CN102164957A - 利用抗体库阵列(ara)发现靶标特异性抗体的方法和组合物 - Google Patents

利用抗体库阵列(ara)发现靶标特异性抗体的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对靶标抗原有特异性的抗体序列。发现方法和组合物包含人类抗体，包含此抗体的序列，表达此抗体的永生化B细胞和能够包含这些抗体的非永生化B细胞库。本发明提供了一种筛选对细胞表面分子，比如利用抗体库阵列对靶细胞表面分子，有特异性的受体有功能性作用的单克隆抗体的方法，同时提供了得自于这些抗体的指向靶标的功能性抗体和治疗方法，并提供了对潜在性治疗性抗体的高通量和平行筛选。本发明还涉及到指向靶标和疫苗的功能抗原决定簇的抗体和源自于这些抗体的治疗方法。

Description

利用抗体库阵列(ARA)发现靶标特异性抗体的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求临时专利申请优先权，美国申请序列号61/083696，标题为“利用抗体库阵列(ARA)发现特异性目标抗体的方法和化合物”，申请时间2008年7月25日。美国序列号61/109418，标题为“利用抗体库阵列(ARA)发现特异性目标抗体的方法和组合物”，申请时间2008年10月29日。美国序列号61/159704，标题为“利用抗体库阵列(ARA)对靶标特异性抗体进行功能性筛选”，申请时间2009年3月12日。其中全部内容在此引证并入本申请。
技术领域
本发明通常涉及对靶标抗原有特异性的抗体序列。确切的说，本发明涉及到包括自然人类抗体，含有该抗体的抗体阵列和表达该抗体的人类B细胞在内的发现方法及其化合物。本发明亦涉及到潜在治疗性抗体的高通量和平行筛选方法。本发明还涉及到指向功能性抗原决定簇的抗体，这些抗原决定簇对应于靶标，疫苗和源于所述的抗体的治疗方法。
背景技术
可以识别细胞表面受体胞外域的单克隆抗体可以作为该受体的激动剂或者拮抗剂。单克隆抗体(MAb)263是一种广泛使用的单克隆抗体，它可以识别生长激素(GH)受体的胞外域(ECD)，它也可以在生物体内或者体外作为生长激素(GH)的激动剂。(Wan Y.，等人，Molecular Endocrinology 17(11)：2240-2250(2003))。
然而，并不是所有的结合有受体的抗体都会显示出与激动剂或者拮抗剂配对的活性。有些需要额外的构象变化引发信号。甚至并不是所有指向激素结合位点和作为激素结合竞争者得Mab都能够充当激动剂并引发信号。(Rowlinson SW，等人，1998JBiol Chem 273：5307-5314).有报道，将激动作用限制在一个很小的Mab范围内作用于促红细胞生成素受体，大量研究显示该受体的96种Mab，仅有4种有激动剂活性(Elliott S，等人，1996JBiol Chem 271：24691-24697)。
在需要延长半衰期的情形下或者可以期望减少频繁治疗的情形下，抗体刺激细胞表面受体的激动剂活性，使它成为非常有吸引力的治疗选择。为了观察了解单克隆抗体怎样激活受体，利用已知的抑制激动剂Mab定位抗原决定基的工作已经开始实行。进一步来讲，在定位激动剂的细胞表面受体结合位点时，单克隆抗体可以加深我们对于受体的结构功能关系的理解。一种用人类巨核细胞培养的鼠类单克隆抗体，术语为BAH-I，可以专一性识别细胞表面促血小板生成素(TPO)的受体(c-Mpl)，显示出激动剂活性。(Deng B.，等人，Blood，92(6)：1981-1988(1998)).
目前特异性蛋白质检测和定量测量的方法有基于抗原/抗体结合的免疫测定法，包括经典的直接免疫测定，比如免疫扩散，免疫电泳，血液凝集和免疫沉淀反应实验，还包括最近发展的一些方法，比如荧光免疫检验法，放射性免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(EIA)和蛋白质印迹法。这些方法利用的是抗原抗体间的专一性反应。但是这些方法每次只能分析一个试剂，限制了单次实验中可以被分析的分子数量。
为了优化人类抗体工程，研究者开发出了一系列的显示方法。噬菌体显示法具有能够与分子库内分子专一性结合的特点，是一种广泛用于多肽和蛋白质分离的方法。抗体库的噬菌体显示法可以作为寻找靶标抗体片段的一种替代方法。在功能性基因和蛋白质方面，在筛选新型高亲和力基和其受体时，噬菌体显示法的使用在基因组学和蛋白质组学方面有至关重要的作用。显示法使得许多疾病下确定主要化合物和路径成为可能，这些疾病主要包括癌症，艾滋病(AIDS)，心血管疾病和自身免疫混乱。
噬菌体显示法具有能够与分子库内分子专一性结合的特点，是一种广泛用于多肽和蛋白质分离的方法。抗体库的噬菌体显示法可以作为寻找靶标抗体片段的一种替代方法。在筛选新型高亲和力基和其受体时，噬菌体显示法的使用在基因组学和蛋白质组学方面有至关重要的作用。显示法使得许多疾病下确定主要化合物和路径成为可能，这些疾病主要包括癌症，艾滋病(AIDS)，心血管疾病和自身免疫混乱。
一般的噬菌粒/辅助噬菌体体系的缺点是噬菌体的高传染性背景，其不显示目的蛋白质，但是与选择靶标的非特异性结合会促使噬菌体繁殖。所述的问题和已提高的细菌的生长速率为不表达重组蛋白的异常噬菌体提供了有利条件，以上的两个特点使得选择效率大大降低。施用于抗体时，这一方法的主要缺点是会丢失轻链和重链的自然组合，并会产生很多假阳性组合。因此寻找轻链和重链(从自然免疫系统中发展起来的)的最优组合的可能性非常小。
由人类后胚胎中心(post-GC)B细胞表达出的亲和成熟的抗体预示着对传染病和生化暴露治疗的极大希望(Casadevall，A.，Pirofski，L.A.，2005.Expert Opin.Biol.Ther.5，1359)。这些抗体的最好来源可能是特定的传染病恢复者或者疫苗接种者，并产生特定保护性抗体响应的人。
人类抗体是由健全的人类免疫系统由于自身功能自然产生的抗体。自然抗体对人类病毒类疾病治疗的效用已经被人超免疫球蛋白的治疗实践证实。三阶段疗法能够利用人类外周血液B细胞产生稳定的杂合细胞群，这些杂合细胞可以很大程度上提高对抗肉毒杆菌神经毒素的亲和成熟的人类IgG抗体的作用。在这个方法中，外周单核血液细胞(PBMC)(a)被选中来表达CD27，后胚中心B细胞的标记物，(b)通过体外培养来改进B细胞的增殖能力和等级转换能力，(c)与已经基因改造的骨髓瘤细胞系融合。(Adekar等人，J Immunol Methods.2008 Apr 20；333(1-2)：156-66.)。
自然抗体，作为一类，在一些方面与通过重组库内细胞(噬菌体和基因改造的小鼠细胞)得到的抗体不同，它所特有的性质使其成为治疗人类疾病的理想治疗手段。(参见Dessain等人， Exploring the Native Human Antibody Repertoire to Create Antiviral Therapeutics in Current Topics
进一步来说，并不是每一个源于病原体染色体组的潜在抗原决定基的免疫识别都是必须的。抗原集合和传染性病原体的抗原决定簇的响应对于保护作用已经足够。所以“免疫性抗病毒药物”基于这样一个概念，即对抗原集合和与宿主免疫系统相互作用的抗原决定基的响应就可以满足保护的需要，并不需要对整个有机体响应。对癌症的有效免疫响应也经常限制到被肿瘤影响的免疫系统范围。因此，人们希望能够获得与任何传染或者肿瘤相关的人类免疫系统的抗体库。
目前此筛选抗体库方法的另一个缺点是我们得到的信息本质上是基于抗体结合目标的能力，在结合到目标物时，只能提供很少或者不能提供基于抗体功能性影响筛选作用。九十年代见证了基因技术和蛋白质技术的快速发展，使开发一整套新目标物变得非常有希望。对正常组织和肿瘤组织的核苷链和蛋白质链的高通量筛选和计算机辅助分析揭示了在蛋白质水平下的细微差别，在理论上可以瞄准癌症治疗。然而，没有获得任何一种临床上可以应用的或者被证实的靶标。在表达模式上的细微差别可能并不是那么重要，而肿瘤选择性功能可能更加相关。新的抗原决定基水平上的靶标物的调查是为了确定哪些可以给肿瘤细胞带来功能性区别，因为与一个抗原决定基的结合可以带来信号传播的变化，而与另一个抗原决定基的结合可能会产生不同的性质。这样在单一治疗失去效力的情况下，允许使用联合治疗法或者利用阻碍不同功能和互相影响的抗体的二阶治疗法。
举例来说，TRASTUZUMAB
Figure BPA00001332393800051
(HERCEPTINGenentech，San Francisco，CA)是一种重组人类单克隆抗体，目标为HER-2(人类表皮生长因子受体2；erb-B2；neu)酪氨酸激酶受体的胞外域。临床研究证实TRASTUZUMAB有抗转HER-2过量表达移性乳腺癌的活性，美国食品药品监督局于1998年批准其上市(Carter P，Presta L，Gorman CM，等人Humanization of an anti-pl85her2 antibody for human cancer therapy.Proc Natl Acad Sci USA(1992)89：4285-4289.)。另外一种以HER-2为靶标物的单克隆抗体，PERTUZUMAB
Figure BPA00001332393800061
(OMNIT ARG
Figure BPA00001332393800062
2C4；Genentech)最近正在患有不同类型实体瘤的癌症病人中进行第一阶段的临床试验。为了和TRASTUZUMAB
Figure BPA00001332393800063
对照，PERTUZUMAB
Figure BPA00001332393800064
通过空间上阻碍HER-2和其他的HER受体的二聚作用来发挥效力，它阻碍了HER-2/EGFR和HER-2/HER-3异二聚体(Agus DB，等人Cancer Cell(2002)2：127-137.)发出的配基活性信号。由于大部分初始就对TRASTUZUMAB有反应的乳腺癌患者一年内就会复发(Cobleigh MA，等人J ClinOncol 1999；17：2639-2648)，研究发现用TRASTUZUMAB
Figure BPA00001332393800066
和PERTUZUMAB
Figure BPA00001332393800067
联合治疗可以协同阻碍HER-2过量表达BT474乳腺癌细胞的存活。(Nahta R.，等人Cancer Res.64，2343-2346(2004))。因此，人们希望能够得到下述抗体库，其中的抗体可以用快速检测或者高通量检测的方式按照功能或者抗原决定基特异性分类。
erbB2致癌基因编码增长因子受体。经证实erbB2基因的过量表达与越来越多的侵略性肿瘤和低水平预后相关。针对这个分子的抗体在体内有抗癌作用，但是有些没有此作用。(Wang等人MoI Immunol.2004 Feb；40(13)：963-969)。显然，有些抗原决定基与erbB2肿瘤生长功能相关，有些则不相关。因此，需要在给定目标下，对抗原决定基进行全面的空间性能研究。
发明内容
以下针对不同实施方案方法、组合物和试剂盒的实施方案的描述将不在任何方面作为对附上的权利要求的限制的解释。
本发明涉及一种人类抗体发现方法，该方法有利于促进基于人类抗体的新型、有效的治疗方法，诊断方法和预测方法的开发。本项发明提供了一种建立包含有与人体内构象相同的抗体库的方法。本发明将进一步提供一个新型的包含人类抗体库中抗体的抗体库阵列(ARA)，来发现瞄准特定抗原的人类自然抗体。通过应用本发明的ARA，本发明可提供包含有瞄准特定抗原的人类自然抗体的新型组合物和试剂盒。
本发明涉及一种快速鉴别有特异性功能的单克隆抗体的方法，该单克隆抗体来自于一系列指向特异性靶细胞表面分子单克隆抗体，比如受体。本发明可以提供新型组合物和试剂盒，所述的组合物和试剂盒包括瞄准特定抗原的人类自然抗体，并具有通过利用本发明中的靶标特异性抗体库阵列(ARA)发现的特异性功能。
本发明涉及一种筛选有生物学功能的单克隆抗体的方法，该方法包括提供一个含有众多指向细胞表面特异性靶标分子的单克隆抗体的抗体库阵列(ARA)，还包括将此ARA与细胞表面存在特异性靶标分子的细胞联系起来，并确定哪些单克隆抗体对细胞表面的特异性靶标分子有抑制作用或者促进作用。
此方法进一步包括：使ARA与通信细胞接触，其中的通信细胞被改造为当其与通信细胞表面靶标分子的激动剂或拮抗剂接触时会表达可检测性信号；在生成可检测性信号必须底物存在的情况下，用单克隆抗体培养通信细胞，其中可检测性信号水平上的变化就可以显示出单克隆抗体细胞表面靶标分子激动剂或者拮抗剂的功能的存在。
