KR102143856B1 - 대식세포에 물질을 송달하는 담체 - Google Patents

대식세포에 물질을 송달하는 담체 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 대식세포에 효율적으로 물질을 송달하기 위한 저비용 및 안전한 수단을 제공하는 것을 목적으로 하고, 유산균 및/또는 그 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 대식세포에 물질을 송달하기 위한 담체에 관한 것이다.

Description

대식세포에 물질을 송달하는 담체 {CARRIER FOR TRANSPORTING SUBSTANCE TO MACROPHAGES}
본 발명은, 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는, 대식세포에 물질을 송달하기 위한 약물담체에 관한 것이다.
생체내의 대식세포는 식균작용에 의한 이물, 노폐물의 제거, 또는 자연면역에 중심적인 역할을 하고 있는 것과 더불어, 항원처리기능에 의해, 획득면역의 조절에도 중요한 역할을 하고 있다고 사료되고 있다. 한편, 대식세포의 활성 혹은 기능의 항진이, 생체에 있어 병적인 상태를 가져오는 경우가 있는 것도 알려져 있다.
대식세포의 활성 혹은 기능의 항진에 기인한 질환으로서는, 아테롬성 동맥경화증, 울혈성 심부전, 허혈성 질환, 재협착, 고혈압, 섬유성 혈관장애(당뇨병, 전신성 에리테마토데스 등), 신경변성질환(예를 들면, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 척수소뇌변성증, 근위축성측색경화증 등), 뇌손상, 뇌혈관사상(예를 들면, 졸중, 발작, 신경상해 및 중추신경계 내부에서의 재생 등), 조혈장애, 성인호흡궁박증후군(ARDS), 암(특히 성인T세포 백혈병을 포함하는 백혈병) 및 고형암, 자기면역질환, 감염(예를 들면, HIV감염 및 AIDS 등), 섬유증식장애(예를 들면, 건선 등), 만성 및 급성 염증 질환(예를 들면, 관절 류머티즘, 크론병, 염증성 장 증후군 등), 사구체 질환, 패혈증, 이식편거절반응, 이식편대숙주질환, 뼈질환, 변형성 섬유증식/염증응답에 의해 특징지어지는 경우가 있는 심장혈관 및 심장혈관 이외의 혈관의 병태, 예를 들면 산소 또는 글루코오스 결핍 조직 등의 병에 의해 손상된 부위로의 백혈구의 침윤에 의해 특징지어지는 질환(예를 들면, 뇌졸중 및 심근경색 등) 등을 들 수 있다.
그런데, 여러 가지 생체조직 중의 대부분의 대식세포에는, 이물 탐식에 기여하는 스캐빈저 수용체가 널리 발현하고 있다. 이 스캐빈저 수용체는, 부전하를 띤 여러 가지 입자에 대해서 친화성을 가지고, 산화, 아세틸화 및 당화 등으로 변성한 변성LDL, 및 체내에 침입한 세균 및 그 구성인자의 탐식을 매개하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1~3). 스캐빈저 수용체의 발현량이 대식세포 내의 변성LDL의 양에 의존해서 조절되지는 않기 때문에, 대식세포는 무제한으로 변성LDL을 흡수한다. 그리고, 상기 아테롬성 동맥경화증은, 이 변성LDL이 과잉축적된 대식세포가 혈관 내막에서 포말화하는 것에 기인한다.
상기와 같이, 대식세포에 있어서의 변성LDL의 과잉축적에 의해, 아테롬성 동맥경화가 일어나기 때문에, 예를 들면, 항포말화작용을 가지는 화합물(예를 들면, esculeogenin A(비특허문헌 4), PPARγ아고니스트(비특허문헌 5), 아디포넥틴(비특허문헌 6) 등), 또는, 대식세포 내에 축적한 변성LDL의 대사나 분해를 담당하는 효소(비특허문헌 7) 등을, 대식세포에 효율적으로 송달함으로써, 보다 효과적으로 아테롬성 동맥경화의 예방 및 치료를 할 수 있다고 사료되며, 오늘날 많은 연구가 이루어지고 있다.
예를 들면, 약물을 대식세포에 효율적으로 송달하기 위해서, 종래, 표적지향성 리포솜을 이용하는 등의 수단이 고안되어 왔다. 그렇지만, 표적지향성 리포솜은, 복잡한 화학합성이나 정제프로세스가 필요하여, 공업화에는 많은 과제가 있엇다.
이로 인해, 대식세포로의 물질 송달의 효율이 높고, 또한 제조가 용이하고, 안전성이 높고, 비교적 저비용인 담체의 개발이 기대되고 있었다.
없음
Nature. 1997 Mar 20; 386(6622):292-6. Cell Microbiol. 2009 Aug; 11(8):1160-9. J Biol Chem. 2011 Feb 11; 286(6):4854-70. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 Nov; 27(11):2400-6. Nat Med. 2001; 7(1):48-52. Atherosclerosis. 2013; 228(1): 124-35. 일본유산균학회지 Vol.14 (2003) No.2 pp.72-79.
