TW202346570A - 屬於艾克曼氏菌(Akkermansia)屬之微生物 - Google Patents
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Abstract
本發明係一種微生物、及以該微生物作為有效成分之用於活化NOD2、激活免疫等之微生物,上述微生物屬於艾克曼氏菌屬,具有包含相對於序列編號:3所記載之核苷酸序列具有超過98.0%之同源性之核苷酸序列等的16S rRNA基因,且具有NOD2促效劑活性,具有對於D-甘露醇之同化性,革蘭氏染色呈陰性,為球狀至短桿狀之厭氧性細菌,氧化酶試驗呈陰性且觸酶試驗呈陽性。
Description
本發明係關於一種屬於艾克曼氏菌(Akkermansia)屬之新穎微生物,更詳細而言,係關於一種該微生物、以及以其作為有效成分之用於活化NOD2(nucleotide-binding oligomerization domain2,核苷酸結合寡聚化結構域2
)之組合物及用於激活免疫之組合物等。
於人體腸道內,多種多樣之腸內微生物聚集並構築了複雜之生態系統。該生態系統亦被稱為腸內微生物群,會對作為宿主之人類之各種生理作用產生影響。因此,在人類健康並長壽之方面上,棲息在腸道內之微生物之種類及其等之多樣性較為重要。
關於作為腸內微生物之1種之屬於艾克曼氏菌屬之微生物,已知其在腸道內之豐度對於各種症狀有效,譬如肥胖、2型糖尿病等代謝障礙、潰瘍性結腸炎、闌尾炎等炎症性疾病。此外,近年來有腦-腸-微生物軸(Brain-Gut-microbiota axis)這一概念,亦報告有艾克曼氏菌之存在量與宿主之性格(社交能力高低)有關(非專利文獻1)。
又,報告有在生活著許多百歲以上長壽者(百歲(centenarian)率較高)之奄美大島(日本),對高齡者之腸內細菌群進行分析後發現,相較於其他地區之同年代高齡者,艾克曼氏菌等之比率較高(非專利文獻2)。進而,亦報告有向早衰症模型小鼠投予艾克曼氏菌後發現,壽命得到延長(非專利文獻3),根據該等結果,提示了艾克曼氏菌於腸內之豐度對宿主之壽命產生較好影響。
如上所述,艾克曼氏菌會對宿主之健康、性格等產生影響,甚至可能延長壽命,故而近年來備受關注,但屬於艾克曼氏菌屬之微生物僅明確有2種(嗜黏蛋白艾克曼氏菌(Akkermansia muchiniphila)、嗜糖艾克曼氏菌(Akkermansia glycaniphila))。
先前技術文獻
非專利文獻
非專利文獻1:Katerina V-A Johnson、Hum Microb J.、「Gut microbiome composition and diversity are related to human personality traits」,2020年3月15日,doi:10.1016/j.humic.2019.100069.
非專利文獻2:森田英利,科學研究費助成事業 研究成果報告書,「針對以奄美群島之百壽者所具有之特徵性腸內細菌群為指標之人類長壽腸內科學之展開」,2021年6月23日
非專利文獻3:Clea Barcena等人,Nat Med.、「Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice1」,2019年8月25日,8卷,1234~1242頁,doi:10.1038/s41591-019-0504-5.
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於,單離出屬於艾克曼氏菌屬之新穎微生物,並提供該微生物。其目的還在於,明確上述微生物對宿主之影響,並提供一種基於該影響之用於改善宿主之健康狀態之組合物。
[解決問題之技術手段]
本發明人等為了達成上述目的而反覆進行了銳意研究,結果,成功地自5名受驗者中3人之糞便中,檢測到屬於艾克曼氏菌屬之微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)之菌落形成。又,確定並比較該等微生物株之16S rRNA(Ribonucleic Acid,核糖核酸)序列,結果表明,均攜帶有包含相同序列(序列編號:3所記載之序列)之16S rRNA基因。
然後,將上述微生物之16S rRNA序列相對於美國國家生物技術資訊中心(以下,稱為NCBI)之rRNA/ITS之基準株資料庫來進行Blast+分析,結果,與已知之嗜黏蛋白艾克曼氏菌(序列編號:1所記載之序列;基因庫寄存號碼AY271254)之同源性為98.0%,與已知之嗜糖艾克曼氏菌之同源性為94.0%(序列編號:2所記載之序列;基因庫寄存號碼KT254068)。進而,對WON2089進行全基因組測序,基於該序列,藉由DFAST進行ANI(Average nucleotide identity,平均核苷酸一致性)分析,與艾克曼氏菌屬之2個菌株進行比較。其結果,與已知之嗜黏蛋白艾克曼氏菌相比,ANI值約為82.5%,與已知之嗜糖艾克曼氏菌相比,ANI值約為77.4%。95%ANI為當前菌種之臨界值,由於低於該值,故表明單離出之微生物株可能為新種類之艾克曼氏菌。
又,於使用API20A之酸產生試驗之結果中,觀察到微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)均與已知之2種艾克曼氏菌同樣地,於D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖中之增殖,但觀察到不同於已知之2種艾克曼氏菌,上述微生物株均於D-甘露醇中亦培育。
進而,對配體活性進行分析後發現,對於已知之2種艾克曼氏菌,未觀察到NOD2促效劑活性,但微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)均觀察到該活性。
再者,NOD2係一種模式識別受體(Pattern Recognition Receptor,PRR),藉由該受體之活化,能夠檢測到已入侵之病原體或變得異常之自體細胞,並將其等排除(所謂自然免疫、後天免疫)。
又,關於WON2089,對IgA(Immunoglobulin A,免疫球蛋白A)分泌促進作用進行評價,結果可知具有該作用,進而還發現較已知之嗜黏蛋白艾克曼氏菌嗜黏蛋白艾克曼氏菌(標準株Muc,strain ATCC BAA-835)之IgA分泌促進作用高2倍以上,從而完成了本發明。
即,本發明提供以下之態樣。
[1]一種微生物,其屬於艾克曼氏菌屬,
其具有包含相對於序列編號:1所記載之核苷酸序列具有98.0%以下之同源性、相對於序列編號:2所記載之核苷酸序列具有94.0%以下之同源性、或相對於序列編號:3所記載之核苷酸序列具有超過98.0%之同源性之核苷酸序列的16S rRNA基因,且
具有以下1)~4)之性質:
1)具有NOD2促效劑活性;
2)具有對於D-甘露醇之同化性;
3)革蘭氏染色呈陰性,為球狀至短桿狀之厭氧性細菌;
4)氧化酶試驗呈陰性,觸酶試驗呈陽性。
[2]一種微生物,其係由寄存號碼NITE BP-03622、NITE BP-03623或NITE BP-03624特定。
[3]如[1]所記載之微生物,其進而相較於嗜黏蛋白艾克曼氏菌之標準株ATCC BAA-835,具有2倍以上之IgA分泌促進作用。
[4]一種用於激活免疫之組合物,其係以如[1]至[3]中任一項所記載之微生物作為有效成分。
[5]一種用於活化NOD2之組合物,其係以如[1]至[3]中任一項所記載之微生物作為有效成分。
[6]一種用於促進IgA之分泌之組合物,其係以如[2]或[3]所記載之微生物作為有效成分。
又,本發明係關於一種如[1]至[3]中任一項所記載之微生物之用途,其係用於製造用於激活免疫之組合物、用於活化NOD2之組合物或用於促進IgA之分泌之組合物。
又,本發明係關於一種如[1]至[3]中任一項所記載之微生物之用途,其係用於激活免疫、用於活化NOD2、或用於促進IgA之分泌。
又,本發明係關於一種如[1]至[3]中任一項所記載之微生物,其係用於激活免疫、用於活化NOD2、或用於促進IgA之分泌。
又,本發明係關於一種用以激活免疫、活化NOD2、或促進IgA之分泌之方法,其係將如[1]至[3]中任一項所記載之微生物之有效量投予至對象。
[發明之效果]
根據本發明,可經由NOD2之活化等來激活免疫。
(屬於艾克曼氏菌屬之新穎微生物)
如後述之實施例所示,本發明人等已成功地自人類之糞便中單離出屬於艾克曼氏菌屬之微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)。而且,可知該等微生物雖與已知之2種艾克曼氏菌(嗜黏蛋白艾克曼氏菌及嗜糖艾克曼氏菌)同屬,但屬於不同種,發現可能為新種。又可知,該等新穎微生物株具有與已知之艾克曼氏菌不同之同化性,進而具有於已知之艾克曼氏菌中未檢測出之NOD2促效劑活性化。