在一些情况下，存在于细胞表面的特异性靶标分子就是受体分子。
在一些情况下，受体从以下这组物质中选择，这些物质包括：外周膜蛋白受体，跨膜受体，代谢性受体，G蛋白偶联受体(GPCR)，酪氨酸激酶受体，鸟苷酸环化酶受体，对胞外配基响应的离子型受体，酪氨酸激酶受体，细胞因子受体，鸟苷酸环化酶受体，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体，人类生长激素受体，葡萄糖输运，铁转蛋白受体，表皮生长因子受体，低密度脂蛋白受体，瘦素受体，白细胞介素受体，IL-I受体，IL-2受体，GPCRs，毒蕈碱乙酰胆碱受体，腺苷受体，肾上腺素受体，伽马氨基丁酸受体，血管紧张素受体，大麻酯受体，胆囊收缩素受体，多巴胺受体，胰高血糖素受体，代谢型谷氨酸受体，组胺受体，嗅觉受体，阿片受体，视紫红质，分泌素受体，血清素受体，生长激素抑制素受体，钙感受受体，生长因子受体，共刺激因子受体，蛋白激酶受体，T细胞受体，B细胞受体，ITIM含受体，ITAM含受体，TNFR总科组分，TNF受体总科，离子通道，和趋化因子受体。
在一些方面，抗体起着受体蛋白全激动剂，部分激动剂，拮抗剂或者反拮抗剂的作用。
一些实施方案中，可检测信号有荧光剂，化学染料，放射性结合试剂，化学发光结合试剂，电化学发光试剂，磁性结合试剂，顺磁性结合试剂，可生成有色物质的酶，可生成化学发光物质的酶，可生成磁性物质的酶或者钌。
本发明与筛选方法相关，其中细胞表面分子的激活作用与作用于底物的酶的活力相关的胞内信号途径相耦合。
在一些实施方案中，酶从以下这些酶组成的本组物质中进行选择，这些酶包括：β-内酰胺酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，β-甘露糖苷酶，酸性磷酸酶，碱性磷酸酶，磷酸二酯酶II。
在一些实施方案中，底物从以下底物中进行选择，这些底物包括：对氨基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，对氨基苯-α-D-吡喃半乳糖苷，对氨基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷，对氨基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，对氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷，对氨基苯-β-D-吡喃甘露糖苷，对氨基苯磷酸盐和对氨基苯磷酸胆碱或其衍生物。
在一些实施方案中，酶对底物的作用可以与化学反应，发光反应，显色反应或者荧光反应相耦合。
本发明涉及一种筛选方法，进一步包括：在抗体功能检测前利用流体剪切力从ARA表面除去未结合的通信细胞。
在一些方面，ARA试验在96或者384孔板中进行。每个孔中都有从单个B细胞克隆中得到的单克隆抗体，其中单克隆抗体的浓度足够从细胞表面靶标分子中得到反应信号。每个孔中都可以与103以上通信细胞进行接触。在一些实施方案中，每孔都可以与少于103通信细胞接触，允许细胞在适宜的条件下生长直至每个孔中都达到或超过103个信号细胞，能够产生可检测信号。
一些情况下，可检测性物质可能是或者不是通信细胞分泌的，信号检测在各个孔中，也即物质生成的地方进行。
一些情况下，每个孔中都可以与通信细胞接触，通信细胞在适合细胞生长的条件下增殖，直至达到103，104，105或者更多。细胞生长条件同样适合于可检测物质的表达。
一些情况下，本筛选法为高通量筛选。一些情况下，本筛选法为高含量筛选。
一些情况下，可检测性物质是细胞表面靶标分子激活过程中间接产生的。
一些情况下，细胞表面靶标分子信号路径的激活可以和β-内酰胺酶表达关联起来，β-内酰胺酶的表达可以用荧光能量共振转移(FRET)反应的底物来量化。
本发明提供了一种可以生产抗体库的方法，该方法包括：从每一个有效数目的人类供体内得到至少104B细胞，形成一个B细胞群，所述的细胞群包含至少105，优选至少106，更加优选至少107不同种类自然生成的抗体。其中的每一个抗体都有自然配对的重链和轻链，以充分表现整体人类免疫系统；将所述的B细胞群划分成不同B细胞亚群，每个亚细胞群平均都可以产生1，5，10，20，50或者100种不同种类抗体；将每个B细胞亚群扩增为B细胞系；在扩增前或者扩增后，将所述的任一个B细胞永生化以产生永生化的B细胞；在B细胞可以将抗体分泌到培养基的合适条件下培养所述的B细胞培养；将所述的抗体附着或者分配到固体表面的特定位置，从而产生抗体阵列。
进一步，本方法包括确定对所述的靶标有特异性的抗体。本方法可以进一步包括确定哪个永生化或者非永生化B细胞系能够生产所述的靶标抗体和从B细胞培养中分离产生所述的靶标抗体的B细胞的步骤。
本发明提供从一个或者多个单个供体中生产抗体的方法，该方法包括：从所述的一个或者多个单一供体中利用自然表达出的抗体获得至少104个B细胞；将所述的B细胞分成可生产至少一个抗体以上的亚细胞群，优选的亚细胞群可以产生约1-100个抗体；将每个B细胞的亚细胞群增殖以得到一个扩增的B细胞系；任选地在扩增前或扩增后固定每一个所述的B细胞系的每个细胞以生产固定化B细胞系；在所述的B细胞可以分泌抗体到所述的培养基的条件下培养所述的B细胞系中的每一个细胞；将所述的抗体固定到固体表面的特定位置。本方法可以进一步包括以下步骤：筛选针对一靶标的所述的抗体。
本发明提供的方法中所述人类供体数至少10，50，100或者500。
本发明提供的方法中所述B细胞群被分成至少10，20，50，100，1000，104，直至107个亚细胞群。
本发明包含一个含有至少105，优选至少106，更加优选至少107个自然产生、有自然配对的VH区和VL区的抗体库，所述的抗体由人类B细胞，优选由永生化的人类B细胞表达得到，其中B细胞从一个足够多样的人类群体中获得，以至于所述的抗体库中的这些抗体具有与全部人类免疫实质上类似的结合活性的多样性。
本发明提供了一个阵列和一个抗体库，它们包括至少105，优选至少106，更加优选至少107或者更多自然表达的人类抗体，所述的抗体有自然配对的与VH和VL区，是由人类B细胞表达的。在一些实施方案中，该抗体库或者ARA可以识别至少105不同的特异性抗原或者靶标，优选至少可以识别106，更加优选至少107或者更多不同的特异性抗原或者靶标。参见US 6319690，通过在此引证全部全部并入本申请。
本发明提供了一个由人类B细胞群组成的库，B细胞可以产生至少105，优选至少106，更加优选至少107或者更多的不同种类的自然生成的抗体，所述的抗体有自然配对的与VH和VL区。所述的人类B细胞群被分为多个B细胞亚群，每个亚群平均可以产生1-100不同种类的抗体，所述的人类B细胞可以从足够多样的病人获得，以至于由所述的库内B细胞所产生的抗体具有与完整的人类免疫实质上相似的结合活性的多样性。
本发明提供了一种建立非永生化B细胞库的方法，该方法包括：从每个有效数量的人类供体中获得至少104记忆B细胞；制备人类B细胞群，所述的B细胞群包含至少105个不同种类的自然产生的抗体，优选至少106，更加优选至少107或者更多个不同种类的自然产生的抗体，其中所述的每个抗体都有自然配对的与重区和轻区；将所述的B细胞群分为多个B细胞亚群，每个亚细胞群平均可以产生1-100个不同种类的抗体；任选地，扩增B细胞亚群生产扩大的B细胞系；在适合保存亚细胞群RNA的条件下存储每一个细胞亚群，这样能够产生平均每个B细胞群可以表达1-100个不同种类的抗体的非永生化B细胞群库。该方法进一步包含下述步骤：制备与所存储的B细胞亚群相应的RNA样本；在RNA样本上，实现逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；分离对应于可以自然配对的VH区和VL区的DNA；在适合表达所述的VH区和VL区的宿主上克隆所述的DNA；并在免疫球蛋白重链和轻链存在的情况下表达所述的VH区和VL区，这样就可以形成自然配对的免疫球蛋白(Ig)。
本发明提供了一种分离靶标特异性抗体的方法，该方法包括：从曾被靶标影响的人类供体中获得B细胞，其中所述的B细胞群包含至少105不同种类的自然产生的与重链和轻链自然配对的抗体；将所述的B细胞群分为多个B细胞亚群，每个亚群平均可以产生1-100种不同种类的抗体；在所述的B细胞分泌抗体到培养基的情况下，扩增B细胞亚群以得到扩增的B细胞培养；将所述的分泌到培养基中的抗体分配到固体表面特定位置，建立抗体库阵列(ARA)；用天然靶标分子探测该抗体库阵列来确定一个或者更多对所述的靶标有特异性的抗体群；利用对应于对所述的靶标有特异性的抗体群的B细胞培养制备RNA样品；在众多RNA样品上实现逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；分离VH区和VL区对应的可以自然配对的DNA；在适合表达所述的VH区和VL区的宿主内，克隆所述的对应于VH区和VL区的DNA；在免疫球蛋白重链和轻链存在的情况下表达所述的VH区和VL区，这样就可以形成自然配对的免疫球蛋白。一些实施方案中，靶标为病毒，细菌，酵母，寄生虫，真菌或者其他病菌。一些实施方案中，靶标分子为病毒粒子，病毒样粒子，被病毒感染的细胞或者病毒蛋白质。在一个实施方案中，靶标为人类免疫缺陷病毒(HIV)。
在一方面，本方法进一步包括，提供了一系列靶标物，这些化合物包括多种类型靶标物和相同靶标的不同血清类型；并且可以确定可交叉反应的抗体。
本发明包括用以下任一方法制备的抗体库阵列(ARA)。
本发明提够了一种基于成簇的抗原决定基筛选抗体的方法，本方法包括：从对应某靶标蛋白的基因片段中得到基因片段抗菌素显示法(GFPD)库，其中GFPD库中的成员依照与一个或者多个抗原决定基团的关系归类成组；提供完整的靶标蛋白；提供从预先暴露在足量靶标下能引起免疫反应的实验者血样中取得的抗体库阵列(ARA)。用完整靶标分子和来自于靶标的有抗原决定基特异性的成簇的GFPD库成员探测该ARA；确定一个或者多个对所述的靶标有特异性的抗体群和至少一个抗原决定簇；利用对应于对所述的抗原决定簇有特异性的抗体群的B细胞培养制备RNA样品；在众多RNA样品上实现逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；分离对应与可以自然配对得VH区和VL区的DNA；在适合表达所述的VH区和VL区的宿主内，克隆所述的对应于VH区和VL区的DNA；在免疫球蛋白重链和轻链存在的情况下表达所述的VH区和VL区，这样就可以形成自然配对的免疫球蛋白。
在一方面，本方法进一步包括利用完整的靶标和GFPD库成员基于ARA的识别模式确定新的抗原决定基。该方法包括下述附加步骤：利用对应于对所述的抗原决定簇有特异性的抗体群的B细胞培养制备RNA样品；在众多RNA样品上实现逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；分离对应与可以自然配对得VH区和VL区的DNA；在适合表达所述的VH区和VL区的宿主内，克隆所述的对应于VH区和VL区的DNA；在免疫球蛋白重链和轻链存在的情况下表达所述的VH区和VL区，这样就可以形成自然配对的免疫球蛋白。
依据所述的方法，本发明涉及一种通过表达特定和克隆的VH区和VL区链制备的治疗性抗体。
本发明涉及一种制备基因片段噬菌体显示(GFPD)库的方法，其中该GFPD成员依照与一个或者多个抗原决定基关系是成簇存在的，通过以下方法实现：提供可以编码靶标蛋白的基因；将所述的基因分为基因片段；制备由GFPD库成员组成的噬菌体显示库；根据有靶标特异性的人类抗体淘选GFPD库；依据其与一个或者多个抗原决定簇的关系对GFPD进行分组。
本方法进一步包括：对GFPD库成员分组；将GFPD库成员覆盖到靶标物已知的三维结构表面，其中靶标物的功能是与部分已知的靶标物三维结构相关的。
本发明涉及一种检测两个或多个其中本申请描述的方法所确定的抗原决定簇之间协同作用的方法，该方法包括：制备表达VH区和VL区第一自然配对的免疫球蛋白，其中VH区和VL区序列得自于对不同抗原决定簇有特异性的抗体群；制备表达VH区和VL区第二自然配对的免疫球蛋白，VH区和VL区序列得自于对不同抗原决定簇有特异性的抗体群；在检测系统中分别和组合执行第一自然配对和第二自然配对的免疫球蛋白来测量完整靶标的活性；检测新的与已知功能相关的抗原决定基的活性或者协同作用活性。