본 발명은, 대식세포에 효율적으로 물질(예를 들면, 약물, 약제 등)을 송달하기 위한, 저비용 및 안전한 담체를 제공하는 것, 및, 대식세포에 물질을 효율적으로 송달하기 위한 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 놀랍게도 유산균이 대식세포에 효율적으로 흡수되는 것을 발견하고, 한층 더 연구를 거듭하여, 유산균이 대식세포의 스캐빈저 수용체에 대해서 높은 친화성을 가짐으로써, 대식세포에 의한 그 유산균의 흡수 효율이 향상한다고 하는 지견을 얻어, 더욱 여러 가지 검토를 거듭하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 발명에 관한 것이다.
(1) 유산균 및/또는 그 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 대식세포에 물질을 송달하기 위한 담체.
(2) 상기 유산균이 락토바실러스(Lactobacillus)속에 속하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 담체.
(3) 상기 유산균이 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 속하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 담체.
(4) 상기 유산균이 락토바실러스 플란타룸 L-137주(Lactobacillus plantarum L-137)인 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 담체.
(5) 상기 유산균이 사균체인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 약물담체.
(6) 대식세포로의 물질의 송달이, 대식세포의 스캐빈저 수용체를 통하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 담체.
(7) 상기 스캐빈저 수용체가 클래스 A의 스캐빈저 수용체인 것을 특징으로 하는 상기 (6)에 기재된 담체.
(8) 상기 물질이, 대식세포가 관여하는 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 이용하는 물질인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 담체.
(9) 상기 대식세포가 관여하는 질환이, 아테롬성 동맥경화증인 것을 특징으로 하는 상기 (8)에 기재된 담체.
(10) 상기 (1)~(9) 중 어느 하나에 기재된 담체와, 상기 대식세포에 송달하는 물질을 함유하는 조성물.
(11) 상기 (1)~(9) 중 어느 하나에 기재된 담체를 이용하는 것을 특징으로 하는 대식세포로의 물질의 송달 방법.
본 발명에 의하면, 소망한 여러 가지 물질을 대식세포에 효율적으로 송달하기 위한 담체를 제공할 수 있다. 또한, 예를 들면 상기 물질로서, 대식세포가 관여하는 질환에 대한 약물을 이용하면, 대식세포가 관여하는 질환(예를 들면, 아테롬성 동맥경화증 등)의 진단, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 유효한 담체 또는 그 담체를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 이용하는 유산균은, 안전성인 점, 대량 배양 및 대량 취득이 가능한 점, 유전자 조합 기술의 적응이 비교적 용이한 점 등에서, 본 발명에 따르면, 안전성이 높고, 대식세포로의 송달 효과가 높은 담체를, 염가로 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 대식세포에 물질을 송달하기 위한 담체에 관한 것이다. 본 발명의 상기 담체는, 유산균 균체 또는 그 추출물을 함유한다. 본 발명의 바람직한 모양에 대해서, 상기 담체가 유산균 균체 또는 그 추출물을 함유하는 것으로, 대식세포로의 물질 송달 효율이 향상된다.
본 발명의 담체에 이용하는 상기 유산균은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 락토바실러스속, 스트렙토코커스속, 엔테로코커스속, 락토코커스속, 비피더스속의 각 균 등, 공지의 유산균을 이용할 수 있다. 더욱 자세하게는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼맨텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 델브루에키 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 스트렙토코쿠스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패슘(Enterococcus faecium), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코커스 플란타룸(Lactococcus plantarum) 또는 비피도박테리움 서모필럼(Bifidobacterium thermophilum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) 등을 들 수 있다. 이들 각종 유산균 중, 분자 송달 효과가 우수한 점에서, 락토바실러스속의 유산균이 바람직하고, 그 중에서도, 락토바실러스 플란타룸이 특히 바람직하다.
상기 락토바실러스 플란타룸에 속하는 균의 본 발명에 있어서의 바람직한 대표예로서는, 락토바실러스 플란타룸 L-137주(공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 1996년 11월 30일 수탁번호 FERM P-15317, 미공연균기(微工硏菌奇) 제15317호로서 기탁), 락토바실러스 플란타룸 JCM1149기준주 및 락토바실러스 플란타룸 L-051주(미공연균기 제11912호) 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는, 락토바실러스 플란타룸 L-137주 등을 들 수 있다.
본 발명에 이용하는 상기 유산균으로서는, 천연 배지, 합성 배지 및 반합성 배지 등의 배지에서 배양한 것 중 어느 것이어도 좋다. 본 발명에 있어서, 유산균의 배양은, 공지 방법, 자체 공지의 방법 또는 그들에 준하는 방법에 따라 실시되어도 좋다.
상기 배지로서는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 질소원 및/또는 탄소원을 함유하는 것이 바람직하게 이용된다. 상기 질소원으로서는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 고기즙, 펩톤, 글루텐, 카제인, 효모엑기스, 아미노산 등을 들 수 있다. 상기 탄소원으로서는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 글루코오스, 크실로오스, 프럭토스, 이노시톨, 말토스, 물엿, 누룩즙, 전분, 바가스, 밀기울, 당밀, 글리세린 등을 들 수 있다. 이들은 1종으로 또는 2종 이상을 조합해서 이용해도 좋다.