因此,本發明之屬於艾克曼氏菌之新穎微生物(以下,亦簡稱為「本發明之微生物」)係關於如下微生物,其
具有包含相對於序列編號:1所記載之核苷酸序列具有98.0%以下之同源性、相對於序列編號:2所記載之核苷酸序列具有94.0%以下之同源性、或相對於序列編號:3所記載之核苷酸序列具有超過98.0%之同源性之核苷酸序列的16S rRNA基因,且
具有以下1)~4)之性質。
1)具有NOD2促效劑活性;
2)具有對於D-甘露醇之同化性;
3)革蘭氏染色呈陰性,為球狀至短桿狀之厭氧性細菌;
4)氧化酶試驗呈陰性,觸酶試驗呈陽性。
一般而言,「屬於艾克曼氏菌屬之微生物」係指屬於疣微菌門、疣微菌綱、疣微菌目、疣微菌科、艾克曼氏菌屬且革蘭氏染色呈陰性,並具有球狀至短桿狀形狀之厭氧性微生物(細菌)。又,該微生物可將黏蛋白用作碳源及氮源以及能量源。進而,亦具有氧化酶試驗呈陰性,觸酶試驗呈陽性之性質。即,屬於艾克曼氏菌屬之微生物為不具有細胞色素氧化酶但具有觸酶之微生物。再者,作為屬於艾克曼氏菌屬之微生物,於提出本申請之前,已知有A. muciniphila(嗜黏蛋白艾克曼氏菌)、A.glycaniphila(嗜糖艾克曼氏菌)這2種。
本發明之微生物係屬於艾克曼氏菌屬,但至少與上述2種已知之艾克曼氏菌不同之微生物。即,如下微生物:關於16S rRNA基因(16S rDNA)之核苷酸序列之同源性相對於嗜黏蛋白艾克曼氏菌之16S rRNA基因之核苷酸序列(序列編號:1所記載之序列)為98.0%以下(例如97.0%以下、96.0%以下、95.0%以下、94.0%以下、93.0%以下、92.0%以下、91.0%以下、90.0%以下、89.0%以下、88.0%以下、87.0%以下),或相對於嗜糖艾克曼氏菌之16S rRNA基因之核苷酸序列(序列編號:2所記載之序列)為94.0%以下(例如93.0%以下、92.0%以下、91.0%以下、90.0%以下、89.0%以下、88.0%以下、87.0%以下)。又,本發明之微生物可為具有如下16S rRNA基因之微生物,該16S rRNA基因包含相對於序列編號:3所記載之核苷酸序列(WON2089、WON2090及WON2093之16S rRNA基因之核苷酸序列)具有超過98.0%(例如98.5%以上、98.7%以上、99.0%以上、99.5%以上、99.7%以上、100.0%)之同源性的核苷酸序列。
再者,於本發明中,「同源性」可意指類似性(similarity)或一致性(identity)。又,「同源性」尤其可意指一致性(identity)。核苷酸序列之同源性可利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,基本局域比對檢索工具)等之比對程式來確定。例如,核苷酸序列之同源性可例舉使用相對於NCBI之rRNA/ITS之基準株資料庫之BLAST+(美國國家生物技術資訊中心)等所算出之序列間之同源性,更具體而言,可例舉對該BLAST+使用預設參數(即使用初始設定之參數)算出之序列間之同源性。又,於本發明中,同源性係用對如此算出之數值之小數點第2位進行四捨五入後所得之值表示。
本發明之微生物可為如下微生物:於ANI(平均核苷酸一致性)分析中,與已知之艾克曼氏菌(例如,嗜黏蛋白艾克曼氏菌)之全基因組序列相比所獲得之值未達95%(例如93%以下、90%以下、87%以下、85%以下、83%以下、80%以下)。再者,ANI值例如如後述之實施例所示,可利用DFAST並使用預設參數(即使用初始設定之參數)而獲得。又,基因組DNA中之GC(guanine-cytosine,鳥嘌呤胞嘧啶)含量較佳為56~57莫耳%(尤其是56.8莫耳%)。
又,本發明之微生物如後述之實施例所示,於同化性中亦具有與上述2種已知之艾克曼氏菌部分不同之性質。即,本發明之微生物之特徵在於至少對於D-甘露醇具有同化性(可合成代謝D-甘露醇之性質),較佳為進而對於麥芽糖不具有同化性(具有無法合成代謝麥芽糖之性質)。又,本發明之微生物還可具有下述與合成代謝有關之性質中之至少1種性質(例如,可進而具有2種以上性質、4種以上性質、5種以上性質、7種以上性質、10種以上性質、11種以上性質、12種以上性質、13種以上性質、14種性質)。
與合成代謝有關之性質:
可合成代謝D-葡萄糖之性質、可合成代謝乳糖之性質、可合成代謝D-甘露糖之性質、無法合成代謝白糖之性質、無法合成代謝柳苷之性質、無法合成代謝D-木糖之性質、無法合成代謝L-阿拉伯糖之性質、無法合成代謝甘油之性質、無法合成代謝D-纖維雙糖之性質、無法合成代謝D-蜜三糖之性質、無法合成代謝D-棉子糖之性質、無法合成代謝D-山梨糖醇之性質、無法合成代謝L-鼠李糖之性質、及無法合成代謝D-海藻糖之性質。
再者,於本發明中,「同化性」特指糖同化性(由糖產生酸之性質)。又,該同化性之有無可藉由公知之酸產生試驗來判定,該公知之酸產生試驗如後述之實施例所示,例如使用API(Application Programming Interface,應用程式介面)系統(Apikenki)等。
又,本發明之微生物如後述之實施例所示,在對於模式識別受體之促效劑活性方面,亦具有與上述2種已知之艾克曼氏菌不同之性質。即,本發明之微生物之特徵亦在於具有該等已知者所不具有之NOD2促效劑活性。進而,本發明之微生物可具有與已知之艾克曼氏菌(例如,嗜黏蛋白艾克曼氏菌(strain ATCC BAA-835)、嗜糖艾克曼氏菌(strain DSM100705))相比高1.5倍以上(較佳為1.7倍以上,更佳為2倍以上)之TLR(Toll-like receptor,類鐸受體)2促效劑活性,又,亦可具有高1.2倍以上(較佳為1.3倍以上,更佳為1.5倍以上)之TLR4促效劑活性。
再者,於本發明中,「NOD2」係亦稱為核苷酸結合寡聚化結構域2之蛋白質,若源自人類,則例如為包含NCBI參考序列(RefSeq)ID:NP_001280486、NP_071445或NP_001357395所記載之胺基酸序列之蛋白質。「TLR2」係亦稱為類鐸受體2之蛋白質,若源自人類,則例如為包含RefSeq ID:NP_001305716、NP_001305718、NP_001305719、NP_001305720、NP_001305722、NP_001305724、NP_001305725或NP_003255所記載之胺基酸序列之蛋白質。「TLR4」係亦稱為類鐸受體4之蛋白質,若源自人類,則例如為包含RefSeq ID:NP_003257、NP_612564或NP_612567所記載之胺基酸序列之蛋白質。
上述對於模式識別受體之「促效劑活性」係指因源自微生物之成分識別上述受體(與之結合)而使該受體活化的性質。關於本發明之促效劑活性,不僅包括上述受體本身之活化(例如,多聚體化),還包括由該活化產生之下游訊號傳遞之活化(例如,經活化之NOD2與作為其下游分子之RICK之結合、利用RICK之IKK複合體之活化、作為NF-κB之抑制分子之IκB之分解、因該分解而游離之NF-κB之核內轉移、利用該轉移之轉錄活化、由此產生之炎症反應等)。又,關於上述促效劑活性,可由業者,例如藉由使用如後述實施例所示之導入有模式識別受體基因及報導基因之細胞(報告實驗系統)來進行定量評價。又,於本發明中,「具有NOD2促效劑活性」可由業者根據所使用之評價系統來適當地判斷,例如,關於如後述之實施例所示之報導實驗系統,當於受檢微生物(10
7個/實驗系統)之存在下培養導入有上述報導基因之細胞所獲得的促效劑活性值顯著高於在無該微生物存在下(例如,僅培養基)培養該細胞所獲得的促效劑活性值時,可判斷該受檢微生物具有NOD2促效劑活性。再者,關於該判斷中之顯著性,可由業者根據作為對象之樣本數(N數)等,適當選擇公知之統計學方法來評價。例如,如後述之實施例所示,於N數為3以上(例如,4或5)之情形時,當藉由進行司徒頓t檢定(Student's t-test)所獲得之P值小於0.01時,可判斷為差異顯著。又,當與在陽性對照(例如,胞壁醯二肽(MDP)10 μg/實驗系統)之存在下培養導入有上述報導基因之細胞所獲得之促效劑活性值相比,在受檢微生物(10
7個/實驗系統)之存在下培養該細胞所獲得之促效劑活性值至少為4分之1(較佳為3分之1以上)時,亦可判斷為受檢微生物具有NOD2促效劑活性。
又,本發明之微生物如後述之實施例所示,可具有較高之IgA分泌促進作用。「IgA分泌」係指來自黏膜(於本發明中尤其是腸道黏膜)之IgA(亦被稱為IgA抗體、免疫球蛋白A之物質)之分泌,該分泌之促進作用「較高」係指該作用與已知之艾克曼氏菌(例如,嗜黏蛋白艾克曼氏菌(strain ATCC BAA-835))相比為2倍以上(較佳為3倍以上,更佳為4倍以上)。又,關於上述IgA分泌促進作用,可由業者,例如藉由使用如後述之實施例所示之含有派亞氏淋巴叢之培養系統,並免疫學地檢測於該系統中分泌出之IgA量(例如,藉由ELISA(Enzyme Linked I mmunosorbent Assay,酵素結合免疫吸附分析)法)而進行定量評價。