本发明提供小分子和治疗性抗体制备，该抗体可以有效调整已结合有一个或多个以上所述的抗原决定簇的靶标的功能。本发明提供一种疫苗制备方法，包括对本申请所述方法决定的功能性抗原决定簇有效的抗体。
本发明提供一种由可转变细胞表面受体功能的治疗性抗体组成的试剂盒。
本发明提供一种可筛选具有特定功能的单克隆抗体的试剂盒，该试剂盒包括：由指向细胞表面特定靶标分子的抗体组成的抗体库阵列(ARA)；和任选地，通信细胞，其中通信细胞被改造成当与通信细胞表面激动剂或者拮抗剂接触时能够表达可检测性信号。
本发明和本发明的其他研究对象，特点和优点在以下具体实施方式、附附图和实施例中进一步说明。
附图说明
附图1是利用抗体库阵列来发现抗体过程的示意附图。
附图2是利用ARA平台技术发现抗HIV单克隆抗体过程的示意附图。
附图3是开发对应于人类基因的抗原决定基库的噬菌体显示法过程的示意附图。
附图4是利用全蛋白质或者病原体作为靶标和利用单个抗原决定级作为靶标筛选ARA过程的示意附图。
附图5是指向靶标上单个功能性抗原决定基的特异抗体群分离过程的示意附图。
具体实施方式
没有进一步细节描述的情况下，根据以下描述，本领域的技术人员能够将本发明进行充分扩展。以下描述仅为说明性描述，任何条件下不作为对本发明公开的其余部分的限制。
将被动抗体治疗应用于传染病治疗的功效和必要性已经被公众认可。(Keller and Stiehm.Clin.Microbiol.Rev.13：602-614(2000)；Oral HB.等人MoI.Biotechnol.21：225-239(2002)；Casadevall等人Nat.Rev.Microbiol.2：695-703(2004).)从病毒性传染病中康复的人和接种含有抗体群的治疗性疫苗的人可以获得对病毒的终身免疫。这些“天然抗体”有与人类免疫系统活动时产生的构想完全一致的成对的重链和轻链。它们与用重组细胞系统或者基因改造的小鼠系统产生的人类或者人类化抗体不同，它们不会复制由人类系统自然产生的抗体全长的“野生型”结构。
天然人类抗体库拥有发展新型单克隆治疗法的未开发潜力。天然人类抗体库有对人类疾病明确的免疫学解决办法，而且它很可能是临床应用上最安全的方法。尽管以前人们采用静脉内免疫球蛋白(IVIG；利用血浆中的自然IgG)的多克隆抗体疗法，本发明涉及一种更有效的新方法的开拓，涉及到克隆天然人类抗体的治疗潜力。目前已经构建出抗体库或者抗体阵列(参见US4829010和4591570，均通过在此引证全部并入本申请)；然而正如本申请所描述和声明的，目前没有任何人类自然抗体库或者ARA能够实质上包括所有人类天然免疫。
本发明提供一个用来发现抗体的抗体库阵列(ARA)。一方面，高通量、多元和可升级的平台可用于对给定供体或者供体库的抗体库做全面的探测。另一方面本发明提供了一个大型候选库，以提高检定有独特功能特点的高质量抗体的几率。
本发明涉及一种从抗体库阵列(ARA)的众多单克隆抗体中快速识别有特定功能抗体的方法。。一方面，高通量、多元和可升级的平台可用于对给定供体或者供体库的抗体库做全面的探测。另一方面本发明提供了一个大型候选库，以提高检定有独特功能特点的高质量抗体的几率。
受体是嵌入在细胞膜或者细胞质中，移动信号分子可能接触的蛋白分子。与受体结合的分子叫做配基，有可能是肽(比如神经传递素)、激素、药物分子、毒素或者抗体，当其与激动剂成键是，受体会发生能够引起细胞响应的构象变化。有些配基(比如拮抗剂)很少在不引起任何反应的情况下阻碍受体。配基诱导的受体变化会导致生理学上的变化，即配基的生理活性。
依据本发明受体包括：外周膜蛋白受体，跨膜受体，代谢性受体，G蛋白偶联受体(GPCR)，酪氨酸激酶受体，鸟苷酸环化酶受体，对胞外配基响应的离子型受体等等。跨膜蛋白可能包括一个或多个跨膜域。例如：酪氨酸激酶受体，一些细胞因子受体，鸟苷酸环化酶受体和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体包含一个单个的跨膜域。然而，包括离子通道和腺嘌呤环化酶的各种其他的蛋白质包含多个跨膜域。由于它们包含7个跨膜区，所以很多重要的细胞表面受体被归类为“七跨膜域(7TM)”蛋白，重要的跨膜蛋白受体包括但不限于：胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体，人类生长激素受体，葡萄糖输运，铁转蛋白受体，表皮生长因子受体，低密度脂蛋白受体，瘦素受体，白细胞介素受体，比如IL-I受体，IL-2受体等等。GPCR包括毒蕈碱乙酰胆碱受体，腺苷受体，肾上腺素受体，GABA受体，血管紧张素受体，大麻酯受体，胆囊收缩素受体，多巴胺受体，胰高血糖素受体，代谢型谷氨酸受体，组胺受体，嗅觉受体，阿片受体，视紫红质，分泌素受体，血清素受体，生长激素抑制素受体，钙感受受体，趋化因子受体，细胞因子受体，诸如此类。信号转换中会涉及到某些受体。
跨膜域的特征包括大约20个连续的被带电氨基酸跟随的疏水氨基酸。因此，基于特定蛋白质的氨基酸序列的分析，可以预测蛋白质内的跨膜域的位置和数量。
跨膜蛋白的胞外域是多种多样的，然而在各种胞外域多次重复发现保守序列。保守结构和/或功能已被归于不同的胞外主题。举例来说，细胞因子受体的特点是半胱氨酸簇和WSXWS(W＝色氨酸，S＝丝氨酸，X＝任意氨基酸)。免疫球蛋白样域是高度保守的。粘液素样域可能与细胞粘附有关，富亮氨酸重复参与到了蛋白-蛋白相互作用中。
与其他分子结合时会涉及到很多胞外域。一方面，胞外域就是受体。与受体域结合的因子包括循环配基，可能是多肽，蛋白质或者小分子，比如腺苷等等。举例来说，生长因子，比如EGF，FGF和PDGF是循环生长因子，会与它们的同源受体结合来引发各种细胞反应。其他影响因子包括细胞因子、有丝分裂因子，神经因子等等。
依照本发明，功能性单克隆抗体可以和细胞表面蛋白胞外特定域互相作用，并直接或者间接性的引发生物学反应。
激动剂可以激活受体并导致强烈的生物学反应。大多数自然配基都是全功能激动剂。相对于全功能激动剂来说，部分激动剂不会彻底激活受体，它们只能引发部分反应。拮抗剂可以与受体结合但是不会激活受体。这样就会导致受体阻碍，抑制其他激动剂的结合。反激动剂通过抑制受体基本活性，会降低受体活力。与受体结合的单克隆抗体有任一种或者多种所述的作用。
本发明使单个样品或者群体中痕量(105-106分之一，)抗体的灵敏检测成为可能。本方法中还提供了在短时间内(三个月或者更短时间)识别和确定靶标特异性天然人类抗体群的方法。
此外，本发明的方法允许在自然构象下，利用天然人类抗体，在自然配对的重链和轻链下对靶标分子进行探测，从而实现有靶标特异性的高质量抗体的筛选。
从人类供体得到的人类IgG+记忆B细胞
单个个体中，人类免疫系统包含1012B细胞纯系型和109以上的组合抗体(Jerne NK，Scand J Immunol.38(1)：1-9(1993))。然而，其中所用的B细胞群包含至少105不同种类的IgG抗体，优选至少106，更加优选至少107不同种类的IgG抗体，IgG抗体可以视为人类对疾病、机能失调和传染病抗原自然免疫响应的代表。每个供体中至少收集104B细胞。其中预期得到的人类天然抗体库和阵列充分包含完整的人类免疫系统对疾病、机能失调或者传染病响应时所可能产生的抗体，通常从10不同供体中收集至少105，优选至少106，更加优选至少107不同种类的自然产生的抗体。
静脉内免疫球蛋白(IVIG)含有从血浆中获得的纯化的自然人类抗体群，可以反映出其生成体的集体抗体免疫的情况。人们注意到，不同地域的供体库特定抗体的浓度不同。因此，本发明中供体库是由不同地域的供体中采集到的，从而提高靶标特异性抗体的多样性。
本发明中一方面，供体群包括未治疗过的患者，未被一般病原体感染的正常人，或者已经接受常规疫苗治疗的病人。
另一方面，本发明中所述瞄准特异性传染病病原体或人类疾病的抗体是人们期望的供体库，选择出来用于患有常见病的患者，或已被感染的或针对接种常见传染病疫苗的人。
实施方案中，供体被目标疾病感染，例如传染病，比如流行性感冒病毒，肝炎病毒C  (HCV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人类免疫缺陷病毒(HIV)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，埃-巴二氏病毒(EBV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，假单胞菌，假丝酵母；呼吸障碍如哮喘，过敏症，慢性障碍性肺病(COPD)，先天性肺纤维化(IPF)，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，代谢障碍比如虚弱，恶病体质，肌消失症，肥胖，血脂异常，代谢综合症，心肌梗塞(MI)，慢性肾衰竭(CRF)，骨质疏松症的肠易激综合征的消化系统紊乱(IBS)，炎性肠病(IBD)，克罗恩氏病(节段性回肠炎)，脂肪肝，纤维症，药物性肝病；神经障碍包括阿耳茨海默氏病(早老性痴呆病)，多发性硬化(MS)，帕金森氏症，牛海绵状脑病(BSE，疯牛病)；肿瘤包括乳腺癌，肾癌，胃癌恶性黑色素瘤，肺癌，结肠癌，神经胶质瘤，淋巴瘤和前列腺肿瘤。
在一个实施方案中，为确定治疗相关靶标的抗体的存在进行B淋巴细胞筛选，所述的靶标物包括与神经状况相关的多肽，细胞因子，趋化细胞因子，生长因子，粘附分子，共刺激分子，瘤细胞抗原，恶性肿瘤细胞抗原及其受体。
多肽与多种神经变性疾病相关，比如亨丁顿舞蹈症(HD)，帕金森氏症(PD)，阿尔茨海默病(AD)，和肌萎缩性侧索硬化(ALS)包括亨廷顿蛋白，重组人蛋白-1，雄激素受体，共济失调蛋白1，共济失调蛋白2，共济失调蛋白3，CACNA1A(钙离子通道，电压增益，P/Q类型，αIA亚单位)，共济失调蛋白-7，α-突触核蛋白(synuclein)，淀粉样前体蛋白(APP)，τ，β-淀粉样蛋白，低分子量神经纤维(LNF)，α-丝连蛋白，外周蛋白，N-Cor，mSin3a，CBP(c-AMP-应答元件结合蛋白)，α-衔接蛋白，α-1-抗胰凝乳蛋白酶，synphilin-1，泊蛋白，UCH-L1(泛素羧基端酯酶L1)，hip-1，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶-1，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶-2，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶-3，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶-6，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶-8，需钙蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，组蛋白乙酰转移酶2(HD AC2)，谷氨酰胺转移酶，多聚谷氨酰胺结合蛋白-1(PQBP1)，β-突触核蛋白，γ-突触核蛋白，SOD1，载脂蛋白E(APOE)，hip-1，早老素PS-I，和早老素PS-2。
细胞因子是各种多肽媒介物的一个统称，它与很多生理功能包括免疫系统和炎症反应的激活有关。细胞因子包含且不限于下述物质：白细胞介素(IL-Iα，IL-Iβ，ILIra和IL-2到IL-18)，肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)，干扰素(INF-α，β和γ)，克隆刺激因子(G-CSF，M-CSF，GM-CSF，IL-3和其他白细胞介素)和生长因子(EGF，FGF，PDGF，TGFα，TGFβ，BMP，GDF，CTGF和ECGF)。细胞因子包含且不仅限于：心营养素-1(CT-I)；CD27；CD27L；CD30Ki-I；CD30L；CD40L  (TRAP)；干扰素α(IFN-α)；干扰素β(IFN-β)；干扰素γ(IFN-γ)；干扰素ω(IFN-ω)；干扰素敏感基因15(ISG-15)；肥胖基因OB；白血病抑制因子LIF；淋巴毒素LT/TNFβ；巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)；巨噬细胞刺激蛋白-α(MSP-α)；巨噬细胞刺激蛋白-β(MSP-β)；移动抑制因子(MIF)；抑瘤素M(OSM)；RANKL；可溶性IL6 R复合物sIL6RC(gpl30+sIL6R)；可溶性Fas配体sCD95L；TNF I型受体TNF-RI；TNFII型受体TNF-RII；TNFSF-18；肿瘤坏死因子αTNF-α和TNFSF-12。
