CN109072192B

CN109072192B - 用于扩展和分化生产抗体的b细胞的方法

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Publication number: CN109072192B
Application number: CN201780022683.2A
Authority: CN
Inventors: H·须贺; K·M·坎丹多; E·昆提科弗; M·卡马塔; T·F·特德; A·吉崎; T·宫垣
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 2016-02-16
Filing date: 2017-02-16
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2037-02-16
Also published as: EP3417052A4; EP3417052B1; EP3417052A1; WO2017143052A1; CN109072192A; JP7018203B2; JP2019509729A; US20190352607A1

Abstract

提供了可用于体外扩展和分化B细胞的饲养细胞系；用于体外扩展B细胞的方法，其包括用所述饲养细胞系培养B细胞；以及用于体外生产单克隆抗体的方法，其包括在充足的条件和充足的时间内用饲养细胞系培养单个B细胞以诱导B细胞扩展和分化成分泌抗体的B细胞克隆。

Description

用于扩展和分化生产抗体的B细胞的方法

相关专利申请的交叉引用

本申请权利要求2016年2月16日提交的美国临时专利申请号62/295,728的优先权的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

序列表

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技术领域

本发明涉及用于生产和支持B细胞，包括人B细胞的方法，所述B细胞可用于生产抗原特异性抗体，更具体为单克隆抗体。更具体而言，本发明涉及培养B细胞以生产单克隆抗体，而不使用杂交瘤技术或EBV-转化的B细胞。

背景技术

已经发现单克隆抗体尤其可用于医学，比如通过开发基于抗体的生物制品或药物制剂。目前用于单克隆抗体生产的方法涉及小鼠杂交瘤方法；即，将生产抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合。其他方法包括EBV-转化的B细胞系和噬菌体展示。使用的生产人单克隆抗体的每种不同的方法都具有技术局限性，使得其难以使用。例如，利用杂交瘤技术，需要“人源化”抗体，以便降低促进针对单克隆抗体的非人部分的免疫应答的频率。另外，对于特定抗原或表位的免疫应答可能是物种特异性的。其他方法具有限制它们广泛用于开发用于治疗和诊断人的单克隆抗体的缺点。

发明内容

本发明基于在可进行B细胞的单个细胞克隆的培养中扩展和分化B细胞的高效方法的发现。在一个方面中，该发现涉及在可进行人B细胞的单个细胞克隆和抗体生产的培养中扩展和分化人B细胞的高效方法。

本发明也基于在培养中扩展和分化B细胞的高效方法的发现，所述方法使得B细胞的单细胞克隆(接种单个B细胞，并将该B细胞扩展成B细胞的克隆)的量和时间段是充足的，从而产生的单克隆抗体的量有利于所产生单克隆抗体的表征。在该方法的一个方面中，人B细胞作为单个克隆扩展和分化，以生产人单克隆抗体。在这些方法的另一方面中，该方法不需要和/或没有添加抗原至扩展培养。在另一方面中，B细胞的抗原特异性是未知的。在另一方面中，B细胞在体外不暴露于抗原。

在本发明的另一方面中，提供了用于生产单克隆抗体，尤其IgG型抗体的体外方法。

在本发明的另一方面中，提供了包括修饰的间质基质细胞或修饰的胸腺上皮细胞的饲养细胞系，其可有效促进和支持培养中的大量B细胞，从而允许比在之前的用修饰小鼠3T3细胞培养B细胞的尝试中观察到的更高水平的单克隆抗体生产。与该方面相关，包括间质基质细胞或胸腺上皮细胞的饲养细胞系，经修饰表达包括CD154(也称为CD40L或CD40配体)和BLyS(B淋巴细胞刺激因子，也称为BAFF(B-细胞活化因子))的组合，或包括CD154、BLyS和IL-21的组合。本发明的饲养细胞支持哺乳动物物种的B细胞，包括人B细胞和鼠B细胞的大量增殖和分化，当B细胞在存在修饰的饲养细胞的情况下体外培养时，不需要添加外源抗原或外源IL-4(即，在缺少外源抗原或外源IL-4的情况下)。

在一个方面中，提供了用于生产结合特定抗原，通常已知抗原的单克隆抗体的方法。该方法包括下述步骤：分离未接触抗原的B细胞，或已经暴露于抗原(例如，提供体外或体内暴露)的B细胞；将分离的B细胞分成单个细胞；在存在根据本发明的修饰饲养细胞(即饲养细胞表达CD154或另一CD40激动剂和BLyS或相当的B细胞活化因子)的情况下，在体外以在少于2周之内在培养中实现数量上至少平均10⁴倍扩展(例如，扩展从单个细胞至10,000个细胞，平均值取自多孔板，比如96孔板的孔中)的条件下和足够的时间内培养分离的B细胞(单个B细胞)。在培养中从扩展的B细胞克隆产生单克隆抗体。进一步的步骤可包括单克隆抗体的表征，比如下述的一个或多个：(a)使用本领域已知的方法确定单克隆抗体的抗原特异性；和(b)分离单克隆抗体，其包括(i)从培养基使用本领域已知的方法纯化单克隆抗体，和/或(ii)从B细胞克隆分离总RNA，以生产编码可变重(VH)抗体链和cDNA编码可变轻(VL)抗体链的cDNA，其接着可被克隆至真核表达载体，用于使用本领域已知的方法重组生产单克隆抗体。可选地，生产抗原特异性单克隆抗体的选择的B细胞克隆可通过如下永生化：杂交瘤技术、EBV-转化、使用PA317 LXSN 16E6E7细胞系(美国典型培养物保藏中心，CRL-2203^TM)产生的多嗜性逆转录病毒LXSN16E6E7的永生化，或本领域已知的其他方法。

本发明的另一方面提供了用于在培养中扩展和分化哺乳动物B细胞的试剂盒。所述试剂盒也可用于使用试剂盒从B细胞扩展生产单克隆抗体。所述试剂盒包括本发明的修饰的饲养细胞、用于从生物样品分离B细胞的试剂，和用于保持修饰的饲养细胞和保持试剂的包装。所述试剂盒可进一步包括培养修饰的饲养细胞和B细胞，以及表征使用该试剂盒从与修饰的饲养细胞共培养的B细胞产生的单克隆抗体所需的一种或多种试剂。

附图说明

图1是显示B细胞扩展的一组图。图1A是显示通过相对于培养天数的扩展倍数测量的人B细胞扩展的图，其是与以下饲养细胞培养的结果：包括表达人BLyS和CD154(添加IL-21)的基质细胞(“MS5^DUO”)，表达BLyS、CD154和IL-21的基质细胞(“MS5^TRIO”)的本发明修饰的饲养细胞，相比于包括表达BLyS和CD154(添加IL-21)的NIH-3T3细胞的饲养细胞(“NIH-3T3-m154/hBLyS”)。这些结果代表在≥3个实验中获得的那些。

图1B是外源性人细胞因子对人B细胞扩展的影响的图。值表示来自对于MS5^Duo细胞单层的一式两份6和10天培养的平均B细胞数，其中在规定的时间段内存在指出的细胞因子组合(a-h)。存在的所有细胞因子为20ng/mL，IL-4(10ng/mL)除外。包含适当细胞因子的另外培养基在第4天和第8天添加至培养。值表示来自两个独立实验的6个样品的平均值(+标准差)。示出了在(a)和其他培养之间或培养(e)和(g)之间明显不同的平均值；^#p<0.05。

图2是一组FACS柱状图，其显示指示的细胞表面标记的水平。图2A是显示在从外周血分离之后，但是在本发明的方法的扩展之前，CD19⁺人B细胞的细胞表面表型(IgM、IgG、CD38和CD138)的图。指示的象限中，表达IgM、IgG、CD38或CD138的活的CD20⁺或CD19⁺B细胞的平均频率由来自具有类似结果的两个独立实验指示。

图2B是显示离体扩展期间，作为在单层MS5^Trio细胞上培养的结果，在6-7天之后，人B细胞的细胞表面表型(IgM、IgG、CD38和CD138)的图。这些结果是在≥3个实验中获得的那些的代表。在指示的象限中，表达IgM、IgG、CD38或CD138的活的CD20⁺或CD19⁺B细胞的平均频率在两个独立实验中显示类似的结果。

图2C是显示离体扩展期间，作为在单层MS5^Trio细胞上培养的结果，在培养的第14天，人B细胞的细胞表面表型(IgM、IgG、CD38和CD138)的图。指示的象限中，表达IgM、IgG、CD38或CD138的活的CD20⁺或CD19⁺B细胞的平均频率在两个独立实验中显示类似的结果。

图3是显示同种型的抗体生产的一组图。图3A是显示离体扩展期间，作为在单层MS5^Trio细胞上培养的结果，在培养的第6天、第10天和第14天，在人B细胞的组织培养上清液流体中的IgM生产的图。柱表示来自两个独立实验的4个样品的平均(+标准差)抗体浓度，如通过ELISA测定。

