CN115598349A - 结核诊断细胞因子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的T细胞特异性细胞因子，所述T细胞特异性细胞因子包括白细胞介素2(IL‑2)、白细胞介素6(IL‑6)和肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)，并根据所述T细胞特异性细胞因子的表达水平建立了数学模型，对结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染进行鉴别诊断。本发明对于高危人群结核感染筛查和临床诊断具有重要的参考价值。

Description

结核诊断细胞因子及其应用
技术领域
本发明涉及鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的细胞因子及诊断模型和用途，属于结核病检测技术领域。
背景技术
WHO估计结核的潜伏感染比例为人口的1/3，而在特定条件下导致的潜伏感染结核向活动性结核的转变，从而出现结核临床表现是目前造成严重的结核疾病负担的重要因素之一。我国作为结核疾病高负担国家之一，降低结核发病率是目前结核病防控的重要目标。尽管多年来我国在结核感染诊断、治疗及科学防控等方面取得了一系列进展，然而鉴于我国较高的潜伏感染比例和庞大的人口基数，结核发病率仍然居高不下。
目前，临床诊断结核感染的方法有限。结核菌素试验(TST)是临床常用筛查结核的免疫学方法，虽然操作简单，观察结果方便，但由于其较高的假阳性，对临床结核病的诊断意义有限；细菌学是诊断结核的金标准，但培养所需时间较长，而且阳性率取决于采集标本中细菌的数量而导致阳性率低，不利于早期诊断与治疗；影像学作为辅助诊断方法，对活动性肺结核诊断有一定价值，但对肺外结核诊断存在困难，且用于结核诊断特异性较差；血清学检测如ELISA、金标等检测抗原或抗体，极难检测活性结核病，鉴于其高的假阴性和假阳性，2011年7月WHO已明确提出停止使用活性结核病血液检测方法。
结核菌感染引起的T细胞γ干扰素释放试验(IGRA)是近年发展起来的一种新方法，可用于诊断结核(TB)和潜伏结核感染(LTBI)，美国认为IGRA可代替结核菌素皮试(TST)，英国相关指南推荐联用IGRA和TST两种测试。已研制开发成功的QuantiFERON-TBGold test(Cellestis Limited，Carnegie，Victoria，Australia)和the T-SPOT.TB test(Oxford Immunotec Limited，Abingdon，United Kingdom)，以RD1区编码的结核特异性抗原6KD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和10KD培养滤过蛋白(CFP-10)为刺激源，检测外周血中结核特异性释放γ干扰素的T淋巴细胞，特异性、灵敏度高，而且对于结核感染，尤其是自然感染和卡介苗接种等潜伏感染的诊断也具有较强的特异性。然而，IGRA检测不能有效鉴别活动性和潜伏性结核感染。
活动性结核和潜伏感染结核是结核感染后两种主要的表现形式，活动性结核具有高度传染性，而潜伏感染结核一般不具有传染性，两者之间的免疫学差异目前尚未完全清晰，使得我们对于结核保护性免疫的理解仍然处于较为模糊的状态，从而使得结核诊断、疫苗开发及治疗等诸多领域受到严重限制。目前，对于结核的潜伏感染和活动性感染尚无有效的鉴别诊断手段。
目前，大量研究表明，潜伏感染结核和活动性感染结核的免疫状态存在显著差异。一方面，不同功能特性的T细胞在潜伏和活动性感染结核中的频率存在显著差异；另一方面，结核特异性T细胞的活化状态在潜伏和活动性感染结核中也各不相同。T细胞免疫在潜伏和活动性感染结核中存在的差异对于结核的鉴别诊断及保护性免疫的理解具有重要意义。
本发明将以流式细胞检测技术为基础的多因子检测平台为基础，对结核特异性抗原刺激的全血上清进行多因子检测分析，筛选细胞因子表达组合，并通过数学模型验证多因子检测在结核感染鉴别诊断中的检测效能。
发明内容
为实现结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的鉴别诊断，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供确定待测样品中白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达量的试剂在制备用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的试剂盒中的应用，其中