又,本發明之微生物還可具有如後述之實施例所示之酵素活性。具體而言,可具有選自由萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶及N-乙醯基-β-胺基葡萄糖甘酶所組成之群中之至少1種酵素之活性(例如,可具有2種、3種或4種酵素之活性)。又,可不具有選自由鹼性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、脂肪酶(C14)、白胺酸芳基醯胺酶、纈胺酸芳基醯胺酶、胱胺酸芳基醯胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶及α-岩藻糖苷酶所組成之群中之至少1種酵素之活性(例如,可不具有5種以上、7種以上、10種以上、12種以上或15種酵素之活性)。再者,如後述之實施例所示,上述酵素活性之有無例如可藉由使用APIZYM之公知之酵素活性試驗來判定。
又,本發明之微生物還可具有如後述之實施例所示之菌體脂肪酸組成。例如,較佳為包含於已知之2種艾克曼氏菌中未檢測到之13:0 anteiso。又,作為其比率,較佳為0.05%以上(例如,0.06%、0.07%、0.08%、0.1%)。另一方面,較佳為不包含於已知之2種艾克曼氏菌檢測到之Summed Feature 1(作為其比率,例如未達0.1%、0.05%以下、0.01%以下)。又,最主要之菌體脂肪酸為15:0 anteiso,其比率較佳為47%以上(例如,50%以上、52%以上、55%以上)。此外,較佳為以10%以下(例如,7%以下、5%以下)之比率含有C15:0,較佳為以0.12%以上(例如,0.15%以上、0.2%以上)之比率含有C15:0 iso 3OH,較佳為以0.25%以上(例如,0.3%以上、0.35%以上、0.4%以上)之比率含有Sum In Feature 6,較佳為以0.2%以上(例如,0.25%以上、0.3%以上)之比率含有C17:0 iso,較佳為以1%以上(例如,1.2%以上、1.5%以上、1.7%以上、1.8%以上)之比率含有C17:0 anteiso,較佳為以0.5%以上之比率含有C18:2 w6,9c,較佳為以4%以上(例如,5%以上、5.5%以上)之比率含有C18:1 w9c,較佳為以0.4%以上之比率含有Sum In Feature 10,較佳為以0.8%以上(例如,0.9%以上)之比率含有C18:0,較佳為以0.1%以上(例如,0.15%以上、0.2%以上)之比率含有Sum In Feature 11,或較佳為以0.3%以上(例如,0.4%以上、0.5%以上、0.6%以上)之比率含有C17:0 anteiso 3OH。
再者,如後述之實施例所示,菌體脂肪酸組成例如可按照Sherlock微生物鑑定系統(Sherlock微生物鑑定系統)之菌體脂肪酸組成分析手冊來進行分析。又,關於脂肪酸之標示,參照後記之表8。
又,本發明之微生物較理想為示出如後述之實施例所示之培育條件。例如,關於培育溫度,於在含有0.1%黏蛋白之改良GAM(Gifu Anaerobic Medium,岐阜厭氧培養基)瓊脂培養基中培養120小時之情形時,較佳為可於25~45℃下培育(增殖),更佳為可於30~40℃下培育,進而較佳為可於30~37℃下培育。進而於相同條件下,亦較理想為於20℃以下及/或50℃以上時無法培育。即,最佳培育溫度為30℃~40℃,較理想為於20℃以下及/或50℃以上時確認不到增殖。又,關於培育pH值,於在含有0.1%黏蛋白之改良GAM瓊脂培養基中以37℃培養120小時之情形時,較佳為可於pH值5.5~9.5下培育,更佳為可於pH值6.0~8.5下培育,進而較佳為可於pH值6.5~8.0下培育。進而於相同條件下,亦較理想為於pH值5.0以下及/或pH值10.0以上時無法培育。即,最佳pH值為6.0~8.5,較理想為於pH值5.0以下及/或pH值10.0以上時確認不到增殖。
本發明之微生物可由業者基於公知之方法適當製備。例如,可藉由將人類、非人類哺乳動物(例如,豬及牛等偶蹄類、老鼠等囓齒類)、家禽、爬蟲類等之消化道內容物(糞便等)如後述之實施例所示,於厭氧性條件下,於艾克曼氏菌培養用之公知培養基(例如,黏蛋白培養基(Mucin Medium)、含黏蛋白之改良GAM培養基、含胰化酪蛋白大豆之培養基)中進行培養來製備。
又,如後述之實施例所示,WON2089、WON2090及WON2093係本發明之微生物之尤佳態樣。
WON2089已於2022年3月17日寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號室)(識別標示:WON2089,寄存號碼:NITE BP-03622)。
WON2090已於2022年3月17日寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(識別標示:WON2090,寄存號碼:NITE BP-03623)。
WON2093已於2022年3月17日寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(識別標示:WON2093,寄存號碼:NITE BP-03624)。
因此,該等菌株可藉由向上述寄存中心進行申請來獲取。
又,本發明之微生物只要屬於艾克曼氏菌,且至少具有NOD2促效劑活性,則亦可為藉由變異處理、基因重組、選擇自然變異株等進行育種後所得之微生物。上述「變異株」意指包含:業者對特定微生物(菌株),藉由業者周知之方法,於不會使其性質產生變化之範圍內使其變異後所得者;藉由選擇自然變異株等進行育種後所得者;或業者可確認與其同等者。又,本發明之微生物不限於寄存或登記在規定機關內之株本身(以下,亦稱為「寄存株」),亦包含與其實質上同等之株(亦稱為「衍生株」或「誘導株」)。作為本發明之寄存株,例如可例舉上述WON2089、WON2090及WON2093。又,「與寄存株實質上同等之株」意指屬於艾克曼氏菌,且至少具有NOD2促效劑活性之株。與寄存株實質上同等之株例如可為以該寄存株為母株之衍生株。作為衍生株,可例舉由寄存株進行育種所得之株或由寄存株自然產生之株。
本發明之微生物可為生菌亦可為死菌體,亦可為生菌及死菌體這兩者。作為「死菌體」,例如可例舉:加熱處理體、焙燒處理體、蒸煮處理體、放射線(γ射線等)照射處理體、酵素處理體、藥物(抗生素等)處理體、化學物質(福馬林等)處理體、超音波處理體。又,本發明之微生物之形態並無特別限定,可為液體或固體之任一種,但就製造時或保管時容易處理之觀點而言,該形態適宜為乾燥形態(例如菌粉末狀等)。乾燥物可藉由如下方法製備:對使菌體分散於溶劑(水等)中所得之懸濁液進行乾燥。乾燥方法並無特別限制,例如可例舉噴霧乾燥(spray dry)法、冷凍乾燥法。殺菌方法並無特別限制,可例舉:蒸煮殺菌法、UHT(Ultra Heat Treated,超高溫處理)殺菌法、空氣殺菌法、加壓殺菌法、高壓蒸氣殺菌法、乾熱殺菌法、流通蒸氣消毒法、電磁波殺菌法、電子束殺菌法、高頻殺菌法、輻射殺菌法、紫外線殺菌法、氧化乙烯氣體殺菌法、過氧化氫電漿殺菌法、化學殺菌法(酒精殺菌法、福馬林固定法、電解水處理法)等。又,亦可視情形,於利用加熱等進行殺菌處理之前後,或乾燥處理之前後,進行界面活性劑處理、磨碎、粉碎處理、酵素處理、分化處理等,藉由該等處理所獲得者亦可包含於本發明之組合物中。
又,於本發明中,不僅可以上述菌體之態樣提供,亦可以該微生物之構成物質、即微生物本身之成分(所謂菌體成分。例如,構成該微生物之胺基酸、肽、核酸、糖、脂質、維生素、激素、及其等之複合體、以及其等與磷、硫金屬元素之複合體等)之態樣提供。
進而,於本發明,亦可為本發明之微生物之培養物。培養物可為包含該微生物者(包含增殖後之該微生物之培養液、固體培養基等),該培養物之形態並無特別限定,可為液體或固體之任一種,但就製造時或保管時容易處理之觀點而言,該形態適宜為乾燥形態(例如培養乾燥物等)。再者,該培養乾燥物等亦可由業者使用上述乾燥方法來適當製備。
(組合物)
如後述之實施例所示,上述本發明之微生物至少具有NOD2促效劑活性。因此,本發明提供一種用於在對象中活化NOD2之組合物,其含有本發明之微生物作為有效成分。
進而,上述本發明之微生物亦可具有較高之IgA分泌促進作用。因此,本發明提供一種用於在對象中促進IgA之分泌之組合物,其含有本發明之微生物作為有效成分。