图3B是显示离体扩展期间，作为在单层MS5^Trio细胞上培养的结果，在培养的第6天、第10天和第14天，人B细胞的组织培养上清液流体中IgG生产的图。柱表示平均(+标准差)来自两个独立实验的4个样品的平均(+标准差)抗体浓度，如通过ELISA测定。

图3C是显示离体扩展期间，作为在单层MS5^Trio细胞上培养的结果，在培养的第6天、第10天和第14天，人B细胞的组织培养上清液流体中的IgA生产的图。柱表示平均(+标准差)来自两个独立实验的4个样品的平均(+标准差)抗体浓度，如通过ELISA测定。

图4是显示扩展的细胞和抗体的各种同种型的生产的一组图。图4A是表示用单层MS5^Trio细胞培养第12天单个人B细胞克隆(每个点表示单个克隆)和它们的扩展数量的图。这些结果是来自两个独立实验的代表性结果。

图4B是描绘图4A中显示的人B细胞克隆在培养的第10天和第12天，组织培养上清液流体中IgM和IgG的浓度的图，如通过ELISA测量。这些结果是来自两个独立实验的代表性结果。

图4C是描绘如通过ELISA测量的，图4A中显示的人B细胞克隆在第12天时，组织培养上清液流体中IgM和IgG的浓度之间的相关性，或单个B细胞克隆扩展和IgM或IgG(n＝69)之间的那些相关性的图。这些结果是来自两个独立实验的代表性结果。

图5是显示特异性抗体的生产的一组图。图5A是显示通过ELISA测量抗桥粒芯糖蛋白1(DSG1)IgG抗体(“吸光度”)相对于96孔板的孔数量(“板孔数量”)的代表图，所述96孔板包含从落叶型天疱疮患者或健康对照分离并与MS5^Trio细胞共培养的B细胞。实水平线显示所述板的所有96孔的平均吸光度值。虚水平线指示所述板的所有96孔的平均值加2个标准偏差值。当孔的吸光度值超过虚线时，其视为是阳性的。

图5B是柱状图，显示抗原特异性B细胞(具有对于DSG1或桥粒芯糖蛋白3(DSG3)的特异性)的频率，所述频率根据来自具有寻常型天疱疮(PV1和PV2)的两个个体或具有落叶型天疱疮(PF1和PF2)的两个个体的循环B细胞计算，与来自没有可测量的抗DSG血清自抗体(“健康对照”，HC)的健康个体的循环B细胞比较。显示的值表示对于每个个体，对于DSG1-或DSG3-特异性IgG抗体为阳性的孔的平均频率。对于每个个体，在每个试验中，评估十一个独立96孔ELISA板。

具体实施方式

本发明基于用于在培养中扩展和分化B细胞的有效方法的发现，所述方法使得从单个细胞克隆扩展和分化的B细胞的量可以产生足够数量的单克隆抗体，可以进行进一步表征而不用依赖于免疫球蛋白基因的首次克隆和表达。进一步表征可包括使用本领域已知的一个或多个高通量筛选试验，表征抗原特异性、功能、结合和/或中和的一个或多个。本发明克服了之前用于扩展和分化鼠B细胞的饲养细胞系比如NIH-3T3细胞系(鼠成纤维细胞细胞系)的缺陷，在培养中扩展人B细胞的饲养细胞系的缺陷，尤其在用于生产单克隆抗体的分化的数量和状态方面。

定义-尽管认为下述术语被生物技术领域的普通技术人员充分理解，但是仍阐释下述定义，以利于阐释本发明。

术语“B细胞”在本文用于指哺乳动物B淋巴细胞，包括但不限于人B细胞和鼠B细胞。任何B细胞可在本发明的方法中扩展，和用于涉及抗体生产的本发明的方法，比如(a)原初B细胞，其包括通过在B细胞发育期间的DNA重排而产生的不同的抗体集合，和(b)B细胞，其已经暴露于特定抗原，或具有暴露于特定抗原的记忆。B细胞包括B细胞群、亚群，或其亚组，包括但不限于原初B细胞、记忆B细胞、活化的B细胞、B1细胞、生发中心B细胞、边缘区B细胞、调节B细胞和滤泡B细胞。

术语“单克隆抗体”在本文用于指对于抗原的表位显示单个结合特异性和亲和性的抗体。术语“重组单克隆抗体”是指通过重组方式，比如通过使用包含免疫球蛋白基因序列(例如，VH和VL cDNA)并且转染至宿主细胞的重组体表达载体而产生的单克隆抗体。这种重组体表达载体可包括人免疫球蛋白基因序列(例如，人VH和人VL cDNA)，其接着被转染至宿主细胞。重组单克隆抗体也包括鼠VH和VL cDNA，其被工程化而产生可用于人的治疗、诊断或治疗诊断应用的“人源化”抗体。

术语“抗原”在本文用于指可刺激产生抗体的物质，并且可被对于该物质特异性的抗体结合(即，抗体可特异性结合与其具有结合特异性的抗原)。抗原可由包括下述中的一种或多种的物质组成：蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、核酸和小分子(有机的或无机的)。抗原可包括：对于人体是外源性的物质、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤抗原、毒素抗原、真菌抗原、自体抗原、改变的自体抗原(由于疾病状态而被改变或修饰的自体抗原)、修饰抗原(由于疾病状态并且与健康的或非疾病状态的抗原相比，错折叠的或氧化的或具有改变的糖基化或过表达或突变的抗原)。

术语“修饰的饲养细胞”和“饲养细胞”在本文用于指被修饰而表达包括CD40激动剂比如CD154(也称为CD40L或CD40配体)和B细胞生存启动子，比如BLyS(B淋巴细胞刺激因子，也称为BAFF(B-细胞活化因子)的组合，或包括CD154、BLyS和IL-21的组合的间质基质细胞或胸腺上皮细胞。这种修饰的饲养细胞的具体例子为修饰的间充质基质细胞系(例如，MS-5细胞，其可以目录号ACC 441从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ)，Braunschweig，德国获得)和修饰的胸腺上皮细胞系(例如，TEC细胞)。作为示意性例子，MS-5是商业上可得的鼠间充质基质细胞系。注意，间充质基质细胞系与成纤维细胞细胞系，比如NIH-3T3细胞系(鼠成纤维细胞细胞系NIH/3T3，保藏为ATCCCRL-1658)的不同在于间充质基质细胞系分泌与成纤维细胞细胞系不同的因子并且可支持不同的功能(包括囊泡形成、血管生成)。例如，MS-5细胞比NIH 3T3细胞分泌明显更高水平的CXCL12(SDF-1)、CXCL-16、Angiopoetin-1、MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1，也称为CCL2)、NOV(过表达的成肾细胞瘤，也称为CCN3)和HGF(肝细胞生长因子)(Zhou等，2012，Br.J.Haematology，157:297-311)。TEC或胸腺上皮细胞系(例如，TEC-84，TEC-D11)支持人淋巴细胞生成(Beaudette-Ziatanovo，Exp.Hematol.，39(5)：570-579)。在培养中，胸腺上皮细胞系可被诱导进行生物改变，而假装间质细胞表型(上皮-间质转变)，比如通过用转化生长因子处理。在形成本发明的修饰的饲养细胞时，间质基质细胞或胸腺上皮细胞被工程化，而表达包括CD40激动剂比如CD154多肽和B细胞生存启动子比如BLyS的组合，或包括这两种多肽和IL-21的组合。如果饲养细胞不被工程化来表达IL-21，则在培养时间段期间，必须将IL-21外源添加至培养基。培养时间段适合小于3周、适合少于2周。培养时间段可为5、6、7、8、9、10、11、12或更多天。

BLys可在表面上表达或可在从细胞表面切割之后为可溶的。可选地，BLyS被促进培养时B细胞生存的不同的因子替换，包括BLyS片段、APRIL、CD22配体、CD22单克隆抗体，或其片段。BLyS是由包括SEQ ID NO:01的核酸序列或编码相同氨基酸的类似的核苷酸序列编码的285个氨基酸糖蛋白(SEQ ID NO：69)。通过本发明的修饰的饲养细胞重组产生的BlyS的长度可变，只要其可结合BLyS受体并且向BLyS受体传导信号，和促进人B细胞的扩展。就此而言，BLyS可作为膜结合型，或以可溶性形式产生。例如，已经发现由氨基酸136-285组成的可溶性形式是有功能活性的。

CD154多肽可被任何CD40激动剂替换，包括但不限于CD40抗体和其片段、CD40配体、CD154多肽和其多肽片段、小分子、合成药物、肽(包括环肽)、多肽、蛋白质、核酸、适配体、合成的或天然无机分子、模拟试剂，以及能够活化CD40的合成的或天然有机分子。在某些实施方式中，CD40激动剂是CD40抗体。CD40抗体可为任何形式。CD40的抗体是本领域已知的(见，例如，Buhtoiarov等，2005，J.Immunol.174:6013-22；Francisco等，2000，CancerRes.60:3225-31；Schwulst等，2006，177:557-65，通过引用以它们的整体并入本文)。CD40激动剂可为CD154多肽并且可在饲养细胞的表面表达或以可溶性形式表达。人CD154多肽用在实施例中并且可作为261个氨基膜结合蛋白(SEQ ID NO：68)或149个氨基酸可溶性蛋白形成，并且可由包括SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03的核苷酸序列，或编码相同氨基酸的类似核苷酸序列编码。就此而言，CD154可作为具有不同长度的膜结合型，或以可溶性形式产生。已经显示，对于CD40L和CD40相互作用重要的氨基酸包括氨基酸128至258。