상기 배지는, 상기 질소원 및/또는 탄소원과 더불어, 추가로, 무기질을 첨가해도 좋다. 상기 무기질로서는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 황산암모늄, 인산칼륨, 염화마그네슘, 식염, 철, 망간, 몰리브덴 또는 각종 비타민류 등을 들 수 있고, 이들을 1종으로 또는 2종 이상을 조합해서 이용해도 좋다.
상기 유산균의 배양온도 및 배양시간은, 배양이 효율적으로 실시될 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 배양온도는, 예를 들면, 통상 약 25~40℃, 바람직하게는 약 27~35℃로 해도 좋고, 배양시간은, 예를 들면 약 12~48시간으로 해도 좋다. 또한, 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 유산균의 배양은, 통기진탕에 의해 실시해도 좋다. 또한, 배지의 pH는, 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 통상 약 pH3~6, 바람직하게는 약 pH4~6로 해도 좋다.
본 발명에 이용하는 유산균의 균체는, 생균체여도 좋고, 사균체여도 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 안정성 및 취급의 용이성 등의 관점에서, 사균체를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 유산균의 사균체를 조제하는 방법에 대해, 구체적으로 설명한다.
본 발명에 있어서, 상기 사균체의 조제방법은, 본 발명의 효과를 잃지 않는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, (Ⅰ) 배양 종료 후에 유산균의 생균체를 배양액으로부터 분리한 후에, 상기 생균체를 살균처리하여 사균체상태로 하는 방법, (Ⅱ) 배양액 중에서 유산균의 생균체를 살균처리하여 사균체상태로 하고, 그 후에 상기 사균체를 배양액으로부터 분리하는 방법 등 중 어느 방법에 따라 조제해도 좋다.
배양액으로부터 균체를 분리하는 방법으로서는, 이 분야에서 통상 이용되는 여러 가지 방법을 채용해도 좋고, 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 구체적으로는, 예를 들면, 배양액에 증류수를 더한 후에 원심분리 등의 수단에 의해 상청을 제거함으로써, 배양액과 균체를 분리하는 방법 등을 채용해도 좋다. 덧붙여, 이 태양에 있어서는, 배양액에 증류수를 더해 원심분리를 실시한 후에 상청을 제거한 후, 원한다면 상청을 제거한 잔류물에 추가로 증류수를 더하여 원심분리를 실시하는 조작을 몇 번 반복해도 좋다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 분리조작으로서 여과공정을 포함하고 있어도 좋다.
이어서, 유산균의 생균체의 살균처리방법에 대해 구체적으로 설명한다. 상기 살균처리방법으로서는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 가열, 자외선조사, 포르말린처리 등을 들 수 있다. 덧붙여, 상기 살균처리는, 채취된 생균체에 대해서 실시해도 좋고, 생균체를 포함한 배양액에 대해 실시해도 좋다.
상기 가열처리를 실시하는 경우, 가열온도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 통상 약 60℃~100℃, 바람직하게는 약 70~90℃로 해도 좋다. 가열수단으로서는, 공지의 방법을 이용할 수 있고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 히터 등의 수단이어도 좋다. 가열시간은, 살균처리를 충분히 완료할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 가열시간은 원하는 온도에 이른 후, 통상 약 5~40분, 바람직하게는 약 10~30분으로 해도 좋다.
상기와 같이 하여 얻어진 상기 사균체는, 추가로 마쇄, 파쇄 또는 동결건조처리 등을 실시하여, 사균체 처리물로도 해도 좋다. 본 발명에 있어서는, 상기 사균체 처리물도 사균체로서 매우 적합하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에는, 유산균의 균체로 바꾸거나 또는 균체와 함께 유산균 균체의 추출물을 이용해도 좋다. 상기 추출물의 추출방법은 특별히 한정되지 않고, 공지방법, 자체 공지방법 또는 그들에 준하는 방법에 따라 실시해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 유산균의 생균체 또는 사균체를, (ⅰ) 상압 또는 가압하에서, 실온 또는 가온한 추출 용매 중에 추가하여 침지나 교반하면서 추출하는 방법, (ⅱ) 추출 용매 중에서 환류하면서 추출하는 방법 등을 들 수 있다. 추출 온도, 추출 시간은, 사용하는 추출 용매의 종류는 추출조건에 의해 적의 선택해도 좋다.
상기 추출 용매로서는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 물, 유기 용매 또는 이들 임의의 비율로의 혼합용매를 이용해도 좋다. 상기 유기 용매로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 저급알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 및 n-부탄올 등), 다가알코올(예를 들면, 1, 3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 실온에서 액체인 알코올류; 에테르류(예를 들면, 디에틸에테르, 프로필에테르 등); 에스테르류(예를 들면, 초산에틸, 초산부틸 등); 케톤류(예를 들면, 아세톤, 에틸메틸케톤 등); 탄화수소류(예를 들면, 헥산, 크실렌, 톨루엔 등); 클로로포름 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 또는 2종 이상을 조합해서 이용해도 좋다. 상기 유기 용매 중에서도, 조작성이나 환경에 대한 영향 등의 관점으로부터, 실온에서 액체인 알코올류, 예를 들면, 탄소원자수 1~4의 저급알코올을 이용하는 것이 바람직하고, 잔류용매에 의한 안전성의 관점에서는 에탄올을 이용하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 상기 추출 조작에 의해 얻은 추출액 및 잔사를 포함하는 혼합물을 원한다면 여과 또는 원심분리 등을 이용하여, 잔사인 고형 성분을 제거해서 얻은 추출액을 그대로 본 발명의 상기 담체의 조제에 이용해도 좋고, 상기 추출액을 농축, 동결건조 또는 스프레이 드라이 등의 방법에 의해, 건조, 분말화해서 사용해도 좋다.