趋化细胞因子是对白细胞有激活或者趋化作用的细胞因子。趋化细胞因子受体属于G蛋白偶联受体组。举例来说，HIV进入宿主细胞需要趋化细胞因子受体，那么它们的拮抗剂就可以用于AIDS的治疗。趋化细胞因子包含且不限于：B-淋巴细胞趋化物(BLC)；趋化细胞因子受体(CCK-I)；皮肤T细胞虏获趋化因子CTACK；嗜酸细胞活化趋化因子-1；嗜酸细胞活化趋化因子-2MPIF-2；嗜酸细胞活化趋化因子-3 CCL26；神经趋化因子；粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)；MGSA；MIP-2α；MIP-2β；血液透析CC1(HCC-I)；血液透析CC4(HCC-4)；IFNγ诱导蛋白10(IP-I0)；IFN诱导T细胞α趋化细胞因子(I-TAC)；白细胞间介素-8(IL-8)；白细胞衍生趋化因子-2；Lungkine；淋巴细胞趋化因子(LPTN)；巨噬细胞炎症蛋白1α；巨噬细胞炎症蛋白1β；巨噬细胞炎症蛋白1δ；巨噬细胞炎症蛋白1γ；巨噬细胞炎症蛋白3α；巨噬细胞炎症蛋白3β；巨噬细胞衍生趋化因子(MDC)；单核细胞趋化蛋白-1(MCP-I；单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2)；单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)；单核细胞趋化蛋白-4(MCP-4)；单核细胞趋化蛋白-5(MCP-5)；IFNγ诱导的单核因子(MIG)；骨髓抑制因子(MPIF)；血小板碱性蛋白(PBP)；血小板因子4；肺部活化调节趋化因子(PARC)；RANTES(依赖激活T细胞分泌调节蛋白)；二级淋巴组织趋化因子(SLC)；间质细胞衍化因子1(SDF-I)；胸腺活化调节趋化因子(TARC)和胸腺表达趋化因子(TECK)。
生长因子包含且不限于酸性纤维原细胞生长因子(aFGF)；活化素βA；刺豚鼠相关蛋白(AGRP)；双调蛋白AR；血管生成素样因子(ALF)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；乙胞素因子；骨形态发生蛋白2(BMP2)；骨形态发生蛋白4(BMP4)；骨形态发生蛋白5(BMP5)；骨形态发生蛋白6(BMP6)；骨形态发生蛋白7(BMP7)；畸胎瘤衍生生长因子-1(CRGF)；表皮生长因子(EGF)；促红细胞生成素(EPO)；纤维原细胞生长因子17(FGF-17)；纤维原细胞生长因子18(FGF-18)；纤维原细胞生长因子19(FGF-19)；纤维原细胞生长因子2(FGF-2)；纤维原细胞生长因子4(FGF-4)；纤维原细胞生长因子6(FGF-6)；纤维原细胞生长因子7(FGF-7)；纤维原细胞生长因子8(FGF-8)；纤维原细胞生长因子9(FGF-9)；Flt3配体(Flt3L)；卵泡抑素(FSP)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞/巨噬细胞CSF(GM-CSF)；增殖分化因子11(GDF-11)；增殖分化因子15(GDF-15)；生长抑制特异性基因6(Gas-6)；肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)；肝细胞生长因子(HGF)；肝细胞生成素A(HPTA)；神经调节蛋白；调蛋白α；调蛋白β；IGF结合蛋白1(IGFBP-1)；IGF结合蛋白-2(IGFBP-2)；IGF结合蛋白-3(IGFBP-3)；IGF结合蛋白-4(IGFBP-4)；抑制素A；抑制素B；胰岛素样生长因子IA(IGF-IA)；胰岛素样生长因子IB(IGF-IB)；胰岛素样生长因子II(IGF-II)；巨噬细胞半乳糖特异性血凝素1(MAC-I)；神经突蛋白；神经秩蛋白；食欲素A；骨粘连蛋白；血清护骨素；血小板源性生长因子α(PDGF-A)；血小板源性生长因子β(PDGF-B)；催乳激素(PRL)；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)；可溶性GM-CSF受体(sGM-CSFR)；干细胞因子(SCF)；促血小板生成素(TPO)；胸腺介质淋巴细胞生成素(TSLP)；促胸腺生成素(Tpo)；转化生长因子α(TGF-α)；转化生长因子β1(TGF-β1)；转化生长因子β2(TGF-β2)；转化生长因子β3(TGF-β3)和血管内皮生长因子(VEGF)。
靶向细胞粘附分子和趋化因子/趋化因子受体作为白细胞溢出和迁移作用的调节物可以作为诸如类风湿关节炎和骨关节炎等慢性炎症性疾病的治疗方法。(Vergunst CE等人，Scandinavian Journal of Rheumatology 34：6，415-425.)细胞粘附分子(CAM)是在与其他细胞或者细胞外基质(ECM)结合，即细胞粘附过程中所涉及的一种位于细胞表面的蛋白质。大多数CAM属于以下四种蛋白家族：Ig(免疫球蛋白)总科(IgSFCAMs)，整合素，钙粘着蛋白和选择素。免疫球蛋白总科CAMs(IgSF CAMs)是亲同种抗原或异染性的，并与整合素或者不同的IgSF CAM结合。IgSF CAM包含且不仅限于：NCAM(神经元细胞粘附分子)；ICAM-I(细胞间粘附分子)；VCAM-I(血管内皮细胞粘附分子)；PECAM-I(血小板内皮细胞粘附分子)；L1；CHL1；MAG；结合素和结合素样分子。钙粘着蛋白家族的成员包括E-钙粘着蛋白(位于上皮)，P-钙粘着蛋白(位于胎盘1)和N-钙粘着蛋白(位于神经元)。选择素家族成员的例子有E-选择素(位于内皮)，L-选择素(位于白细胞)和P-选择素(位于血小板)。整合素是可以和细胞外基质相互作用的细胞表面受体，是很多胞外信号传递的媒介物。细胞粘附在传染病和神经障碍疾病中都有涉及。
共刺激性信号是一种在T细胞激活过程中使用的抗原非特异性信号，是细胞表面表达共刺激分子的抗原所在细胞和T细胞相互作用时产生的。(Tacke等人，Eur.J.Immunol.，1997，27：239-247.)由T细胞表达的共刺激分子CD28即是一个实例，它可以与APC细胞膜上的CD80和CD86相互作用。其他由T细胞表达的共刺激受体包括ICOS(可诱导共刺激分子)，CTLA-4和PD1。共刺激信号的抑制物可用于风湿性关节炎和肾移植期间的治疗，以及T细胞共刺激缺乏症的治疗，尤其是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)，血中丙球蛋白贫乏症，选择性免疫球蛋白不足，比如选择性IgA不足和普通可变性免疫缺陷(CVID)。
含有淋巴细胞的样本可以在不同时间点从病人供体采集。在一个实施方案中，从已经从靶标疾病恢复的病人体内采集淋巴细胞样本，恢复时间至少为1，5，10，15，20，25天，至少为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11个月，或至少为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10年。另一实施方案中，从目前患有靶标疾病的病人体内采集淋巴细胞，该病人在采集之前已经被诊断出患有靶标疾病至少1，5，10，15，20，25天，或者至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10月，或者1，2，3，4，或者5年。
为了制备供体特异性人类抗体库，需要从人体(病人供体)中收集含有B淋巴细胞的样品。举例来说，这个样品可能取自骨髓，血液，脾脏，淋巴结，扁桃体等等。外周血液单核细胞是最常见的样本来源，人们注意到，骨髓是单个个体成熟抗体库的完整“化石档案”，在脾脏内的单核细胞中IgG抗体存在的比例更高。初级人类B细胞的最好来源是脾单核细胞，扁桃体和外周血液单核细胞。(Olsson等人J.Immunol.Methods 61：17-32(1983)；Karpas A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1799-1804(2001))。
正如本领域技术人员所熟知的，本程序开始于从人类血液中分离外周血液单核细胞(PBMC)，通常是使用Ficoll梯度离心法。用B细胞选择性标记物比如anti-CD 19将PBMC染色。将染色的B细胞用流式细胞(计量)术进行分类。在本发明中，每5mL血液样本中可以获得约5-10x104B细胞。
克隆抗体生成B细胞
抗体生成B细胞可以在多孔板中进行培养。在一个实施方案中，96，384或者1536孔板的每个孔内为寡克隆，每个孔内含有一个以上B细胞克隆。一个孔容纳至少1，2，5，10，15或20不同的B细胞克隆，优选是1-100B细胞克隆。优选地，一个孔容纳10个左右不同的B细胞克隆。可以依据Love等人(Love et al.，Nature Biotechnology，24，pp.703-707(2006)(″Love″))的方法构建高密度库。优选地在微孔板内处理B细胞；更加具体的说是96孔，384孔或1536孔微孔板。使用微孔板(例如与使用Love的nano-format相比)的优点是便于B细胞的回收。人们预期，微孔板单个孔可以容纳多个B细胞，每个孔的多个B细胞可以生成不同的人类自然抗体。另一实施方案中，在一个96，384或者1536孔孔板的每个孔进行克隆，孔内平均包含有不超过一个B细胞克隆，这个实施方案在人类B细胞非永生化时为优选的。
在限制每孔稀释约10个细胞的情况下，将细胞分类到微孔板中可选的两个办法包括：从半固体培养基中挑选克隆(Davis，J.M.，等人J.Immunol.Methods 50，161-171(1982)；Rueda，A.Z.&Coll，J.M.J.Immunol.Methods 1 14，213-217(1988))和荧光激活细胞分类术(FACS；Herzenberg，L.A.等人.Clin.Chem.48，1819-1827(2002)；Carroll，S.& Al-Rubeai，M.Expert Opin.Biol.Ther.4，1821-1829(2004))。
任选地，B细胞克隆可以在孔板内任意扩增。在体外刺激B细胞会导致：细胞内生成更多免疫球蛋白mRNA，克隆扩增的细胞分离，从而提高释放到培养基中的可溶性免疫球蛋白生成量。
本文已经描述了多种体外有效刺激原始B细胞的方法。Zubler和他的同事们(Wen等人，Eur J.Immunol.198717：887)描述了在B细胞培养中利用EL4亚克隆突变株EL4-B5作为刺激物/饲养细胞的方法。Banchereau和他的同事们(Valle等人，Eur J Immunol.1989 19：1463)描述了拮抗剂anti-CD40单克隆抗体的使用，用于呈现Fc-γ受体表达用作饲养细胞的成纤维细胞。最近，CD40L转染细胞系已经用于刺激物/饲养细胞(Armitage等人，Nature.1992 357：80和Spriggs等人，J Exp Med.1992 176：1543)，此外应用的还有CD40L可溶性片段的重组细胞(Hollenbaugh等人，EMBO J.1992 11：4313和Mazzei等人，JBiol.Chem.1995 270：7025)。美国专利5540926描述了一种有助于B细胞增殖的方法：将激活的B细胞暴露在体外直至达到可溶性gp39蛋白的有效浓度。在用美国商陆有丝分裂原或者EBV使杂种细胞融合前用增殖的刺激物处理初始B细胞。(Olsson等人J.Immunol.Methods 61：17-32(1983)；Butler JL等人J.Immunol.130：165-168(1983))。美国专利5851531描述了一种用含有美国商陆(Phytolacca americana)血凝素的美国商陆有丝分裂原刺激B细胞的方法。已知含有未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸具有免疫刺激作用，尤其是在基础环境(CpG motifs)下，对人类白细胞有高度的刺激作用，会引起B细胞的增殖。(Krieg，1999 Biochim.Biophys.Acta 93321：1-10；Krieg，A.M.，Applied Antisense Oligonucleotide Technology，24：431-448(1998)).
