CN109668819A - 一种机体免疫功能评价的试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents
一种机体免疫功能评价的试剂盒及其使用方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明建立了一种机体免疫功能评价试剂盒及其及其使用方法和应用，该试剂盒使用Toll样受体激动剂刺激外周血单个核细胞，以IL‑6、IL‑10、IFN‑α为指标评估机体固有免疫反应；使用抗人CD3抗体和抗人CD28抗体刺激外周血单个核细胞后，以IL‑2、IL‑4、IL‑17a、IFN‑γ为指标评估机体T淋巴细胞反应；使用CD40L/BAFF/IL‑21/IL‑4蛋白刺激单个核细胞，以IgG1、IgG2评估机体B细胞分泌抗体能力。所有检测指标使用流式细胞仪进行检测。本发明中多指标联合应用，可以比较全面的评价机体的免疫细胞功能。本试剂盒操作简单，能够同时进行多份样本的评价。
Description
技术领域
本发明属于医药生物学领域，具体涉及一种体外评价人体免疫功能的试剂盒及其使用方法和应用。
背景技术
免疫系统由固有免疫和获得性免疫系统组成。固有免疫是抵抗外来病原体的第一道防线，包括多种效应细胞和分子，如各种粒细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞( DC)、 NK细胞和体液杀菌成分如补体、抗微生物肽、溶菌酶等，能够对病原体产生快速非特异性的免疫应答。获得性免疫是在个体发育过程中通过细胞超家族基因重排而产生的抗原识别细胞，主要包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，对非己抗原发生反应，同时产生免疫记忆。
固有免疫的本质是识别病原生物所特有的保守性分子模式，即病原相关分子模式（pathogen-associatedmolecular pattern，PAMP）。模式识别受体是固有免疫应答中最具代表性的受体，能够识别并结合PAMP，可使宿主细胞区分自己和非己，激活与固有免疫相关的信号转导通路。Toll样受体（TLR）是常见的模式识别受体，在识别侵入的病原、早期启动机体的固有免疫反应、诱导多种炎症介质和细胞因子的产生有着重要的作用。
获得性免疫即抗原特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞对自身正常组织细胞产生天然免疫耐受，对非己抗原性异物产生免疫排斥反应，机体接受某种抗原刺激后，只能产生对该种抗原特异性的免疫应答，抗体和效应T细胞只能对该种抗原和表达此种抗原的靶细胞产生作用，在抗原特异性T、B淋巴细胞增殖分化阶段，有部分T、B淋巴细胞分化成免疫记忆细胞，当机体再次接触相同抗原时，这些免疫记忆细胞可迅速增殖分化为免疫效应细胞，产生相应体液或细胞免疫效应。
目前有多种评价机体免疫功能的方法，如检测细胞亚群比例及绝对计数、血清抗体测定、中性粒细胞趋化功能试验、白细胞吞噬功能试验、抗体依赖性细胞毒性试验等，但是这些方法分类较多，每项只能反应一个指标，多项测试耗费人力物力，因此急需一项多指标综合评价免疫功能的手段，以便更好的评价机体的免疫功能。此外，随着对机体免疫系统的深入了解以及生物技术的迅速发展，免疫治疗已经成为肿瘤治疗的重要手段。评价免疫治疗后机体的免疫功能对科学评价免疫治疗的疗效有重要的意义。目前缺乏标准化的免疫治疗患者免疫功能评价的方法。
本发明采用的技术方案是：分离外周血单个核细胞，使用TLR激动剂、抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠以及转染了CD40L/BAFF/IL-21/IL-4的K562细胞刺激单个核细胞，用于评估机体免疫反应。
本发明所述的评价方法操作简单，用时短，便于规模化评价。
本发明建立的评价方法可以用于健康人、细菌及病毒感染患者、肿瘤患者以及自身免疫性疾病患者等人的机体免疫状态评估。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快速、多指标联合评估机体免疫功能的试剂盒。该试剂盒可以用于健康人、感染病人、癌症病人的免疫功能评价。
为解决上述技术问题：本发明提供一种机体免疫功能评价试剂盒，所述试剂盒包括Toll样受体激动剂、抗人CD3抗体和CD28抗体、以及CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4。
进一步的，所述试剂盒中Toll样受体激动剂包括但不限于TLR1/2激动剂、TLR4激动剂、TLR9激动剂；上述激动剂可单独使用，也可联合使用。
优选的，所述试剂盒中抗人CD3抗体和CD28抗体是包被在磁珠或培养皿上进行使用的。
优选的，所述试剂盒中TLR1/2激动剂包括但不限于 LPS-PG 、 LTA-SA standard、 PGN-SA 或Pam3CK4； TLR4激动剂包括但不限于LPS; TLR9激动剂包括但不限于ODN2216、ODN2206、ODN2243或ODN2395。
所述试剂盒在评价人体免疫功能时，评价指标分三类，其中Toll样受体激动剂用于评价天然免疫，其评价指标为: IL-6、IL-10、IFN-α；抗人CD3和CD28抗体用于评价T淋巴细胞功能，评价指标为：IL-2、IL-4、IL-17a、IFN-γ；CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4用于评价B淋巴细胞功能，评价指标为：IgG1、IgG2。
优选的，所述试剂盒中CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4是通过转染了CD40L、BAFF、IL-21和IL-4基因的K562细胞分泌获得。
采用权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其步骤如下：
一、固有免疫的评价：
（1）取待评价机体分离的PBMC培养于细胞培养板中；