본 발명의 상기 담체는, 상기 균체 또는 상기 추출물을 함유함으로써, 대식세포에 고효율로 흡수된다. 이로 인해, 본 발명의 상기 담체는, 원하는 물질을 대식세포에 효율적으로 송달시키기 위한 담체로서 매우 적합한 담체이다.
덧붙여, 본 발명에 있어서, 대식세포란, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 마크로파지, 단구, 다핵백혈구 및 수상세포(樹狀細胞) 등을 함유한다.
본 발명의 담체에 의해, 대식세포에 송달하는 물질로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 기능성 물질 등을 들 수 있다. 상기 기능성 물질로서는, 대식세포에 송달되는 것으로 어떠한 효과가 있는 기능을 가진 물질인 것이, 바람직하게는, 예를 들면, 원자, 분자, 화합물, 펩티드, 단백질, 핵산, 벡터, 바이러스, 세포 등을 들 수 있다. 상기 「어떠한 효과」란, 특별히 한정되지 않고, 바람직한 또는 유용한 효과여도 좋고, 유해한 작용을 가져오는 작용이어도 좋다. 상기 「유해한 작용」은, 시험, 연구에 이용할 수도 있고, 또한, 생체에 대해서 바람직하지 않은 작용을 끼치는 대식세포가 존재한 경우에, 이것의 기능을 억제 또는 소멸시키는 데에 이용할 수 있다. 즉, 본 발명의 담체를 이용하는 목적에 따라, 상기 기능성 물질을 선택하면 된다.
본 발명의 하나의 태양에 있어서, 상기 기능성 물질로서는, 예를 들면, 마크로파지에 대해서 항포말화작용(抗泡沫化作用)을 가지는 화합물(예를 들면, esculeogenin A, PPARγ아고니스트, 아디포넥틴 등); 산화형LDL의 흡수에 의해 마크로파지 내에 축적한 콜레스테롤의 대사, 분해를 담당하는 효소(예를 들면, 콜레스테롤 산화 효소 ChoA 등); 대식세포의 활성화에 기여하는 염증성 사이토카인(예를 들면, IL-1β 등); 및, 세포를 검출 및 식별하기 위해서 유용한 형광색소(예를 들면, 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC) 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 태양에 있어서, 상기 기능성 물질은, 대식세포가 관여하는 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 이용하는 물질이다.
상기 대식세포가 관여하는 질환으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 아테롬성 동맥경화증, 울혈성 심부전, 허혈성 질환, 재협착, 고혈압, 섬유성 혈관장애(당뇨병, 전신성 에리테마토데스 등), 신경변성질환(예를 들면, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 척수소뇌변성증, 근위축성측색경화증 등), 뇌손상, 뇌혈관사상(예를 들면, 졸중, 발작, 신경상해 및 중추신경계 내부에서의 재생 등), 조혈장애, 성인호흡궁박증후군(ARDS), 암(특히 성인T세포 백혈병을 포함한 백혈병) 및 고형암, 자기면역질환, 감염(예를 들면, HIV 감염 및 AIDS 등), 섬유증식장애(예를 들면, 건선 등), 만성 및 급성 염증질환(예를 들면, 관절 류머티즘, 크론병, 염증성 장 증후군 등), 사구체 질환, 패혈증, 이식편거절반응, 이식편대숙주질환, 뼈질환, 변형성 섬유 증식/염증 응답에 의해 특징지어지는 경우가 있는 심장혈관 및 심장혈관 이외의 혈관의 병태, 예를 들면 산소 또는 글루코오스 결핍 조직 등의 병에 의해 손상된 부위에의 백혈구의 침윤에 의해 특징지어지는 질환(예를 들면, 뇌졸중 및 심근경색 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에 있어서, 상기 대식세포가 관여하는 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 이용하는 물질은, 예를 들면, 아테롬성 동맥경화의 예방 개선 효과를 목적으로 하는 경우, esculeogenin A, PPARγ아고니스트, 아디포넥틴 및 ChoA 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 대식세포에 송달하는 물질은, 본 발명의 상기 담체에 담지시켜도 좋고, 또한, 단지 상기 대식세포에 송달하는 물질과 본 발명의 상기 담체를 혼합해서 이용해도 좋다.
상기 대식세포에 송달하는 물질을 본 발명의 담체에 담지시키는 방법에 대해 설명한다.