通过刺激B细胞，能够使可溶性免疫球蛋白释放到培养基中，从而使工作人员可以方便的筛选B细胞培养以确定抗原特异性重链抗体的存在。例如，人们可以通过从细胞中去除条件培养基来检测条件上清液，用免疫配置中的部分或者全部样品对培养基中的免疫球蛋白的浓度进行定量，显示其中已被刺激B细胞的细胞培养。这样使人们在后续的免疫球蛋白基因克隆步骤中，能够排除未成功刺激的B细胞群。
B细胞克隆的永生化
能产生人类天然抗体的初始人类B细胞能够通过EBV转换，形成杂和细胞或者重组的方式在原位实现永生化和堆积。克隆这些抗体的杂和细胞法有很多潜在的优势，包括操作方便，抗体表达产量高和自然构象下捕获抗体的能力强。
B细胞克隆可以通过本领域内熟知的技术方法进行扩增，如杂交瘤细胞技术的使用，举例来说，Harlow等(Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988))和Hammerling等(Hammerling，等人，在：Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))都做过相关描述。
在改进的杂交瘤细胞生成法中，Dessain等(J.Immunol.Methods 291，109(2004))证明通过使用可以表达人类端粒酶(hTERT)和鼠白细胞介素-6(mIL-6)的鼠融合伙伴细胞系(MPT)能够产生稳定的人类B细胞杂交细胞。
另一个熟知的扩增人类B细胞系的方法是用EB病毒(EBV)转化。生成EBV转化B细胞系的实验方案在本领域内很知名，比如《Current Protocols in Immunology》(Coligan等人，Eds.，1994，John Wiley & Sons，N.Y.)第7章22节中概述的方案，也全部纳入了参考资料。在进行EBV转化前一般需将组织制作成单细胞悬浮液。此外，会在含有B细胞的样本溶液中执行物理去除T细胞或者灭活T细胞(例如用环孢霉素处理)的步骤，因为从抗EBV抗体血清反应呈阳性的个体中取得的T细胞会用EBV抑制B细胞永生化。
通常，将EBV接种到人类B细胞样本中培养3-4周。典型的EB病毒来源是B95-8细胞系(ATCC#VR-1492)培养上清。通常EBV转化的物理特征在3-4周的培养周期结束后可以看到。利用相差显微镜观察，转化细胞呈现个大，清晰，多毛的特征，并倾向于聚集成紧密的细胞簇。初始条件下，EB病毒系一般是多克隆的。然而，细胞培养时间过度延长的话，由于特定B细胞克隆的选择性生长，EB病毒系可能变成单克隆或者多克隆。或者多克隆EB病毒转化系可能是亚克隆的(例如通过控制稀释培养)，或者用合适的融合伙伴融合并至于限制稀释的平板上以获得单克隆B细胞系。用于EB病毒转化细胞系的适宜的融合伙伴包括小鼠骨髓瘤细胞系(例如SP2/0，X63-Ag8.653)，异源骨髓瘤细胞系(人鼠杂交，例如SPAM-8，SBC-H20和CB-F7)和人细胞系(例如GM1500，SKO-007，RPMI 8226和KR-4)。
在一个最近改进的EB病毒永生化方法中，在EB病毒暴露之前，先用CpG寡核苷酸刺激人类初始CD 19+IgG+B细胞。(Hartmann and Krieg.J.Immunol.164：944-953(2000))。
以上过程可得到一个克隆扩增的IgG+记忆B细胞培养库，每个细胞培养都能产生1，2，3，4，5和/或10种不同的IgG。每个孔板内的杂合细胞或者EB病毒永生化细胞可以被存储作为特异性抗体种类的来源。
作为抗体源的非永生化B细胞库
在分析上清液之前需从相应的B细胞分离出条件上清，上清液分析期间，所有B细胞培养都要保存好。这样孔板内原始B细胞培养中的对应于重要抗体的B细胞可以重新获得，并用本领域内技术人员熟知的方法来拯救人类自然IgG编码的mRNA。本发明建立了这样一个B细胞库，每个对应于特定抗原特异性和/或每个代表1，2，5，10或者20能产生B细胞的人类自然IgG能够克隆，堆积和存储(例如作为冷冻颗粒)。
已除去用于分析的条件上清的B细胞颗粒在条件上清分析期间可以用多种方法存储：用适合于存储活哺乳动物细胞的介质(即含有10％DMSO细胞培养基)以完整的冷冻细胞的形式存储，用RNA保护性细胞裂解液裂解细胞颗粒，以冷冻细胞溶解产物的形式(也就是TRIzol
Figure BPA00001332393800301
Invitrogen(Carlsbad，California))来存储，或者不降解细胞的情况下，在室温或者更低温度下在防RNA降解的缓冲液中存储(也就是RNAlater
Figure BPA00001332393800302
Ambion(Austin，Texas))。
从原始定义的单个人类B细胞克隆和表达抗体的策略是本领域所已知的(Wardemann等人，Science 301：1374-1377(2003))。依据本发明的后续发展，RNA是从存储的B淋巴细胞中分离得到的。所得的RNA是从免疫库中挑选出来的核酸的集合，其中含有编码人类自然免疫球蛋白的mRNA。在本发明中，事先挑选免疫球蛋以便结合重要的抗原。分离RNA的方法在本领域内也是已知的(Liedtke等人PCR Methods Appl.1994 Dec；4(3)：185-187)，如TRIzol
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试剂(Invitrogen)。从非永生化抗原特异性B淋巴细胞中能够获得足量的RNA以用于RT-PCR中抗体的拯救。
利用可以与编码抗体基因的核酸序列侧链杂交的种群特异性寡核苷酸，像单细胞逆转录PCR这样的方法可以用于扩增重链和轻链变异核酸序列或其碎片(Coronella，等人(2000)Nucleic Acids Res.28(20)：E85)。举例来说，利用人类特异性寡核苷酸，人类变异的重链和轻链抗体域可以利用PCR扩增(参见Sblattero and Bradbury Immunotechnology 3：271-278(1998))。扩增的序列可以用DNA序列表征，作为单个序列在表达系统中直接克隆。从单个B细胞扩增常规的4链抗体的免疫球蛋白的其他技术在Takahashi等(Takahashi等人，Journal of Biotechnology 49(1996)，201-210)和Embleton等(Embleton等人，Nucleic Acids Research，Vol.20，No.15，3831-3837)的文章中均有描述。Tiller等(J Immunol Methods.329(1-2)：1 12-124(2008))描述了用嵌套RT-PCR扩增单个人类B细胞克隆转录得到的重链和对应轻链的方法，该人类B细胞可以用荧光活性细胞分类法获得。
接下来，被扩增的核酸序列可以引入到合适的表达体系中存储和进一步的使用。在表达体系中生成重组蛋白，如抗体，的方法是本领域所熟知的。通常，在宿主细胞中编码抗体的核酸序列能够以一种适宜表达抗体或其片段的形式被插入到重组表达载体中。适宜的表达形式要求重组表达载体含有一个或者多个与编码抗体或其片段的核酸相关的调控序列，在某种程度上此序列会允许从核酸到mRNA的转录过程和mRNA到蛋白质的翻译过程的进行。调控序列可能包括启动子，增强子和其他表达的调控元件(例如Poly A信号)，这是本领域技术人员都熟知的(Goeddel D.D.，ed.，Gene Expression Technology，Academic Press，San Diego，Calif.(1991))。应该理解解表达载体的设计可能会受转染宿主细胞的选择和/或所要求的表达水平不同这些因素的影响。
在一个实施方案中，为进行免疫球蛋白的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)拯救，将为RT和PCR实验准备的新制的引物与酶/核苷的主混合物加入到所有孔内，孔内有新解冻的PCR扩增条，扩增条内有在-80℃下存贮的B细胞。利用相同或者不同的合适的3’端引物，使cDNA的逆转录反应和PCR扩增相继在同一个管内进行。如领域内技术人员所知，反应在温度循环器下进行。一旦RT和PCR实验开始，立即开始反应混合物的分析(例如，用SYBRSafe的荧光染色琼脂糖凝胶)。PCR是一种有纯化作用的扩增。例如，利用Qiagen PCR净化离心柱，在合适的限制酶作用下扩增元可以被纯化和消化，消化物通过琼脂糖凝胶纯化，如Qiaquick的凝胶萃取试剂盒(Qiagen)。这样，与人类自然免疫球蛋白轻链和重链对应的DNA就被捆绑到预先消化的含有诱导性启动子的表达载体中，周质空间领导人信号采用标准方式。用电穿孔的方式将捆绑混合物引入到感受态细胞中，在选择培养基上培养。采用两个引物分别退火克隆位点的5′和3′的克隆PCR法，筛选单个克隆以确定插入质粒的克隆，用SYBR Safe琼脂糖凝胶染色法检测PCR扩增长度。轻链和重链基因的克隆可以通过测序进行证实。我们计划建立一个从每个人类有效供体采集至少104记忆B细胞从而建库的方法，制备人类B细胞群，其中B细胞群含有至少105不同种类的自然生成的抗体，每个抗体都有成对的重链和轻链；将所述的B细胞群随机分入不同B细胞亚群，每个亚群平均可以产生1-100不同种类的抗体；扩增每个B细胞亚群从而产生一个扩增的B细胞培养；在适宜保存其RNA的条件下，储存每个B细胞亚群，这样可以生成一个每个群平均可以表达1-100不同种类的抗体的非永生化B细胞群库。接下来，我们计划制备与所存储的B细胞亚群相应的RNA样本，对RNA样本进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；分离对应于可以自然配对的VH区和VL区的DNA。再下一步，我们计划在可以表达所述的VH区和VL区的宿主内，克隆所述的与VH区和VL区对应的DNA，在免疫球蛋白重链和轻链存在的情况下表达所述的VH区和VL区，就可以形成一个自然配对的免疫球蛋白。
对克隆人类自然IgG基因的抗原反应活性筛选可以在用于测序的相同细胞培养复制上进行。在抗原覆盖的ELISA平板上，细胞培养的萃取物可以平行地被筛选结合。
筛选抗原特异性抗体的B细胞库
利用免疫测定的B细胞条件上清来检测连结免疫球蛋白的抗原，允许人们检测哪个孔内含有被刺激的可以编码与抗原连结的免疫球蛋白的B细胞。本领域中的技术人员均能够获得选择性免疫球蛋白免疫测定所需要的试剂。例如，这样的试剂包括但不限于针对抗体轻链和/或重链的多克隆或者单克隆抗体。制备和表征这种多克隆或者单克隆抗血清的方法是本领域内的技术人员所熟知的。Daley等(Clin Diag Lab Immunol.2005 12：380)在其文章中对适用于检测标记物的非限制性试剂进行了描述。
