KR20210036855A - 암 치료를 위한 절대혐기성 인체 장내미생물 및 이의 용도 - Google Patents

암 치료를 위한 절대혐기성 인체 장내미생물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 아커만시아 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 신규한 아커만시아 HB03 균주(Akkermansia sp. HB03)는 독성 유전자가 없어 생체 내에서 부작용을 나타내지 않으면서도, 우수한 항암 활성을 나타내므로, 암을 예방 또는 치료하기 위한 제제의 개발에 널리 활용될 수 있다.

Description

암 치료를 위한 절대혐기성 인체 장내미생물 및 이의 용도{Strict anaerobic human gut microbe for antitumor treatment and uses thereof}
본 발명은 절대혐기성 인체 장내미생물의 일종인 베루코마이크로바이엘스(Verrucomicrobiales) 과(family)에 속하는 신규한 아커만시아(Akkermansia) 속(genus) 균주인 HB03 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
아커만시아(Akkermansia) 속(genus)의 균주는 인간의 장내 뮤신(mucin) 분해 박테리아의 한 종류로, 그람 음성이며 절대혐기성 균주이다. 아커만시아 속의 균주는 운동성이 없고(non-motile) 포자를 형성하지 않으며(non-spore-forming)(Yuji Naito, et al., A next-generation beneficial microbe: Akkermansia muciniphila, J Clin Biochem Nutr. 2018 Jul; 63(1): 33-35.) 타원형 형태(oval-shaped)로 알려져 있고, 뮤신을 탄소와 질소의 유일한 공급원으로 사용할 수 있으며 장내 뮤신이 함유된 배지에서 절대혐기성(strict anaerobic condition) 조건으로 배양할 수 있다. 또한, 다양한 동물 종의 위장관에서 번식할 수 있다(colonize).
장내 미생물은 여러 종류의 종양에 대한 면역 반응 조절에 중요한 역할을 하고, 종양 생태계 내 종양세포 억제 및 면역 활성을 특이적으로 활용하는 잠재성을 가지는 것으로 알려진 바, 종양의 치료적 접근법으로 유용하다.
한편, 전세계적으로 성인 인구의 사망 원인 중 하나인 암(cancer)은 수술 기법의 발달 및 항암, 방사선 치료의 도입으로 인해 치료 성과가 개선되었지만, 진단받은 환자의 절반 가량은 여전히 암으로 인해 사망하고 있어 여러 국가에서 중요한 문제 중 하나로 간주되고 있다. 따라서, 암을 치료 및 예방하기 위한 방법의 개발이 시급한 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 아커만시아(Akkermansia) 속(genus)에 속하는 신규 균주를 발굴하고자 예의 연구 노력한 결과, 종래의 아커만시아 뮤시니필라 균주와 구별되는 신규한 아커만시아 속의 균주를 발굴하고 상기 균주가 기존의 아커만시아 뮤시니필라 균주와 비교하여 우수한 항암 활성을 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 수탁번호 KCCM12318P로 기탁된 신규한 아커만시아 HB03 균주(Akkermansia sp. HB03)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 아커만시아 HB03 균주, 이의 불활성화된 균주, 이의 배양액, 이의 소포체, 이의 단백체 및 이의 대사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 아커만시아 HB03 균주, 이의 불활성화된 균주, 이의 배양액, 이의 소포체, 이의 단백체 및 이의 대사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 한편, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 수탁번호 KCCM12318P로 기탁된 신규한 아커만시아 HB03 균주(Akkermansia sp. HB03)를 제공하는 것이다.
본 발명의 용어 "아커만시아 균주(Akkermansia sp.)"는 인간 또는 동물의 장내 뮤신(mucin) 분해 박테리아의 한 종류로, 그람 음성이며 절대혐기성(strict anaerobic) 균주이다. 아커만시아 균주는 뮤신을 탄소와 질소의 유일한 공급원으로 사용할 수 있으며 장내 뮤신이 함유된 배지에서 절대혐기성 조건으로 배양할 수 있다. 또한, 다양한 동물 종의 위장관에서 번식할 수 있다(colonize).
본 발명자들은 건강한 한국인의 대변 시료로부터 장내 뮤신(mucin) 분해 박테리아의 한 종류인 신규한 아커만시아 균주(Akkermansia sp.)를 분리하고 아커만시아 HB03 균주(Akkermansia sp. HB03)라 명명하였다. 본 발명의 일 실시예에서, 분리된 신규한 아커만시아 균주가 신규한 균주임을 증명하기 위하여 분리된 균주의 게놈을 완전 해독하여 이를 기존의 아커만시아 균주 게놈과 비교 분석하였다. 구체적으로, 아커만시아 균주(Akkermansia sp.) 총 66종의 게놈염기서열을 조회하여 MASH 유전체 염기서열 평균 유사도(average nucleotide identity)에 기반한 클러스터링을 실시하였다(도 1)(Matthew R Olm et al. dRep: a tool for fast and accurate 게놈 comparisons that enables improved genome recovery from metagenomes through de-replication. ISME J. 2017 Dec; 11(12): 2864-2868.). 이를 통해 도출된 단일 종 클러스터에 속하는 44종의 균주 유전체(cluster 3)만을 취하여 후속 분석을 실시하였다. 프로카(prokka)에 의해 생산된 GFF3 포맷(Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 2014 Jul 15;30(14):2068-9.)에서 주석화된 어셈블리(annotated assemblies)를 취하여 팬 게놈(pan genome)을 계산하는 고속 독립형 팬 게놈 파이프라인인 로어리(Roary)를 실시하였다. 이후 FastTree2를 이용하여 계통수(approximately maximum-likelihood trees)를 작성하였다(Price MN, Dehal PS, Arkin AP. FastTree 2--approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PLoS One. 2010 Mar 10;5(3):e9490.)(도 2). 유전자 존재/부재(gene presence/absence)의 그림으로부터 120개의 균주 특이적 유전자를 추출하고(도 3), 상기 유전자들에 특이적인 균주를 "아커만시아 HB03 균주(Akkermansia sp. HB03)"이라고 명명하였다. HB03 균주의 전체 게놈 유전자에 병원체가 병원성(독성)을 내는데 필요한 유전자 집단인 병원성(독성) 유전자군(Pathogenicity island, PAI)이 존재하는지 확인한 결과, HB03 균주에는 병원성(독성) 유전자군이 존재하지 않는 것을 확인하였다(도 5). 상기 명명한 "아커만시아 HB03 균주(Akkermansia sp. HB03)" 균주는 2018년 9월 11일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM12318P로 기탁하였다.
본 발명자들이 제공한 신규한 아커만시아 균주는 지금까지 보고되지 않았고, 미생물자원 보존 및 분양 기관에 일반기탁균주 또는 특허균주로 균주가 기탁되어 있지 않으며, 본 발명자에 의하여 최초로 건강한 한국인 대변에서 분리되고 특허균주로 기탁되었다.
상기 신규한 아커만시아 균주인 HB03 균주는 아커만시아 뮤시니필라에 비해 본 발명의 변형된 BTTM 배지에서 세포 수율(cell yield)이 2 배 이상 높으며, 생육 속도 또한 2 배 정도 빠른 것으로 확인되었다(표 1).
특히, 아커만시아 뮤시니필라는 침착이 어렵고 부유하는 성질이 있어 원심분리가 어렵고 이에 따라 대량생산이 어려우나 HB03 균주는 원심분리가 용이하여(도 6) 대량생산 및 게놈 편집이 모균주에 비해 용이하였다. 또한, HB03 균주는 병원성(독성) 유전자가 없어 생체 내에서 부작용을 일으키지 않는다. 뿐만 아니라, 뮤신이 없는 배지에서 아커만시아 뮤시니필라는 뮤신의 분해 산물인 L-쓰레오닌(L-threonine)을 생육을 위한 필수 성분으로 요구하나 HB03 균주는 L-쓰레오닌이 배지에 첨가되지 않아도 1.32 X 109 cells/ml 농도까지 생육 가능함을 확인하였다(표 2).