상기 담지 방법은, 본 발명의 효과를 잃지 않는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 상기 대식세포에 송달하는 물질을, 상기 유산균의 균체 표면 및/또는 균체 내부 혹은 상기 유산균 추출물에 결합시켜도 좋다. 상기 결합 방법으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 공유결합, 극성공유결합, 이온결합, 정전결합, 배위공유결합, 방향족결합, 수소결합, 쌍극자 또는 판데르발스 상호작용을 포함하는 화학결합을 채용해도 좋다. 또한, 유전자 공학적으로, 상기 균체 표면 및/또는 균체 내부에 발현, 생산시킴으로써, 상기 대식세포에 송달하는 물질을 균체에 담지시켜도 좋다.
이어서, 상기 담지 방법을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 하나의 태양에 있어서, 상기 유산균에 형광표지제(예를 들면, FITC isomer-I(동인화학제))를 담지시키는 경우, 상기 유산균 및 상기 형광표지제를 차광하에서 반응시킴으로써, 균체 표면에 상기 형광표지제를 담지시킬 수 있다. 상기 반응 조건으로서는, 예를 들면, 약 30℃~45℃로 약 10분~120분으로 해도 좋다.
또한, 본 발명의 다른 하나의 태양에 있어서, 상기 유산균에 콜레스테롤 산화 효소 ChoA를 담지시키는 경우, 상기 유산균 유래의 플라스미드와 choA 유전자를 도입한 대장균 유래 플라스미드를 임의로 융합시켜서 제작한 플라스미드 pWK7(예를 들면, J Biosci Bioeng. 2001; 92(5): 459-65. 참조.) 등을, 일렉트로포레이션법 등으로 유산균에 도입하여 형질 전환하는 것으로, 상기 유산균에 콜레스테롤 산화 효소 ChoA를 담지시켜도 좋다.
　유전자 공학적인 기술을 응용함으로써, 예를 들면, 아디포넥틴(예를 들면, Atherosclerosis. 2013; 228(1): 124-35. 을 참조.)이나 IL-1β(예를 들면, Clin Vaccine Immunol. 2010; 17(1): 43-8. 을 참조. )를, 유산균에 담지시킬 수 있다.
본 발명의 상기 담체는, 상기 유산균 균체 및/또는 추출물과 더불어, 유산균 이외의 성분을 함유 하고 있어도 좋다. 그 성분은, 본 발명의 효과를 잃지 않는 한, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 의약, 약학 및 식품 등의 분야에서 알려진 임의의 성분을 이용할 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 상기 유산균 이외의 성분은, 상기 유산균 균체 및/또는 추출물과 친화성이 높은 것, 또는 상기 유산균 균체 및/또는 추출물과 결합할 수 있는 것 등인 것이 바람직하다. 이러한 성분으로서는, 예를 들면, 지질, 스테롤, 식물유, 광유, 레시틴류 등을 들 수 있다.
게다가, 본 발명의 상기 담체는, 타게팅제 등의 대식세포로의 흡수를 촉진하는 물질을 포함하고 있어도 좋다. 여기서, 상기 「타게팅제」란, 바람직하게는, 특정 표적기관 또는 조직에 대해서 선택성을 나타내는 화합물을 가리킨다. 상기 타게팅제로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 여러 가지 화합물을 사용해도 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 레티노이드 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 담체 중, 상기 유산균 균체 및/또는 추출물의 함유량은, 본 발명의 효과가 발휘되면, 특별히 한정되지 않지만, 상기 약물담체 100질량% 중, 예를 들면, 약 1질량%~100질량%의 범위여도 좋다. 또한, 본 발명의 상기 담체에 담지시킨다, 또는 상기 담체와 혼합시키는 상기 대식세포에 송달하는 물질의 양은, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한, 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 상기 담체 100질량부에 대해, 예를 들면, 약 10질량부~300질량부가 좋다.
본 발명의 다른 하나의 모양은, 본 발명의 상기 담체 및 상기 대식세포에 송달하는 물질을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 상기 대식세포에 송달하는 물질은, 바람직하게는, 상기 기능성 물질이다. 본 태양에 있어서의 상기 조성물은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 의약품, 음식품, 사료, 식품첨가제 및 사료첨가제 등이 좋고, 바람직하게는, 의약품 등이다.
또한, 본 발명의 상기 담체의 의약 제조에의 사용도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 상기 의약품에 대해 설명한다.
상기 의약품의 투여 경로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 경구 또는 비경구의 어느 경로에서 포유동물에 투여해도 좋다.
상기 의약품의 제형은, 특별히 한정되지 않고, 그 투여 경로에 따라 선택되어도 좋다. 제형으로서는, 예를 들면, 경구제, 비경구제의 어느 형태여도 좋다.
상기 경구제로서는, 과립제, 산제, 정제(당의정을 포함한다), 환제, 캅셀제, 시럽제, 유제, 현탁제 등을 들 수 있다. 비경구제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 주사제(예를 들면, 피하주사제, 정맥내 주사제, 근육내 주사제, 복강내 주사제 등), 점적제, 외용제(예를 들면, 경비투여제재, 경피제제, 연고제 등), 좌제(예를 들면, 직장좌제, 질좌제 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 의약품은, 이 분야에서 통상 실시되고 있는 수법에 의해 제조해도 좋다. 또한, 상기 의약품은, 본 발명의 상기 담체, 상기 기능성 물질 외에, 예를 들면, 약학상 허용되는 담체를 포함해도 좋다. 상기 약학상 허용되는 담체로서는, 예를 들면, 부형제, 결합제, 희석제, 첨가제, 향료, 완충제, 증점제, 착색제, 안정제, 유화제, 분산제, 현탁화제, 방부제 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 약학상 허용되는 담체로서는, 예를 들면, 탄산마그네슘, 스테아린산마그네슘, 탈크, 설탕, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라간트, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스, 저융점 왁스, 카카오 버터 등을 들 수 있고, 이들은 1종으로 또는 2종 이상을 조합해서 이용해도 좋다.