Y＝1/(1+EXP(-0.097967922×A-0.001303236×B+0.003329857×C+1.918391909))，其中EXP表示指数；A表示IL-2的表达量，B表示IL-6的表达量；C表示TNF-α的表达量；其中当Y小于0.7时，待测样品诊断为结核分枝杆菌潜伏感染，当Y大于或等于0.7时，待测样品诊断为结核分枝杆菌活动性感染。
在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌活动性感染是细菌学阳性的活动性结核感染。
在一些实施方案中，所述试剂选自白细胞介素2(IL-2)抗体或抗原结合片段、白细胞介素6(IL-6)抗体或抗原结合片段和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括结核分枝杆菌特异性抗原，所述结核分枝杆菌特异性抗原选自ESAT-6、CFP-10和Rv3615c。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括植物凝集素(PHA)溶液或其他T细胞非特异性阳性刺激物，所述其他T细胞非特异性阳性刺激物选自佛波酯、离子霉素和CD3激活型抗体。
另一方面，本发明提供用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的T细胞特异性细胞因子，其特征在于，所述T细胞特异性细胞因子包括白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
另一方面，本发明提供用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的组合物或试剂盒，其特征在于，包括白细胞介素2(IL-2)抗体或抗原结合片段、白细胞介素6(IL-6)抗体或抗原结合片段和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的组合物或试剂盒，还包括结核分枝杆菌特异性抗原，所述结核分枝杆菌特异性抗原选自ESAT-6、CFP-10和Rv3615c。
在一些实施方案中，用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的组合物或试剂盒，还包括植物凝集素(PHA)溶液或其他T细胞非特异性阳性刺激物，所述其他T细胞非特异性阳性刺激物包括但不限于佛波酯(Phorbol myfismte acetate，PMA)、离子霉素(ionomycin，Ion)和CD3激活型抗体。
另一方面，本发明提供检测试剂盒，其包含：
a.结核分枝杆菌特异性抗原，包括但不限于ESAT-6、CFP-10和Rv3615c；
b.植物凝集素(PHA)溶液或其他T细胞非特异性阳性刺激物，所述其他T细胞非特异性阳性刺激物包括但不限于佛波酯(Phorbol myfismte acetate，PMA)、离子霉素(ionomycin，Ion)和CD3激活型抗体；
c.无菌EP管；
d.多因子检测试剂盒，所述因子包括但不限于IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α；
e.其他流式检测和多因子检测所需试剂及耗材。
另一方面，本发明提供诊断设备，所述诊断设备包括处理器，所述处理器利用根据权利要求1所述的鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的T细胞特异性细胞因子的表达水平建立诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的诊断模型。
另一方面，本发明提供上述鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的T细胞特异性细胞因子在制备鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的组合物或试剂盒中的用途。
另一方面，本发明提供上述鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的T细胞特异性细胞因子在鉴别结核特异性T细胞的活化状态中的用途或在制备鉴别结核特异性T细胞的活化状态的组合物或试剂盒中的用途。
