克曼氏菌16S rRNA序列的进化树见图1，其揭示了其归属于疣微菌门、疣微菌纲、疣微菌目、阿克曼氏菌科、阿克曼氏菌属。
将上述实施例中得到的两株阿克曼氏菌（N21116和N21169）于2022年12月2日送至广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼）进行保藏。分类学命名均为：Akkermansiasp.，保藏编号分别为：GDMCC No: 62888和62889。
广西阿克曼氏菌N21116和N21169的耐人工肠液水平
具体具体实验步骤为：取上述实施例中得到的广西阿克曼氏菌N21116和N21169进行过夜培养活化（30℃~37℃，转速150rpm~220rpm），PBS稀释菌液浓度至OD600=1。按体积比10%的接种量，将菌液接种于pH=8的人工肠液中，分别于2h、4h、6h、8h后各取100μL溶液涂布于粘蛋白固体培养基平板中，在厌氧工作站中37℃培养72h后进行单菌落数量计数。并根据单菌落数量计算广西阿克曼氏菌N21116和N21169在人工肠液中的存活率。
其中，人工肠液的制备方法为：取磷酸二氢钾6.8 g，加500 mL水溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，加入10 g胰酶后加水稀释至1000 mL即得。
同时，以嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835作为对照组。
结果如图3所示。
可以发现，在短时间内，短时间内嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835对人工肠液耐受性优于广西阿克曼氏菌N21116和N21169。但处理时间达到8h后，广西阿克曼氏菌N21116和N21169在pH=8.0的人工肠液处理8h后存活率为120%和129%，显著高于嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835（91%）。这说明本发明实施例中的广西阿克曼氏菌N21116和N21169对于肠液耐受性较好，有潜力能在人体胃肠道中长期定殖，可以满足作为益生菌剂的条件。
广西阿克曼氏菌N21116和N21169的安全性评价
为保证上述实施例中得到的广西阿克曼氏菌N21116和N21169在各类用途中的安全性，在本实施例中对两者进行了菌株的安全性评价。
具体检测项目包括：
对上述实施例中得到的广西阿克曼氏菌N21116和N21169进行全基因组测序，检测是否存在毒力因子和致病基因。在序列相似度≥85%和e值<10-5的条件下，与现有VFDB（Virulence Factor Database）毒力因子数据库进行检索，结果未匹配到任何毒力因子和致病基因（具体见表2），因此可以从基因层面断定广西阿克曼氏菌N21116和N21169无致病力风险。
表2 毒力因子和致病基因携带情况
注：“--”表示无。
广西阿克曼氏菌N21116和N21169的抗氧化水平
将上述实施例中得到的广西阿克曼氏菌N21116和N21169分别在合成液体培养基中，37℃厌氧培养72小时后，4℃条件下8000 rpm离心10分钟，以分离上清和细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于PBS中，并将细胞浓度调节至1×1010CFU/mL。超声裂解后，4℃条件下8000 rpm离心10分钟，收集上清液获得无细胞提取物（CFE）。
检测无细胞提取物的羟基自由基、超氧化阴离子自由基清除能力和SOD活力（使用南京建成生物工程研究所的羟自由基测试试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测定试剂盒和总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒），测定方法参考使用说明书。
同时，以嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835和嗜黏蛋白阿克曼氏菌A21028作为对照组。
结果如图4所示。