人IL-21(成熟的多肽)包括131个氨基酸(SEQ ID NO：70)，并且可由包括SEQ IDNO:04的核苷酸序列，或编码相同氨基酸的类似核苷酸序列编码。就此而言，IL-21可以以各种长度产生，只要保持了结合和诱导通过IL-21受体的信号传导，并且已经显示对于IL-21结合和功能相互作用重要的氨基酸包括但不限于氨基酸33、145和148。饲养细胞可被工程化，以表达IL-21，或可将IL-21外源添加至培养。添加的IL-21可在2ng/mL和1000ng/mL之间，适当地在5和500ng/mL之间，适当地在10和100ng/mL之间。

术语“暴露于抗原”在本文用于指该抗原以足够的浓度和足够的时间接触B细胞，使得B细胞被抗原活化(例如，结合B细胞受体(BCR)，或诱导B细胞分化成能够产生对于活化抗原(“特定抗原”)特异性的抗体的B细胞。存在许多B细胞可体内暴露于抗原的方式，包括但不限于感染、注射、接种疫苗、免疫和循环(例如，肿瘤抗原、改变的自体抗原、自体抗原)。在另一实施方式中，B细胞可体外暴露于特定抗原并且被特定抗原活化。例如，美国公开的专利申请US2015/0299655公开了用于通过特定(例如，已知的)抗原体外免疫人B细胞的方法，其包括在存在抗原组合物的情况下，培养人外周血单核细胞的总群体足够的时间并且在充分的条件下，使得人外周血单核细胞中存在的B细胞被抗原组合物免疫，所述抗原组合物包括至少一种与Tat蛋白质耦联的已知的抗原和抗原呈递细胞的受体的配体(后者包括结合C-凝集素类型受体的糖、结合Fc受体的免疫球蛋白或其片段(例如，包含Fc部分))。

体内暴露于抗原的B细胞可使用本领域已知的方法，从包括外周血或其他体液(例如，滑液或渗出物)或从组织(例如，来自个体身体的任何组织，包括但不限于骨髓、心脏组织、神经组织、肿瘤组织、患病的组织、结缔组织、脾组织、淋巴结组织、结缔组织、胸腺组织和其他淋巴组织)的生物样品分离。这种方法包括使用抗体包被的磁珠分级和荧光活化的细胞分选。在免疫磁性分选中，可进行阳性和/或阴性选择，分离B细胞。用于分离B细胞的试剂包括用于分离B细胞的一种或多种抗体制剂。对于B细胞的细胞表面标记特异性的(可结合B细胞的细胞表面标记的)抗体包括对于IgM、IgD、IgG、IgA、IgE、CD19、CD20、CD21、CD22、CD24、CD40、CD72、CD79a、CD79b，或这些的组合(尤其对于分离的B细胞亚群或子集)，或包括另外的细胞表面分子比如CD5，CD9、CD10、CD23、CD38、CD48、CD80、CD86、CD138或CD148的组合特异性的抗体。抗体或抗体组合可结合形成试剂中的磁珠，用于通过免疫磁性分离或分选来分离B细胞。抗体可结合如本领域熟知的荧光标签，以形成用于通过荧光活化的细胞分选来分离B细胞的试剂。分离用于接种单个B细胞培养的B细胞可使用本领域已知的方法完成，其包括但不限于有限稀释或稀释克隆，和荧光活化的细胞分选。

本文提供的体外或离体扩展B细胞的方法包括从受试者分离至少一个B细胞。在该方法中使用的B细胞可获得自受试者的各个区域，包括但不限于受试者中的血液、脾、腹膜腔、淋巴结、骨髓、自身免疫性疾病的位点、炎症的位点或经历移植排斥的组织。细胞可通过本领域技术人员可用的任何方式获得自受试者。获得的细胞群体应包含B细胞，但是可为混合的细胞群体。受试者可为具有B淋巴细胞的任何动物，适当地哺乳动物、适当地家养的动物，比如马、母牛、猪、猫、狗或小鸡，或适当地人。可选地，细胞可源自干细胞，包括但不限于B细胞干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞和诱导的多能干细胞，其在本文所述的方法中使用之前，已经适当地体外分化而发育成B细胞或B细胞祖先。见，例如，Carpenter等，2011，Blood 117：4008-4011。B细胞可为原初细胞或抗原暴露的细胞。

B细胞可使用上述分离和选择方法或本领域技术人员已知的其他方法分离，并且可包括阳性和阴性选择步骤。B细胞可为小于100％B细胞。分离用于指示一组细胞被从温育培养基、饲养细胞或其他非B细胞分离。分离并不意味着表达所得分离的细胞具有某些水平的纯度或同质性。细胞可使用本领域技术人员可用的任何方式获得、分离或选择。例如，B细胞可从粘附细胞通过在适当的温育之后，选择非粘附细胞而获得。细胞也可通过FACS分选或通过结合抗体包被磁珠的不同能力来选择，用于细胞表面标记表达。混合群体中选择细胞的方式是本领域技术人员熟知的。

分离的B细胞然后用饲养细胞系培养，包括修饰为表达CD40激动剂和B细胞生存启动子和任选地IL-21的基质细胞系。可将IL-21外源添加至培养基。进行培养步骤，而不用添加另外的外源IL-4。术语“不用另外的外源IL-4”指示培养包括的外源添加至培养的小于200pg/mL IL-4、小于100pg/mL IL-4、小于50pg/mL IL-4或适当地小于5pg/mL IL-4。这与美国专利号8,815,543或美国公开号2014/0065118报道的小鼠B细胞扩展方法不用，其都通过引用并入本文。如本文使用的，B细胞的扩展包括刺激细胞的增殖以及防止细胞凋亡或细胞的其他死亡。如本文所使用，“培养”和“温育”用于指示在37℃和5％CO₂下，细胞与指示的添加剂(饲养细胞、细胞因子、激动剂、其他刺激分子或培养基，其可包括缓冲液、盐、糖、血清或各种其他成分)一起，保持在细胞培养基中一段时间。适当地，本文使用的温育或培养时间为至少48个小时，但是可为多达八天或更多天的任何时间段。本领域技术人员认识到，可改变培养或温育时间，以允许适当的扩展，以为不同的细胞密度或个体子集的频率来调整，并且以允许研究人员适当的时间使用细胞。因此，精确的培养长度可由本领域技术人员凭经验确定。如果饲养细胞被修饰表达Il-21或Il-21可为添加至培养的唯一外源细胞因子，可也进行培养一段时间，而不添加任何外源细胞因子。

方法可允许两倍至超过5x10⁶倍扩展B细胞。B细胞在少于2周内，在培养中被扩展至少平均10³、10⁴或10⁵倍。在培养时间段之后，可选择细胞，以去除任何非B细胞，或阳性选择B细胞或特定的B细胞子集。培养步骤可包括抗原或可不添加抗原而完成。不添加抗原与如上定义的不添加IL-4类似。扩展的B细胞可能在培养时间段期间，已经经历了类别转换。在一个实施方式中，分离的B细胞对于IgM是阳性的，并且在本文所述的方法中扩展之后，至少10％、15％、20％、25％的扩展的B细胞表达IgG。在一个实施方式中，至少1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％或更多的扩展的B细胞表达IgA。如果在培养步骤之前，细胞被分成单个B细胞，则所得扩展的B细胞可用于生产和分离单克隆抗体。可使用本领域技术人员可用的方法确定单克隆抗原特异性并且可从B细胞纯化单克隆抗体。

本公开不限于本文阐释的构造、组分的排列，或方法步骤的具体细节。参考下述公开，本文公开的组合物和方法能够以对于本领域技术人员显而易见的各种方式制备、实施、使用、进行和/或形成。本文使用的措辞和术语是仅仅为了描述的目的并且不应视为限于权利要求的范围。顺序指示符，比如第一、第二和第三，如在说明书和权利要求中指示各种结构或方法步骤使用，并不意味着解释为指示任何具体的结构或步骤，或这种结构或步骤的任何特定顺序或构造。本文所述的所有方法可以以任何适当的顺序进行，除非本文另外指出或通过上下文以其他方式明确相反。本文提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“比如”)的使用，旨在仅仅利于公开并且不暗示对本公开范围的任何限制，除非以其他方式要求。说明书中的语言和附图中显示的结构都不应解释为指示任何未要求的要素对于实施公开的主题是必要。本文使用的术语“包括”、“包含”或“具有”和其变型意思是囊括其后列举的要素和其等同物，以及另外的要素。叙述为“包括”、“包含”或“具有”某些要素的实施方式也解释为“基本上由那些某些要素组成”和“由那些某些要素组成”。