（2）在细胞中加入TLR1/2激动剂、TLR4 激动剂、TLR9激动剂，放置二氧化碳培养箱培养；
（3）收集培养上清，检测培养上清中IL-6、IL-10、IFN-α的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度；通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能；
二、T细胞免疫的评价：
（1）分离待评价机体的PBMC培养于细胞培养板中；
（2）在细胞中加入抗人CD3抗体和抗人CD28抗体，放置二氧化碳培养箱培养；
（3）收集培养上清；检测培养上清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度；通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能；
三、B细胞分泌抗体能力的评价：
（1）分离待评价机体的PBMC培养于细胞培养板中；
（2）在细胞中加入转染了CD40L/BAFF/IL-21/IL-4的K562细胞，K562与PBMC的比例为1:1，放置二氧化碳培养箱培养24h；
（3）收集培养上清；检测培养上清中IgG1、IgG2的分泌量，使用流式细胞仪检测IgG的浓度，过检测IgG产生的量来评价机体免疫功能。
综上所述，上述机体免疫功能评价试剂盒可在评价机体免疫功能方面得以应用。所述机体包括但不限于健康人、感染病人、癌症病人。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所述试剂盒使用TLR激动剂、抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠以及转染了CD40L/BAFF/IL-21/IL-4的K562细胞刺激单个核细胞，用于评估机体免疫反应。该试剂盒可用于多指标综合评价机体免疫功能，操作简单，用时短，可以用于健康人、细菌及病毒感染患者、肿瘤患者以及自身免疫性疾病患者等人的机体免疫状态评估。
附图说明
图1显示了不同数量的细胞在TLR激动剂的刺激下分泌细胞因子的浓度；
图2显示了不同数量的细胞在CD3/28抗体刺激下分泌细胞因子的浓度；
图3显示了B细胞在CD40L/BAFF/IL-21/IL-4刺激时不同时间点的抗体分泌量；
图4显示了TLR激动刺激健康人PBMC IL-6、IL-10和IFN-α的分泌量；
图5显示了抗人CD3/28刺激健康人PBMC IL-2、IL-4、IL-17a和IFN-α的分泌量；
图6显示了CD40L/BAFF/IL-21/IL-4刺激B细胞IgGs的分泌量。
具体实施方式
本发明所述试剂盒通过Toll样受体（Toll like receptor，TLR）激动剂刺激外周血单个核细胞，从而以IL-6、IL-10、IFN-α为指标评价固有免疫反应功能；通过抗人CD3抗体和抗人CD28抗体刺激外周血单个核细胞，从而以IL-2、IL-4、IL-17a和IFN-γ为指标评价T细胞免疫功能；通过CD40配体（CD40L）和B细胞活化因子(BAFF）以及IL-21和IL-4刺激人外周血单个核细胞，从而以IgG1和IgG2为指标评价B细胞分泌抗体功能。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：外周血单个核细胞（PBMC）的分离
1.取肝素抗凝的人外周血10ml置于离心管中，用PBS对外周血进行1:2稀释，混合均匀；
2. 另取新的50mL离心管，加入15ml淋巴细胞分离液，把混匀的血液稀释液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液上层，使两者形成清晰分层，400g，离心30min；
3. 离心结束后，吸取单个核细胞层至新的50ml离心管中，加入30ml KBM581培养基清洗一遍，800g离心5min，弃上清。
4.加入20ml KBM581培养基，吹吸混匀，室温200g离心10分钟，弃上清。加入10mlKBM581培养基重悬计数。
实施例2：固有免疫功能评价细胞数量的定量
1.取分离的PBMC，按照1×105、2×105、4×105、8×105的细胞数设置浓度梯度，复孔，放置96孔U底细胞培养板中。
2. 细胞分4组，分别有阴性组及加入TLR1/2激动剂Pam3CSK4（InvivoGen，tlrl-pms）100ng/ml、TLR4 激动剂LPS100ng/ml、TLR9激动剂ODN 2216（invivogen, tlrl-2216-1） 2.5μM的刺激组，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h。
3. 收集培养上清。
4. 使用细胞因子检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IL-6、IL-10、IFN-α的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度。
5. 实验结果如图1所示：2×105细胞在Toll样受体激动剂的刺激下能够检测到IL-6、IL-10、IFN-α的分泌。
实施例3：T细胞免疫功能评价细胞数量的定量
1. 取分离的PBMC，按照1×105、2×105、4×105、8×105的细胞数设置浓度梯度，复孔，放置96孔U底细胞培养板中。
2. 在细胞中加入抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠（磁珠为CELLectionPan Mouse IgG Kit , invitrogen: 11531D ），细胞与磁珠比例为1:1，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h。
3. 收集培养上清。
4. 使用细胞因子检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度。