另一方面，本发明提供检测上述用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的T细胞特异性细胞因子的表达水平的方法，其特征在于，采用流式细胞检测技术对T细胞特异性细胞因子的表达水平进行检测。
在一些实施方案中，检测上述用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的T细胞特异性细胞因子的表达水平的方法，包括：
1)采集个体的抗凝外周血，分装并加入阴性对照、结核特异性抗原及非特异性刺激物，进行体外培养；
2)孵育完成后将上述各管在室温条件下离心，小心吸取上清血浆；
3)取多因子检测试剂盒中预包被有抗T细胞特异性细胞因子的微球，与T细胞特异性细胞因子标准品或血浆样品进行孵育，孵育结束后在每孔加入常温的PBST离心清洗；
4)去除洗液，每孔加入稀释的检测抗体，室温孵育；
5)去除检测抗体溶液，PBST清洗，之后每孔加入稀释好的链霉亲和素-PE结合物，室温孵育；
6)PBST清洗，之后PBS清洗，用流式细胞仪进行检测分析，记录荧光值，给出检测结果，之后利用各细胞因子标准品检测值计算标准曲线，并计算各细胞因子在所检测血浆上清中的浓度数值，给出最终反应结果。
另一方面，本发明提供鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的方法，其包括检测上述用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的T细胞特异性细胞因子的表达水平。
在一些实施方案中，鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的方法，还包括利用回归分析建立数学模型计算获得参数，定义为Y值。
有益效果
本发明所开发的结核潜伏感染和活动性感染鉴别诊断多因子组合和模型，适用于结核感染筛查，其检测结果对于高危人群结核感染筛查和临床诊断具有重要的参考价值。本发明相较于其他结核免疫学检测，能够利用一份样本全面获得结核抗原刺激后特异性细胞因子的特征，对于结核潜伏感染和活动性感染的鉴别诊断具有重要意义。
附图说明
图1示出了IL-2(A)、IFN-γ(B)、IL-6(C)和TNF-α(D)四种细胞因子在健康组(HC)、潜伏感染结核组(LTBI)和细菌学阳性的活动性结核组(ATB-P)间的比较。每组的NC表示为阴性对照刺激检测值，TB表示为结核抗原刺激检测值，二者间的统计差异采用配对T检验分析。不同样本组间的差异采用独立样本T检验分析。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；ns：p>0.05。
图2示出了IFN-γ(A)、IL-2(B)、IL-6(C)和TNF-α(D)四种细胞因子在健康组(HC)和潜伏感染结核组(LTBI)间诊断效率的ROC分析。
图3示出了IFN-γ(A)、IL-2(B)、IL-6(C)和TNF-α(D)四种细胞因子在潜伏感染组和活动性感染结核组间诊断效率的ROC分析。应用回归分析建立的数学模型得出Y值在潜伏感染组和活动性感染结核组间的比较(E)和诊断效率的ROC分析(F)。
图4示出了模型诊断效率的大样本验证。应用IL-2、IL-6和TNF-α细胞因子回归分析建立的数学模型得出Y值在大样本潜伏感染组(148例)和活动性感染结核(150例)组间的比较(A)和诊断效率的ROC分析(B)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1.血浆多种细胞因子组合检测
本实施例所涉及的样本包括：健康对照50例、潜伏感染者50例和活动性结核感染者50例。
不同样本组筛选标准为：
A.健康对照：
影像学显示肺部无阴影，结核特异性IGRA检测为阴性。
B.潜伏感染者：
影像学显示肺部无阴影，结核特异性IGRA检测为阳性。
C.活动性结核病人：
a.临床主治医生根据志愿者临床表现确诊为肺结核；
b.影像学显示肺部阴影；
c.结核菌培养阳性。
入选的结核病例及健康志愿者年龄在18-60岁之间，性别随机挑选。
本发明所用的样本来自个体的静脉外周血。经过筛选的个体经主治医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床医生对志愿者进行采血。采血时使用含有肝素抗凝的一次性真空采血管(格雷纳，奥地利)，每名志愿者采血约5ml。
1.结核特异性抗原刺激血浆制备：