상기 경구제는, 고형제(예를 들면, 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 과립제 등)여도 좋다. 상기 고형제는, 유효성분을 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 안정제, 용해보조제 등과 혼합하여, 통상의 방법에 따라 제재화해도 좋다. 상기 부형제로서는, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 글루코오스, 미결정셀룰로오스, 전분 등을 들 수 있다. 상기 결합제로서는, 예를 들면, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 메타규산아르민산마그네슘 등을 들 수 있다. 상기 붕괴제로서는, 예를 들면, 섬유소 글리콜산칼슘 등을 들 수 있다. 상기 활택제로서는, 예를 들면, 스테아린산마그네슘 등을 들 수 있다. 상기 용해보조제로서는, 예를 들면, 글루타민산, 아스파라긴산 등을 들 수 있다. 또한, 원한다면, 코팅제(예를 들면, 백당, 젤라틴, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트 등)로 피복하고 있어도 좋고, 피복은 2층 이상이어도 좋다.
상기 경구제는, 액제(예를 들면, 수제, 현탁제, 유제, 시럽제, 에릭실제 등)여도 좋다. 상기 액제는, 유효성분을 일반적으로 이용되는 희석제(예를 들면, 정제수, 에탄올 또는 그들의 혼액 등)에 용해하고, 현탁 또는 유화하여 제재화하면 된다. 더욱이 이 액제는, 습윤제, 현탁화제, 유화제, 감미제, 풍미제, 방향제, 보존제, 완충제 등을 함유하고 있어도 좋다.
본 발명의 의약품이 비경구제인 경우의 상기 주사제는, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 및 용시 용제에 용해 또는 현탁해서 이용하는 고형의 주사제를 포함한다. 상기 주사제는, 예를 들면, 유효성분을 용제에 용해, 현탁 또는 유화하는 것으로 제재화해도 좋다. 상기 용제로서는, 예를 들면, 주사용 증류수, 생리식염수, 식물유, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올과 같은 알코올류 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 2종 이상을 조합해서 이용해도 좋다. 게다가 상기 주사제는, 안정제, 용해 보조제(예를 들면, 글루타민산, 아스파라긴산, 폴리솔베이트80(등록상표) 등), 현탁화제, 유화제, 무통화제, 완충제, 보존제 등을 포함하고 있어도 좋다. 상기 주사제는, 더욱이, 최종 공정에 있어서, 멸균 또는 무균 조작이 포함되어 있어도 좋다.
또한, 무균의 고형제, 예를 들면 동결건조품을 제조하여, 그 사용 전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용제에 용해해서 사용해도 좋다.
본 발명의 상기 의약품의 투여량은, 특별히 한정되지 않고, 그 목적에 의해 적의 선택해도 좋다. 투여량은, 질환의 종류, 정도; 투여 경로; 투여 대상; 투여 대상의 연령, 성별, 상태 등; 혹은 본 발명의 상기 담체에 담지 또는 상기 담체와 혼합시키는 상기 기능성 물질의 종류, 그 외의 조건에 따라 설정해도 좋다.
본 발명의 상기 의약품의 투여 대상으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 임의의 동물, 예를 들면 포유동물(사람, 마우스, 래트, 말, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 소 등) 등을 들 수 있다.
이어서, 본 발명의 상기 음식품에 대해 설명한다.
본 발명의 상기 음식품은, 일반적으로 음식품에 이용되는 식품 첨가제, 예를 들면 감미료, 착색료, 보존료, 증점안정제, 산화방지제, 발색료, 표백료, 곰팡이방지제, 검베이스, 고미료, 효소, 광택제, 산미료, 조미료, 유화제, 강화제, 제조용제, 향료, 향신료추출물 등의 1종 이상이 첨가되어도 좋다. 덧붙여, 본 발명의 상기 음식품에는, 건강식품, 기능성 식품, 특정 보건용 식품, 유아(乳兒)용 식품, 유아(幼兒)용 식품, 임산부용 식품, 병자용 식품이 포함된다.