5.实验结果如图2所示：1×105以上的细胞数均能检测到IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、的分泌。
实施例4：B细胞免疫功能评价培养时间实验
1. 取分离的PBMC，按照每孔2×105细胞铺板，设置复孔，放置96孔U底细胞培养板中。
2. 在细胞中加入同时转染了CD40L（CD40配体）、BAFF（B细胞活化因子）、IL-21和IL-4的K562细胞，K562与PBMC的比例为1:1， 200ul培养体系，放置二氧化碳培养箱分别培养1天、2天、5天。
3. 收集培养上清。
4. 使用human Immunoglobulin Isotyping Panel - IgGs (4-plex）检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的分泌量，使用流式细胞仪检测IgG的浓度。
5. 实验结果显示：B细胞在转染了CD40L和BAFF的K562细胞刺激下，24小时已经能够检测到IgGs分泌量的增加。实验结果如图3所示。
实施例5: 27位健康人固有免疫的评价
1. 取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔。
2. 在细胞中加入TLR1/2激动剂Pam3CSK4（InvivoGen，tlrl-pms）100ng/ml、TLR4激动剂LPS 100ng/ml、TLR9激动剂ODN 2216（invivogen, tlrl-2216-1）2.5μM，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h。
3. 收集培养上清。使用细胞因子检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IL-6、IL-10、IFN-α的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度。
4.实验结果如表1和图4所示，从图4中可以看出阴性组无法检测到IL-6、IL-10和IFN-α的分泌，只有添加了TLR激动剂刺激机体,从而产生上述细胞因子，通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能
表1. TLR激动刺激健康人PBMCIL-6、IL-10和IFN-α的分泌量
实施例6：27位健康人T细胞免疫的评价
1.取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔。
2.在细胞中加入抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠（磁珠为CELLectionPan Mouse IgG Kit , invitrogen: 11531D ），细胞与磁珠比例为1:1，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h。
3.收集培养上清。使用细胞因子检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度。
4. 实验结果如表2和图5所示，从图5中可以看出阴性组无法检测到IL-2、IL-4、IL-17和IFN-γ的分泌，只有添加了抗人CD3抗体和抗人CD28抗体刺激机体,从而产生上述细胞因子，通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能。
表2. 抗人CD3/28刺激健康人PBMCIL-2、IL-4、IL-17a和IFN-γ的分泌量
实施例7 16位健康人B细胞分泌抗体能力的评价
1. 取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔。
2.在细胞中加入转染了CD40L/BAFF/IL-21/IL-4的K562细胞，K562与PBMC的比例为1:1，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h。
3.收集培养上清。使用human Immunoglobulin Isotyping Panel - IgGs (4-plex）检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IgG1、IgG2的分泌量，使用流式细胞仪检测IgG的浓度。
4.实验结果如表3和图6所示，虽然阴性组和刺激组中都能检测到B细胞的IgGs分泌，但刺激组大部分样本分泌量显著提高。
表3. CD40L/BAFF/IL-21/IL-4刺激B细胞IgGs的分泌量
根据以上实验结果，设定95%以上健康人免疫反应结果作为参考范围，可以得出本实验方法确定的免疫评价参考范围。如下表4所示：
表4. 免疫功能评价参考值
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (12)
1.一种机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Toll样受体激动剂、抗人CD3抗体和CD28抗体、以及CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4。
2.根据权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中Toll样受体激动剂包括但不限于TLR1/2激动剂、TLR4激动剂、TLR9激动剂；上述激动剂可单独使用，也可联合使用。
3.根据权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中抗人CD3抗体和CD28抗体是包被在磁珠或培养皿上进行使用的。
4.根据权利要求2所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中TLR1/2激动剂包括但不限于 LPS-PG 、 LTA-SA standard 、 PGN-SA 或Pam3CK4； TLR4激动剂包括但不限于LPS; TLR9激动剂包括但不限于ODN 2216、ODN2206、ODN2243或ODN2395。
