JP5832105B2 - 5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンを含むエキスの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明の第1は、(1)マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して0.5〜50倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得、次いで前記マッシュルーム破砕物を加熱することにより、殺菌を行うと共に、マッシュルームの組織を部分的に分解し、マッシュルーム破砕加熱物を得る工程;および、(3)前記マッシュルーム破砕加熱物を、40〜121℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る工程;を有する、5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンを含むエキスの製造方法である。
本工程では、マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して0.5〜50倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得る。
本発明の好ましい実施形態によれば、工程(2)において、上記工程(1)で得られたマッシュルーム破砕加熱物を、40〜60℃程度まで冷却後、セルラーゼまたはヘミセルラーゼを添加して酵素処理し、マッシュルーム破砕酵素処理物を得る。酵素処理を行うことにより、マッシュルームの細胞壁を分解し、細胞から5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンを効率よく放出させて、工程(3)による抽出効率を向上することが可能となる。
本工程では、前記(1)で得られたマッシュルーム破砕加熱物または前記(2)で得られたマッシュルーム破砕酵素処理物を、40〜121℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る。当該工程によって、マッシュルーム破砕酵素処理物から、5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンを高い効率で抽出することができる。
遠心分離条件は、水不溶性部分を分離できる条件であれば特に制限されない。具体的には、マッシュルーム抽出物を、4〜50℃で、3000〜12000rpm、5〜30分間、遠心分離することが好ましく、4〜30℃で、4000〜10000rpm、5分〜30分間、遠心分離することがより好ましい。
濃縮方法は、特に制限されず、減圧濃縮、限外濾過、真空濃縮、凍結濃縮、膜濃縮等、公知の方法が使用できる。また、濃縮条件は、特に制限されないが、通常、80℃以下、より好ましくは30〜70℃で、濃縮装置により減圧下濃縮することが好ましい。また、濃縮後の液量もまた、特に制限されず、使用する状況により適当な質量とすればよい。
前記濃縮液を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかけて、5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンの含有率を向上させる。このようにすることによって、高い含有率を有するMTAエキスを得る。以下、工程(6−1)の好ましい態様を説明する。
逆相カラムクロマトグラフィーは、移動相に、水、メタノール、アセトニトリル等の極性を有する溶出溶媒を用い、固定相に、オクタデシル基等を化学結合した無極性の充鎮剤を用いたカラムクロマトグラフィーのことであり、移動相より固定相に溶け易い成分ほど遅く溶出するため、極性の大きいものほど早く溶出する。
滅菌条件は、80℃以上であれば、十分、滅菌できるが、好ましくは80〜121℃、より好ましくは90〜121℃の温度で、好ましくは10〜60分間、より好ましくは10〜30分間、滅菌する。このような温度および時間範囲であれば、濃縮液中の有効成分の活性は維持しつつ、滅菌を十分行うことができる。なお、上記滅菌操作は、1回行われてもあるいは2回以上繰り返し行われてもよく、また、繰り返し行う場合には、各操作条件は、同一であってもあるいは異なる条件であってもよい。
滅菌抽出液の乾燥方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、凍結乾燥、スプレードライ乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、蒸気乾燥、バレル乾燥、スピン乾燥、吸引乾燥、赤外線乾燥、対流伝熱乾燥、気流乾燥、流動層乾燥、加熱水蒸気乾燥、回転ドラム乾燥、マイクロ波乾燥、超臨界乾燥等の方法によって、滅菌抽出液を乾燥粉末化することもできる。
本発明の第2は、本発明の第1の製造方法によって製造された5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンを含むエキスを有効成分(以下、単に「本発明のエキス」とも称する)として含有する、医薬品である。本発明の第2の医薬品としては、インスリン抵抗性に起因する疾病に対する予防剤若しくは治療剤であれば特に制限させることはなく、例えば、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、肥満症、アルツハイマー(特開2008−285438号公報 参照)などに対する予防剤または治療剤などが挙げられる。
本発明の第3は、本発明のエキスを含む、食品である。
市販の生のマッシュルーム1000gを測り採り、水洗したものに、等量の蒸留水1000mlを加え、ブレンダーで破砕し、約1mm以下の大きさのマッシュルーム破砕物を得た。得られたマッシュルーム破砕物に、マッシュルーム破砕物の細胞壁を部分的に分解すること、および殺菌を目的として、100℃で10分間、煮沸を行い、マッシュルーム破砕加熱物を得た。次に、このマッシュルーム破砕加熱物に蒸留水2000gを加えた。その後、生マッシュルームの質量に対して、1.05質量%のクエン酸を加え、pHを4に調節し、40℃まで冷却した。さらに、この冷却したマッシュルーム破砕加熱物に、生マッシュルームの質量に対して、0.1質量%の植物組織崩壊酵素であるセルラーゼ製剤を加え、緩やかに攪拌させながら、40℃で1時間、酵素処理を行い、マッシュルーム破砕酵素処理物を得た。
高分解能Positive ion FABマススペクトルを測定したところ、m/z 298.099にM+Hのシグナルが観察され、その分子式はC11H15N5O3Sであることが示された。また1Hおよび13C−NMRスペクトルにおいて、下記に示したように6−aminopurin,riboseおよびS−methyl基の存在を示すシグナルが観察された。これらシグナルは、5−deoxy−5’−(methylthio)−adenosineのシグナルと完全に一致した。以上の結果から、以下の構造を同定した。