本文叙述值的范围仅仅旨在用作单独提及落在该范围内的每个分开值的速记方法，除非本文另外指出，并且每个分开值并入说明书，如同其在本文中单独叙述。例如，如果浓度范围叙述为1％至50％，则期望值，比如2％至40％、10％至30％或1％至3％等在说明书中被明确列举。这些仅仅是具体期望的例子，并且列举的最小值和最大值之间并且包括最小值和最大值的数值的所有可能的组合视为在本公开中被明确公开。使用词语“约”来描述具体叙述的量或量的范围，意思是指示非常接近所叙述值的值包括在该量中，比如由于形成测量时的制造公差、工具和人误差等而可能或自然被考虑的值。提及量时的所有百分数是按重量计，除非另外指出。

不认为任何参考文献，包括本说明书中引用的任何非专利或专利文档，构成了现有技术。尤其，应当理解，除非以其他方式指出，本文提及任何文档不视为认为任何这些文档在美国或任何其他国家形成了本领域公知常识的一部分。参考文献的任何讨论叙述了它们作者声称的，并且申请人保留挑战本文引用的任何文档的准确性和针对性的权利。本文引用的所有参考文献通过引用以它们的整体被完全并入，除非另外清楚地指出。在引用的参考文献中的任何定义和/或描述存在任何分歧的情况下，应以本公开为准。

除非另外指出或由上下文指出，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”指“一个或多个”。例如，“一种蛋白质”或“一种RNA”应分别解释为意思是“一种或多种蛋白质”或“一种或多种RNA”。

下述实施例仅仅指示意性的并且不意味着限制本发明的或所附的权利要求的范围。

实施例1

在该实施例中，提供了根据本发明的用于体外扩展人B细胞的方法。从健康的成人供体收集肝素化血液。通过使用层ficoll-甲泛影钠在Sepmate50管中以300x g离心10分钟来分离血液单核细胞。用缓冲液(PBS)，将外周血单核细胞(PBMC)稀释2倍，并且然后离心(300x g，10min)和再悬浮于MACS缓冲液(PBS中0.5％牛血清白蛋白(BSA，w/v)，2.5mMETDA)中至～3x10⁷细胞/mL。根据制造商的指导，使用CD19磁珠，通过阳性选择来分离CD19⁺B细胞。简言之，用CD19单克隆抗体包被的微球(60μL微球/mL的PBMC)在4℃下温育分离的单核细胞15分钟，稀释10倍，通过离心再次成粒，并且再悬浮在1mL的MACS缓冲液中。在磁场下，将细胞上样在预先湿润的LS柱上(一种柱，其包括由铁磁球组成的基质，所述铁磁球覆盖有允许快速和轻柔分离细胞的涂料)。接着，用另外6ml的MACS缓冲液冲洗柱。通过从磁场移除柱，和将3ml包含10％FCS(胎牛血清)的RPMI 1640培养基添加至柱，并且将洗脱液收集在分开的圆锥形管中，而洗脱CD19⁺细胞。使用血球计在显微镜下，测定活细胞浓度，台盼蓝染色死细胞。通过免疫荧光染色和流式细胞术分析，B细胞纯度CD19⁺细胞频率≥98％。另外的选择轮可用于增强纯化。

首先使用诱导鼠B细胞扩展的培养条件尝试体外扩展人B细胞。在包括表达BLyS和CD154的NIH-3T3细胞(NIH-3T3-m154/hBLyS)的基质细胞单层上培养纯化的人B细胞，在模仿小鼠B细胞培养的培养条件下添加人IL-21(专利申请US20140065118)。随后，使用3T3-CD154^EAT或3T3-CD154^BEAT细胞，在模仿小鼠B细胞培养的培养条件下，在存在外源重组细胞因子混合物，包括IL-2、IL-4、IL-21、IL-10和APRIL的情况下，尝试体外扩展纯化的人B细胞。简言之，NIH-3T3-m154/hBLyS细胞用编码小鼠CD154和小鼠BLyS的cDNA超转染，以产生NIH-3T3-CD154^EAT细胞，或编码小鼠CD154、小鼠BLyS和小鼠IL-21的cDNA超转染，以产生NIH-3T3-CD154^BEAT细胞。分离表达这些cDNA的基质细胞系，亚克隆并且评估它们支持小鼠和人B细胞扩展的能力。在24-孔板中，以1ml的培养基中3x10⁵细胞/孔的密度接种基质细胞至少12小时，然后将纯化的人B细胞(3x10³/孔)添加至培养。当人B细胞被添加至培养时，用包含IL-4(10ng/mL)的新鲜培养基替换来自每个孔的培养基。在4天的培养之后，将另外包含IL-4(10ng/mL)的培养基(0.7mL)添加至每个孔。在培养的第6天，在用0.4ml的胰蛋白酶-EDTA处理之后，收集B细胞和基质细胞。将细胞悬液通过离心成粒，并且再悬浮在2ml的培养基中。通过显微镜(血球计)量化B细胞数，并且通过免疫荧光测定B细胞的频率，用流式细胞术分析染色。但是，尽管在这些条件下观察到了明显的小鼠B细胞扩展，在这些尝试中，未观察到明显的人B细胞生存或扩展(例如，扩展小于130倍)。所以，NIH-3T3细胞用人BLyS和人CD154 cDNA转染，分离CD154⁺BLyS⁺细胞、扩展和随后亚克隆。在这些条件下，9至12天培养时间段内，最大的人B细胞扩展未显著增加超过使用NIH-3T3-mCD154/hBLyS细胞单层所观察到的(专利申请US20140065118)，因为12天时间内的人B细胞扩展仅仅为130±17倍(平均值±标准差；图1A)。通过添加外源人重组细胞因子混合物，包括IL-2、IL-4、IL-21、IL-10和APRIL，未显著改善人B细胞扩展。所以，评估一系列另外的人和小鼠基质细胞它们支持人B细胞扩展的能力。

使用下述载体和克隆选择的方法，用人BLyS和人CD154转染不同的人基质细胞和小鼠基质细胞。编码人BLyS的cDNA用于产生BLyS-IRES-eGFP DNA构建体，以便提供(GFP-绿色荧光蛋白)选择标记，独立于对CD154表达的免疫荧光染色。将人CD154 cDNA和人BLyS-IRES-eGFP DNA独立地克隆至具有LTR作为启动子的基于逆转录病毒的表达载体(pMSCVpuro载体)并且通过逆转录病毒转导，使用商业上可获得的逆转录病毒包装细胞系，转染至基质细胞系。转染之后，在培养期间，随后选择稳定的嘌呤霉素(5μg/mL)抗性细胞。通过将基质细胞的细胞表面用APC(别藻蓝素)缀合的CD154单克隆抗体染色，使表达CD154和分泌BLyS的细胞可视化，使用荧光-活化的细胞分选，分离APC⁺GFP⁺(CD154⁺BLyS⁺)细胞。在培养中扩展分离的CD154⁺BLyS⁺细胞、亚克隆并且测试它们体外支持和扩展人B细胞的能力。测试它们支持和扩展人B细胞的能力的基质细胞包括：小鼠MS-5细胞，骨髓基质细胞系；AFT024细胞，小鼠胎肝基质细胞系；OP9细胞，小鼠骨髓基质细胞系；人A549细胞，腺癌肺泡基底上皮细胞系；人EA-Hy926细胞，人内皮细胞系；HS-5细胞，人成纤维样基质细胞系；TEC-84细胞，人胸腺基质细胞系；使用PA317 LXSN 16E6E7细胞系产生的多嗜性逆转录病毒LXSN16E6E7永生化的人包皮成纤维细胞(美国典型培养物保藏中心，CRL-2203^TM)；和类似转化的人脐带静脉内皮细胞。结果显示表达人BLyS和CD154的大部分基质细胞系不能稳定支持B细胞生存或扩展，或支持人B细胞扩展的效率比转染的小鼠NIH-3T3细胞较低。令人吃惊地，和出人意料地，MS-5细胞和TEC-84细胞表现出在培养中支持和扩展人B细胞的能力，随后的具有对于支持人B细胞扩展最佳生长特征的MS-5细胞克隆而不显著需要通过用丝裂霉素C处理细胞防止细胞分裂而抑制基质细胞增殖。

被修饰为表达人CD154和BLyS的MS-5细胞和TEC-84细胞被进一步和类似地修饰以表达IL-21。人IL-21cDNA用于产生IL-21-2A-肽-mBFP2 DNA构建体，确保经可切割的2A肽序列表达蓝色荧光蛋白质(mBFP2)。插入IL-21-2A-肽-mBFP2 DNA代替pMSCVpuro载体的嘌呤霉素基因。随后，在培养期间，选择稳定的嘌呤霉素(5μg/mL)抗性细胞。使用荧光活化的细胞分选分离APC⁺GFP⁺BFP⁺的修饰的饲养细胞(CD154⁺BLyS⁺IL-21⁺)，并且随后分离和测试每个基质细胞系的单个细胞克隆支持人B细胞增殖的能力。