又,NOD2係一種模式識別受體,藉由活化該受體,可檢測已入侵之病原體或變得異常之自體細胞,並將其等排除(自然免疫、後天免疫)。因此,本發明提供一種用於在對象中激活自然免疫及/或後天免疫之組合物,其含有本發明之微生物作為有效成分。
進而,於黏膜組織中分泌之IgA於該組織表面上阻止病原體等之入侵(所謂黏膜免疫)。因此,本發明提供一種用於在對象中激活黏膜免疫之組合物,其含有本發明之微生物作為有效成分。
又,如上所述,本發明提供一種用於在對象中激活免疫之組合物,其含有本發明之微生物作為有效成分。
上述組合物中作為有效成分含有之本發明之微生物不僅可為上述菌體(生菌、死菌體),亦可為其菌體成分、培養物之形態。例如,作為用於活化NOD2之組合物之有效成分,可例舉源自本發明之微生物之肽聚糖(較佳為具有類MDP結構之肽聚糖)作為較佳者。作為用於激活自然免疫及/或後天免疫之組合物之有效成分,除上述肽聚糖以外,就活化TLR2或TLR4之觀點而言,亦可例舉脂磷壁酸、脂蛋白質、脂阿拉伯甘露聚糖、酵母聚糖、脂多糖(LPS)、脂質A作為其較佳例。又,作為用於促進IgA之分泌之組合物之有效成分,可例舉Pam
3CSK
4、脂磷壁酸、LPS作為較佳例。
本發明之組合物可為醫藥組合物(醫藥品、凖藥品等)、食品組合物(飲食品、動物用飼料等)、或細胞實驗、模型動物實驗等中所使用之試劑之形態。又,本發明之組合物可根據作為有效成分之本發明之微生物之形態,藉由公知之製劑學方法進行製劑化。例如,可製成膠囊劑、錠劑、丸劑、液劑、散劑、顆粒劑、細粒劑、膜衣劑、圓粒劑、口含劑、舌下劑、咀嚼劑、口頰錠(buccal)劑、糊劑、糖漿劑、懸浮劑、酏劑、乳劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、敷劑、經皮吸收型製劑、洗劑、抽吸劑、霧劑、注射劑、栓劑等,以經口或非經口之方式使用,但就非侵入性且可簡便地攝取之觀點而言,較理想為經口攝取。
於該等製劑化中,可與藥理學上或作為飲食品所容許之載體,具體而言,可與生理鹽水、殺菌水、培養基、植物油、溶劑、賦形劑、基劑、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、香味劑、芳香劑、媒劑、防腐劑、結合劑、稀釋劑、等張劑、鎮痛劑、增量劑、崩解劑、緩衝劑、包衣劑、潤滑劑、著色劑、甜味劑、黏稠劑、矯味矯臭劑、增溶劑或其他添加劑等適當組合。
又,於該等製劑化中,鑒於本發明之微生物為腸內微生物這一點,尤其是於以經口投予為目的之製劑中,可與能夠將本發明之微生物高效率地傳遞至腸道內之組合物組合。此種能夠傳遞至腸道內之組合物並無特別限制,可適當採用公知之組合物,例如可例舉:pH值敏感性組合物、抑制釋放至腸道之組合物(纖維素系聚合物、丙烯酸聚合物及共聚物、乙烯酸聚合物及共聚物等)、特異性地黏附於腸道黏膜之生物黏附性組合物(例如,美國專利第6368586號說明書所記載之聚合物)、含有蛋白酶抑制劑之組合物、由腸道內酵素特異性地分解之組合物。
於將本發明之組合物用作醫藥組合物之情形時,可與用於免疫之激活等之公知之物質併用。作為該公知之物質,例如可例舉:乳酸菌、雙叉乳酸桿菌等益生菌、益菌助生質。
於將本發明之組合物用作食品組合物之情形時,例如可為健康食品、功能性食品、特定保健用食品、營養功能食品、功能性標示食品、營養輔助食品、病人用食品、或動物用飼料。再者,功能性食品通常基於其作用機制,被分類為益生菌、生物源、益菌助生質、合生元這4種,於本發明中,可採用益生菌、生物源、合生元、益菌助生質之態樣。
本發明之飲食品除了可以如上所述之組合物之形式攝取以外,亦可以各種飲食品之形式攝取。作為飲食品之具體例,可例舉:功能性飲料、飲劑、果凍狀飲料、清涼飲料水、乳飲料、茶飲料、酒精飲料、湯類等液狀食品;酸乳酪、優酪乳等醱酵食品、醱酵飲料;食用油、調味醬、蛋黃醬、人造奶油等包含油分之製品;飯類、麵類、麵包類等含碳水化合物食品;火腿、香腸等畜產加工食品;日式魚糕、魚貝乾貨、醃製食品等水產加工食品;醃菜等蔬菜加工食品;果凍等半固體狀食品;味噌等醱酵食品;西式點心類、日式點心類、糖果類、口香糖類、軟糖、冷凍甜點、冰淇淋等各種點心類;咖喱、澆汁菜、中式湯等蒸煮製品;速食湯、速食味噌汁等速食食品或微波爐食品等。進而,亦可例舉製備成粉末、顆粒、錠劑、膠囊劑、液狀、糊狀或果凍狀之健康飲食品。再者,本發明中之飲食品之製造可藉由該技術領域中公知之製造技術來實施。於該飲食品中,亦可添加對免疫之激活等有效之1種或2種以上之成分(例如,其他腸內微生物、對本發明之微生物於腸道等中之增殖有效之成分)。又,亦可藉由與發揮除該激活等以外之功能之其他成分或其他功能性食品組合,而製成多功能性飲食品。
再者,作為上述「其他腸內微生物」,並無特別限制,可例舉:乳酸菌、雙叉乳酸桿菌等益生菌。作為上述「對本發明之微生物於腸道等中之增殖有效之成分」,例如可例舉:N-乙醯D-葡萄糖胺、N-乙醯D-半乳胺糖、多酚。
又,於本發明中所提出之飲食品組合物中,亦可作為顯示出保健用途之飲食品提供、銷售。「顯示」行為包含對需要者告知上述用途之所有行為,可為將能夠直接識別上述用途之表述、或能夠想起、類推出上述用途等之表述附在組合物本身上者,亦可為附在裝有組合物之容器、包裝材或隨附文件中者。又,「顯示」亦可為藉由傳單、說明書、彈出式廣告、目錄、海報、書籍、DVD(Digital Versatile Disc,數位化多功能光碟)等記憶媒體、電子公告板或網際網路等之廣告等,將本發明之組合物有效這一內容作為本發明組合物之相關資訊進行顯示、宣傳者。
<免疫之激活方法等>
本發明亦提供一種於對象中活化NOD2之方法、促進IgA之分泌之方法、或激活免疫之方法,該等方法之特徵在於:向對象投予或使其攝取本發明之微生物、或包含該微生物作為有效成分之組合物(上述本發明之組合物)。再者,於本發明中,被激活之「免疫」如上所述,可例舉自然免疫、後天免疫、黏膜免疫,更具體而言,可例舉:排除病原菌等、誘導抗菌肽(α防禦素等)之產生、促進輔助T細胞之分化、及控制腸內細菌。
本發明中之免疫之激活等之「對象」為包含人類之動物。作為除人類以外之動物,並無特別限制,可將各種家畜、家禽、寵物、實驗用動物等作為對象。具體而言,可例舉:豬、牛、馬、綿羊、山羊、雞、野鴨、鴕鳥、家鴨、狗、貓、兔、倉鼠、小鼠、大鼠、猴等,但並不限於其等,例如可例舉:感覺到免疫功能降低者、高齡者、欲激活免疫功能者。又,即便為對免疫功能無特別之擔憂等者,亦可以免疫功能之激活等為目的而日常攝取。
又,本技術可用於治療性目的,亦可用於非治療性目的。「非治療性用途」之概念如下:不包含醫療行為即藉由治療對人體進行處置之行為。例如可例舉健康增進等。
於投予或攝取本發明之微生物、或包含該微生物作為有效成分之組合物(上述本發明之組合物)之情形時,其投予量或攝取量係根據對象之年齡、體重、健康狀態、組合物之種類(醫藥品、飲食品等)、有效成分之形態(例如生菌、死菌體、菌體成分、培養物)等來適當選擇。
本發明之微生物(生菌或死菌體)之含量或使用量並無特別限定,於上述組合物中為1×10
4~1×10
12、更佳為1×10
6~1×10
12、進而較佳為1×10
8~1×10
12。再者,單位為CFU/g或CFU/mL、或cells(個)/g或cells(個)/mL。CFU表示菌落形成單位(Colony forming unit)。
又,本發明之微生物(生菌或死菌體)之每天投予量並無特別限定,較佳為每天1×10
4~1×10
12,亦可為1×10
6~1×10
12,進而可為1×10
8~1×10
12。再者,單位為CFU/天、或cells(個)/天。
又,上述數值範圍之上限值及下限值之組合僅為例示,其等之組合可適當變更。又,於有效成分為微生物之成分、培養物之情形時,例如可設為與上述菌體量相對應之成分量、培養物量。
再者,作為本發明之微生物、或包含該微生物作為有效成分之組合物(上述本發明之組合物)之投予或攝取量如上所述,但可每天1次或分成複數次(例如2次、3次)投予或攝取。又,投予或攝取期間亦可根據免疫功能之狀態中止,但亦可不中止而連續投予或攝取。再者,關於「連續」,可每天連續,亦可為間隔一定時間之連續,但就效果之方面而言,較佳為每天連續投予或攝取本發明之微生物、或包含該微生物作為有效成分之組合物。
[實施例]
以下,基於實施例更具體地說明本發明,但本發明並不限定於以下之實施例。又,本實施例係使用下述方法,單離出屬於艾克曼氏菌屬之新穎微生物,並對該等微生物之性質進行分析。
(微生物之單離方法)
於大塚製藥股份有限公司大津營養製品研究所(日本滋賀縣大津市),對屬於同所之5名成人進行采便,並將所採取之糞便儘可能快地轉移至厭氧室。使糞便懸浮於以成為0.5 g/L之濃度之方式添加有半胱胺酸之生理鹽液中,連續稀釋後,植菌於黏蛋白培養基(Mucin Medium)(組成示於下述表1)中,於37℃之厭氧室內進行液體培養(最長培養7天)。
[表1]
黏蛋白培養基 | ||||||