抗凝血：3-5ml，肝素抗凝6ml采血管。
血液采集后处理：
a)分别取1ml抗凝血加入到QuantiFERON-gold-tb试剂盒(德国凯杰)所提供的阴性对照管(Nil)、结核特异性抗原刺激管(TB)和阳性对照管(Mitogen)，之后上下颠倒混匀，使管内抗原与全血充分混匀，将上述加入抗凝血的三种刺激管放至37℃培养18-20小时，并保持直立状态；
b)孵育完成后将上述各管在室温条件下以2000rpm/min离心10分钟，小心吸取上清血浆。
2.血浆中多种细胞因子检测：
a、取多因子检测试剂盒中预包被有抗IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α的微球，与IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α标准品或血浆样品进行孵育，孵育结束后在每孔加入200μl常温的PBST离心清洗2次。
b、去除洗液，每孔加入100μl稀释的检测抗体，室温孵育2h。
c、去除检测抗体溶液，PBST清洗3次，之后每孔加入稀释好的链霉亲和素-PE结合物100μl，室温孵育1h。
d、PBST清洗3次，之后PBS清洗2次。用流式细胞仪进行检测分析，记录PE荧光值，给出检测结果。
3.结果分析：
通过不同细胞因子标准品的定量检测，建立不同细胞因子定量检测的标准曲线，并根据不同细胞因子在流式细胞仪检测出的PE荧光值，计算得出每个检测血浆上清中各细胞因子的含量。通过对健康组、潜伏感染组和细菌学阳性的活动性结核组样本各细胞因子含量的比较分析，发现在潜伏感染组和活动性感染组中IFN-γ、IL-2、IL-6在结核抗原刺激后显著增加。IFN-γ和TNF-α在潜伏感染组和活动性感染组间无显著差异，而IL-2和IL-6在潜伏感染组和活动性感染组存在显著差异(图1A-图1D)。
实施例2.潜伏感染和活动性感染结核的诊断模型建立
通过实施例1中对不同细胞因子的检测，发明人进一步对不同细胞因子在不同组间的诊断价值进行了受试者工作特征曲线(ROC)分析，并得出诊断效率AUC值。AUC值是总体诊断效率评价的关键指标，其在0.5-1之间的数值代表诊断效率的高低，其中越接近1表明诊断效率越高，反之代表诊断效率越低。
以结核抗原特异性IFN-γ检测为目标的IGRA释放实验是目前已知能够鉴别结核感染的有效方法，包括酶联免疫吸附(ELISA)技术和酶联免疫斑点(ELISPOT)技术为基础的检测，在实施例1中IGRA检测也被用作潜伏感染人群确定的标准之一。通过实施例1中流式细胞检测获得的四种细胞因子在健康组和潜伏感染组中的诊断效率比较，发现IFN-γ对健康组和潜伏感染组的诊断效率最高(AUC＝0.949)，而IL-2的诊断效率也较高(AUC＝0.885)，IL-6和TNF-α在健康组和潜伏感染组中的诊断效率较低(图2A-2D)。因此，应用多因子检测技术所获得的IFN-γ值与IGRA检测结果一致性良好，能够作为判断结核感染的诊断依据。
通过对四种因子在潜伏感染和活动性感染中鉴别诊断的价值进行分析，结果表明，IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α四种细胞因子单独用于潜伏感染和活动性感染鉴别诊断的ROC分析中的曲线下面积(AUC)在0.622-0.712之间，诊断效率较差(图3A-图3D)。
由于IFN-γ在之前的文献报道(Alexandre Harari等，Nature Medicine 17，372–376(2011))和实施例1的结果中都提示其不能有效鉴别诊断潜伏感染和活动性感染，而尽管TNF-α在上述实施例1中潜伏感染组和活动性感染组间无显著差异，但是在活动性感染结核中有升高的趋势，且其他研究提示TNF-α在潜伏和活动性感染中的重要性。发明人进一步对IL-2、IL-6和TNF-α细胞因子进行了回归分析，并评价其在潜伏感染组和活动性感染组鉴别诊断中的价值。
通过回归分析，将IL-2、IL-6和TNF-α细胞因子通过下列数学模型整合成为单一分析指标，定义为Y值，该模型计算方程为：
Y＝1/(1+EXP(-0.097967922×A-0.001303236×B+0.003329857×C+1.918391909))
其中，EXP表示指数；A表示IL-2的表达量，B表示IL-6的表达量；C表示TNF-α的表达量。
通过对该模型计算得出的Y值在潜伏感染组和活动性感染组间的比较，发现其具有显著的统计学差异(p<0.001)(图3E)。进一步通过ROC分析，发现其曲线下面积(AUC)为0.887，相较于单个细胞因子的诊断效率大幅提高(图3F)。