본 발명의 상기 음식품의 형태는, 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들면, 이른바 영양보조식품(서플리먼트)으로서의 정제, 과립제, 산제, 드링크제 등을 들 수 있다. 이 외에는, 예를 들면 차음료, 청량음료, 탄산음료, 영양음료, 과실음료, 유산음료 등의 음료, 소바, 우동, 중화면, 즉석면 등의 면류, 엿, 캔디, 껌, 초콜릿, 스낵과자, 비스킷, 젤리, 잼, 크림, 구이과자, 빵 등의 과자 및 빵류, 어묵, 햄, 소시지 등의 수산 및 축산가공식품, 가공유, 발효유 등의 유제품, 샐러드유, 튀김유, 마가린, 마요네즈, 쇼트닝, 휘핑크림, 드레싱 등의 유지 및 유지가공식품, 소스, 타레(양념장) 등의 조미료, 카레, 스튜, 덮밥, 죽, 잡탕죽 등의 레토르트파우치식품, 아이스크림, 샤벳, 빙수 등의 빙과 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 음식품의 섭취량은, 특별히 한정되지 않고, 음식품의 형태; 음식품을 섭취하는 대상의 연령, 성별, 상태 등; 혹은 본 발명의 상기 담체에 담지 또는 상기 담체와 혼합시키는 상기 기능성 물질의 종류, 그 외의 조건에 따라 설정할 수 있다.
이어서, 본 발명의 상기 담체의 대식세포에 물질을 송달하는 경로에 대해 설명한다.
본 발명의 상기 담체의 대식세포로의 물질의 송달은, 스캐빈저 수용체를 통하는 것이 바람직하다. 상기 스캐빈저 수용체는, 특별히 한정되지 않지만, 클래스A의 스캐빈저 수용체인 것이 바람직하다. 그 클래스A의 스캐빈저 수용체로서는, AI 및 AII(모노클로널항체 Clone2F8에 의해 인식되는 CD204 항원수용체) 등을 들 수 있다.
본 발명은, 또한, 본 발명의 상기 담체를 이용하여, 대식세포에 물질을 송달하는 방법도 함유한다. 대식세포에 송달하는 물질은, 상기대로여도 좋고, 또한 송달은, 상기 스캐빈저 수용체를 통하는 것이어도 좋다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 근거해 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람에 의해, 많은 변형을 실시할 수 있다.
(실시예 1)
MRS(de Man, Rogosa, Sharpe) 액체 배지에 락토바실러스 플란타룸 L-137(수탁번호 FERMBP-08607)주를 파종하고, 32℃로 24시간 배양했다. 배양 후, 배양액을 4200×g, 4℃, 10분간 원심분리하여 균체를 모았다. 얻어진 균체를 생리식염수에 잘 분산하고, 4200×g, 4℃, 10분간 원심분리한 후, 상청을 제거하여, 균체를 회수했다. 게다가, 회수한 균체를 생리식염수에 잘 분산시켜, 상기 조건에서 원심분리하는 조작을 3회 반복했다. 그 후, 얻어진 균체를 이온교환수에 분산하여, 80℃로 20분간 가열했다. 4200×g, 4℃, 10분간 원심분리해서 침전을 동결건조함으로써, 가열사균체를 얻었다(실시예품 1).
(실시예 2)
상기 락토바실러스 플란타룸 L-137주 대신에 락토바실러스 플란타룸 JCM1149주를 이용한 이외는, 실시예 1과 같게 하여, 가열사균체를 얻었다(실시예품 2).
(시료의 조제)
실시예품 1 및 2를, 50mM 탄산나트륨 완충액(pH9.6) 1mL에 5mg/mL의 농도로 현탁했다. 균체 현탁액에 종농도가 5μg/mL가 되도록 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) isomer-I(동인화학)를 첨가하고, 37℃로 60분간, 차광하에서 반응시켜, 균체를 FITC로 표지했다. FITC로 표지한 균체를 19000×g, 4℃의 조건으로 10분간 원심분리하고, 침전을 1mL의 인산 완충액에 현탁 후, 상기와 같은 조건으로 원심분리했다. 인산 완충액에의 현탁과 원심분리의 조작을 3회 반복한 후, 원심분리로 얻어진 잔류물을 1mL의 인산 완충액에 현탁하여, 10% FBS함유 RPMI1640 배지에서 500배 희석했다.
(대식세포의 조제)
대식세포는, 마우스 비장 유래의 것을 이용했다.
마우스(BALB/c, 자성, 6~12주령)로부터 비장을 적출하여, 10% FBS함유 RPMI1640 배지 중에서 눌러 으깨었다. 0.017M의 트리스완충액(pH7.65)에 최종 농도 0.75%가 되도록 염화암모늄을 더하여 제작한 용액으로, 얻어진 세포 집단을 4℃, 5분간 처리해서 적혈구를 파괴한 후, #200메쉬를 통해, 비장세포 부유액을 얻었다. 비장세포 부유액 중의 세포 수는 자동혈구 계측장치(CDA-500, 시스멕스사제)를 이용해 측정했다. 비장세포의 농도가 1×107(세포 수)/mL가 되도록, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 상기의 비장세포 부유액을 현탁 후, 24 구멍 배양 플레이트에 1mL씩 첨가하여, 5% 탄산가스 배양기 내에서 37℃, 90분간 배양했다. 그 후, 배양액을 피펫팅하고, 비접착세포를 포함하는 배양액을 신중하게 제거하여, 대식세포를 많이 포함하는 접착세포집단을 얻었다. 배양액을 제거 후, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지를 500μL 첨가했다.