KH 2PO 4 | 0.4 g/L | |||||
Na 2HPO 4 | 0.53 g/L | |||||
NH 4Cl | 0.3 g/L | |||||
NaCl | 0.3 g/L | |||||
MgCl 2•6H 2O | 0.1 g/L | |||||
CaCl 2 | 0.11 g/L | |||||
鹼性微量元素溶液 *1 | 1 ml/L | |||||
酸性微量元素溶液 *2 | 1 ml/L | |||||
刃天青 | 0.5 mg/L | |||||
NaHCO 3 | 4 g/L | |||||
Na 2S•9H 2O | 0.25 g/L | |||||
商業豬胃黏蛋白(類型II;Sigma) | 0.5%(w/v) | |||||
*1:鹼性微量元素溶液 | ||||||
Na 2SeO 3 | 0.1 mM | |||||
Na 2WO 4 | 0.1 mM | |||||
Na 2MoO 4 | 0.1 mM | |||||
NaOH | 10 mM | |||||
*2:酸性微量元素溶液 | ||||||
FeCl 2 | 7.5 mM | |||||
H 3BO 4 | 1 mM | |||||
ZnCl 2 | 0.5 mM | |||||
CuCl 2 | 0.1 mM | |||||
MnCl 2 | 0.5 mM | |||||
CoCl 2 | 0.5 mM | |||||
NiCl 2 | 0.1 mM | |||||
HCl | 50 mM | |||||
將確認到微生物之增殖之培養液於黏蛋白培養基中連續稀釋後,塗佈於黏蛋白培養基瓊脂培養板,於37℃下進行厭氧培養。再者,每個受驗者之糞便製備1個培養板。然後,自各培養板中儘可能地拾取菌落,再次接種至黏蛋白培養基中,進行厭氧培養。然後,於觀察到增殖之培養液中以最終濃度成為10%之方式添加甘油後,分注成1 ml等分,於-80℃下保存以作為原液。
(微生物之16S rRNA基因之定序)
將製備上述原液時獲得之培養液之一部分提供給98℃ 15分鐘之熱處理,提取DNA。將該DNA作為模板,使用bacterial 16S rRNA PCR kit Fast(Takara Bio公司製造),對編碼一部分16S rRNA之DNA區域之800 bp進行擴增後,藉由桑格測序(ABI PRISM 3500xL Genetic Analyzer System)來確定上述區域之序列。而且,對於所確定之序列,進行利用NCBI Blast(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)所進行之16S rRNA系統分析,選拔出被分類為艾克曼氏菌屬之微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)。再者,該等3種微生物株分別自3名不同受驗者中單離出。
又,於Techno Suruga Lab股份有限公司(日本靜岡縣靜岡市),藉由以下順序確定該等微生物株之16S rRNA之大致全長序列。
・將自上述微生物株提取出之DNA作為模板,藉由使用通用引子9F及1510R之PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)來擴增16S rRNA之編碼區域。
・對所獲得之PCR產物進行純化後,將其提供給使用9F/515F/536R/926R/1099F/1510R引子及ABI PRISM 3500xL Genetic Analyzer System之序列分析,確定其等之序列。
進而,將如此獲得之全長序列提供給相對於NCBI之rRNA/ITS之基準株資料庫之Blast+分析,算出與已知之屬於艾克曼氏菌屬之微生物株之同源性等。
(系統樹之創建)
進而,自NCBI之資料庫獲取已知之屬於艾克曼氏菌屬之微生物株(嗜黏蛋白艾克曼氏菌、嗜糖艾克曼氏菌)及屬於疣微菌門之代表株之16S rRNA序列,使用MEGA版本10.2.5,藉由近鄰結合(neighbor joining)法(bootstrap 1000次重複)創建系統樹。
(微生物之基因組分析)
將上述微生物株(WON2089)接種至培養基(含有胰酪腖大豆肉湯培養基(BD)、2 g/L之N-乙醯D-葡萄糖胺(和光純藥工業公司製造)、4 g/L之蘇胺酸(和光純藥工業公司製造)及0.05%半胱胺酸(和光純藥工業公司製造)),於厭氧條件下,於37℃下培養24小時。
使用NucleoBond(註冊商標) HMW DNA(takara bio公司製造),自所獲得之培養物中提取DNA。使用Short Read Eliminator(Circulomics公司製造)處理其DNA 2000 ng,去除大致10 Kbp以下之低分子DNA。重複2次該低分子去除操作,製備基因組DNA。
使用連接測序套組(Nanopore公司製造),根據所獲得之基因組DNA(400 ng)製備奈米孔測序用基因庫。然後,使用MinION流槽FLO-MIN106 R9.41revD進行測序分析(長讀長測序分析)。
又,使用Illumina Nextera DNA Flex Library Prep Kit(illumina公司製造),按照其操作說明並根據上述基因組DNA(500 ng)製備基因庫。然後,以最終濃度成為15%之方式添加PhiX,利用MiSeq實施155 bp×2之序列分析(短讀長測序分析)。
根據下述條件,自如此獲得之長讀長及短讀長中去除低質量之序列。
・短讀長係去除Q30以下,長讀長測序係去除Q10以下
・短讀長係去除20 bp以下,長讀長係去除3,000 bp以下
・去除殘存之轉接序列。
而且,藉由flye版本2.7(https://www. nature. com/articles/s41587-019-0072-8)及unicycler版本0.4.8(https://pubmed. ncbi. nlm. nih. gov/28594827/)來集合序列資料,獲得1個環狀序列。進而,藉由Pilon版本1.23(https://pubmed. ncbi. nlm. nih. gov/25409509/),於環狀序列中出現錯配之情形時進行修正,獲得1個最終之環狀序列。
又,根據如此獲取之環狀序列算出GC含量。進而,利用DFAST(https://pubmed. ncbi. nlm. nih. gov/29106469/)進行分析,獲取ANI(平均核苷酸一致性)值。
(微生物之細胞形態觀察)
將上述微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)分別接種至瓊脂培養板(含有改良GAM(Nissui公司製造)及0.1%黏蛋白),於厭氧條件、37℃下培養48小時。刮取所形成之菌落,塗抹於載玻片,使用纖維G「Nissui」(Nissui Pharmaceutical公司製造)進行革蘭氏染色。然後,藉由光學顯微鏡觀察形態。
(同化性)
將上述微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)分別接種至瓊脂培養板(含有改良GAM及0.1%黏蛋白),於厭氧條件、37℃下培養48小時。用棉棒刮取所形成之菌落,並使之懸浮於厭氧性菌生化學鑑定套組API20A(Biomerieux Japan公司製造)配套之培養基中。於厭氧條件下(N
2:CO
2:H
2/90:5:5)培養48小時,判定酸產生。
另外,將由棉棒刮取出之菌落懸浮在殺菌生理鹽水中後,使用酵素活性試驗用套組APIZYM,按照其操作說明(http://products. sysmex-biomerieux. net/product/pdf/25207E)來判定酵素活性。
(脂肪酸測定)
將上述微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)分別接種至瓊脂培養板(含有改良GAM及0.1%黏蛋白),於厭氧條件、37℃下培養48小時。刮取所形成之菌落,進行冷凍乾燥。然後,使用菌體脂肪酸組成分析系統Sherlock微生物鑑定系統(版本6.0),按照其手冊來測定脂肪酸。
(最佳培育溫度、pH值之確定)
將上述微生物株(WON2089)接種至液體培養基(含有改良GAM及0.1%黏蛋白),於厭氧條件下培養120小時。在其培養過程中,在10~50℃之範圍內調整培育溫度,在4.5~10之範圍內調整pH值,而實施試驗。
(配體分析)
將上述微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)接種至培養基(含有TRYPTICASE SOY BROTH(BD公司製造)、2 g/L之N-乙醯D-葡萄糖胺(和光純藥工業公司製造)、4 g/L之蘇胺酸(和光純藥工業公司製造)及0.05%半胱胺酸(和光純藥工業公司製造)),於厭氧條件下、37℃下培養24小時。於室溫下提供給10,000 g、5分鐘之離心處理,去除培養基後,利用大塚生理鹽水清洗菌體,再次於室溫下,提供給10,000×g、5分鐘之離心處理,並集菌。然後,以成為10