表明广西阿克曼氏菌N21116在羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率和SOD活力三个指标均显著优于嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835和嗜黏蛋白阿克曼氏菌A21028（P<0.001）。尤其是在羟基自由基清除率方面，广西阿克曼氏菌N21116及N21169两株均达到90%，远高于标准株的65.56%和A21028的73.38%，体现出极为优异的抗氧化能力。而且，广西阿克曼氏N21169也同样优于两种嗜黏蛋白阿克曼氏菌，因此，可以判断阿克曼氏菌N21116和N21169均具有较高的抗氧化能力。
广西阿克曼氏菌N21116和N21169的线虫减脂试验
将上述实施例中得到的广西阿克曼氏菌N21116和N21169培养于合成液体培养基中，将大肠杆菌OP50培养于LB液体培养基中，培养条件均为：温度37℃，时间20h，转速200rpm。分别取广西阿克曼氏菌N21116和N21169和大肠杆菌OP50菌液（菌液浓度均为107CFU/mL）涂板于线虫培养基（nematode growth medium，NGM）上过夜培养。
其中，NGM培养基配方为：氯化钠3g，琼脂粉17g，蛋白胨2.5g，去离子水975mL。将上述组分充分混合均匀后，用锡箔纸封口。高压蒸汽灭菌20min后，水浴锅冷却至55℃。在无菌条件下加入已灭菌的1 mL的1M CaCl2，1mL的1M MgSO4，25mL的1M KPO4buffer，1mL的5mg/mL胆固醇（溶于95%乙醇中）。
将解冻的线虫（秀丽隐杆线虫）离心后分别加至有OP50的NGM培养基上，置于20℃培养箱培养3天。
对实验用线虫进行同期化处理：使用M9缓冲液悬浮培养后的线虫，吸至培养管中，向每管中加入裂解液（质量比5N的NaOH和体积比5%次氯酸钠溶液），裂解6 min，3500 r/min离心1 min，弃上清液，用M9缓冲液反复清洗4次。再次离心弃上清液。将沉淀转移至NGM培养基上，20℃恒温过夜培养，即得L1期线虫幼虫。用M9缓冲液冲洗离心一次后，将线虫幼虫转移至含有OP50的NGM平板上，20℃培养28-30h即可得到同期化线虫，即L4期线虫。
将得到的同期化线虫随机分成三组空白组（OP50）、N21116组和N21169组，每组150条。挑取L4期线虫当天记为第0天，实验过程中，线虫每2天更换一次含有OP50和广西阿克曼氏菌N21116和N21169的NGM培养基。在第7天用冷却的M9缓冲液洗三次后，将线虫重悬在4%的多聚甲醛中。室温下轻微摇动1h，3000~4000rpm离心1 min，去除上清后用M9缓冲液洗两次。随后将线虫重悬在含有60%（v/v）的异丙醇和0.01%（v/v）的Triton X-100的混合PBS溶液中，孵育15 min。待线虫沉降后，去除异丙醇，加入1 mL的40%油红O染色剂，在25℃摇床孵育1~2h使其充分染色。去除染料，用M9缓冲液清洗两次。加入200 μL的M9缓冲液，在倒置荧光显微镜下逐条对线虫拍照。采用Image J统计图像染色区光强度数据。
同时，以嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835和嗜黏蛋白阿克曼氏菌A21028作为对照组。
结果如图5和图6所示。
可以发现喂食嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835的线虫脂肪粒形成的抑制率为33.9%。喂食嗜黏蛋白阿克曼氏菌A21028和广西阿克曼氏菌N21169的线虫脂肪粒形成抑制率42.1%和44.8%，与标准株组没有显著差别（P>0.05）。但广西阿克曼氏菌N21116喂食组的脂肪形成抑制率达到89.0%，与以上三组均存在显著降低55.1%（P<0.01）、46.9%（P<0.0001）和44.2%（P<0.001）。而且，从线虫脂肪染色显微图片（图4）可以直观看出，广西阿克曼氏菌N21116喂食组线虫脂肪粒分布稀疏、粒径更小，线虫体型更加纤细。可见广西阿克曼氏菌N21116减脂效果显著。
广西阿克曼氏菌N21116和N21169抑制结肠癌细胞增殖
将人结肠癌细胞株HCT116培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640（TransGen）培养基中，待细胞生长至对数期时，用胰酶消化后通过血球计数板进行细胞计数。将细胞按照5×103个/孔均匀接种于96孔板中，置于37℃含有5% CO2的细胞培养箱中培养过夜。将活化好的阿克曼氏菌N21116或N21169离心后制备菌悬液，细菌浓度为1×108CFU/mL。取部分菌悬液离心得到菌体后用PBS清洗2次，于70℃水浴锅中灭活30min，得到灭活菌。按照分组：空白组（加入等量PBS）、N21116活菌组、N21169活菌组，N21116灭活菌组、N21169灭活菌组，每组六个重复。与细胞共孵育72h后，利用CCK-8试剂（索莱宝）检测HCT116细胞增殖情况（按使用说明书进行操作）。