5.根据权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在评价人体免疫功能时，评价指标分三类，其中Toll样受体激动剂用于评价天然免疫，其评价指标为:IL-6、IL-10、IFN-α；抗人CD3和CD28抗体用于评价T淋巴细胞功能，评价指标为：IL-2、IL-4、IL-17a、IFN-γ；CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4用于评价B淋巴细胞功能，评价指标为：IgG1、IgG2。
6.根据权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4是通过转染了CD40L、BAFF、IL-21和IL-4基因的K562细胞分泌获得。
7.采用权利要求1-6所述机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其步骤如下：
固有免疫的评价：
（1）取待评价机体分离的PBMC培养于细胞培养板中；
（2）在细胞中加入TLR1/2激动剂、TLR4 激动剂、TLR9激动剂，放置二氧化碳培养箱培养；
（3）收集培养上清，检测培养上清中IL-6、IL-10、IFN-α的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度；通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能；
二、T细胞免疫的评价：
（1）分离待评价机体的PBMC培养于细胞培养板中；
（2）在细胞中加入抗人CD3抗体和抗人CD28抗体，放置二氧化碳培养箱培养；
（3）收集培养上清；检测培养上清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度；通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能；
三、B细胞分泌抗体能力的评价：
（1）分离待评价机体的PBMC培养于细胞培养板中；
（2）在细胞中加入CD40L、BAFF、IL-21和IL-4，放置二氧化碳培养箱培养24h；
（3）收集培养上清；检测培养上清中IgG1、IgG2的分泌量，使用流式细胞仪检测IgG的浓度，通过检测IgG产生的量来评价机体免疫功能。
8.根据权利要求7所述采用机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其固有免疫的评价方法具体步骤如下：（1）取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔；（2）在细胞中加入TLR1/2激动剂Pam3CSK4100ng/ml、TLR4 激动剂LPS 100ng/ml、TLR9激动剂ODN 22162.5μM，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h；（3）收集培养上清，使用细胞因子检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IL-6、IL-10、IFN-α的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度，通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能。
9.根据权利要求7所述采用机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其T细胞免疫的评价方法具体步骤如下：（1）取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔；（2）在细胞中加入抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠，细胞与磁珠比例为1:1，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h；（3）收集培养上清，使用细胞因子检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度，通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能。
10.根据权利要求7所述采用机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其B细胞分泌抗体能力的评价方法具体步骤如下：（1）取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔；（2）在细胞中加入转染了CD40L/BAFF/IL-21/IL-4的K562细胞，K562与PBMC的比例为1:1，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h；（3）收集培养上清，使用human Immunoglobulin Isotyping Panel - IgGs (4-plex）检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IgG1、IgG2的分泌量，使用流式细胞仪检测IgG的浓度，通过检测IgG产生的量来评价机体免疫功能。
11.权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒在评价机体免疫功能方面的应用。
12.权利要求11中评价机体免疫功能方面的应用，所述机体包括但不限于健康人、感染病人、癌症病人。
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