被刺激的B细胞将可溶性免疫球蛋白释放到培养基中，使得人们可以方便地对B细胞培养进行筛选来确定抗原特异性重链抗体的存在情况。例如，人们除去细胞的条件培养基，可以检测条件上清，用免疫测定中用来定量培养基中免疫球蛋白浓度的全部或者部分样本研究哪个被刺激的细胞培养内含有成功刺激的B细胞。这使人们在后续的免疫球蛋白基因克隆步骤中能够排除未成功刺激的B细胞培养。这样的筛选方法的应用，允许人们关注唯一相关B细胞克隆的免疫球蛋白基因的下游克隆(抗原特异性人类自然免疫球蛋白生成细胞)。
有机会获得被刺激的B细胞条件上清使人们能够筛选能够生成具有理想功能特点的免疫球蛋白的B细胞克隆，例如在可疑抗原处，能够中和受体/配基相互作用，对受体激活有激动或者拮抗作用，有高抗原连结亲和力，或者能够抑制酶的活性。对这些特性的筛选可以在从B细胞培养条件上清中分离得到的抗体上进行，但是在条件上清本身中进行更加方便。筛选包含有B细胞条件上清的抗体，以确定以上提到的活性类型的方法是本领域技术人员所知悉的。多相实验法(比如平板，珠，微阵列和生物测定免疫测定中的显色，荧光和放射性信号)和均相实验法(比如LANCE，Alphascreen
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或者用共焦成像系统例如ABI′s FMAT
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或者Evotech′s Opera)二者都适用于结合及活性测定。关于亲和测定方法，举例如生物测定方法，表面质膜回声方法或者悬臂式MEMS方法和速率(rate-off)选择性免疫测定方法(Friguet等人，J Immunol Methods.198577：305)作为非排他性例子曾被提到。
在一个实施方案中，在克隆扩增前筛选可以产生抗体的B细胞。Love等[Nature Biotech.24(6)：703-707(2006)]描述了一种用于微型雕刻的软性印刷技术，它采用密集的含有单个细胞的微孔(每个0.1-1nl)排列来打印相应细胞分泌的分子排列。这些细胞在打印之后继续培养，这个微阵列以类似商业化的蛋白质或者抗体微阵列相似的方式被探测。该方法使人们实现了显示出期望特征的细胞快速确定，这些特征包括抗原特异性抗体的分泌和其随后恢复为克隆扩增。
由B细胞培养上清所产生的抗体可能被检验用于免疫特异性连接，其方法是本领域技术人员熟知的。可以应用的免疫测定包括且不限于竞争性或者非竞争性试验体系，仅举几例：western印记，放射性免疫测定，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“三明治”免疫测定，免疫沉淀反应检测，沉淀素试验，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散试验，凝集试验，补体结合试验，免疫放射性试验，荧光免疫测定，和蛋白A免疫试验等。以上试验方法为常规手段并且是本领域知悉的。(参见Ausubel等人，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，在此通过引证全部并入本申请)。
生成抗体库阵列(ARAs)
ARA的原材料通过培养永生化克隆产生分泌IgG抗体来生成。人类免疫球蛋白分泌可以用ELISA试验的标准技术(E.Harlow，D.Lane，Antibodies：A laboratory manual.(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988))来分析。在一个实施方案中，标准96孔板或者384孔板的孔内附着有原始重链和轻链特异性抗体兔抗人类IgG。该抗体，与辣根过氧化物酶结合后，只能在1∶3000磷酸缓冲盐/0.1％牛血清白蛋白溶液中次要应用。这些试验方法是由使用显色底物的标准技术发展而来的。
每个孔内扩增的B细胞培养表达的B细胞培养上清可用来建立抗体库阵列(ARA)。典型地，104到105个特点，优选的5x104个特点一式两份被印记到每个ARA上。几个这样的印记技术是本领域中知悉的。
在不丢失ELISA微阵列活性的情况下，人类免疫的典型ARA的形成要求将抗体固定化在固体基质上。在结构上蛋白质是比DNA更复杂的分子，由于其疏水性和与表面的离子相互作用，当其被固定到固体基质上时它可能解开折叠，失去活性。在烘干过程中，也有可能使蛋白质变性。微阵列ELISA的抗体捕捉是在低体积(0.3到1nL)下印记的。由于印记体积下，抗体捕获点干得非常快，长时间的存储通常需要芯片被预先干燥。当抗体比大多数蛋白质都稳定时，由于干燥和存储仍然有可能会丧失活性。
目前有三种将抗体连结到载玻片上的固定化化学范畴：(i)物理吸附，(ii)活性基团通过共价键结合，(iii)载玻片上功能基团与抗体之间的亲和相互作用。(Reviewed in Seurynck-Servoss SL等人，Frontiers in Bioscience 12：3956-3964(2007).
(i)蛋白质的物理吸附能够通过在蛋白质和载玻片表面覆盖的物质之间的疏水作用或者离子相互作用进行，这些物质包括琼脂糖，聚丙烯酰胺，硝化纤维，聚-L-赖氨酸，或氨基硅烷。虽然这是一种简易的固定化技术，但其不容易控制，而且可能导致高可变性和表面抗体分子取向任意的不理想情况。抗体被随便的固定化到表面可能会导致结合到抗体区的抗原直接吸附到玻璃表面，因此很难接近。
(ii)共价连接是通过功能基团连接的，功能基团包括赖氨酸或者精氨酸的伯胺基团，半胱氨酸铰链区的活性硫醇基团或者与恒定区(Fc)H2域连接的碳水化合物，其中恒定区可以用于将抗体永久固定在表面上。尽管通过硫醇或者碳水化合物的附着允许抗体直接定位，但附着的流程却更加复杂。在附着到表面之前，必须减少二硫键或者必须氧化碳水化合物组。这些氧化还原反应会破坏抗体结构，降低活性，还可能需要额外的纯化步骤。
最常用的用于抗体共价固定化的表面化学是环氧化物，醛类和N-羟基琥珀酰亚胺酯，它们都可以与蛋白质表面的伯胺反应。附着在表面的肼通过碳水化合物残余粘附，附着在表面的顺丁烯二酰亚胺通过硫醇基残余粘附。
(iii)通基于亲和相互作用的抗体永生化典型实例是利用抗体独特的官能团或者蛋白质序列为抗原结合位点定位。目前用于亲和抗体永生化的技术有：(i)蛋白质A或G涂片，其对抗体的Fc区域有高亲和力(Kusnezow，W.&J.D.Hoheisel：Journal of Molecular Recognition，16，165-176(2003)；Anderson，G.P.，等人Biosensors and Bioelectronics，12，329-336(1997))或者(ii)对抗体独特标记有特异性的亲和载玻片(Cha，T.，等人Proteomics，5：416-419(2005)；Wingren，C，等人Proteomics，5：1281-1291(2005))。通过Fc特异性抗体实现固定化是很有吸引力的，因为商业化的单克隆抗体不需经过任何进一步处理就可以使用。蛋白质A和G在抗体种类和缓冲条件上是变化的。因此，在所有条件下用蛋白质A和G固定化所有抗体可能是不可能的，可能需要换用抗人类Fc抗体。
链霉生物素-亲和素相互作用有很高的亲和力，研究显示通过链霉生物素或者生物素-亲和素相互作用的抗体固定化可能导致高度敏感试验(Delehanty，J.B.&F.S.Ligler.Analytical Chemistry，74，5681-5687(2002))。然而，有必要用生物素化抗体在链霉生物素或者抗生素图层的载玻片上进行捕获。生物素可以以化学法加入。含有聚L-赖氨酸斑的抗体阵列利用交联层附着在玻璃表面(Haab，B.B.等人Genome Biol.2，research 0004.1-0004.12(2001))，含有聚L-赖氨酸斑IgG阵列(CEL Associates，Pearland，Tex.)利用光反应交联层(Molecular Biosciences，Boulder，Colo.)或者聚丙烯酰胺凝胶(Packard Bioscience，Meriden，Conn.)或者已经描述过的载玻片(Miller，JC等人Proteomics 3，56-63(2003))。
然而典型的ARA含有每个孔板内扩增B细胞培养表达的B细胞培养上清，可以同样包括待检测的靶标抗原的阳性对照，条形码和关于ARA组成的相似识别信息。
在一个实施方案中，我们计划在ARA的每个斑点或者位点用一个以上独特抗体对ARA进行印记或者定位，优选至少每个点一个抗体克隆，更加优选每个点1-50个抗体克隆，再更加优选是每个点10-20个抗体克隆。
筛选用于靶标连结的ARA
可以采用天然蛋白质，多肽或者其他包括各种试剂和疾病条件在内的抗原性分子探测方法来筛选ARA。Haab BB(Molecular & Cellular Proteomics 4：377-383(2005))撰文评论了各种筛选方法。利用抗体库进行高通量筛选和蛋白质定量分析的方法是本领域知悉的。(Chaga GS 441：129-151 in Tissue Proteomics，B.C-S.Liu and J.R.Ehrlich eds.，Methods in Molecular Biology (2008)Springer-Verlag(NY)；Cahill D.，Journal of Immunological Methods，250(1-2)：81-91(2001)；Sanchez-Carbayo M.，Clin Chem.52(9)：1651-1659(2006))。Sanchez-Carbayo(Sanchez-Carbayo M.，Methods MoI Biol.428：263-87(2008))和Kopf等(Kopf等人，Int J Biochem Cell Biol.39(7-8)：1305-1317(2007))撰文讨论了抗体阵列在肿瘤蛋白质组学方面的应用。
ARA可能包括附着在微阵列表面的抗体。用结合到可检测化合物上的目的抗原对ARA进行探测(interrogate)，化合物举例如下：荧光标记化合物，化学发光标记或生物发光标记，或者是将酶的底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)添加到ARA内，并作用一段时间，然后检测适宜抗体的存在。在将目的抗原添加到以涂层的孔内后，可能还会添加连接有可检测化合物的第二个抗体。任何可用于检测的合适的标记物或者筛选工具都可以用于此项探测(interrogation)。本领域的技术人员能够知道那些能够被改进以提高可检测信号的参数和其他本领域内已知的ELISA参量。关于ELISA的进一步讨论，参见Ausubel等撰写的《Current Protocols in Molecular Biology》。(Ausubel等人，eds，(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，section 1 1.2.1.)。