이는 HB03 균주가 아커만시아 뮤시니필라 표준균주와는 달리 뮤신이나 뮤신 분해산물인 L-쓰레오닌이 없어도 뮤신이나 L-쓰레오닌 이외의 다양한 탄소원과 질소원을 영양성분으로 생장이 가능함을 시사한다.
상기 신규한 아커만시아 HB03 균주는 우수한 항암 활성을 나타내므로, 상기 신규한 아커만시아 균주, 이의 불활성화된 균주, 이의 배양액, 이의 소포체, 이의 단백체 또는 이의 대사체 등은 암을 예방하거나 또는 치료하기 위한 유효성분으로 사용될 수 있다. 이에 대해서는 하기에 구체적으로 서술하였다.
일 예로, 본 발명의 미생물은 "실질적으로 정제된(substantially purified)" 것을 사용할 수 있다. 상기 "실질적으로 정제된"은 샘플에서 실질적으로 농축된 균주 또는 하나 이상의 균주 혼합물을 지칭한다. 상기 샘플에서 본 발명의 미생물은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 농축되어 실질적으로 정제된 것일 수 있으며, 또는 상기 샘플은 본 발명의 미생물 외에 효과가 없거나 바람직하지 않은 효과를 가지는 미생물을 50% 미만, 40%, 20%, 15%, 또는 1% 이하로 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 발명의 조성물에 포함되는 미생물은 경구 투여를 위해 코팅으로 캡슐화된 것을 사용할 수 있다. 상기 코팅은 미생물이 위에서 분해되지 않도록 하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 발명의 미생물, 이의 배양액, 소포체, 단백체 및 대사체는 분리된(isolated) 것일 수 있다. 상기 "분리된" 은 자연적으로 발생하지 않는 환경에 존재하거나 혹은 자연적으로 존재하지 않는 형태의 물질을 지칭한다. 이는 자연에서 자연적으로 회합되어 있고 자연에서 발견되는 것과 같은 물질을 다른 성분으로부터 실질적으로 분리하는 것을 포함한다. 상기 분리된 물질은 예를 들어 자연 상태에서 결합되어(associated) 있는 하나 이상의 구성이 제거되거나, 자연에서 발견되는 형태가 변형되었거나, 자연적으로 결합된 다른 구성성분에 비해 그 물질의 양을 변경하도록 변형된 물질일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태는 신규한 아커만시아 HB03 균주, 이의 불활성화된 균주, 이의 배양액, 이의 소포체, 이의 단백체 및 이의 대사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "암"은 비 제한적으로 고형암과 혈액암을 포함한다. 상기 암은 다양한 유형의 암, 예를 들어 비 제한적으로 머리, 목, 눈, 입, 목구멍, 식도, 가슴, 뼈, 폐, 결장, 직장, 위, 전립선, 유방, 난소, 신장, 방광, 간, 췌장 및 뇌 암을 포함한다. 상기 암은 달리 나타내지 않는 한 1차 및 전이성 암을 추가로 포함할 수 있다. 상기 암은 예를 들면, 폐암, 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 난소암, 흑색종, 두경부암, 피부암, 전립선암, 결장직장암, 간세포암, 섬유육종 또는 자궁경부암을 포함할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 암은 항암제에 내성을 나타내는 암을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항암제는 화학항암제, 표적항암제 또는 면역관문억제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "화학항암제"는 암세포의 증식을 억제하기 위하여 개발된 치료제이다. 작용 기전은 DNA 단계의 세포 합성을 저해하는 등 항암제마다 다양하며, 급성 백혈병, 림프종, 고환암 등 항암제에 잘 반응하는 암의 주요 치료수단으로 사용된다. 상기 화학항암제는 세포독성항암제, 화학약물항암제로도 불린다. 상기 화학항암제는 예를 들면, 젬시타빈(Gemcitabine)(제시타빈주), 사이타라빈(Cytarabine), 카르보플라틴(Carboplatin)(파라플라틴), 시스플라틴(Cisplatin)(플라티놀, 플라티놀-AQ), 크리조티닙(Crizotinib)(잘코리), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)(시톡산, 네오사르), 도세탁셀(Docetaxel)(탁소티어), 독소루비신(Doxorubicin)(아드리아마이신), 엘로티닙(Erlotinib)(타르세바), 에토포사이드(Etoposide)(베페시드), 플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 이리노테칸(irinotecan)(캄토사르), 리포좀-캡슐화된 독소루비신(독실), 메토트렉세이트(Methotrexate)(폴렉스, 멕세이트, 아메토프테린), 파클리탁셀(Paclitaxel)(탁솔, 아브락산), 토포테칸(Topotecan)(하이캄틴), 트라벡티딘(Trabectedin)(욘델리스), 빈크리스틴(Vincristine)(온코빈, 빈카사르 PFS) 또는 빈블라스틴(Vinbrastine)(벨반) 등이 있다.
본 발명의 용어 "표적항암제"는 암세포가 가진 특정 마커만을 판별하여 공격하는 항암제로, 정상 세포를 건드리지 않고, 암세포 살상력도 수 배 우수하다. 상기 표적항암제는 예를 들면, 이마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate)(글리벡), 세툭시맙(Cetuximab)(얼비툭스), 게피티닙(Gefitinib)(이레사), 올무티닙(olmutinib)(올리타), 오시머티닙(osimertinib)(타그리소), 베바시주맙(bevacizumab)(아바스틴), 소라피닙(Sorafenib)(넥사바), 옥살리플라틴(Oxaliplatin)(엘록사틴) 또는 수니티닙(Sunitinib)(수텐트) 등이 있다.
본 발명의 용어 "면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 수술과 화학요법(화학항암제), 방사선 치료의 1세대 항암제와 표적치료(2세대 항암제 또는 표적항암제)에 이은 3세대 항암제로 떠오르고 있는 항체 치료제이다. 이들은 체내 면역세포의 면역기능을 활성화시켜 강력한 항암 효과를 보이며 동시에 적응증이 다양한 장점을 가진다. 또한, 지나친 면역 활성으로 인한 정상세포의 손상을 막기 위하여 일정기간만 작동하도록 하기 때문에 부작용이 거의 없다. 상기 면역관문억제제는 예를 들면, PD-1(Programmed cell death protein 1), CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4), PD-L1(Programmed death-ligand 1), PD-L2(Programmed death-ligand 2), A2AR(adenosine A2A receptor), B7-J3(B7 family molecule), B7-H4(B7 family molecule), BTLA(B- and T-lymphocyte attenuator), Kir(killer cell immunoglobulin-like receptors), LAG3(Lymphocyte-activation gene 3), TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3, HAVCR2; Hepatitis A virus cellular receptor 2) 또는 VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation)의 억제제 등이 있다.
상기 억제제는 전술한 물질을 타겟으로 하는 단일클론항체(mAb)일 수 있으며, 예를 들어, PD-1에 대한 항체(αPD-1 mAb), CTLA-4에 대한 항체(αCTLA-4 mAb) 또는 PD-L1에 대한 항체(αPD-L1 mAb)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 용어 "치료"는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 '암 예방 또는 치료'는 '항암' 효과를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "항암"은 암의 예방, 치료, 증상의 경감 및 완화 등을 모두 포괄하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "항종양"은 고형암으로 인해 발생하는 악성종양이 그 크기가 경감되거나 소멸되는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "불활성화된 균주"는 비기능성이 되거나 사멸된 균주를 의미하며, 균주를 비기능성이 되게 하거나 사멸시키는 방법에는 열 불활성화, pH 불활성화, 화학적 불활성화 등이 있다. 불활성화 균주는 비기능성 균주 또는 사멸된 균주로부터 유래하는 세포 용해물 또는 세포 외 산물을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 불활성화는 가열에 의한 열 불활성화일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "배양액"은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 또는 이로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양액은 신규한 아커만시아 HB03 균주를 배양하여 얻어진 결과물을 의미한다. 넓은 의미로 상기 배양물은 상기 아커만시아 균주의 전체 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있다. 이때, 상기 배양상등액은 상기 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 파쇄물은 상기 균주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 본 발명에서 제공하는 아커만시아 균주를 배양하는 방법을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 배양방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다.