同时，以嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCC BAA-835作为对照组。
结果如图7所示。
可以发现，广西阿克曼氏菌N21116和N21169对人结肠癌细胞株HCT116生长抑制率为85%，活菌组和灭活菌组基本相当（P>0.05），且不低于嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株ATCCBAA-835（P>0.05）。可见，广西阿克曼氏菌N21116和N21169的活菌和灭活菌形态均具备不低于标准株的人结肠癌细胞株HCT116生长抑制率，其具有显著的抑制人结肠癌细胞生长的能力。
基于广西阿克曼氏菌N21116或N21169的抗氧化、肿瘤抑制和减脂的产品
取广西阿克曼氏菌N21116或N21169菌株进行发酵扩繁，然后对发酵扩繁后的菌液进行离心、冻干，即得冻干粉。然后按照下述配方进行复配，即可得到含有广西阿克曼氏菌N21116或N21169的产品。
以人体的使用量为标准，按照重量百分含量计算，含有广西阿克曼氏菌N21116或N21169的产品的配方为：10%广西阿克曼氏菌N21116或N21169冻干粉，15%茶多酚（购自善恩康生物科技有限公司），15%杨梅花青素提取物（购自善恩康生物科技有限公司），50%麦芽糊精和10％可溶性膳食纤维（购自善恩康生物科技有限公司）。制备方法为：将上述原料充分混合后即得。
综上所述，由上述试验结果表明，在现有的阿克曼氏菌属中，仅广西阿克曼氏菌N21116和N21169同时兼具优异的抗氧化、减肥降脂和抑制肿瘤生长的功效，且可在人工肠液环境中可以存活，因此，能够说明其有潜力定植在机体胃肠道中，稳定并长久的发挥抗氧化、减肥降脂和抑制肿瘤生长的功效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.阿克曼氏菌，其特征在于，所述阿克曼氏菌为广西阿克曼氏菌N21116，分类学命名为Akkermansia guangxiensis sp.，于2022年12月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No: 62888。
2.阿克曼氏菌，其特征在于，所述阿克曼氏菌为广西阿克曼氏菌N21169，分类学命名为Akkermansia guangxiensis sp.，于2022年12月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No: 62889。
3.含有权利要求1和/或2所述阿克曼氏菌的产品，其特征在于，所述产品为药品。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品中的广西阿克曼氏菌的质量分数大于等于1%。
5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品中的广西阿克曼氏菌的质量分数大于等于8%。
6.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品中的广西阿克曼氏菌的质量分数大于等于10%。
7.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品中还含有其他辅料，所述辅料包括药学上可接受的辅剂。
8.一种含有权利要求1和/或2所述阿克曼氏菌的产品，其特征在于，所述产品中包括有权利要求1和/或2所述阿克曼氏菌的冻干粉、植物提取物、麦芽糊精和膳食纤维。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，按照质量百分比计，所述产品包括5～15%权利要求1和/或2所述阿克曼氏菌冻干粉、15～40%植物提取物、40～60%麦芽糊精和5～15%膳食纤维。
10.权利要求1和/或2所述的阿克曼氏菌在制备产品中的用途；所述产品具有如下（1）～（3）中至少一种功能：
（1）抗氧化；
（2）减脂；
（3）治疗结肠癌。
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