比较本发明的修饰的饲养细胞与用人BLyS和小鼠CD154 cDNA转染的NIH-3T3细胞(NIH-3T3-mCD154/hBLyS)作为饲养细胞支持和诱导扩展从血液分离的人B细胞的能力。在该比较中，将活的人CD19⁺B细胞添加至新鲜饲养细胞单层的各自培养。在NIH-3T3-mCD154/hBLyS细胞单层上用外源人IL-4(2ng/ml)培养人B细胞7天。将包含IL-4(2ng/ml)的另外培养基在第2天和第4天添加至培养。在第7天分离B细胞并且转移至具有外源人IL-21(10ng/ml)的新鲜NIH-3T3-mCD154/hBLyS细胞单层5天。在使用人CD154和BLyS转染的MS-5细胞(MS5^Duo细胞)的培养中，在添加IL-4加IL-21的MS5^Duo细胞上培养B细胞6天，然后用外源IL-21培养直到第14天。在使用人CD154、BLyS和IL-21转染的MS-5细胞(MS5^Trio细胞)的培养中，在添加IL-4的MS5^Trio细胞上培养B细胞6天，然后不添加外源细胞因子培养，直到第14天。在第12天或第14天，从每个孔收集B细胞和基质细胞并且分析。图1显示了针对人CD19⁺B细胞的体外扩展(扩展倍数是相对于开始培养时，培养中存在的B细胞的数量)，包括表达人CD154和BLyS的MS-5克隆(MS5^Duo)或表达人CD154、BLyS和IL-21的MS-5克隆(MS5^Trio)的修饰饲养细胞与NIH-3T3-mCD154/hBLyS细胞的比较。利用MS5^Duo细胞或MS5^Trio细胞作为修饰饲养细胞，人B细胞分别在第10天扩展12,018±5,523倍和21,611±3,576倍，和到第12天扩展61,547±16,134-和80,761±28,979倍(图1A)。利用NIH-3T3-mCD154/hBLyS饲养细胞，人B细胞到第7天扩展3.4倍和到第12天扩展～130倍。也注意到，利用MS5^Duo细胞或MS5^Trio细胞的B细胞的培养可在没有IL-4的情况下进行，对于扩增和分化具有类似或更好的结果(图1B和2B-C)。因此，本发明的修饰的饲养细胞与NIH-3T3-mCD154/hBLyS细胞作为饲养细胞相比可显著促进人B细胞的扩展。与测试其该能力的大部分小鼠和人细胞系比较，本发明的修饰的饲养细胞提供了显著更优的基质细胞单层，用于人B细胞扩展。

实施例2

该实施例阐释了本发明的修饰的饲养细胞诱导体外扩展的人B细胞分化的能力。分析在MS5^Duo或MS5^Trio培养系统中，体外扩展的人B细胞指示分化的标记。使用PerCP-、FITC-、PE/Cy7、FITC和PE/Cy7缀合的CD19(HIB19)、IgM(MHM-88)、IgG(HP6017)、CD38(HIT2)和CD138(MI15)单克隆抗体评估人B细胞表型。通过流式细胞术分析活的细胞。在MS5^Duo或MS5^Trio培养系统中扩展的人B细胞保留了CD19⁺和CD20⁺，确认了它们B细胞的来源(图2)。约80％新鲜分离的人血液B细胞表达IgM，在用修饰的饲养细胞培养之前，～4％表达IgG(图2A)。在用修饰的饲养细胞单层培养第7天，一半的B细胞表达IgM和～16％表达IgG(图2B)。培养结束时，大部分在MS5^Trio培养系统中扩展的B细胞表达细胞表面IgM，但是IgM^-IgG^-IgA⁺CD19⁺B细胞的频率已经扩展了(图2B-C)。在用修饰的饲养细胞培养之前，小于10％的新鲜分离的B细胞表达CD38或CD138(图2A)，其是在活化的B细胞上表达的活化标记并且以高密度在浆细胞上表达。到培养的第6-7天，16％在MS5^Trio培养系统中扩展的B细胞表达CD38活化标记(图2B)。到培养的第14天，达56％的这些B细胞表达CD38，23％的B细胞表达CD38和CD138(图2C)。用在MS5^Duo培养系统中扩展的B细胞获得了类似的(如果不相同的话)的结果。用本发明的修饰的饲养细胞培养的一些人B细胞获得了与它们活化并且分化成分泌抗体的浆母细胞一致的表型。

实施例3

该实施例中阐释了本发明的修饰的饲养细胞诱导体外扩展的人B细胞以生产抗体的能力。分析在MS5^Duo或MS5^Trio培养系统中体外扩展的人B细胞的抗体生产。通过酶联免疫试验(ELISA)测定人IgG、IgM和IgA抗体水平。用包含1％BSA的tris-缓冲生理盐水封闭平板，然后将细胞培养上清液流体(从大量B细胞培养1:10稀释或如果来自单个B细胞培养则不稀释)添加至平板。碱-磷酸酶缀合的抗IgG₁抗体用于检测结合的抗体，并且1M的二乙醇胺/0.5M MgCl₂与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物用作检测试剂。读取405nm处的吸光度。使用磷酸盐缓冲液(PBS)中1％的BSA涂布对照平板，并且如上封闭，然后添加培养上清液流体和检测试剂。基于为每个ELISA使用商业上可得的人IgM、IgG和IgA标准，获得的标准曲线量化抗体浓度。

与它们体外扩展期间的人B细胞表型改变一致，如本文实施例2中描述，到MS5^Trio培养系统中体外扩展的第6天，在人B细胞的组织培养上清液流体中，未检测到分泌的IgM(图3A)。但是，到第10天，IgM浓度增加至7.8μg/mL，且在第14天为92μg/mL。类似地，到第14天，IgG水平显著增加至2.4μg/mL(图3B)。IgA水平在第10天和第14天也增加，但是仍小于0.3μg/mL(图3C)。用MS5^Duo培养系统中扩展的B细胞获得了类似的(如果不相同的话)结果。与MS5^Duo或MS5^Trio培养系统中体外扩展的人B细胞相对照，在NIH-3T3-mCD154/hBLyS、NIH-3T3-CD154^EAT或3T3-CD154^BEAT基质细胞单层上在类似条件下培养的人B细胞未能将可测量的抗体分泌至组织培养上清液流体中。从而，由于在本发明的修饰的饲养细胞上的扩展，一些人B细胞在离体扩展期间分化并且明显分泌IgM和IgG抗体。

在本发明的一个方面中，提供了生产人单克隆抗体的方法，所述抗体结合特定抗原，通常是已知抗原。该方法包括下述步骤：分离人B细胞，将分离的B细胞分成单个细胞，在存在根据本发明的修饰的饲养细胞的情况下，在可在少于2周的培养中实现数量上至少10⁴倍扩展(例如，从单个细胞至10,000个细胞的扩展，多孔板的多个孔的平均扩展数量)的条件和足够的时间内，培养分离的B细胞(单个细胞)，其中从培养中扩展的B细胞克隆产生单克隆抗体。该方面不包括直接添加抗原至分离的B细胞与本发明的修饰的饲养细胞的共培养以试图引导抗原选择或进一步诱导抗原-敏化(即，当分离的B细胞在存在修饰的饲养细胞的情况下培养时，不存在外源抗原，因为这对于根据本发明的方法生产单克隆抗体不是必要的)。

为了阐释该方面，在96-孔板的MS5^Trio基质细胞单层上培养单个人B细胞，不添加外源细胞因子。在这些有限稀释试验中，在60％至70％的孔中观察到了人B细胞集落；反映克隆效率为60％至70％。在包含B细胞集落的孔中，在12天之后，单个B细胞平均扩展46,689±4,105倍(图4A)。在培养的第10天和第12天，组织培养上清液流体IgM浓度分别为5.5±1.2μg/mL和9.3±1.4μg/mL(图4B)。在培养的第10天和第12天，IgG浓度分别为3.5±0.5μg/mL和10.5±0.8μg/mL。尽管个体B细胞克隆的IgM和IgG分泌之间没有相关性以及IgM分泌和B细胞扩展之间没有相关性，但是在IgG分泌和B细胞扩展之间存在显著正相关性(图4C)。因此，个体孔中的一些B细胞经历了同种型转换，一些B细胞也分化成了分泌抗体的细胞。为每个B细胞克隆产生了显著浓度的抗体，从而确保测定它们的BCR特异性。