发明人进一步对该模型的诊断临界值和相应的检出率(检测灵敏度)和特异性在潜伏感染者50例和活动性结核感染者50例样本组中进行了分析，当检测值小于临界值时，待测样本诊断为结核分枝杆菌活动性感染，当检测值大于或等于临界值时，待测样本诊断为结核分枝杆菌潜伏感染。结果如表1所示。Y的临界值为0.6时，潜伏感染的检出率(检测灵敏度)和特异性分别为72％和82％；Y的临界值为0.7时，潜伏感染的检出率(检测灵敏度)和特异性分别为64％和84％；而Y的临界值为0.8时，潜伏感染的检出率(检测灵敏度)和特异性分别为52％和92％。
表1.诊断模型建立与不同诊断临界值下的检出率和特异性
诊断临界值 检出率 特异性
0.6 72％ 82％
0.7 64％ 84％
0.8 52％ 92％
实施例3：多因子检测模型在潜伏感染和活动性感染结核中的诊断应用验证
本实施例进一步对上述实施例2所建立的鉴别诊断模型的诊断效果进行了较大样本的验证。
本实施例所涉及的样本包括：健康对照150例、潜伏感染者148例和细菌学阳性的活动性结核感染者150例，其样本纳入标准、样本采集和处理及细胞因子检测如实施例1所描述。
通过实施例2所建立的鉴别诊断模型，将本实施例检测所获得的IL-2、IL-6和TNF-α细胞因子浓度值带入模型公式，计算得出Y值。结果分析表明，Y值在潜伏感染组和活动性感染组间具有显著的统计学差异(p<0.001)(图4A)。进一步通过ROC分析，发现其曲线下面积(AUC)为0.809(图4B)。
发明人进一步对该模型的诊断临界值和相应的检出率(检测灵敏度)和特异性在潜伏感染者148例和细菌学阳性的活动性结核感染者150例组成的样本组中进行了分析，结果如表2所示。Y的临界值为0.6时，潜伏感染的检出率(检测灵敏度)和特异性分别为69.6％和76.6％；Y的临界值为0.7时，潜伏感染的检出率(检测灵敏度)和特异性分别为63.5％和82.7％；而Y的临界值为0.8时，潜伏感染的检出率(检测灵敏度)和特异性分别为56.1％和84.7％。因此，该模型以Y值为0.7时在模型建立阶段样本和验证样本中的检测灵敏度和特异性较为接近，可以作为诊断潜伏感染和活动性感染的合适的诊断标准。
表2.诊断模型的验证与不同诊断临界值下的检出率和特异性
诊断临界值 检出率 特异性
0.6 69.6％ 76.6％
0.7 63.5％ 82.7％
0.8 56.1％ 84.7％
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.确定待测样品中白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达量的试剂在制备用于鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染和活动性感染的试剂盒中的应用，其中
Y＝1/(1+EXP(-0.097967922×A-0.001303236×B+0.003329857×C+1.918391909))，其中EXP表示指数；A表示IL-2的表达量，B表示IL-6的表达量；C表示TNF-α的表达量；其中当Y小于0.7时，待测样品诊断为结核分枝杆菌活动性感染，当Y大于或等于0.7时，待测样品诊断为结核分枝杆菌潜伏感染。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌活动性感染是细菌学阳性的活动性结核感染。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自白细胞介素2(IL-2)抗体或抗原结合片段、白细胞介素6(IL-6)抗体或抗原结合片段和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体或抗原结合片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括结核分枝杆菌特异性抗原，所述结核分枝杆菌特异性抗原选自ESAT-6、CFP-10和Rv3615c。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括植物凝集素(PHA)溶液或其他T细胞非特异性阳性刺激物，所述其他T细胞非特异性阳性刺激物选自佛波酯、离子霉素和CD3激活型抗体。
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