(시험예 1)
상기(대식세포의 조제)로 얻은 대식세포를 많이 포함하는 접착세포집단 500μL에, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에서 10μg/mL의 농도로 조제된 실시예품 1 및 실시예품 2의 FITC 표지균체(시료 1 및 2), 혹은, 균체를 포함하지 않고 10% FBS 함유 RPMI1640 배지만으로 조제된 대조시료(시료 3) 500μL를, 대식세포를 많이 포함하는 접착세포집단 500μL에 첨가했다. 상기 시료 1~3을 5% 탄산가스 배양기 내에서 37℃, 4시간 혹은 24시간 배양하고, 그 후, 대식세포를 회수했다. 회수한 대식세포 중의 FITC 표지균체를 흡수한 대식세포의 비율을, 플로우사이토미터(베크만 콜터)를 이용해서 검출하여, 대식세포가 균을 흡수한 비율을 산출했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
4시간 배양 24시간 배양
시료1 (L-137주) 23% 47%
시료2 (JCM1149주) 4% 23%
시료3 (균체없음) 0% 1%
(시험예 2)
상기(대식세포의 조제)로 얻은 대식세포를 많이 포함하는 접착세포집단 500μL에, A타입의 스캐빈저 수용체에 대한 단일클론항체 IgG2b(clone RTK4530, 이하, 항스캐빈저 A항체라고 한다.)를 4μg 첨가했다(시료 4). 또한, 항스캐빈저 A항체를 바꾸어 아이소타이프 컨트롤 항체 4μg를 첨가한 시료도 조제했다(시료 5). 5% 탄산가스 배양기 내에서 37℃, 1시간 배양 후, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에서 10μg/mL의 농도로 조제된 실시예품 1의 FITC 표지균체 500μL를 첨가하여, 4시간 혹은 24시간 배양했다. 4시간 후, 혹은 24시간 후에 대식세포를 회수하고, 회수한 대식세포 중 FITC 표지균체를 흡수한 대식세포의 비율을, 플로우사이트미터를 이용해서 검출하여, 대식세포가 균을 흡수한 비율을 산출했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
4시간 배양 24시간 배양
시료4 (항스케빈져 A 항체) 1% 19%
시료5 (아이소타이프컨트롤 항체) 24% 45%
시험예 1의 결과로부터, 본 발명의 담체에 이용하는 유산균 균체(L-137주 및 JCM1149주)는, 효율적으로 대식세포에 흡수되는 것이 나타났다.
또한, 시험예 2의 결과로부터, 스캐빈저 A 수용체를 불활성화시킨 대식세포(시료 4를 첨가한 세포)에 대해서는, 유산균 균체의 흡수율이 현저하게 낮아지는 것을 알았다. 즉, 본 발명의 담체는, 주로 대식세포의 스캐빈저 수용체를 통해 흡수되는 것이 나타났다.
본 발명에 의하면, 소망한 여러 가지 물질을 대식세포에 효율적으로 송달할 수 있고, 예를 들면 기능성 물질로서, 대식세포가 관여하는 질환에 대한 약물을 이용함으로써, 대식세포가 관여하는 질환(예를 들면, 아테롬성 동맥경화증 등)의 진단, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 유효한 담체 또는 상기 담체를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다. 게다가, 본 발명에는, 안전성인 점, 대량 배양 및 대량 취득이 가능한 점, 유전자 조합 기술의 적응이 비교적 용이한 점 등에서, 식품 및 의약품의 분야에서 넓게 이용되어 온 유산균 및/또는 그 추출물을 이용하기 위해, 본 발명에 의하면, 안전성이 높고, 대식세포로의 송달 효과가 높은 담체를, 염가로 제조할 수 있다.

Claims (11)

  1. 대식세포가 관여하는 질환의 진단, 예방 및 치료로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상에 사용될 수 있는 물질이 대식세포로 송달되기 위해 담지되어 있는 담체를 유효성분으로 포함하는, 대식세포가 관여하는 질환의 진단, 예방 및 치료로 이루어진 군으로부터 1 이상의 용도로 사용하기 위한 약학 조성물에 있어서,
    상기 담체가 락토바실러스 플란타룸 L-137주(Lactobacillus plantarum L-137)인 유산균 및 상기 유산균의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 함유하고, 및
    상기 대식세포가 관여하는 질환이, 아테롬성 동맥경화증, 울혈성 심부전, 허혈성 질환, 재협착, 고혈압, 섬유성 혈관장애, 신경변성질환, 뇌손상, 뇌혈관사상, 조혈장애, 성인호흡궁박증후군(ARDS), 암, 고형암, 자기면역질환, 감염, 섬유증식장애, 만성 또는 급성 염증 질환, 사구체 질환, 패혈증, 이식편거절반응, 이식편대숙주질환, 뼈질환, 및 변형성 섬유증식 또는 염증응답에 의해 특징지어질 수 있는 심장혈관 또는 심장혈관 이외의 혈관의 병태로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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  4. 청구항 1에 있어서, 상기 유산균이 사균체인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 청구항 1 또는 4에 있어서, 대식세포로의 물질의 송달이, 대식세포의 스캐빈저 수용체를 통하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 스캐빈저 수용체가 클래스 A의 스캐빈저 수용체인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 대식세포가 관여하는 질환이, 아테롬성 동맥경화증인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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