实施例4

本发明的方法的进一步步骤可包括使用本领域已知的方法表征由每个B细胞克隆产生的单克隆抗体，比如确定单克隆抗体对于抗原的特异性。为看确定根据本发明的方法产生的单克隆抗体的特异性，可使用本领域已知的数种方法的任何一种。例如，现可用抗原阵列，其允许用少量来自B细胞克隆的未稀释的组织培养上清液流体，筛选多达100种不同的抗原，其显著提高了鉴定单克隆抗体具有特异性的抗原的效率，与单克隆抗体生产数量相匹配。简言之，纯化的生物素化的抗原通过使用0.2或0.4mm实心打印针直接接触打印，点样(spot)在链霉抗生物素包被的96-孔微量滴定板中。不冲洗打印的板并且将板储存在4℃直到备用。对于筛选，将B细胞克隆上清液流体直接添加至孔，如果期望，则利用任选的封闭步骤(例如，BSA)。对于打印阵列中的抗原特异性的生物素化的人抗体用作阳性对照和定向标记。将B细胞克隆上清液添加至抗原阵列并且在4℃温育过夜。在用缓冲液(PBS+0.1％Tween)冲洗之后，将阵列用抗人抗体(用于检测人抗体)，或抗鼠抗体(用于检测鼠抗体)温育2小时，利用用于荧光检测的荧光团或酶(例如，碱性磷酸酶)标记，以及利用比色基质进行比色检测。抗原阵列可然后用高通量显微镜分析，图像捕获并且使用成像软件优化和量化检测。

已经描述了类似的高通量抗原微阵列，其中可在少于一周内进行大于25,000个抗原-抗体反应性测试。在一个系统中，蛋白质抗原的阵列被共价结合至醛-涂布的载玻片。抗原在醛载玻片上的结合需要24小时，以变得稳定，并且证实稳定性为至少六月。使用固体针沉积技术和商业上可获得的机器人系统，将抗原微阵列芯片打印在载玻片上。使用该系统使得少至20μl的培养上清液流体与阵列表面上的抗原温育。如果期望同时测定免疫球蛋白类的单克隆抗体的测定与抗原特异性,与阵列结合的人抗体的存在可用与两个不同和可区分的检测分子缀合的抗人IgG和抗人IgM抗体的混合物制备(例如，通过可并入三至四个不同激光器用于不同的检测的阵列阅读器的激光器扫描)。

本发明的方法的进一步步骤可包括表征单克隆抗体，比如分离单克隆抗体，其包括(i)使用本领域已知的方法从培养基纯化单克隆抗体，和/或(ii)包括从B细胞克隆分离总RNA，以产生编码可变重(VH)抗体链的cDNA和编码可变轻(VL)抗体链的cDNA，其然后可被克隆至真核表达载体，用于使用本领域已知的方法重组生产单克隆抗体。就此而言，可收获使用本发明的方法扩展和分化的人B细胞克隆，随后从B细胞克隆的细胞提取总RNA。可使用本领域已知分离总RNA的许多方法中的任何一种，比如使用商业上可获得的miniprep试剂盒。可使用本领域已知的引物(见，例如，SEQ ID NOs：5-12)和逆转录酶-聚合酶链式反应选择性扩增人VH和VL链基因，以制备各自的cDNA分子。可使用嵌套PCR引物，扩增人免疫球蛋白(Ig)重(H)和轻(L)链转录体。然后，免疫球蛋白特异性cDNA用作嵌套PCR扩增中的模板。简言之，来自每个单克隆B细胞扩展的1-2μl的cDNA用作模板，以及外部VH PCR引物和适当的恒定区引物(见，例如，SEQ ID NOs：42-67)来扩增同种型特异性BCR转录体。如果必要，来自外部扩增的PCR产物可用作用于第二轮内部扩增的模板(见，例如，SEQ ID NOs：13-41)。在每种情况下，质粒特异性序列可添加至正向引物和反向引物，以产生可容易克隆至选择的载体的抗体转录体，用于再表达分析。生产性Ig重排可使用公众可获得的软件与生殖细胞系Ig序列比较，并且使用商业上可得的软件分析，以确定V(D)J基因家族使用。可使用生殖细胞系V、D和J序列确定突变频率。可使用商业上可得的软件构建V_H-D-J_H、V_κ-J_κ和V_λ-J_λ转录体比对和基于平均同一性百分数的系统发生树。一旦表征，VH和VL序列可根据需要用于产生适当的同种型的重组人或小鼠单克隆抗体，随后在真核细胞中表达和单克隆抗体蛋白质生产。例如，VH链cDNA和VL cDNA可被克隆至为用于表达选择的宿主细胞的表达载体，和将表达载体共转染至宿主细胞。任何数量的宿主细胞可用于生产重组人或鼠单克隆抗体，包括但不限于哺乳动物细胞(例如，293T细胞、中国仓鼠卵巢细胞等)、杆状病毒、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞。然后，克隆转染的宿主细胞并且在足够的条件下和足够的时间中生长，以生产抗体。使用本领域已知的方法和标准工业系统，生产过程可按比例扩增，以制备大量的抗体。根据需要，可然后使用本领域已知的标准免疫纯化技术纯化单克隆抗体，例如比如通过使用蛋白质A和/或蛋白质G色谱(用于IgG)或使用对于IgA、IgM或IgD特异性的抗免疫球蛋白抗体。

实施例5

在该实施例中，阐释了用于生产结合特定抗原，通常是已知抗原的人单克隆抗体的方法，其中暴露于抗原在体内进行，并且其中由于体内暴露于该抗原，人个体具有可生产对于该抗原具有结合特异性的抗体的B细胞。在该方法一个阐释的应用中，个体可具有病理学病情、不适或疾病过程，使得将该个体的B细胞暴露于与病理性病情、不适或疾病过程相关或造成的一个或多个抗原。通过这种暴露产生的抗体可有助于病情、不适或疾病过程的发展或进展(“病理性抗体”)或，相反，可在尝试抑制或阻止病情或疾病发展而产生(“治疗性抗体”)。方法包括下述的步骤：从这种人个体分离B细胞，将分离的B细胞分成单个细胞，在存在根据本发明的修饰的饲养细胞的情况下，在可在少于2周的培养中实现数量至少10⁴倍扩展的条件和足够的时间下，体外培养分离的B细胞(单个细胞)，其中从培养的扩展B细胞克隆产生单克隆抗体。从该共培养产生的每种单克隆抗体，可然后评估抗原特异性。

作为该方法的举例说明，从具有寻常型天疱疮(PV)或落叶型天疱疮(PF)的个体分离的B细胞产生单克隆抗体。通过临床表现、组织学和直接免疫荧光发现，诊断患有这些疾病的每一种的个体。在机构审查委员会批准下，包括书面知情同意书，进行该研究。纳入该研究的个体为未接收除天疱疮之外的内部或炎症不适的任何治疗的天疱疮患者。使用本文所述的方法，体外共培养分离的B细胞和修饰的饲养细胞。简言之，从具有天疱疮的患者分离循环血液B细胞。将MS5^Trio细胞在96-孔板中培养至少12个小时，然后添加从天疱疮患者分离和纯化的血液B细胞。为了有限稀释，将0.2ml包含B细胞(10细胞/mL)的新鲜的组织培养基添加至每个孔，而不添加任何外源细胞因子。在第6天和第9天，用新鲜培养基替换一半的培养基。在第12天，从每个孔收集培养上清液流体，并且评估上清液流体存在与天疱疮相关的自抗体。就此而言，两种形式的天疱疮(PV和PF)由复层上皮或粘膜和皮肤的细胞表面抗原的自身抗体造成。通常，这些病理学抗体结合细胞表面细胞桥粒的钙依赖性粘附分子，在PF中记录为桥粒芯糖蛋白1(DSG1)，在PV中记录为桥粒芯糖蛋白3(DSG3)和/或desmogelin 1。因此，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，测试上清液流体存在人抗DSG1抗体和人抗DSG3抗体。如图5A中显示，在检查单个96-孔板时，平均存在三至四孔个包含产生人抗DSG1抗体的B细胞克隆，如通过ELISA测定。因为十一个96-孔板用于每个患者样品，理论上接种了10,560个B细胞。基于来自所有十一个板的阳性孔的数量和单个B细胞培养系统的克隆效率，计算抗原特异性血液B细胞的比例。如图5B中显示，在天疱疮患者中，约0.3％至0.5％的循环B细胞具有对于DSG1或DSG3的抗原特异性(图5B，PV和PF)。ELISA中，对于DSG1和DSG3反应性的B细胞克隆也分离自没有天疱疮的健康的个体(“健康对照”，HC)，其没有可检测的抗DSG血清抗体(图5B)。因此，证实了用于扩展单个B细胞和诱导B细胞以生产可检测的人单克隆抗体体外方法，所述抗体结合特定抗原，通常为已知抗原，其中暴露于抗原在体内进行。可选地，可鉴定能够结合所述抗原的原初B细胞并且分离它们的单克隆抗体产物。