상기 아커만시아 균주를 배양하기 위하여는 뮤신, 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시켜야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 주로 뮤신이나 N-아세틸글루코사민이며, 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사용할 수 있고, 이외에 갈락토사민, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 소이톤(soytone), 트립톤, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 변형된 BTTM 배지를 사용하여 본 발명의 아커만시아 HB03 균주 및 아커만시아 뮤시니필라 표준균주(ATCC BAA-835 균주)를 배양하였으며, 배양 시 온도는 37℃로 유지하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "소포체(vesicle)"는 세포 내에 존재하는 비교적 작은 주머니 형태의 구획으로, 화학 물질을 감싸서 이동시키는 데 사용하는 구조물을 의미한다. 상기 소포체는 소낭과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "단백체"는 특정한 세포, 조직 또는 생물체 등 다양한 생물학적 개체에서 발현하고 있는 모든 단백질의 총집합을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 단백체는 신규한 아커만시아 균주 유래 단백질일 수 있고, 예를 들면, HB03-01, HB03-02 또는 HB03-03일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "대사체"는 세포, 조직, 체액과 같은 생물학적 시료 내에 존재하는 대사물질들의 총체를 의미한다. 일반적으로 1500 달톤(Dalton) 이하의 물질들로 구성되어 있고 생체 내 대사물질(endogenous metabolome; 예를 들면, 아미노산, 핵산, 지방산, 당류, 아민류, 당지질, 짧은 펩티드, 비타민, 호르몬 등)과 생체 외 대사물질(exogenous metabolome; 예를 들면, 약물, 음식, 첨가제, 독성 물질 등)로 분류된다. 이때 DNA, RNA, 단백질이 분해되어 생성되는 표적물질도 대사체로 분류되기도 한다. 대사체는 체내 대사의 영향을 받아 매 초마다 빠르고 역동적으로 변하기 때문에 유전체나 단백체에 비해 약물의 반응이나 음식으로 인한 영양분의 변화와 같은 표현형(phenotype)을 즉각적으로 반영한다(생화학분자생물학회).
상기 HB03-01은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 상기 HB03-03은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에서의 HB03-01 또는 HB03-03 단백질은 비록 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것이라고 정의하였으나, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들면, 본 발명의 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 본 발명의 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들면, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드’는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.
상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 신규한 아커만시아 HB03 균주, 이의 불활성화된 균주, 이의 배양액, 이의 소포체, 이의 단백체 및 이의 대사체로부터 유래하는 추출물 또는 분획물, 현탁액 등의 형태를 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "추출물"은 본 발명에서 제공하는 신규한 아커만시아 균주를 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 상기 추출물을 얻는 추출 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다. 상기 추출물을 얻는 데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다. 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexan), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "현탁액"은 액체 속에 미세한 고체의 입자가 용해되지 않은 채 액체 속에 균일하게 분산되어 있는 혼합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 현탁액은 동결건조된 일정 수 이상의 균주가 물, PBS(Phosphate-buffered saline) 용액 또는 배양 배지(액체 배지, media)에 분산된 것일 수 있다. 상기 "현탁액"은 "균주 조성물"과 혼용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 항암제와 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 용어 "병용 투여"는 암의 예방, 치료, 증상의 경감 및 완화 등을 위해 본 발명의 약학 조성물과 암 치료를 위한 항암제를 동시에 또는 시간차를 두고 독립적 또는 비독립적(혼합)으로 투여하는 것을 의미한다. 상기 병용 투여를 통해 본 발명의 약학 조성물 또는 항암제의 단독투여보다 높은 항암 활성을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 항암제에 내성이 나타나는 암에 대해서 항암제의 단독투여보다 높은 항암 활성을 나타낼 수 있다.
상기 항암제는, 예를 들면, 화학항암제, 표적항암제 또는 면역관문억제제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 화학항암제, 표적항암제 또는 면역관문억제제는 전술한 바와 같으나, 이에 제한되지 않고 공지되어 있는 항암제라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 대장암(CT26, MC38), 폐암(LLC), 흑색종(B16F10), 교모세포종(GL261) 및 육종(MCA205)동물 모델에 면역관문억제제(αPD-1 mAb, αCTLA-4 mAb 또는 αPD-L1 mAb)와 HB03을 병용 투여하였을 경우, 면역관문억제제를 단독으로 처리하였을 때보다 항-종양 효과가 현저히 증가되었다(도 11 내지 13).
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 대장암(MC38) 동물 모델에 항암제(5-FU(5-Fluorouracil), 옥살리플라틴(Oxaliplatin))와 HB03를 병용 투여하였을 경우, 항암제를 단독으로 처리하였을 때보다 항-종양 효과가 현저히 증가되었다(도 16).
상기 실시예의 결과는, 본 발명의 신규한 아커만시아 균주가 그가 나타내는 항암 활성으로 인하여, 항암제의 투여 용량은 줄이면서 종양 형성을 효과적으로 억제시킴을 시사한다.
본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 항암제에 대해 내성이 있는 개체에도 병용 투여될 수 있다.
상기 항암제는 면역관문억제제, 화학항암제 또는 표적항암제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 면역관문억제제는 전술한 바와 같으며, 암환자의 70% 이상이 이들 면역관문억제제에 반응하지 않거나 내성이 유발된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 면역관문억제제(αPD-1 mAb 또는 αCTLA-4 mAb)에 대해 내성이 생긴 대장암(CT26, MC38) 및 흑색종(B16F10) 동물 모델에 HB03을 병용 투여하였을 경우, αPD-1 mAb 및 HB03의 병용 투여는 αPD-1 mAb를 단독으로 처리하였을 때보다 항-종양 효과가 현저히 증가되었으며, 이러한 효과는 기존에 알려진 아커만시아 뮤시니필라 균주 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주를 병용 투여 했을 때보다 우수하다(도 14). 또한, αCTLA-4 mAb 및 HB03의 병용 투여는 αCTLA-4 mAb를 단독으로 처리하였을 때보다 항-종양 효과가 현저히 증가되었다(도 15).
상기 실시예의 결과는, 본 발명의 신규한 아커만시아 균주가 그가 나타내는 항암 활성으로 인하여, 면역관문억제제에 내성이 생긴 암에 대해서도 병용 투여 시, 종양 형성은 효과적으로 억제시킴을 시사한다.