7微生物/20 μl之方式懸浮於大塚生理鹽水中,提供給70℃、30分鐘之加熱處理。再者,微生物數係藉由螢光染色法來測定。
另一方面,將下述人類胚胎腎細胞(HEK)轉形體於潛伏期培養基(含有DMEM(Thermofisher Scientific公司製造)、50 U/ml青黴素(penicillin)(Thermofisher Scientific公司製造)、50 μg/ml鏈黴素(streptomycin)(Thermofisher Scientific公司製造)、HEK-Blue Selection(Invivogen公司製造)及10% FBS(Thermofisher Scientific公司製造))中,於37℃、5%CO
2下維持培養。
HEK-Blue hTLR2(Invivogen公司製造,hkbhtlr2)、
HEK-Blue hTLR4(Invivogen公司製造,hkbhtlr4)、
HEK-Blue hNOD2(Invivogen公司製造,hkbhnod2)。
再者,於該等HEK轉形體中穩定地組入有各種模式識別受體(PRR)基因(hTLR2、hTLR4、hNOD2)及報導基因(SEAP)。於上述轉形體中,於PRR促效劑之存在下,隨著該PRR之活化,SEAP之表現得到促進。因此,可將根據該表現而變化之試劑(QuantiBlue Solution)之顏色(吸光度)作為指標,而對上述微生物株之PRR促效劑活性進行評價。
然後,將如此維持之細胞用潛伏期培養基調整為2.0x 10
5細胞/ml,於96孔培養板中每孔接種180 μl。細胞接種後,將調整為10
5微生物/20 μl、10
6微生物/20 μl、10
7微生物/20 μl之菌體以每孔20 μl之方式添加至96孔培養板中,並培養24小時。再者,分別使用Pam3CSK4(TLR2促效劑,富士膠片和光純藥工業公司製造)、LPS from Escherichia coli O111:B4(TLR4促效劑,Sigma公司製造)、MDP(NOD2促效劑,Invivogen公司製造)作為陽性對照。向所獲得之細胞培養液20 μl中添加QuantiBlue Solution(Invivogen公司製造)180 μl,於37℃下反應1小時後,測定620 nm之吸光度。
(IgA測定)
首先,製備派亞氏淋巴叢(PP)細胞。具體而言,首先藉由MF固體飼料及自來水之自由攝取來飼育、維持小鼠(BALB/c CrSlc/雄性,9~13週齡)。藉由頸椎脫臼對檢疫後之小鼠實施安樂死處置後,摘除小腸。用生理鹽水清洗腸道外側後,將用眼科用剪自小腸外側表面切出之PP放入至添加有RPMI1640之24孔培養板中,並進行冰浴冷卻。使用不鏽鋼網將細胞單一化,用5 mL之完全培養液(complete medium)(+)(添加有50 μM巰基乙醇、100 U/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素、15 mM-HEPES(pH值7.2)、10% FBS之RPMI1640培養基)仔細清洗。用40 μm細胞濾網過濾細胞懸浮液,以4℃、280×g之條件提供給10分鐘之離心處理。離心後,抽吸去除培養上清液,再次懸浮於5 mL之完全培養液(+)中。重複相同操作2次後,用1.0 mL之完全培養液(+)使所獲得之沈澱物懸浮,以細胞濃度成為1.2x10
6cells/mL之方式進行調整。將如此製備而成之細胞懸浮液以每孔200 μL之方式接種至96孔培養板中,於37℃、5% CO
2下培養約2小時直至PP細胞落於培養板底。
繼而,利用上述(配體分析)所記載之方法,培養微生物株(WON2089),對其培養物進行加熱處理,調整為10
7微生物/20 μl。然後,將如此獲得之死菌液添加至PP細胞中各20 μL,於37℃、5% CO
2下培養6天。培養後,利用離心機(KUBOTA 5200)以1,000 rpm(180×g)對培養板離心10分鐘後,將上清液150 μL回收至微管中,於-80℃下冷凍保存至IgA測定。
然後,使用IgA、Mouse、ELISA定量套組(ELISA Quantitation Kit)(Bethyl Laboratories公司製造)進行IgA測定。
(結果)
如上所述,自5人中3人之糞便中檢測到屬於艾克曼氏菌屬之微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)之菌落形成。又,確定並比較該等微生物株之16S rRNA序列,結果表明均攜帶有包含相同序列之16S rRNA基因。
相對於NCBI之rRNA/ITS之基準株資料庫,對上述微生物之16S rRNA序列進行Blast+分析,結果如下述表2所示,與嗜黏蛋白艾克曼氏菌之同源性為98.0%,與嗜糖艾克曼氏菌之同源性為94.0%。又,亦如基於16S rRNA序列創建之系統樹(圖1)所示,此次單離出之3種微生物株為屬於艾克曼氏菌屬之微生物,但表明其等可能為不同菌種。
[表2]
登記名 | 株名 | 寄存號碼(Accession No.) | 同源率(%) |
Akkermansia muchiniphila(嗜黏蛋白艾克曼氏菌) | Muc | AY271254 | 98.0(1406/1435) |
Akkermansia glycaniphila(嗜糖艾克曼氏菌) | Pyt | KT254068 | 94.0(1355/1442) |
Persicirhabdus sediminis | YM20-087 | AB331886 | 86.5(1272/1471) |
Luteolibacter algae(藻蒼黃色桿菌) | A5J-41-2 | AB331893 | 86.0(1268/1475) |
Luteolibacter pohnpeiensis(波恩佩島蒼黃色桿菌) | A4T-83 | AB331895 | 85.8(1267/1476) |
Haloferula sargassicola(棲馬尾藻鹽桿條菌) | MN1-1037 | AB372856 | 86.4(1228/1421) |
Luteolibacter gellanilyticus | CB-286403 | LN833280 | 86.6(1212/1400) |
Oceaniferula marina | N1E253 | MN897724 | 85.5(1259/1472) |
Haloferula harenae | YM23-227 | AB372852 | 86.3(1217/1410) |
Haloferula rosea(玫瑰色鹽桿條菌) | 06SJR1-1 | AB372853 | 85.9(1216/1416) |
Haloferula luteola | YC6886 | FJ032193 | 86.2(1202/1395) |
Rubritalea halochordaticola | MN1-1006 | AB543683 | 85.1(1247/1465) |
Rubritalea sabuli(沙海生紅桿菌) | YM29-052 | AB353310 | 85.1(1247/1465) |
Rubritalea tangerine(淺紅橙海生紅桿菌) | YM27-005 | AB297806 | 85.1(1254/1473) |
Haloferula phyci(海草鹽桿條菌) | AK18-024 | AB372854 | 85.7(1213/1416) |
Haloferula helveola | 05IJR53-1 | AB372855 | 85.7(1212/1415) |
Haloferula chungangensis | CAU1074 | JN001489 | 85.6(1219/1424) |
Luteolibacter luojiensis | CCTCC2010415 | JN630810 | 85.7(1203/1403) |
Rubritalea spongiae | YM21-132 | AB297805 | 84.7(1248/1474) |
Rubritalea squalenifaciens | HOact23 | AB277853 | 84.9(1219/1436) |
對於WON2089,確定全基因組測序分析,基於該序列,利用DFAST進行ANI分析。然後,與嗜黏蛋白艾克曼氏菌之2個菌株比較,結果如下述表3所示,值分別約為82.5%,低於95% ANI之當前菌種之臨界值。即,表明經單離之微生物株為新種之艾克曼氏菌。