序列表

<110> 杜克大学

H·须贺

K·坎丹多

E·昆提科弗

M·卡马塔

T·特德

A·吉崎

T·宫垣

<120> 用于扩展和分化生产抗体的B细胞的方法

<130> 5667-00388

<150> US 62/295,728

<151> 2016-02-16

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1090

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: BLyS

<400> 1

taactctcct gaggggtgag ccaagccctg ccatgtagtg cacgcaggac atcaacaaac 60

acagataaca ggaaatgatc cattccctgt ggtcacttat tctaaaggcc ccaaccttca 120

aagttcaagt agtgatatgg atgactccac agaaagggag cagtcacgcc ttacttcttg 180

ccttaagaaa agagaagaaa tgaaactgaa ggagtgtgtt tccatcctcc cacggaagga 240

aagcccctct gtccgatcct ccaaagacgg aaagctgctg gctgcaacct tgctgctggc 300

actgctgtct tgctgcctca cggtggtgtc tttctaccag gtggccgccc tgcaagggga 360

cctggccagc ctccgggcag agctgcaggg ccaccacgcg gagaagctgc cagcaggagc 420

aggagccccc aaggccggcc tggaggaagc tccagctgtc accgcgggac tgaaaatctt 480

tgaaccacca gctccaggag aaggcaactc cagtcagaac agcagaaata agcgtgccgt 540

tcagggtcca gaagaaacag tcactcaaga ctgcttgcaa ctgattgcag acagtgaaac 600

accaactata caaaaaggat cttacacatt tgttccatgg cttctcagct ttaaaagggg 660

aagtgcccta gaagaaaaag agaataaaat attggtcaaa gaaactggtt acttttttat 720

atatggtcag gttttatata ctgataagac ctacgccatg ggacatctaa ttcagaggaa 780

gaaggtccat gtctttgggg atgaattgag tctggtgact ttgtttcgat gtattcaaaa 840

tatgcctgaa acactaccca ataattcctg ctattcagct ggcattgcaa aactggaaga 900

aggagatgaa ctccaacttg caataccaag agaaaatgca caaatatcac tggatggaga 960

tgtcacattt tttggtgcat tgaaactgct gtgacctact tacaccatgt ctgtagctat 1020

tttcctccct ttctctgtac ctctaagaag aaagaatcta actgaaaata ccaaaaaaaa 1080

aaaaaaaaaa 1090

<210> 2

<211> 1859

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: CD154

<400> 2

actttgacag tcttctcatg ctgcctctgc caccttctct gccagaagat accatttcaa 60

ctttaacaca gcatgatcga aacatacaac caaacttctc cccgatctgc ggccactgga 120

ctgcccatca gcatgaaaat ttttatgtat ttacttactg tttttcttat cacccagatg 180

attgggtcag cactttttgc tgtgtatctt catagaaggt tggacaagat agaagatgaa 240

aggaatcttc atgaagattt tgtattcatg aaaacgatac agagatgcaa cacaggagaa 300

agatccttat ccttactgaa ctgtgaggag attaaaagcc agtttgaagg ctttgtgaag 360

gatataatgt taaacaaaga ggagacgaag aaagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt 420

gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct 480

gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac accatgagca acaacttggt aaccctggaa 540

aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc 600

ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa gctccattta tagccagcct ctgcctaaag 660

tcccccggta gattcgagag aatcttactc agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa 720

ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg 780

gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt 840

ggcttactca aactctgaac agtgtcacct tgcaggctgt ggtggagctg acgctgggag 900

tcttcataat acagcacagc ggttaagccc accccctgtt aactgcctat ttataaccct 960

aggatcctcc ttatggagaa ctatttatta tacactccaa ggcatgtaga actgtaataa 1020

gtgaattaca ggtcacatga aaccaaaacg ggccctgctc cataagagct tatatatctg 1080

aagcagcaac cccactgatg cagacatcca gagagtccta tgaaaagaca aggccattat 1140

gcacaggttg aattctgagt aaacagcaga taacttgcca agttcagttt tgtttctttg 1200

cgtgcagtgt ctttccatgg ataatgcatt tgatttatca gtgaagatgc agaagggaaa 1260

tggggagcct cagctcacat tcagttatgg ttgactctgg gttcctatgg ccttgttgga 1320

gggggccagg ctctagaacg tctaacacag tggagaaccg aaaccccccc cccccgccac 1380

cctctcggac agttattcat tctctttcaa tctctctctc tccatctctc tctttcagtc 1440

tctctctctc aacctctttc ttccaatctc tctttctcaa tctctctgtt tccctttgtc 1500

agtctcttcc ctcccccagt ctctcttctc aatccccctt tctaacacac acacacacac 1560

acacacacac acacacacac acacacacac acacacagag tcaggccgtt gctagtcagt 1620

tctcttcttt ccaccctgtc cctatctcta ccactataga tgagggtgag gagtagggag 1680

tgcagccctg agcctgccca ctcctcatta cgaaatgact gtatttaaag gaaatctatt 1740

gtatctacct gcagtctcca ttgtttccag agtgaacttg taattatctt gttatttatt 1800

ttttgaataa taaagacctc ttaacattaa gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1859

<210> 3

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: CD154

<400> 3

tctgccagaa gataccattt caactttaac acagcatgat cgaaacatac aaccaaactt 60

ctccccgatc tgcggccact ggactgccca tcagcatgaa aatttttatg tatttactta 120

ctgtttttct tatcacccag atgattgggt cagcactttt tgctgtgtat cttcatagaa 180

ggttggacaa gatagaagat gaaaggaatc ttcatgaaga ttttgtattc atgaaaacga 240

tacagagatg caacacagga gaaagatcct tatccttact gaactgtgag gagattaaaa 300

gccagtttga aggctttgtg aaggatataa tgttaaacaa agaggagacg aagaaagaaa 360

acagctttga aatgcaaaaa ggtgatcaga atcctcaaat tgcggcacat gtcataagtg 420

aggccagcag taaaacaaca tctgtgttac agtgggctga aaaaggatac tacaccatga 480

gcaacaactt ggtaaccctg gaaaatggga aacagctgac cgttaaaaga caaggactct 540

attatatcta tgcccaagtc accttctgtt ccaatcggga agcttcgagt caagctccat 600

ttatagccag cctctgccta aagtcccccg gtagattcga gagaatctta ctcagagctg 660

caaataccca cagttccgcc aaaccttgcg ggcaacaatc cattcacttg ggaggagtat 720

ttgaattgca accaggtgct tcggtgtttg tcaatgtgac tgatccaagc caagtgagcc 780

atggcactgg cttcacgtcc tttggcttac tcaaactctg aacagtgtca ccttgcaggc 840

tgtggtggag ctgacgctgg gagtcttcat 870

<210> 4

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: IL-21

<400> 4

ctgaagtgaa aacgagacca aggtccagct ctactgttgg tacttatgag atccagtcct 60

ggcaacatgg agaggattgt catctgtctg atggtcatct tcttggggac actggtccac 120

aaatcaagct cccaaggtca agatcgccac atgattagaa tgcgtcaact tatagatatt 180

gttgatcagc tgaaaaatta tgtgaatgac ttggtccctg aatttctgcc agctccagaa 240

gatgtagaga caaactgtga gtggtcagct ttttcctgtt ttcagaaggc ccaactaaag 300

tcagcaaata caggaaacaa tgaaaggata atcaatgtat caattaaaaa gctgaagagg 360

aaaccacctt ccacaaatgc agggagaaga cagaaacaca gactaacatg cccttcatgt 420

gattcttatg agaaaaaacc acccaaagaa ttcctagaaa gattcaaatc acttctccaa 480

aagatgattc atcagcatct gtcctctaga acacacggaa gtgaagattc ctgaggatct 540

aacttgcagt tggacattgt taca 564

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 逆转录酶(RT)引物IgM

<400> 5

atggagtcgg gaaggaagtc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 逆转录酶(RT)引物IgD

<400> 6

tcacggacgt tgggtggta 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 逆转录酶(RT)引物IgE

<400> 7

tcacggaggt ggcattgga 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 逆转录酶(RT)引物IgA1

<400> 8

caggcgatga ccacgttcc 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 逆转录酶(RT)引物IgA2

<400> 9

catgcgacga ccacgttcc 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 逆转录酶(RT)引物IgG

<400> 10

aggtgtgcac gccgctggtc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 逆转录酶(RT)引物Igκ

<400> 11

gcaggcacac aacagaggca 20

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: 逆转录酶(RT)引物Igλ

<400> 12

aggccactgt cacagct 17

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH1-内部

<400> 13

caggtgcagc tggtrcagtc tggg 24

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH2-内部

<400> 14

cagrgcacct tgarggagtc tggtcc 26

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH3-内部

<400> 15

gaggtkcagc tggtggagtc tggg 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH4-内部

<400> 16

caggtgcagc tgcaggagtc gg 22

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH5-内部

<400> 17

gargtgcagc tggtgcagtc tggag 25

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH6-内部

<400> 18

caggtacagc tgcagcagtc aggtcc 26

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-1-内部

<400> 19

gacatccagw tgacccagtc tc 22

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-2-内部

<400> 20

gatattgtga tgacccagwc tccac 25

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-3-内部

<400> 21

gaaattgtgt tgacrcagtc tcca 24

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-4-内部

<400> 22

gacatcgtga tgacccagtc tc 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-5-内部