본 발명의 약학 조성물은 총 조성물의 중량 대비 상기 추출물을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제(분말제), 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 동결건조된 신규한 아커만시아 균주를 액체 배양배지에 재현탁하여 제조한 균주 조성물 HB03 또는 상기 HB03을 열 불활성화시켜 제조한 HB03(P)를 대장암(CT26), 폐암(LLC), 췌장암(Panc02), 흑색종(B16F10), 교모세포종(GL261) 및 육종(MCA205)이 각각 유발된 종양 동물 모델에 일정 기간 동안 전처리(종양 접종 전 투여) 또는 후처리(종양 접종 후 투여)한 결과, 각 종양의 성장이 현저히 감소되었으며(도 7 및 도 9), 이러한 항 종양효과는 아커만시아 뮤시니필라 표준 균주(ATCC BAA-835 균주) 또는 비피도박테리움 롱검 균주(ATCC BAA-999 균주)를 투여 했을 때보다 우수하였다(도 8). 또한, AKK p2261(Collection de souches de I'Unite des Rickettsies (CSUR)에 기탁된 CSUR P2261)과 HB03의 투여에 의한 항암 효능을 비교하였을 때, HB03 투여에 의한 항암효과가 더욱 증가하였다(도 10). 이를 통해 HB03 투여에 의한 항암 효과가 다른 32종의 균주에 비해 우수함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, HB03 유래 단백질인 HB03-01이 대장암 및 폐암세포의 증식을 의미 있게 감소시켰으며(도 18A 및 18B), 또 다른 단백질인 HB03-03과 함께 폐암세포의 세포사 유도 조절 효소(caspase-3)를 각각 활성화시켰다(도 18C). 상기 실시예의 결과는, 본 발명의 신규한 아커만시아 균주가 그가 나타내는 항암 활성으로 인하여, 암의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있음을 시사한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란 암의 증상을 보이거나 보일 위험이 있는 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물을 암의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 암을 예방 또는 치료 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용가능하다. 예를 들면, 인간, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 개체에서든 사용할 수 있다. 또는, 인간을 제외한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 포유동물에 하루 동안 약 0.0001 내지 100mg/kg, 구체적으로 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 본 발명의 약학 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다. 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 신규한 아커만시아 HB03 균주, 이의 불활성화된 균주, 이의 배양액, 이의 소포체, 이의 단백체 및 이의 대사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 상기 조성물의 투여로 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 질환은 암을 의미한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 암의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져 오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 암의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 암의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 예를 들면, 본 발명에 따른 균주를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 신규한 아커만시아 HB03 균주는 독성 유전자가 없어 생체 내에서 부작용을 나타내지 않으며, 상기 균주 조성물, 상기 균주 유래 소포체, 단백체, 대사체 또는 불활성화된 상기 균주 조성물은 종양 성장을 저해하는 효과가 우수하고, 다른 항암제, 특히, 면역관문억제제와 병용 투여시 종양 억제 효과가 현저히 우수했으며, 상기 균주 조성물로부터 유래한 대사체인 단백질 또한 암세포의 성장 억제 및 세포사 유도를 통해서 종양의 형성 및 진행을 효과적으로 억제하는 효과를 나타내므로, 암을 예방 또는 치료하기 위한 제제의 개발에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 NCBI로부터 아커만시아(Akkermansia) 균주 총 66종의 게놈염기서열을 조회하여 dRep 으로 MASH 유전체 염기서열 평균 유사도(average nucleotide identity)에 기반한 클러스터링을 실시한 결과이다.
도 2는 아커만시아(Akkermansia) 균주의 계통수(approximately maximum-likelihood trees)를 작성한 결과이다.
도 3은 유전자 존재/부재(gene presence/absence)의 그림으로부터 120개의 균주 특이적 유전자를 추출한 결과이다.
도 4는 LS-BSR(large-scare blast score ratio)을 사용하여 블라스트 점수의 비율(blast score ratio, BSR)을 계산하여 유전자의 존재 여부를 점검한 결과이다.
도 5는 HB03 균주의 유전자에 병원성(독성) 유전자군(Pathogenicity island, PAI) 존재 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 7,000 rpm으로 균주 배양액을 원심분리하였을 때 HB03 균주와 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 균주의 침전도를 확인한 결과이다. HB03 균주는 원심분리를 통해 균체와 배양상등액이 완전하게 분리 가능하였으나 아커만시아 뮤시니필라 균주는 분리되지 않았다.
도 7은 종양을 가진 마우스를 대상으로 HB03 및 HB03(P)를 후처리(종양 접종 후 투여)한 경우, 대조군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) BALB/c 마우스에 대장암 세포주인 CT26을 접종하고 6일 후부터 18일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (B) C57BL/6 JAX 마우스에 폐암 세포주인 LLC를 접종하고 6일 후부터 18일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (C) C57BL/6 JAX 마우스에 흑색종 세포주인 B16F10을 접종하고 6일 후부터 18일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (D) C57BL/6 JAX 마우스에 췌장암 세포주인 Panc02를 접종하고 6일 후부터 30일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표. (E) C57BL/6 JAX 마우스에 교모세포종 세포주인 GL261을 접종하고 6일 후부터 22일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표. (F) C57BL/6 JAX 마우스에 육종 세포주인 MCA205를 접종하고 6일 후부터 16일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
도 8은 종양을 가진 마우스를 대상으로 HB03, 아커만시아 뮤시니필라, 또는 비피도박테리움 롱검을 후처리(종양 접종 후 투여)한 경우, 대조군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) BALB/c 마우스에 대장암 세포주인 CT26을 접종하고 5일 후부터 16일까지 HB03, 아커만시아 뮤시니필라, 또는 비피도박테리움 롱검을 처리한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (B) C57BL/6 JAX 마우스에 폐암 세포주인 LLC를 접종하고 5일 후부터 16일까지 HB03, 아커만시아 뮤시니필라, 또는 비피도박테리움 롱검을 처리한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (C) C57BL/6 JAX 마우스에 흑색종 세포주인 B16F10를 접종하고 5일 후부터 14일까지 HB03, 아커만시아 뮤시니필라, 또는 비피도박테리움 롱검 처리한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
도 9는 종양을 가진 마우스를 대상으로 HB03 및 HB03(P)를 전처리(종양 접종 전 투여)한 경우 대조군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) BALB/c 마우스에 대장암 세포주인 CT26를 접종하기 7일 전부터 접종 후 18일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (B) C57BL/6 JAX 마우스에 폐암 세포주인 LLC를 접종하기 7일 전부터 접종 후 18일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (C) C57BL/6 JAX 마우스에 흑색종 세포주인 B16F10를 접종하기 7일 전부터 접종 후 18일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (D) C57BL/6 JAX 마우스에 췌장암 세포주인 Panc02를 접종하기 7일 전부터 접종 후 18일까지 매일 HB03 및 HB03(P)를 처리한 후 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
도 10은 종양을 가진 마우스를 대상으로 HB03, 또는 아커만시아 뮤시니필라 (AKK P2261)을 후처리(종양 접종 후 투여)한 경우, 대조군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) C57BL/6 JAX 마우스에 대장암 세포주인 MC38을 접종하고 5일 후부터 14일까지 HB03, 또는 아커만시아 뮤시니필라 (AKK P2261)을 처리한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
도 11은 종양을 가진 마우스를 대상으로 면역관문억제제(αPD-1 mAb)를 HB03과 병용 투여한 경우와 단독으로 처리했을 때, 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) BALB/c 마우스에 대장암 세포주인 CT26를 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αPD-1 mAb를 2일 간격으로 16일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (B) C57BL/6 JAX 마우스에 폐암 세포주인 LLC를 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αPD-1 mAb를 2일 간격으로 16일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (C) C57BL/6 JAX 마우스에 흑색종 세포주인 B16F10를 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αPD-1 mAb를 2일 간격으로 15일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (D) C57BL/6 JAX 마우스에 교모세포종 세포주인 GL261을 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αPD-1 mAb를 2일 간격으로 15일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
도 12는 종양을 가진 마우스를 대상으로 면역관문억제제(αCTLA-4 mAb)를 HB03과 병용 투여한 경우와 단독으로 처리했을 때, 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) C57BL/6 JAX 마우스에 육종 세포주인 MCA205를 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αCTLA-4 mAb를 2일 간격으로 15일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (D) C57BL/6 JAX 마우스에 대장암 세포주인 MC38을 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αCTLA-4 mAb를 2일 간격으로 15일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
도 13은 종양을 가진 마우스를 대상으로 면역관문억제제(αPD-L1 mAb)를 HB03과 병용 투여한 경우와 단독으로 처리했을 때, 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) C57BL/6 JAX 마우스에 대장암 세포주인 MC38를 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αPD-L1 mAb를 2일 간격으로 15일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표;
도 14는 항생제 투여에 의한 면역관문억제제(αPD-1 mAb)의 내성을 가진 마우스를 대상으로 면역관문억제제(αPD-1 mAb)를 HB03 또는 비피도박테리움 롱검과 병용 투여한 경우와 단독으로 처리했을 때, 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) BALB/c 마우스에 대장암 세포주인 CT26을 접종하기 2주전부터 항생제를 물과 함께 섭취하며 접종 3일 후 일반 음용수로 변경하고 48시간 후 (접종 후 5일)부터 대조군 HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αPD-1 mAb를 2일 간격으로 16일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (B) C57BL/6 JAX 마우스에 흑색종 세포주인 B16F10을 접종하기 2주전부터 항생제를 물과 함께 섭취하며 접종 3일후 일반 음용수로 변경하고 48시간 후 (접종 후 5일)부터 대조군 HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αPD-1 mAb를 2일 간격으로 16일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
도 15는 항생제투여에 의한 면역관문억제제(αCTLA-4 mAb)의 내성을 가진 마우스를 대상으로 면역관문억제제(αCTLA-4 mAb)를 HB03과 병용 투여한 경우와 단독으로 처리했을 때, 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) C57BL/6 JAX 마우스에 대장암 세포주인 MC38을 접종하기 2주전부터 항생제를 물과 함께 섭취하며 접종 3일후 일반 음용수로 변경하고 48시간 후 (접종 후 5일)부터 대조군 HB03을 각각 매일 투여하면서 mIgG 또는 αCTLA-4 mAb를 2일 간격으로 16일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
도 16은 종양을 가진 마우스를 대상으로 항암제(5-FU5-Fluorouracil), 옥살리플라틴(Oxaliplatin))를 HB03과 병용 투여한 경우와 단독으로 처리했을 때, 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) C57BL/6 JAX 마우스에 대장암 세포주인 MC38를 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03을 각각 매일 투여하면서 PBS 또는 5-FU, 옥살리플라틴을 2일 간격으로 16일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표;
도 17은 pET-30a 벡터이다.