[表3]
物種名(organism name) | 菌株(strain) | 寄存號碼(accession) | ANI |
嗜黏蛋白艾克曼氏菌 | strain=DSM 22959 | GCA_008000975.1 | 82.5 |
嗜黏蛋白艾克曼氏菌 | strain=ATCC BAA-835 | GCA_000020225.1 | 82.5 |
嗜糖艾克曼氏菌 | strain=Pyt | GCA_001683795.1 | 77.4 |
基於上述全基因組測序,分析GC含量,結果為56.8莫耳%。又,如下述表4所示,微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)之形態均為球狀至短桿狀。進而,所有微生物株均革蘭氏染色性及氧化酶反應呈陰性,但觸酶反應呈陽性。進而,如下述表5所示,所有微生物株均最佳培育溫度為30℃~40℃,另一方面,於20℃以下或50℃以上時未觀察到增殖。又,最佳pH值為6.0~8.5,另一方面,於pH值5.0以下或pH值10.0以上時未觀察到增生。再者,關於該等GC含量、細胞之形態、革蘭氏染色性、氧化酶反應、觸酶反應及培育條件,為與已知之艾克曼氏菌相同之性質。
[表4]
[表5]
使用瓊脂培養基:改良GAM+0.1%黏蛋白 培養時間:120小時 | 使用瓊脂培養基:改良GAM+0.1%黏蛋白 培養時間:120小時 培養溫度:37℃ | ||||||||
培育pH值 | 培育結果 | ||||||||
培育溫度(℃) | 培育結果 | 4.5 | - | ||||||
10 | - | 5.0 | - | ||||||
15 | - | 5.5 | +w | ||||||
20 | - | 6.0 | + | ||||||
25 | +w | 6.5 | ++ | ||||||
30 | ++ | 7.3 | ++ | ||||||
35 | ++ | 8.0 | ++ | ||||||
37 | ++ | 8.5 | + | ||||||
40 | + | 9.0 | +w | ||||||
45 | +w | 9.5 | +w | ||||||
50 | - | 10.0 | - | ||||||
+:陽性 -:陰性 +w:較弱陽性 ++表示培育良好 | +:陽性 -:陰性 +w:較弱陽性 ++表示培育良好 | ||||||||
於使用API20A之酸產生試驗中,如下述表6所示,微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)均與已知之2種艾克曼氏菌(嗜黏蛋白艾克曼氏菌(strain ATCC BAA-835)、嗜糖艾克曼氏菌(strain DSM100705))相同,觀察到於D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖中之增殖。另一方面,與已知之2種艾克曼氏菌不同,上述微生物株均於D-甘露醇中亦觀察到增殖。又,關於嗜糖艾克曼氏菌中觀察到之於麥芽糖中之增生,上述微生物株均與嗜黏蛋白艾克曼氏菌同樣,未被觀察到。
[表6]
利用API20A之酸產生 | |||||||||||
糖 | WON2089 | WON2090 | WON2093 | 嗜黏蛋白艾克曼氏菌BAA835 | 嗜糖艾克曼氏菌DSM100705 | ||||||
D-葡萄糖 | + | + | + | + | + | ||||||
D-甘露醇 | + | + | + | - | - | ||||||
乳糖 | + | + | + | + | + | ||||||
白糖 | - | - | - | - | - | ||||||
麥芽糖 | - | - | - | - | + | ||||||
柳苷 | - | - | - | - | - | ||||||
D-木糖 | - | - | - | - | - | ||||||
L-阿拉伯糖 | - | - | - | - | - | ||||||
甘油 | - | - | - | - | - | ||||||
D-纖維雙糖 | - | - | - | - | - | ||||||
D-甘露糖 | + | + | + | + | + | ||||||
D-蜜三糖 | - | - | - | - | - | ||||||
D-棉子糖 | - | - | - | - | - | ||||||
D-山梨糖醇 | - | - | - | - | - | ||||||
L-鼠李糖 | - | - | - | - | - | ||||||
D-海藻糖 | - | - | - | - | - | ||||||
使用APIZYM之酵素活性試驗之結果,對於WON2089,觀察到下述表7所示之酵素活性。
[表7]
利用APIZIM之細菌酵素活性
酵素 | WON2089 | |
鹼性磷酸酶 | - | |
酯酶(C4) | - | |
酯酶脂肪酶(C8) | - | |
脂肪酶(C14) | - | |
白胺酸芳基醯胺酶 | - | |
纈胺酸芳基醯胺酶 | - | |
胱胺酸芳基醯胺酶 | - | |
胰蛋白酶 | - | |
胰凝乳蛋白酶 | - | |
酸性磷酸酶 | - | |
萘酚-AS-BI-磷酸水解酶 | + | |
α-半乳糖苷酶 | - | |
β-半乳糖苷酶 | + | |
β-葡萄糖醛酸酶 | + | |
α-葡萄糖苷酶 | - | |
β-葡萄糖苷酶 | - | |
N-乙醯-β-氨基葡萄糖苷酶 | + | |
α-甘露糖苷酶 | - | |
α-岩藻糖苷酶 | - |
又,對於WON2089及已知之2種艾克曼氏菌(嗜黏蛋白艾克曼氏菌、嗜糖艾克曼氏菌),測定菌體之脂肪酸,結果,觀察到下述表8所示之菌體脂肪酸之組成。
[表8]
脂肪酸種類 | WON2089 | 嗜黏蛋白艾克曼氏菌 | 嗜糖艾克曼氏菌 | |
飽和脂肪酸 | ||||
C 13:0 | 0.1 | 0.3 | 0.1 | |
C 14:0 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | |
C 15:0 | 4.1 | 11.9 | 23.8 | |
C 16:0 | 4.0 | 5.6 | 5.1 | |
C 17:0 | 2.7 | 4.1 | 0.2 | |
C 18:0 | 1.0 | 0.7 | 0.3 | |
C 14:0DMA | 0.3 | 0.1 | 0.2 | |
C 16:0aldehyde | 0.6 | 0.7 | 0.6 | |
不飽和脂肪酸 | ||||
C 16:1ω7c | - | 0.1 | 0.1 | |
C 18:1ω9c | 5.8 | 3.1 | 1.5 | |
C 18:2ω6,9c | 0.5 | 0.4 | 0.2 | |
支鏈脂肪酸 | ||||
C 11:0anteiso | - | - | 0.1 | |
C 13:0anteiso | 0.1 | - | - | |
C 14:0iso | 5.6 | 10.1 | 4.0 | |
C 15:0anteiso | 55.5 | 45.4 | 44.5 | |
C 15:0iso | 1.5 | 1.3 | 1.9 | |
C 16:0iso | 2.7 | 3.6 | 1.8 | |
C 17:0anteiso | 1.8 | 0.9 | 0.2 | 按照Sherlock微生物鑑定系統(版本6.0、MIDL、USA)之菌體脂肪酸組成成分分析手冊進行分析 |
C 17:0iso | 0.3 | 0.1 | - | 使用瓊脂培養基:改良GAM+0.1%黏蛋白 |
C 18:0iso | 0.1 | 0.1 | - | 對於*滯留時間大致相同且無法特定脂肪酸種類之脂肪酸,標示為下述Summed Feature |
羥基化脂肪酸 | ||||
C 15:03OH | 7.5 | 7.7 | 10.8 | Summed Feature 1:C13:1 at 12-13、C14:0 aldehyde及C11:1 2OH |
C 15:0iso 3OH | 0.2 | - | 0.1 | Summed Feature 2:C12:0 3OH及C13:0 DMA |
C 16:03OH | 0.6 | 0.9 | 1.1 | Summed Feature 3:C15:0 ISO aldehyde及unknown 13.570 |
C 17:03OH | 1.4 | 1.1 | 0.4 | Summed Feature 4:unknown 14.762、C15:2 FA、C15:2及C15:1 ω8c |
C 17:0anteiso | 0.6 | 0.2 | 0.2 | Summed Feature 5:C15:0 DMA及C14:0 3OH |