在一些实施方案中，可以直接用全病毒或表面表达抗原的细胞对ARA进行筛选。本实施方案中病毒或者细胞被固定化在ARA内，可以被任何已知的，包括以上所讨论的，检测技术检测。
抗原对抗体的亲和力和抗原-抗体相互作用解除率可以通过竞争性结合试验测量。一个竞争性结合试验的实施例是放射性免疫测定，它包括：在未标记抗原数量上升的情况下，用目的抗体培养标记抗原(例如3H或125I)，检测结合到标记抗原上的抗体。目的抗体对特定抗原的亲和力和结合解除率可以用Scatchard点分析的数据来确定。和第二抗体的竞争也可以用放射性免疫测定法来检测。在本实施方案中，在未标记的第二抗原数量上升的情况下，用结合有标记化合物(例如3H或125I)的目的抗体培养抗原。
对应ARA“hits”孔板内对抗体生成克隆的拯救
永生化的抗体生成克隆可能会通过限制稀释培养被解缠绕，然后用反拯救ELISA进行阳性抗体检测。生产针对特定抗原的人类自然抗体的B细胞克隆被连续稀释直至达到每孔内一个B细胞的浓度，然后用反IgG捕获ELISA法筛选所期望抗体的生成。这样单个抗体生成B细胞杂合细胞对特定抗原的特异性就可以被确定和分离出来。
在一个实施方案中，所期望的人类自然抗体的“拯救”涉及到在合适的宿主细胞内自然配对的克隆重链和轻链的表达。Coronella(Nucleic Acids Res.28(20)：E85(2000))发现了用FACS从单个B淋巴细胞中分离人类免疫球蛋白重链和轻链并进行扩增的方法。用嵌套RT-PCR方法，Coronella(2000)记述了一种在体内重新产生成对的来自大量细胞的VH区和VL区的方法。Tiller(J.Immunol Methods.329(1-2)：112-124(2008))也描述了扩增重链和相应轻链基因转录产物的方法，其中轻链基因转录产物是从单个人类B细胞克隆中利用嵌套RT-PCR用荧光激活细胞分选法得到的。Tiller(2008)进一步描述了体细胞变异Ig基因到原细菌系基因的回复突变，将免疫球蛋白基因从单个人类B细胞克隆到真核表达载体，在人类肾细胞系产生重组抗体。其中将Coronella(2000)和Tiller(2008)的方法全部纳入了参考范围。可以用如ELISA法和荧光免疫检测法对自然配对的人类抗体重组体进行筛选。通过此法，能够获得表达人类自然配对免疫球蛋白的细胞系。本发明涉及到人类Ig重组体和表达重组体Ig的细胞系，其中重组体Ig包括轻链和重链的自然配对。
抗体表征和铅的选择/验证
一旦B细胞杂合细胞或者EBV永生化克隆被确定为能够生产预期种类的IgG，永生化的B细胞系就可以采用领域内的标准方法进行产生毫克级的所谓的″hit″抗体的大规模生产(参见Monoclonal Antibody Production，The National Academies Press(1999))。
这样的永生化B细胞系可以利用单个抗体生成克隆的VH区和VL区基因的拯救进行表征。额外的步骤，比如用本领域已知的方法进行VH区和VL基因的克隆和测序，可以被用于此新型永生化B细胞系的增殖。
利用ARA平台发现新的功能性抗原决定基
本发明的抗体库阵列(ARA)提供了一个高通量平台，促进新的功能性抗原决定基的确定和被保护实验者的B细胞中相应人类单克隆抗体(mAbs)的确定。这个平台为发现能在自然构象下结合靶标的人类Abs提供了可能。抗体库可以在被不同mAb结合的抗原或者自然靶标的不同抗原决定基下生成。由于给定蛋白质或者抗原的不同抗原决定基与靶标蛋白质的不同功能特点有关，此ARA平台可以实现被人类免疫系统瞄准的多功能抗原决定簇的鉴定。典型的，ARA平台可以用于筛选几百个被特定疾病的特异性抗体影响的人类对象。由于每一个对象可以提供大约105IgG种类，此ARA平台在生产高通量mAb库方面非常有用，mAb能够瞄准几乎所有被人类免疫系统瞄准的功能性抗原决定基。由于ARA平台允许基于成百上千的供体样本的快速筛选，该高通量方法实现了在低试剂使用量下的微阵列筛选。
在本发明的一方面，ARA平台用于恢复～107种对抗滤过性毒菌靶标，比如附图2所示的人类免疫缺陷性病毒(HIV)，的重组IgG种类。在该实施例中，涉及到的从暴露在HIV下的实验对象中采集的血液样本和含有IgG+记忆B细胞。在多孔平板上培养单个的B细胞，实现克隆扩增和抗体分泌细胞分化。ARA是通过人体B细胞培养中IgG的永生化形成的。用HIV感染相关的自然滤过性毒菌靶标筛选该ARA。这些靶标可能是从所有病毒粒子或者病毒样蛋白质，单个蛋白质(例如表面蛋白或者包膜蛋白)或者被HIV感染的细胞中筛选出来的。确定ARA靶标连结点对应的B细胞培养，从细胞培养分离得到的B细胞裂解物中拯救IgG重组体。
采用ARA平台技术，抗HIV单克隆抗体发现的方法提供了符合潜在保护性抗滤过性病原体反应的人类IgG+记忆B细胞生成的存档，该筛选是在靶标的自然构象下进行的，因此能产生更多的相关结果。
在本发明的一方面，实现了假设得自不同种类HIV变形或者相同靶标蛋白质内的多靶标的平行筛选。这使得其可以利用广泛交叉反应鉴定抗体。
对应给定靶标上单个抗原决定簇的抗体的发现
erbB2致癌基因可以编码生长因子受体，生长因子受体的过度表达与侵袭性肿瘤和不良预后有关。有些指向该分子的抗体在体内有抗癌作用，但是有些却没有。利用计算机指导的蛋白质工程和定点突变，对erbB2基因上抗原决定基结合作用的抑制(HERCEPTIN
Figure BPA00001332393800421
)和非抑制作用(HF)分析揭示了两种不同的结合相互作用。(Wang等人MoI Immunol.(2004)40(13)：963-969)。非抑制作用抗体HF只能识别erbB2胞外域(ECD)的N末端，然而抑制作用抗体HERCEPTIN
Figure BPA00001332393800422
结合到其专有的C末端。
ARA筛选平台可用于指向给定靶标不同抗原决定基的抗体鉴别和表征。这使得具有与抗原决定簇结合的特异性功能有潜在活性的抗体的发现成为可能。
在本发明的这一方面，噬菌体显示库的成员可以表达由给定靶标基因片段表达的部分蛋白质，该库可以用于确定对给定靶标产生假定免疫反应的抗原决定基库。在一个实施方案中，靶标的功能性测试和其他标准技术，比如如定点突变，可以结合起来用于具有特异性功能的单个或者组基因片段关系的分析。
由噬菌体显示提供的基因片段决定了抗原决定基特异性，此ARA筛选平台可用于使抗靶标Abs成簇。从功能性抗原决定簇得到的Abs代表样本的详细表征(如测序sequencing)可用于进一步揭示相互作用的特点，该特点可能可以积极或者消极用于与每个抗原决定簇相关的功能。
在本发明的一方面，两个或者更多抗原决定簇的成对分析可用于确定潜在的或者隐藏的功能性抗原决定基。这些隐藏的抗原决定基可能可以促进与不同抗原决定基得结合，或与已知功能相关的功能。该方法允许对抗原决定基间隔的扩展，基于之前的方法在文献中抗原决定基间隔被比喻成唯一可用的东西。
在一个实施方案中，如附图3所示，可以生成噬菌体基因片段显示(GFPD)库。利用本领域已知的方法可以生成一个噬菌体基因片段显示表达库。(参见Silverman G.J.，第20章：Construction and Selection from Gene Fragment Phage-Display Expression Libraries，in Phage Display：A Laboratory Manual by Carlos F.Barbas III，Dennis R.Burton，Jamie K.Scott，Gregg J.Silverman，
Figure BPA00001332393800431
CSHL Press，2004)基因片段是通过核酸内切酶降解可以编码给定靶标基因得到的。通过将基因片段插入到噬菌体的基因组DNA中，在噬菌体表面表达部分靶标蛋白质的方法，就可以产生一个GFPD库。通过在指向靶标的人类抗体上筛选GFPD库，获得了一个包含有被恢复的基因片段的人类抗原决定簇库。对应不同抗原决定簇A、B、C等的基因片段(GFPD库的成员)被分别定义。在一个实施方案中，将基因片段覆盖在已知三维结构的靶标蛋白质上，以确定基因片段对应的特定抗原决定基。
在ARA平台上，利用完整的蛋白质或者病原体靶标进行的筛选通常能够形成众多hit，如附图4所示。用与抗原决定基A、B、C等对应的GPDL成员完成同来源ARA的进一步筛选。通常，每个抗原决定基筛选2-3个GPDL成员，尽管可被筛选的抗原决定基对GPDL成员数没有任何上限。Hit形式的比较对用被抗原决定基特异性基因片段簇产生的完整蛋白质也可以揭示以前未发现的新型抗原决定基。优选地，抗原决定基特异性基因片段和完整靶标都可以被抗体识别出来。因此，成千上万个特定靶标抗原的hit可以被分解为10，20，30，40或者更多的对应抗原决定簇的抗体“族”(“families”)。抗体可以通过与可以识别新型抗原决定基的抗体VH区对应的基因测序来进一步表征。
附图5为用ARA平台来确定功能性抗原决定基抗体的步骤的示意图。功能相关的筛选得到已知的和新确定的抗原决定基的典型的抗体在VH区被排序并拯救，以用于进一步的开发。用这个方法可以确定适合于治疗方法发展和对靶标特异性功能有效地主动和被动疫苗开发的独特抗体。本发明同样涉及特异性抗体库，抗体和对本发明方法中抗体对应的特异靶标有效地治疗方法和疫苗。
利用ARA对进行抗体功能筛选
哮喘是一种复杂的肺部传染病，其可以用气道高反应性(AHR)，嗜酸性粒细胞炎症，粘液分泌过多，皮下纤维化，IgE水平升高来表征。白细胞介素13(IL-13)是哮喘过敏性反应效应阶段的关键媒介物。(Huang SK，等人J Immunol.(1995)；155(5)：2688-2694)。抗IL-13抗体在治疗阻碍其相关信号途径的哮喘方面非常有用。(WO/2005/062967)。IL-13同样与霍奇金病(HD)相关，研究发现其在HD细胞系中过量表达。(Kapp，U.，等人J.Exp.Med.，Volume 189，Number 12，1999；1939-1946)。对霍奇金病(HD)有效的抗IL-13抗体因IL-13的作用会影响受体结合。
单克隆抗体(MAb)263是广泛使用的单克隆抗体，它可以识别生长激素(GH)受体的胞外域(ECD)，在体外和体内都可作为GH激动剂。(Wan Y.，等人，Molecular Endocrinology 17(11)：2240-2250(2003))。小鼠单克隆抗体，术语为BAH-I，在人类巨核细胞内培养，其可以特异性识别血小板生成素(TPO)的细胞表面受体(c-Mpl)，显示了其激动剂活性。(Deng B.，等人，Blood，92(6)：1981-1988(1998)).