도 18은 종양 세포에 대해서 HB03 유래 분비 단백질들을 처리한 경우, 종양의 성장 및 세포사(apoptosis) 유도를 분석한 결과이다. (A) 대장암 세포주인 CT26과 (B) 폐암 세포주인 LLC에 HB03 유래 단백질인 HB03-01을 48시간 동안 농도별로 처리한 후, 세포증식을 분석한 결과에 대해서 나타낸 도표; (C) 폐암 세포주인 LLC에 HB03 유래 단백질인 HB03-01 또는 HB03-03을 24시간 동안 처리한 후, 세포사 유도 여부를 세포사 조절 단백질인 caspase-3의 활성화된 형태로 나타낸 도표.
도 19는 종양을 가진 마우스를 대상으로 HB03 유래 분비 단백질들을 처리한 경우, 대조군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석한 결과이다. (A) C57BL/6 JAX 마우스에 대장암 세포주인 MC38을 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03-01(AT1)을 2일 간격으로 16일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표; (B) C57BL/6 JAX 마우스에 대장암 세포주인 MC38을 접종하고 5일 후부터 대조군, HB03-03(AT3)을 2일 간격으로 16일까지 5회 투여한 후, 종양 성장 동역학을 관찰한 그래프를 나타낸 도표.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 게놈염기서열을 이용한 신규 균주의 동정
NCBI로부터 아커만시아(Akkermansia) 균주 총 66종의 게놈염기서열을 조회하여 dRep으로 MASH 유전체 염기서열 평균 유사도(average nucleotide identity, ANI)에 기반한 클러스터링을 실시하였다(도 1)(Matthew R Olm et al. dRep: a tool for fast and accurate 게놈 comparisons that enables improved genome recovery from metagenomes through de-replication. ISME J. 2017 Dec; 11(12): 2864-2868.). 이를 통해 도출된 단일 종 클러스터에 속하는 44종의 균주의 유전체(cluster 3)만을 취하여 후속 분석을 실시하였다.
코어 유전자 정렬(core-gene alignment)에 의한 계통수를 작성하기 위해, 프로카(prokka)에 의해 생산된 GFF3 포맷(Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 2014 Jul 15;30(14):2068-2069.)에서 주석화된 어셈블리(annotated assemblies)를 취하여 팬 게놈(pan genome)을 계산하는 고속 독립형 팬 게놈 파이프라인인 로어리(Roary)를 실시하였다. 이후 FastTree2를 이용하여 계통수(approximately maximum-likelihood trees)를 작성하였다(Price MN, Dehal PS, Arkin AP. FastTree 2--approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PLoS One. 2010 Mar 10;5(3):e9490.)(도 2). 유전자 존재/부재(gene presence/absence)의 그림으로부터 120개의 균주 특이적 유전자를 추출하였다(도 3). 이들의 대부분은 기능이 알려져 있지 않은 가설의 단백질(hypothetical protein)이었다. 상기 유전자들에 특이적인 균주를 "아커만시아 HB03(Akkermansia sp. HB03)"이라고 명명하였다.
로어리는 활성 CDS(코딩 서열)에서 번역한 단백질 서열에 의존하므로 유전체 염기서열에 오류가 있거나 주석화가 불완전한 경우 처음부터 분석 대상에서 제외되었다. 따라서, 로어리가 예측한 HB03 균주 특이적 유전자는 다시 모든 분석 대상 유전체 서열(단백질 코딩 서열이 아닌)에 대하여 검색하여 존재하지 않음을 명백히 하였다. LS-BSR(large-scare blast score ratio)을 사용하여 블라스트 점수의 비율(blast score ratio, BSR)을 계산하여 유전자의 존재 여부를 점검하였다(도 4).
앞서 추출 및 검증한 HB03 균주의 유전자에 병원체가 병원성(독성)을 내는데 필요한 유전자 집단인 병원성(독성) 유전자군(Pathogenicity island, PAI)이 존재하는지 확인한 결과, HB03 균주의 전체 게놈 유전자에는 병원성(독성) 유전자군이 존재하지 않는 것을 확인하였다(도 5).
상기 검증한 HB03 균주는 모균주인 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 표준균주(ATCC BAA-835)와 전체 게놈을 비교한 결과 8%의 차이가 있었으며, 게놈이 일치하는 부분에서도 전체 ANI값이 97% 수준에 불과하여, 기존 표준균주와 구별되는, 신규한 균주임을 확인하였다.
실시예 2: 신규 균주의 배양 특성 검정
HB03 균주를 변형된 BTTM 배지(Nat. Med. 2017. 23:107-113) (BTTM 배지에서 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)의 양을 1/10로 저감하고 L-트레오닌(L-threonine)의 양을 1/5로 저감함)에서 37℃의 혐기성 조건으로 배양하였다.
그 결과, HB03 균주는 하기 표 1과 같이 아커만시아 뮤시니필라에 비해 세포 수율(cell yield)이 2 배 이상 높으며, 생육속도 또한 2 배 정도 빠른 것으로 확인되었다.
37℃ 배양 일수(시간) 1일(24시간)
(cells/㎖)		 2일(48시간)
(cells/㎖)		 3일(72시간)
(cells/㎖)
ATCC BAA-835T 5.77 x 108 1.97 x 109 2.15 x 109
HB03 1.3 x 109 4.74 x 109 5.67 x 109
또한, 아커만시아 뮤시니필라는 침착이 어렵고 부유하는 성질이 있어 원심분리가 어렵고 이에 따라 대량생산이 어려우나 HB03 균주는 원심분리가 용이하여(도 6) 대량생산 및 게놈 편집이 모균주에 비해 용이하였다.
이 외에도 아커만시아 뮤시니필라 균주의 경우 배지 내에 아미노산의 일종인 L-쓰레오닌(L-thronine)이 없는 경우 생육이 일어나지 않았으나 HB03 균주는 L-쓰레오닌을 배지에 첨가하지 않아도 1.0 X 109 cells/ml의 농도까지 생육을 하였다(표 2). 이는 HB03 균주가 아커만시아 뮤시니필라 표준균주와는 달리 뮤신이나 뮤신 분해산물인 L-쓰레오닌이 없어도 뮤신이나 L-쓰레오닌 이외의 다양한 탄소원과 질소원을 영양성분으로 생장이 가능함을 나타낸다.
배지조성 (37℃, 2일 배양) ATCC BAA-835
(cells/ml)		 HB03
(cells/ml)
HB medium 1.97 x 109 4.74 x 109
HB medium- Glucose 제외 1.79 x 109 1.63 x 109
HB medium- Tryptone 제외 1.75 x 109 1.02 x 108
HB medium- N-acetylglucosamine 제외 No growth No growth
HB medium- Threonine 제외 No growth 1.32 x 109
이를 통해 본 발명의 균주는 기존의 아커만시아 뮤시니필라 균주와 다른 산업적으로 유용한 여러 특성을 지님을 확인하였다. 상기 본 발명의 균주인 "아커만시아 HB03(Akkermansia sp. HB03)"는 2018년 9월 11일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM12318P로 기탁하였다.