Summed Features 1 | - | 0.1 | 0.1 | Summed Feature 6:C15:0 anteiso 3OH及C16:1 ω9c DMA Summed Feature 7:C17:2 at 16 ,760及C17:1 ω9c |
5 | 1.1 | - | 1.1 | Summed Feature 8:C17:1 ω8c及C17:2 at 16.801 |
6 | 0.4 | 0.1 | 0.2 | Summed Feature 9:C16:0 iso 3OH及unknown 17.157 DMA |
9 | 0.6 | 0.6 | 0.4 | Summed Feature 10:C18: 1 ω7c及unknown 17.834 |
10 | 0.4 | 0.3 | 0.1 | Summed Feature 11:C17:0 iso 3OH及C18:2 DMA |
11 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | Summed Feature 12:unknown 18.622及C19:0 iso |
total | 100 | 100 | 100 | Summed Feature 13:15:0 anteiso DMA及14:0 2OH |
對配體活性進行分析,結果如圖2所示,對於已知之2種艾克曼氏菌(嗜黏蛋白艾克曼氏菌(strain ATCC BAA-835)、嗜糖艾克曼氏菌(strain DSM100705)),未觀察到NOD2促效劑活性,但微生物株(WON2089、WON2090、WON2093)均觀察到該活性。又,雖未圖示,但已知之2種及上述微生物株均觀察到TLR2促效劑活性及TLR4促效劑活性,關於TLR2促效劑活性,與已知之2種相比,上述微生物株之TLR2促效劑活性高1.5倍左右。又,關於TLR4促效劑活性,與已知之2種相比,上述微生物株之TLR4促效劑活性略高。
進而,關於WON2089,對IgA分泌促進作用進行評價,結果如圖3所示,可知具有該作用,又,亦可知與已知之嗜黏蛋白艾克曼氏菌(strain ATCC BAA-835)之IgA分泌促進作用相比高2倍以上。
[產業上之可利用性]
如上所述,本發明之屬於艾克曼氏菌屬之微生物係至少在於D-甘露醇中之同化性方面與已知之艾克曼氏菌不同之新種微生物。又,本發明之屬於艾克曼氏菌屬之微生物可具有已知者所沒有之NOD2促效劑活性,進而,亦可具有較高之IgA分泌促進作用。
因此,本發明之屬於艾克曼氏菌屬之微生物可由NOD2之活化等介導而激活宿主之免疫等。因此,可用作具有該賦活作用之醫藥品、食品等。
[寄存編號]
(1)識別標示:WON2089
(2)寄存號碼:NITE BP-03622
(3)寄存日期:2022年3月17日
(4)寄存機構:獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心
(1)識別標示:WON2090
(2)寄存號碼:NITE BP-03623
(3)寄存日期:2022年3月17日
(4)寄存機構:獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心
(1)識別標示:WON2093
(2)寄存號碼:NITE BP-03624
(3)寄存日期:2022年3月17日
(4)寄存機構:獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心
圖1係基於本發明之微生物(WON2089)、已知之艾克曼氏菌(嗜黏蛋白艾克曼氏菌、嗜糖艾克曼氏菌)及屬於疣微菌(Verrucomicrobia)門之代表株之16S rRNA序列所製作的系統樹。
圖2係表示針對本發明之微生物(WON2089、WON2090、WON2093)及已知之艾克曼氏菌(嗜黏蛋白艾克曼氏菌、嗜糖艾克曼氏菌),分析NOD2促效劑活性所得之結果之圖表。
圖3係表示針對本發明之微生物(WON2089)及已知之艾克曼氏菌(嗜黏蛋白艾克曼氏菌(標準株Muc,strain ATCC BAA-835)),分析IgA之分泌促進作用所得之結果之圖表。
[主張利用生物材料1]
[寄存國家]JP日本
[寄存機構]獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心
[寄存日期]2022/03/17
[寄存號碼]NITE BP-03622
[主張利用生物材料2]
[寄存國家]JP日本
[寄存機構]獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心
[寄存日期]2022/03/17
[寄存號碼]NITE BP-03623
[主張利用生物材料3]
[寄存國家]JP日本
[寄存機構]獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心
[寄存日期]2022/03/17
[寄存號碼]NITE BP-03624
TW202346570A_112118683_SEQL.xml
Claims (6)
- 一種微生物,其屬於艾克曼氏菌屬(Akkermansia屬),且具有 包含相對於序列編號:1之核苷酸序列具有98.0%以下之同源性、相對於序列編號:2之核苷酸序列具有94.0%以下之同源性、或相對於序列編號:3之核苷酸序列具有超過98.0%之同源性之核苷酸序列的16S rRNA基因,並 具有以下1)~4)之性質: 1)具有NOD2促效劑活性; 2)具有對於D-甘露醇之同化性; 3)革蘭氏染色呈陰性,為球狀至短桿狀之厭氧性細菌; 4)氧化酶試驗呈陰性,觸酶試驗呈陽性。
- 一種微生物,其係由寄存號碼NITE BP-03622、NITE BP-03623或NITE BP-03624特定。
- 如請求項1之微生物,其進而相較於嗜黏蛋白艾克曼氏菌之標準株ATCC BAA-835,具有2倍以上之IgA分泌促進作用。
- 一種用於激活免疫之組合物,其係以如請求項1至3中任一項之微生物作為有效成分。
- 一種用於活化NOD2之組合物,其係以如請求項1至3中任一項之微生物作為有效成分。
- 一種用於促進IgA之分泌之組合物,其係以如請求項2或3之微生物作為有效成分。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022-083151 | 2022-05-20 | ||
JP2022083151 | 2022-05-20 |
Publications (1)
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---|---|
TW202346570A true TW202346570A (zh) | 2023-12-01 |
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW112118683A TW202346570A (zh) | 2022-05-20 | 2023-05-19 | 屬於艾克曼氏菌(Akkermansia)屬之微生物 |
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---|---|
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---|---|---|---|---|
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DK3443071T3 (da) * | 2016-04-11 | 2022-01-31 | Univ Wageningen | Hidtil ukendt bakterieart |
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-
2023
- 2023-05-19 TW TW112118683A patent/TW202346570A/zh unknown
- 2023-05-19 WO PCT/JP2023/018734 patent/WO2023224117A1/ja unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
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WO2023224117A1 (ja) | 2023-11-23 |
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