<400> 23

gaaacgacac tcacgcagtc tc 22

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-6-内部

<400> 24

gaaattgtgc tgacwcagtc tcca 24

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-7-内部

<400> 25

gacattgtgc tgacccagtc t 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-1-内部

<400> 26

cagtctgtgy tgackcagcc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-2-内部

<400> 27

cagtctgccc tgactcagcc 20

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-3-内部

<400> 28

tcytatgagc tgacwcagcc ac 22

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-31-内部

<400> 29

tcttctgagc tgactcagga ccc 23

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-4ab-内部

<400> 30

cagcytgtgc tgactcaatc 20

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-4c-内部

<400> 31

ctgcctgtgc tgactcagc 19

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-5/9-内部

<400> 32

cagsctgtgc tgactcagcc 20

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-6-内部

<400> 33

aattttatgc tgactcagcc ccact 25

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-7/8-内部

<400> 34

cagrctgtgg tgacycagga g 21

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-10-内部

<400> 35

caggcagggc wgactcag 18

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgA-1-内部

<400> 36

gctggtgctg cagaggctca g 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgA-2-内部

<400> 37

gctggtgctg tcgaggctca g 21

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgD-内部

<400> 38

gtgtctgcac cctgatatga tgg 23

<210> 39

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgG-内部

<400> 39

gctcytgga 9

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgM-内部

<400> 40

ggaattctca caggagacga gg 22

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物C-κ-内部

<400> 41

gggaagatga agacagatgg t 21

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH1-外部

<400> 42

ccatggactg gacctggagg 20

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH2-外部

<400> 43

atggacatac tttgttcca 19

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH3-外部

<400> 44

ccatggagtt tgggctgagc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH4-外部

<400> 45

atgaaacacc tgtggttctt 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH5-外部

<400> 46

atggggtcaa ccgccatcct 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物VH6-外部

<400> 47

atgtctgtct ccttcctcat 20

<210> 48

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-1/2-外部

<400> 48

gctcagctcc tggggct 17

<210> 49

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-3-外部

<400> 49

ggaarcccca gcdcagc 17

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-4/5-外部

<400> 50

ctsttsctyt ggatctctg 19

<210> 51

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-κ-6/7-外部

<400> 51

ctsctgctct gggytcc 17

<210> 52

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-1-外部

<400> 52

cctgggccca gtctgtg 17

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-2-外部

<400> 53

ctcctcasyc tcctcact 18

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-3-外部

<400> 54

ggcctcctat gwgctgac 18

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-31-外部

<400> 55

gttctgtggt ttcttctgag ctg 23

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-4ab-外部

<400> 56

acagggtctc tctcccag 18

<210> 57

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-4c-外部

<400> 57

acaggtctct gtgctctgc 19

<210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-5/9-外部

<400> 58

ccctctcsca gsctgtg 17

<210> 59

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-6-外部

<400> 59

tcttgggcca attttatgc 19

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-7/8-外部

<400> 60

attcycagrc tgtggtgac 19

<210> 61

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:正向引物V-λ-10-外部

<400> 61

cagtggtcca ggcaggg 17

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgA-1-外部

<400> 62

cgaygaccac gttcccatct 20

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgD-外部

<400> 63

ctgttatcct ttgggtgtct gcac 24

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgG-外部

<400> 64

cgcctgagtt ccacgacacc 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物IgM-外部

<400> 65

ccgacgggga attctcacag 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物C-κ-外部

<400> 66

gaggcagttc cagatttcaa 20

<210> 67

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的:反向引物C-λ-外部

<400> 67

aggccactgt cacagct 17

<210> 68

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: CD154多肽序列

<400> 68

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His

210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

<210> 69

<211> 285

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: BLyS多肽序列

<400> 69

Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu

1 5 10 15

Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro

20 25 30

Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu

35 40 45

Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val

50 55 60

Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg

65 70 75 80

Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly

85 90 95

Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu

100 105 110

Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn

115 120 125

Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln

130 135 140

Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys

145 150 155 160

Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser

165 170 175

Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr

180 185 190

Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met

195 200 205

Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu

210 215 220

Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu

225 230 235 240

Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly

245 250 255

Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu

260 265 270

Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu

275 280 285

<210> 70

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的: IL-21多肽序列

<400> 70

Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met

1 5 10 15

Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln

20 25 30

Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln

35 40 45

Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro

50 55 60

Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln

65 70 75 80

Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile

85 90 95

Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala

100 105 110

Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr

115 120 125

Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu

130 135 140

Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asp Ser

Claims

1.一种用于体外扩展人B细胞的方法，所述方法包括：

(a)分离至少一个人B细胞，和

(b)结合IL-21且没有另外的外源IL-4，用饲养细胞系培养来自步骤(a)的所述至少一个人B细胞，所述饲养细胞系包括经修饰表达CD154多肽和BLyS多肽的MS-5间充质基质细胞系，其中所述人B细胞用所述饲养细胞系在充足的条件下培养并培养充足的时间，以使得所述人B细胞在数量上扩展，并且其中在步骤(a)中分离的一个人B细胞被用于步骤(b)中。

2.权利要求1所述的方法，其中所述饲养细胞系包括经修饰表达CD154多肽、BLyS多肽和IL-21多肽的MS-5间充质基质细胞系，其中所述饲养细胞系能够在少于2周内在培养中使人B细胞的数量扩展至少平均10⁴倍。

3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述至少一个人B细胞在步骤(a)中的分离之前已经暴露于抗原。

4.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中步骤(b)中所述用饲养细胞系培养所述至少一个人B细胞在存在抗原的情况下进行。

5.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养在没有添加的抗原的情况下进行。

6.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述至少一个人B细胞通过与抗原结合而分离。

7.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之后，至少10％的扩展的人B细胞表达IgG，或者其中在步骤(b)之后，至少2.5％的扩展的人B细胞表达IgA。

8.一种用于生产单克隆抗体的方法，其包括：

(a)分离B细胞；

(b)将来自步骤(a)的B细胞分成单个B细胞；

(c)结合IL-21且没有另外的外源IL-4，用饲养细胞系培养所述单个B细胞，以生产多个B细胞克隆，所述饲养细胞系包括修饰为表达CD154多肽和BLyS多肽的MS-5间充质基质细胞系，

(d)评估所述多个B细胞克隆生产的至少一种单克隆抗体的抗原特异性，和

(e)纯化所述多个B细胞克隆产生的至少一种单克隆抗体,

其中所述单个B细胞是人B细胞并且用饲养细胞系在充足的条件下培养并且培养充足的时间，以使得所述单个B细胞在数量上扩展，并且分化成生产单克隆抗体的B细胞克隆。

9.权利要求8所述的方法，其中所述B细胞在步骤(a)的分离之前已经暴露于抗原。

10.权利要求8所述的方法，其中步骤(c)中不包括抗原。

11.权利要求8所述的方法，其中在步骤(c)之后，至少10％的扩展的B细胞表达IgG，或者其中在步骤(c)之后，至少2.5％的扩展的B细胞表达IgA。

12.权利要求8所述的方法，其中所述饲养细胞系包括经修饰表达CD154多肽、BLyS多肽和IL-21多肽的MS-5间充质基质细胞系，其中所述饲养细胞系能够在少于2周内在培养中使人B细胞的数量扩展至少平均10⁴倍。

13.一种用于体外扩展和分化哺乳动物B细胞的试剂盒，其包括饲养细胞系、用于从生物样品分离B细胞的至少一种抗体和用于从外周血样品收集所述B细胞的试剂，其中所述饲养细胞系包括经修饰表达CD154多肽、BLyS多肽和IL-21多肽的MS-5间充质基质细胞系，其中所述饲养细胞系能够在少于2周内在培养中使人B细胞的数量扩展至少平均10⁴倍。

14.权利要求13所述的试剂盒，其中所述抗体为CD19抗体。

15.权利要求13所述的试剂盒，进一步包括对于培养所述修饰的饲养细胞系和所述分离的B细胞必要的一种或多种试剂。

16.权利要求15所述的试剂盒，其中所述试剂是IL-21。

17.权利要求13-16中任一项所述的试剂盒，进一步包括用于表征从所述B细胞产生的单克隆抗体的一种或多种试剂。

18.权利要求17所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体为对IgM、IgG、IgA或IgE具有特异性的抗体。

19.一种饲养细胞系，其包括经修饰表达CD154多肽、BLyS多肽和IL-21多肽的MS-5间充质基质细胞系，其中所述饲养细胞系能够在少于2周内在培养中使人B细胞的数量扩展至少平均10⁴倍。

20.权利要求19所述的饲养细胞系，其中所述CD154多肽包括SEQ ID NO:68或其功能片段或变体。

21.权利要求19至20中任一项所述的饲养细胞系，其中所述BLyS多肽包括SEQ ID NO:69或其功能片段或变体。

22.权利要求19至20中任一项所述的饲养细胞系，其中所述IL-21多肽包括SEQ ID NO:70或其功能片段或变体。