실시예 3: 종양 동물 모델 및 균주 조성물 준비
3-1. 종양 동물 모델
C57BL/6J JAX 및 BALB/c 마우스는 대한바이오링크에서 구입하여 6-8주령 수컷 마우스를 실험에 사용하였다. 마우스들은 케이지당 1마리씩 물과 음식에 자유롭게 접근하도록 하면서 조절된 환경(12시간 주광 사이클, 오후 7시에 암전)에서 사육하였다. C57BL/6 JAX 마우스에는 췌장암 세포주(Panc02), 흑색종 세포주(B16F10), 교모세포종 세포주 (GL261), 육종 세포주(MCA205) 대장암 세포주(MC38) 및 폐암 세포주(LLC)를, BALB/c 마우스에는 대장암 세포주(CT26)를 주입하여 종양 형성을 유도하였다. 종양 형성을 위해서 구체적으로, 마우스에 1ⅹ107 cells/100㎕의 Panc02, 2ⅹ105 cells/100㎕의 B16F10, 5ⅹ105 cells/100㎕의 GL261, 5ⅹ105 cells/100㎕의 MCA205, 5ⅹ105 cells/100㎕의 MC38, 5ⅹ105 cells/100㎕의 LLC, 5ⅹ105 cells/100㎕의 CT26 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양 크기를 종료 시점까지 2일 또는 3일마다 측정하고 종양부피를 길이 x 폭2 x 0.5로 계산하였다. HB03 및 그 단편에 의한 종양의 크기변화 및 면역 환경의 변화 연구를 위해, 막창자 내용물을 회수하여 액체 질소에 침지시키고 -80℃에서 보관하였다. 모든 실험 동물 절차는 한국생명공학연구원 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다.
3-2. 균주 조성물
-70℃, 20% 글리세롤에 보존된 균주(아커만시아 속. HB03, 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835, 비피도박테리움 롱검 ATCC BAA-999, 아커만시아 뮤시니필라 p2261)를 각각 37℃에서 배양한 후 5.0ⅹ109 CFU/ml로 액체 배양배지에 재현탁시킨 균주 조성물 HB03(아커만시아 속 HB03의 조성물), 아커만시아 뮤시니필라(아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835의 조성물), AKK p2261(아커만시아 뮤시니필라 p2261의 조성물) 및 비피도박테리움 롱검(비피도박테리움 롱검 ATCC BAA-999의 조성물)을 제조하였다. 이하 실시예에서 달리 표시하지 않는 한 "아커만시아 뮤시니필라"는 표준균주인 아커만시아 뮤시니필라 BAA-835를 의미하며 "AKK p2261"은 아커만시아 뮤시니필라 p2261을 의미한다. HB03, 아커만시아 뮤시니필라의 배양에는 실시예 2의 변형된 BTTM, AKK p2261의 배양에는 COS 배지(Columbia medium + 5% sheep blood (BiomιrieuxTM); Columbia medium: Polypeptone 17.0 g/L, Pancreatic Peptone of Heart 3.0 g/L, Autolytic yeast extract 3.0 g/L, Corn starch 1.0 g/L, Sodium chloride 5.0 g/L), 비피도박테리움 롱검의 배양에는 MRS 배지(De Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) medium)를 사용하였다.
앞서 제조한 HB03을 70℃에서 30분 동안 끓여 열 불활성화된 균주 조성물(HB03(P))을 제조하였다.
실시예 4: 균주 조성물 투여 방법
실시예 3-1의 대장암(CT26, MC38), 폐암(LLC) 및 흑색종(B16F10) 동물 모델은 종양 접종 7일 전 또는 5일 또는 6일 후부터 18일까지, 교모세포종(GL261) 동물 모델은 종양 접종 7일 전 또는 5일 또는 6일 후부터 22일까지, 육종 (MCA205) 동물 모델은 종양 접종 7일 전 또는 5일 또는 6일 후부터 16일까지, 췌장암(Panc02) 동물 모델은 종양 접종 7일 전 또는 6일 후부터 30일까지 매일 1회 경구 위관영양법으로 실시예 3-2의 균주 조성물 HB03, HB03(P), 아커만시아 뮤시니필라, AKK p2261 또는 비피도박테리움 롱검 각각을 100 μl씩 투여하였다.
실시예 5: 종양 동물 모델에서 균주 조성물 투여의 종양 성장 저해 효과 검정
실시예 3-1의 종양 동물 모델에 HB03 및 HB03(P)을 후처리(종양 접종 후 투여)한 경우, 대조군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석한 결과를 도 7에 나타내었다.
실시예 3-1의 종양 동물 모델에 HB03, 아커만시아 뮤시니필라, 또는 비피도박테리움 롱검을 후처리(종양 접종 후 투여) 한 경우, 대조군(PBS 투여)과 비교하여 종양 성장차이를 분석한 결과를 도 8에 나타내었다.
실시예 3-1의 종양 동물 모델에 HB03 및 HB03(P)를 전처리(종양 접종 전 투여) 한 경우, 대조군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석한 결과를 도 9에 나타내었다.
실시예 3-1의 종양 동물 모델에 HB03 또는 AKK p2261을 후처리(종양 접종 후 투여) 한 경우, 대조군(PBS 투여)과 비교하여 종양 성장차이를 분석한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 7 및 도 9와 같이, HB03 또는 HB03(P)를 종양세포 이식 이전 혹은 이후 일정기간 투여하였을 경우, 해당 종양의 성장이 현저히 감소되었다.
또한 도 8과 같이, 아커만시아 뮤시니필라, 또는 비피도박테리움 롱검과 HB03의 투여에 의한 항암 효능을 비교하였을 때, HB03 투여에 의한 항암 효과가 더욱 증가하였으며, 도 10에서도, AKK p2261과 HB03의 투여에 의한 항암 효능을 비교하였을 때, HB03 투여에 의한 항암효과가 더욱 증가하였다. 이를 통해 HB03 투여에 의한 항암 효과가 다른 3종의 균주에 비해 우수함을 확인하였다.
본 결과에서는 암 치료제로서 장내 미생물인 HB03 또는 HB03(P)가 종양 성장을 억제하는 이점을 입증하는 바, 본 발명의 균주 HB03는 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 6: 종양 동물 모델에서 면역관문억제제 및 균주 조성물 병용 투여의 종양 성장 저해 효과 검정
실시예 3-1의 종양 동물 모델에 면역관문억제제(aPD-1 mAb)와 HB03를 병용 투여한 경우, 병용 투여하지 않은 군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석하였다. 대조군에는 mIgG(150 μg/mouse) 및 PBS(100 ㎕/mouse), 실험군에는 αPD-1 mAb(150 μg/mouse) 및 PBS(100 ㎕/mouse), αPD-1 mAb(150 μg/mouse) 및 HB03(100 ㎕/mouse)을 투여하였다. 대장암(CT26), 폐암(LLC), 흑색종(B16F10) 및 교모세포종(GL261) 동물 모델에 종양 접종 후 5일 후부터 16일까지 2일 간격으로 5회 mIgG 또는 αPD-1 mAb 100 μl을 정맥주사하고, PBS(ctrl, 대조군) 또는 HB03 100 μl을 각각 매일 경구 위관영양법을 통해 앞서 표기한 용량으로 투여하고 16일째에 종양 크기를 비교하여 도 11에 나타내었다.
다른 면역관문억제제(αCTLA-4 mAb)와 HB03를 병용 투여한 경우, 병용 투여하지 않은 군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석하기 위해, 대조군에는 mIgG(25 μg/mouse) 및 PBS(100 ㎕/mouse), 실험군에는 αCTLA-4 mAb(25 μg/mouse) 및 PBS(100 ㎕/mouse), αCTLA-4 mAb(25 μg/mouse) 및 HB03(100 ㎕/mouse)을 투여하였다. 육종(MCA205) 및 대장암(MC38) 동물 모델에 종양 접종 후 5일 후부터 16일까지 2일 간격으로 5회 mIgG 또는 αCTLA-4 mAb 100 μl을 정맥주사하고, PBS(ctrl, 대조군) 또는 HB03 100 μl을 각각 매일 경구 위관영양법을 통해 앞서 표기한 용량으로 투여하고 16일째에 종양 크기를 비교하여 도 12에 나타내었다.