上記で調製したマッシュルームエキス末(MTA含有量測定用乾燥粉末)80mgをエッペンチューブに測り取り、5倍量(400μL)のMeOHを加えてホモジナイザーで30秒間ホモジナイズした。その後、遠心分離し(10,000rpm、10分)、上清を回収した。
4.1
2.で同定した活性成分をジメチルスルホキシド(DMSO)で1000μg/mLになるように、溶解させた。
COS−1細胞をトリプシン処理により回収し、1000rpm、4℃で、3分間遠心分離した後、上清を除去した。得られた細胞を、2mlの培地(DMEM培地)に分散して、60mm培養シャーレ(Corning社)に5×105cell/wellの密度で播いた後、37℃、5% CO2存在下にて、24時間、培養した。
4.2における、被検試料添加から24時間後、96well plateから培地を25μl/well回収し、96well white plateに移した。その後、残りの100μl/wellに、37℃にて融解したルシフェラーゼ(Luciferase)活性測定用溶液を100μl/well添加し、暗所にて35分間反応させた後、それぞれのLuciferaseの発光強度(下記式中の、「被検試料のLuciferase発光強度」)を測定した。なお、上記方法において、比較対照として、被検試料を添加する代わりにDMSOを添加する以外は、同様の実験を行った(下記式中の、「DMSOのLuciferase発光強度」)。また、Luciferase活性測定用溶液は、下記に従って調製された。
4.2における、被検試料添加から24時間後、96well plateから回収した培地25μl/wellに、1×Dillution Buffer 25μl/wellを添加した。セロハンテープで蓋をした後、穏やかに攪拌し、65℃で30分間、放置した。その後、4℃に冷却し、25℃に戻してから、Assay Buffer 90μl/wellを添加して、穏やかに攪拌した。25℃で5分間放置し、MUP solution 10μl/wellを添加して、穏やかに攪拌した。暗所にて25℃で60分間反応させた後、4−methyl umbelliferoneに基づくSEAPの蛍光強度(Ex=360nm、Em=460nm)(下記式中の、「被検試料のSEAP蛍光強度」)を測定した。なお、上記方法において、比較対照として、被検試料を添加する代わりにDMSOを添加する以外は、同様の実験を行った(下記式中の、「DMSOのSEAP蛍光強度」)。また、1×Dillution Buffer、Assay Buffer及びMUP solutionは、1.5に従って調製された。
4.3で使用されるLuciferase活性測定用溶液は、以下のようにして調製した。すなわち、60mM Tricine−NaOH(pH7.8)、16mM (MgCO3)4Mg(OH)2・5H2O(塩基性MgCO3)、0.4mM EDTA、10% Surfact−Amps X−100(Thermo)、0.5mM D−Luciferin potassium salt(ナカライテスク)、1.5mM Adenosine 5’−triphosphate(SIGMA)、0.5mM Coenzyme A(SIGMA)、及び0.1mM β−Mercapto ethanolを超純水で調製し、10ml程度ずつ分注して使用直前まで−20℃で保存した。
4.3で測定されたLuciferaseの発光強度、および4.4で測定されたSEAPの蛍光強度から、下記数式1に従い、PPARγ活性化能を算出した。結果、9373であった。PPARγ活性化能の結果を図1に示す。
最終濃度を125μg/mLとなるように添加した以外は、実施例1と同様に実験を行い、PPARγ活性化能を算出した。結果、6080であった。PPARγ活性化能の結果を図1に示す。
最終濃度を63μg/mLとなるように添加した以外は、実施例1と同様に実験を行い、PPARγ活性化能を算出した。結果、3348であった。PPARγ活性化能の結果を図1に示す。
Claims (3)
- (1)マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して0.5〜50倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得、次いで前記マッシュルーム破砕物を加熱することにより、殺菌を行うと共に、マッシュルームの組織を部分的に分解し、マッシュルーム破砕加熱物を得る工程;
(3)前記マッシュルーム破砕加熱物を、40〜121℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る工程;および、
(6−1)前記マッシュルーム抽出物を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかけて、5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンの含有率を向上させる工程;を有する、
5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンを含むエキスの製造方法。 - (2)前記(1)の工程に記載のマッシュルーム破砕加熱物を、40〜60℃の温度でセルラーゼまたはヘミセルラーゼを用いて酵素処理を行い、マッシュルーム破砕酵素処理物を得る工程;をさらに有し
前記(3)の工程に記載のマッシュルーム破砕加熱物の代わりに、前記マッシュルーム破砕酵素処理物の熱水抽出を行う、請求項1に記載の製造方法。 - (1)マッシュルームに、マッシュルームの質量に対して0.5〜50倍の質量の水を加えた後、マッシュルームを破砕して、マッシュルーム破砕物を得、次いで前記マッシュルーム破砕物を加熱することにより、殺菌を行うと共に、マッシュルームの組織を部分的に分解し、マッシュルーム破砕加熱物を得る工程;
(2)前記マッシュルーム破砕加熱物を、40〜60℃の温度でセルラーゼまたはヘミセルラーゼを用いて酵素処理を行い、マッシュルーム破砕酵素処理物を得る工程;
(3)前記マッシュルーム破砕酵素処理物を、40〜121℃に加熱して熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得る工程;および、
(6−1)前記マッシュルーム抽出物を合成吸着樹脂によるクロマトグラフィーにかける工程;を有し、
前記(1)または(2)の工程のいずれかにおいて、マッシュルーム破砕物のpHが3〜6になるように、酸を添加する工程を有する、
5’−デオキシ−5’−メチルチオアデノシンの製造方法。
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