또한, 또 다른 면역관문억제제(αPD-L1 mAb)와 HB03를 병용 투여한 경우, 병용 투여하지 않은 군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석하기 위해, 대조군에는 mIgG(100 μg/mouse) 및 PBS(100 ㎕/mouse), 실험군에는 αPD-L1 mAb(100 μg/mouse) 및 PBS(100 ㎕/mouse), αPD-L1 mAb(100 μg/mouse) 및 HB03(100 ㎕/mouse)을 투여하였다. 대장암(MC38) 동물 모델에 종양 접종 후 5일 후부터 16일까지 2일 간격으로 5회 mIgG 또는 αPD-L1 mAb 100 μl을 정맥주사하고, PBS(ctrl, 대조군) 또는 HB03 100 μl을 각각 매일 경구 위관영양법을 통해 앞서 표기한 용량으로 투여하고 16일째에 종양 크기를 비교하여 도 13에 나타내었다.
도 11 내지 13과 같이, 면역관문억제제인 αPD-1 mAb, αCTLA-4 mAb 또는 αPD-L1 mAb와 HB03를 병용 투여하였을 경우, 면역관문억제제를 단독으로 처리하였을 때보다 항-종양 효과가 현저히 증가되었다.
본 결과에서는 암 치료 시, 면역관문억제제를 저농도로 사용하여 부작용 및 저항성은 감소시키고 항-종양 효과는 증가시키는데 장내 미생물인 HB03이 종양 성장을 억제하는 이점을 입증하였다.
실시예 7: 내성 동물 모델에서 면역관문억제제 및 균주 조성물 병용 투여의 종양 성장 저해 효과 검정
실시예 3-1의 종양 동물 모델에 종양을 투여하기 2주전부터 암피실린(Ampicillin 1㎍/㎖), 스트렙토마이신(Streptomycin 5 ㎍/㎖), 콜리스틴(Colistin 1 ㎍/㎖)을 음용수에 용해하여 섭취하며 종양을 접종하고 면역관문억제제(αPD-1 mAb) 및 HB03을 투여하기 48시간 전 일반 음용수로 교체한 후, αPD-1 mAb와 HB03 또는 비피도박테리움 롱검을 병용 투여한 경우, 병용 투여하지 않은 군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석하였다. 대장암(CT26) 및 흑색종(B16F10) 동물 모델에 종양 접종 후 5일 후부터 16일까지 2일 간격으로 5회 mIgG 또는 αPD-1 mAb을 정맥주사하고 PBS(ctrl, 대조군), HB03 또는 비피도박테리움 롱검을 각각 매일 경구 위관영양법으로투여하여, 면역관문억제제 및 균주 조성물을 100 μl씩 투여하였다. 이후 16일째에 종양 크기를 비교하여 도 14에 나타내었다.
또한, 실시예 3-1의 종양 동물 모델에 종양을 투여하기 2주전부터 암피실린(1㎍/㎖), 스트렙토마이신(5 ㎍/㎖), 콜리스틴(1 ㎍/㎖)을 음용수에 용해하여 섭취하며 종양을 접종하고 면역관문억제제(αCTLA-4 mAb) 및 HB03을 투여하기 48시간 전 일반 음용수로 교체한 후, αCTLA-4 mAb와 HB03을 병용 투여한 경우, 병용 투여하지 않은 군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석하였다. 대장암(MC38) 동물 모델에 종양 접종 후 5일 후부터 16일까지 2일 간격으로 5회 mIgG 또는 αCTLA-4 mAb을 정맥주사하고 PBS(ctrl, 대조군) 또는 HB03을 각각 매일 경구 위관영양법으로 투여하여, αCTLA-4 mAb 및 균주 조성물을 100 μl씩 투여하였다. 이후 16일째에 종양 크기를 비교하여 도 15에 나타내었다.
도 14와 같이, 항생제 투여에 따른 면역관문억제제의 내성이 생긴 마우스에 면역관문억제제인 αPD-1 mAb와 HB03를 병용 투여하였을 경우, 면역관문억제제를 단독으로 처리하였을 때보다 항-종양 효과가 현저히 증가되었으며, 이러한 효과는 기존에 알려진 아커만시아 뮤시니필라 또는 비피도박테리움 롱검을 병용 투여 했을 때보다 우수하였다.
또한, 도 15와 같이, 항생제 투여에 따른 면역관문억제제의 내성이 생긴 마우스에 면역관문억제제인 αCTLA-4 mAb와 HB03를 병용 투여하였을 경우, 면역관문억제제를 단독으로 처리하였을 때보다 항-종양 효과가 현저히 증가되었다.
본 결과에서는 암 치료 시, 면역관문억제제 내성으로 항암 효율이 낮아지는 현상이 장내 미생물인 HB03에 의해 극복되어 항-종양 효과는 증가시킴으로써 종양 성장을 억제하는 이점을 입증하였다.
실시예 8: 종양 동물 모델에서 항암제 및 균주 조성물 병용 투여의 종양 성장 저해 효과 검정
실시예 3-1의 종양 동물 모델에 화학항암제(5-FU(5-Fluorouracil)), 표적항암제(옥살리플라틴(Oxaliplatin))와 HB03를 병용 투여한 경우, 병용 투여하지 않은 군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석하였다. 대조군에는 살린(Saline) (100 ㎕/mouse) 및 PBS(100 ㎕/mouse), 실험군에는 5-FU(2㎎/㎏), 옥살리플라틴(20 ㎎/㎏) 및 살린(100 ㎕/mouse), 5-FU(2㎎/㎏), 옥살리플라틴(20 ㎎/㎏) 및 HB03(100 ㎕/mouse)을 투여하였다. 대장암(MC38) 동물 모델에 종양 접종 후 5일 후부터 16일까지 2일 간격으로 5회 5-FU 및 옥살리플라틴 100 μl을 정맥주사하고, PBS(ctrl, 대조군) 또는 HB03 100 μl을 각각 매일 경구 위관영양법을 통해 앞서 표기한 용량으로 투여하였다. 이후 16일째에 종양 크기를 비교하여 도 16에 나타내었다.
그 결과, 도 16과 같이, 대장암 동물 모델에 항암제인 5-FU, 옥살리플라틴과 HB03를 병용 투여하였을 경우, 항암제를 단독으로 처리하였을 때보다 항-종양 효과가 현저히 증가되었다.
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실시예 9: 종양 세포에서 균주 조성물 투여의 종양 성장 저해 및 세포사 (apoptosis) 유도 효과 검정
HB03 균주가 생산하는 단백질인 HB03-01 및 HB03-03을 코딩하는 유전자를 HB03 균주의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 증폭하였다. 이후 증폭한 유전자를 pET-30a 벡터에 클로닝하고(도 17), 대장균(E.coli)에서 과발현하였다. 과발현된 균주를 원심분리하여 균체만을 수득한 후에 PBS 버퍼에 재현탁하여 균체를 농축한 후 초음파 처리(Sonication)를 통해 균체를 파쇄하고 다시 원심분리를 하여 상등액만을 분리한 후 이 상등액을 His-taq 컬럼을 사용하여 HB03-01(서열번호 1) 및 HB03-03(서열번호 2) 단백질을 순수하게 정제하였다.
이후, 정제된 HB03-01 및 HB03-03 단백질들이 암세포 세포주의 증식 또는 세포사(Apoptosis)에 영향을 주는지에 대해 조사하였다. 구체적으로, 대장암 세포주(CT26) 및 폐암 세포주(LLC)에 HB03 유래 단백질인 HB03-01을 0(무처리), 0.1, 1.0, 10 μg/ml의 농도, HB03-03을 10 μg/ml의 농도로 처리하고 암세포의 증식 변화 및 세포사 유도 조절 효소인 캐스파제-3(caspase-3)의 활성 수준을 확인하였다.
암세포의 증식 변화를 확인하기 위해, 엠티티 분석(MTT assay)을 실시하였다. 각 암세포주를 DMEM 배지(Gibco, 미국)를 사용하여 37℃, 5% CO2의 항온기에서 96-well 플레이트에 1Х104 cells/well의 농도로 넣어 24시간 배양하였다. 조직 내에서 증식하는 고형암 조건을 부여하기 위해, 최종 농도가 20 mM이 되도록 2-탈산포도당(2-deoxyglucose; 2-DG)을 처리하여 저 포도당 조건을 유지한 다음 6시간 동안 배양한 후, HB03-01을 0, 0.1, 1.0, 10 μg/ml의 농도로 48시간 동안 처리하였다. 엠티티 용액을 10 ㎕씩 첨가한 후 다시 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 96-웰 플레이트에 있는 배지를 제거하고, 100 ㎕의 DMSO로 플레이트 내에서 형성된 포르마잔(formazan)을 녹인 다음, 이의 흡광도를 ELISA 판독기(Model 680, BioRad)의 540 nm에서 측정하였다. 이때, 대조군은 HB03-01을 0 μg/ml의 농도로 처리하였으며(무처리), 측정값은 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포 생존률(%)로 나타내었다.
캐스파제-3의 활성 수준을 확인하기 위해, 단백질 수준을 측정하기 위한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 10 μg/ml의 HB03-01 및 HB03-03로 24시간 동안 각각 처리된 폐암세포를 2 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 0.5 mM EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), 300 mM 슈크로스(sucrose) 및 2 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유하는 빙냉(ice-cold) 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에서 균질화시켰다. 50 μg의 단백질을 15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 겔에서 전기영동한 후, 세미드라이 트렌스퍼 시스템(Semidry transfer system, Hoefer, Holliston, MA, USA)을 사용하여 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막에 옮겼다. 비특이적 결합은 5% 탈지분유(non-fat dry milk)로 배양하여 막았다. 막을 4℃에서 1 차 500 배 희석액과 함께 하룻밤 동안 항온 배양한 후, 1:1000으로 희석한 HRP(horseradish peroxidase)로 결합하여 2차 항체로 배양하였다. ECL 검출 키트(ECL detection kit, Amersham Biosciences Korea, Seoul, Korea)를 이용하여 면역 복합체를 검출하고 X-ray 필름에 자동 방사선 조사하였다. 웨스턴 블롯에 사용되는 항체는 actin, 절단된 캐스파제-3(cleaved caspaese-3)였으며 Santa Cruz Biotechnolgy(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다.
그 결과 도 18A 및 18B와 같이, HB03 유래 단백질인 HB03-01은 대장암 및 폐암세포의 증식을 의미 있게 감소시켰다. 또한, 도 18C와 같이, 또 다른 HB03 유래 단백질인 HB03-03과 함께 폐암세포의 세포사 유도 조절 효소(caspase-3)를 각각 활성화시켰다.
이로부터 장내 미생물인 HB03 유래 단백질 또는 대사체가 암 치료에 도움이 되는 환경을 생성하거나 종양 성장을 억제하는 이점을 입증하였다.
실시예 10: 종양 동물 모델에서 균주 조성물 투여의 종양 성장 저해 효과 검정
실시예 3-1의 종양 동물 모델에 HB03-01(AT1) 및 HB03-03(AT3)을 후처리(종양 접종 후 투여)한 경우, 대조군과 비교하여 종양 성장 차이를 분석한 결과를 도 19에 나타내었다.
그 결과, HB03-01(AT1) 및 HB03-03(AT3)은 HB03-01(AT1) 및 HB03-03(AT3) 처리하지 않은 대조군에 비해 종양 성장을 현저히 억제하는 것을 확인하였다.
본 결과에서는 암 치료제로서 장내 미생물 HB03에서 파생한 단백질이 종양 성장을 억제하는 이점을 입증하는 바, 본 발명의 균주 HB03의 단백질이 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 실시예들의 결과는 장내 유익 미생물의 존재 또는 증가된 수준, 미생물의 활성 및 불활성의 수준이 암 치료 또는 종양의 성장 및 확산에 대한 영향을 강화시킴을 시사하였다.
특히, 본 발명에서는 특정 미생물, 즉, 본 발명의 신규한 유익 미생물의 주입에 의한 장내 미생물의 조절이 종양의 치료를 촉진하고 다른 면역 반응의 기전을 감소시키거나 억제시켜 종양 성장을 억제한다는 것을 입증하였다. 구체적으로, 본 발명에서 개시한 신규한 유익 미생물은 암 치료를 촉진하는 암 치료에 도움이 되는 대사체(세포, 조직, 체액과 같은 생물학적 시료 내에 존재하는 대사물질. 예를 들면, 아미노산, 핵산, 지방산, 당류, 아민류, 당지질, 짧은 펩티드, 비타민, 호르몬 등) 또는 단백체를 분비하여 암 치료에 도움이 되는 환경을 생성하고 종양 성장을 억제한다.
도표 및 그래프의 평균 ± SEM으로 표시하였다. 종양 성장 측정들 사이의 통계적 차이를 확인하기 위한 p-value는 student's t-test (Excel software)에 의해 추산하였다. P<0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였고, 하기와 같이 표시되었다: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12318P 20180911
<110> HEALTHBIOME <120> Strict anaerobic human gut microbe for antitumor treatment and uses thereof <130> KPA190659-KR-P1 <150> KR 10-2019-0118268 <151> 2019-09-25 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 287 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HB03-01 <400> 1 Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile Ala 1 5 10 15 Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg 20 25 30 Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala 35 40 45 Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala 50 55 60 Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe 65 70 75 80 Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr 85 90 95 Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro 100 105 110 Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn 115 120 125 Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys 130 135 140 Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu 145 150 155 160 Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu 165 170 175 Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala 180 185 190 Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile 195 200 205 Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala 210 215 220 Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro 225 230 235 240 Ala Asp Glu Ala Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile 245 250 255 Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn 260 265 270 Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 275 280 285 <210> 2 <211> 127 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HB03-03 <400> 2 Ile Pro Glu Ser Ser Val Pro Ala Ala Ala Val Ser Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 Ala Tyr Pro Asn Ala Gly Pro Ile Glu Trp Asp Ser Glu Met His Gly 20 25 30 Met Glu Arg Ile Tyr Glu Ala Glu Phe Arg Ile Asn Gly Phe Gln Phe 35 40 45 Asp Val Lys Ile Ala Pro Asp Gly Lys Ile Val Arg Ile Lys Glu Glu 50 55 60 Ile Ala Ala Ser Ser Leu Pro Glu Ala Val Arg Ala Ser Val Leu Lys 65 70 75 80 Arg Tyr Pro Gly Cys Arg Ile Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Glu Gly 85 90 95 Glu Leu Val Arg Tyr Lys Val Glu Val Ala Asp Ser Arg Asp Asp Tyr 100 105 110 Asp Val Leu Ile Ala Pro Asp Gly Asn Ile Leu His Val Asp Arg 115 120 125

Claims (12)

  1. 수탁번호 KCCM12318P로 기탁된 신규한 아커만시아 HB03 균주(Akkermansia sp. HB03).
  2. 제1항의 아커만시아 균주, 이의 불활성화된 균주, 이의 배양액, 이의 소포체, 이의 단백체 및 이의 대사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 불활성화는 가열에 의한 열 불활성화인, 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 약학 조성물은 항암제와 병용 투여하는 것인, 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항암제는 화학항암제, 표적항암제 및 면역관문억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약학 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 암은 항암제에 내성을 나타내는 암을 포함하는, 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항암제는 면역관문억제제인, 약학 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 단백체는 HB03-01 및 HB03-03 중 어느 하나 이상의 단백질인, 약학 조성물.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법.
  10. 제1항의 아커만시아 균주, 이의 불활성화된 균주, 이의 배양액, 이의 소포체, 이의 단백체 및 이의 대사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 불활성화는 가열에 의한 열 불활성화인, 식품 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 단백체는 HB03-01 및 HB03-03 중 어느 하나 이상의 단백질인, 식품 조성물.
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