并不是所有指向激素结合点的MAb和在激素结合时充当全竞争物的MAb都可以作为激动剂并引发信号。(Rowlinson SW，等人，1998 J Biol Chem 273：5307-5314).有文献报道过将激动剂限制在MAb的狭小范围内作用于促红细胞生成素受体，大量研究显示，96个作用于受体的MAb，只有4个显示出激动剂活性。(Elliott S，等人，1996 J Biol Chem 271：24691-24697).
erbB2致癌基因能编码生长因子受体。erbB2的过量表达经证明与很多侵略性肿瘤和预后较差有关。一些指向该分子的抗体在体内具有抗肿瘤效果，但是有些抗体却没有此效果。(Wang等人MoI Immunol.2004 Feb；40(13)：963-969).
几个用于抑制肿瘤坏死因子(TNF)功能的抗体通过与TNF结合以影响其不同功能的方式来发挥作用。INFLIXIMAB
Figure BPA00001332393800451
通过与可溶性(在血液内能自由移动)和跨膜形式(位于T细胞和其他相似细胞的细胞膜膜外侧)的TNFα的高亲和性结合来抑制TNFα的生物活性，抑制或者防止TNFα和其受体的有效结合。REMICADE
Figure BPA00001332393800452
and HUMIRA
Figure BPA00001332393800453
(另一种TNF拮抗剂)属于抗TNF抗体的亚类(它们是自然生成形式的抗体)，能够抑制各种形式(胞外，跨膜，和与受体结合)的TNFα。(Choy EH等人N EnglJ Med.2001；344：907-916)。ENBREL
Figure BPA00001332393800454
第三种TNF拮抗剂，属于不同的亚类，由于其修饰过的形式，不能抑制与受体结合的TNFα。
CD28存在于T细胞表面，在其激活过程中起着重要作用。CD28通过与其配基结合从而被触发，信号转导可通过CD28进行。CD28的激活依赖于其细胞质域的磷酸化过程。CD28并没有内在的磷酸化活性，反之它依赖于外在的激酶作用，例如p561ck。然而，有些抗体可以通过预先排斥受体附近的磷酸酶(与激酶作用相反)，从而充当CD28受体的超级激动剂。
通过本发明的ARA平台技术，针对不同抗原决定基的自然抗体的高通量鉴定和分类得以实现，并能够对大量调节不同抗原决定簇各种功能的抗体同样进行鉴定。本方法同样可以鉴定隐藏的抗原决定簇。对有些确定的隐藏抗原决定基功能的调节同样也是对已知的功能性抗原决定基或者整个靶标功能调节的协同作用。
在一个实例中，单克隆抗体可以排列在固体表面上并通过ARA内离散的靶标特异性元素克隆来分类。在一些实施方案中，MAb被固定在器皿的内表面，这些器皿主要从微滴度孔，微滴度板，试管，培养皿，微通道和微阵列中选择。这样，就可以在原位对抗体从通信细胞引发信号的能力进行检测。通常情况下，在一个优选的实施方案中，抗体是不扩散的，它结合到一种从样品接受地(例如微滴度板，微阵列等)中分离出来的不溶性支撑物上。该不溶性支撑物可以是由任何抗体能够结合上去的物质组成的，它很容易从可溶性材料中分离出来，或者和整个筛选方法互不排斥。这种支撑物的表面可能是固体的，可能是多孔的或者任何可用的形状。合适的不溶性支撑物举例如下，如微滴度板，微阵列，膜和水珠。这些通常是由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖，尼龙或者消化纤维，聚四氟乙烯等制成的。微滴度板和微阵列尤其方便，因为利用他们，用少量的试剂和样本就可以同样进行大量的检测。由于化合物的结合方法与试剂和整个方法是一致的，所以化合物的特殊结合方式不是至关重要的，这种结合方式可以维持化合物的活力并且是不可扩散的。
被改造为能够直接或者间接表达对细胞表面受体活性调节做出响应的可测量“信号”(“reporter”)物质(可检测性标签)的细胞系可以被用于筛选能够激活或者抑制受体的单克隆抗体。在一些实施方案中，细胞表面分子(例如受体)的激活与影响底物共价键断裂的酶的活力是相耦合的。酶可以从本组物质中选择，包括β-内酰胺酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，β-甘露糖苷酶，酸性磷酸酶，碱性磷酸酶，和磷酸二酯酶II。底物可以从本组物质中选择，包括对氨基苯-β-D-半乳糖苷，对氨基-α-D-半乳糖苷，对氨基-α-D-葡萄糖苷，对氨基-β-D-葡萄糖苷，对氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷，对氨基苯-β-D-吡喃甘露糖苷，对氨基苯磷酸盐和对氨基苯磷酸胆碱或其衍生物。底物的断裂通常与可检测的变色或者荧光反应相关连。
在一些实施方案中，可检测性标签是荧光基团，化学染料，放射性结合试剂，化学发光结合试剂，电化学发光试剂，磁结合试剂，顺磁结合试剂，热磁结合试剂，能产生有色物质的酶，能产生化学发光物质的酶，能产生磁性物质的酶。在一些特定实施方案中，可检测性标签是钌或者多钌标记物。
筛选用染料或者荧光试剂处理的细胞的方式是本领域熟知的。相当可观的与细胞基因工程相关的文献均利用能产生荧光的蛋白质，例如将改性的绿色荧光蛋白(GFP)作为通信分子。Morise等(Biochemistry 13(1974)，p.2656-2662)和Ward等(Photochem.Photobiol.31(1980)，p.611-615)发现了野生型GFP的一些特点。Aequorea victoria水母的GFP最大激发在395nm，最大发射波长在510nm，而且它不需要外部因子来激发起荧光活性。发出荧光的(luminogenic)可检测性底物，例如荧光素酶，也可以利用。
美国专利5401629和5436128描述了检测和评估胞外信号的细胞内转导的试验方法和化合物，该方法利用了可以表达细胞表面受体的重组细胞，且该专利包含有转录调控元件的通信基因结构，该转录调控元件能够对细胞表面受体活动做出响应。
标准高通量筛选(″HTS″)用化合物和生物学试剂的混合物连同能够注入到96或者384标准微滴度板内的指示剂化合物。每个孔内测量的信号，荧光释放，光密度或者放射能，与孔内所有试剂发出的信号结合到一起显示出孔内所有分子的总平均数。Science Applications International Corporation (Science Applications International Corporation(SAIC)130 Fifth Avenue，Seattle，Wash.98109)描述了一种成像板式指示器。这个系统利用CCD相机对96孔板整个区域成像。所得图像用于分析计算每个孔内所有试剂的总荧光强度。Molecular Devices，Inc.(Sunnyvale，Calif.)描述了一种系统(FLIPR)，其利用低角度照射激光扫描和在96孔板的孔底200微米范围内选择性激发荧光的方法来降低细胞单层膜成像时的背景影响。该系统利用CCD相机来对96孔板底部整个区域成像。尽管这个系统能够测量孔底部细胞单层膜产生的信号，但是所测得的信号是孔内整个区域的平均值，因此仍然认为该信号是一种细胞群体的平均响应值的测量。该图像用于分析计算细胞试验中每个孔内的总荧光信号。细胞基筛选系统中，为了激活响应也应用了流体传输设备，例如FLIPR系统，来激发响应，这样利用宏观成像系统就能够观察到整个孔内群体平均响应情况。
与高通量筛选形成对照的是，各种高含量筛选(HCS)被开发出来以满足细胞成分和作用过程中时空动力学详细信息的需要。高含量筛选能够自动提取与细胞结合的特异性荧光试剂的各色荧光信息(Giuliano and Taylor(1995)，Curr.Op.Cell Biol.7：4；Giuliano等人(1995)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24：405)，并用可测量空间和时间动力学的光学系统对细胞进行分析。(Farkas等人(1993)Ann.Rev.Physiol.55：785；Giuliano等人(1990)In Optical Microscopy for Biology.B.Herman and K.Jacobson(eds.)，pp.543-557.Wiley-Liss，New York；Hahn等人(1992)Nature 359：736；Waggoner等人(1996)Hum.Pathol.27：494)。
高含量筛选可以利用荧光标记抗体，生物配基，和/或核酸杂交探针在固定化细胞上实现；或利用多色荧光指示剂和“生物传感器”(biosensor)在活细胞上实现。固定化细胞和活细胞的选择取决于所需的特定细胞试验方法。
固定的细胞实验是最简单的，因为微滴度板内的初始活细胞库可以用各种化合物以检测剂量处理，然后细胞就可以被固定用特异性试剂标记和检测。固定化之后不能对细胞进行任何环境控制。仅可以在一个时间点获得空间信息。数千种可用于细胞的抗体，配基和核酸杂交探针的可用性使得这个方法对于多种细胞筛选非常有吸引力。固定化和标记步骤的自动实现，使得该方法效率很高。
活细胞试验更加成熟有效，这是因为含有理想试剂的活细胞库的能够随时间，空间被筛选。必须保持细胞的生理健康以适应多种荧光测量的需要，所以测量中需要控制细胞的环境(温度，湿度和二氧化碳)。目前可以显示细胞内的生物化学变化和分子活动情况的荧光生理指标和生物传感器越来越多。(Giuliano等人，(1995)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24：405；Hahn等人，(1993)In Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity.W.T.Mason，(ed.)，pp.349-359，Academic Press，San Diego).
荧光试剂的使用和其可用性促进了活细胞和固定化细胞的高含量筛选的发展。由于多色自动提取仪器制造的进步，高含量信息使得发展HCS自动化仪器成为可能。Taylor等(American Scientist 80(1992)，p.322-335)描述了很多相关的方法和应用。
典型试验方法中，够表达靶标受体的细胞和被改造包含有对受体激活和抑制敏感的可检测信号基因系统的细胞可用于接触含有指向受体分子的单克隆抗体的ARA。在一些实施方案中，ARA包含一个多孔板(96或者384孔)，每个孔内含一种已知单克隆抗体。可能有必要准备多个含有单个单克隆抗体的“点”，这样的话MAb浓度才能足够大以引发可检测性信号。同样地，每个孔内必须含有103，104，或者105以上的细胞以激发可检测性信号。在实例中，例如U.S.Pub.Pat App.No.20070275435所描述的，可以采用微孔内细胞培养实时监测的细胞培养芯片。
在通讯细胞接触ARA仪器表面后，未被检测性单克隆抗体捕获的细胞会通过流体剪切力去除。被捕获的细胞在仪器上以允许细胞生长和通信物质表达的方式被培养。保留在被捕获的细胞内部的通信物质可以利用ARA设备直接测量(例如利用可检测性底物)。采用这种方法，拥有受体激动活性或者拮抗活性的单克隆抗体可以利用通信信号的有无来进行确定，通信信号由代表成组的单克隆抗体的ARA设备上离散元素捕获的细胞引发的。
例如，NF-κB(核因子被激活的B细胞的κ轻链增强子)是一个蛋白质复合物，它可以充当转录因子。几乎所有动物细胞中都发现有NF-κB的存在，它与外界刺激的细胞应答有关。很多细胞表面受体的刺激，比如RANK，TNFR，会直接导致NF-κB被激活，在基因表达中快速变化。人类胚胎肾脏细胞系在NF-κB响应元件(NF-κB-bla HEK 293T CellSensor Cell Line，Invitrogen Corp.，Calif.)的调控下能够稳定表达β-内酰胺酶基因，对肿瘤坏死因子α(TNFα)的刺激作出响应，使得NF-κB信号途径被激活，随之开始表达β内酰胺酶。β内酰胺酶的表达通过荧光共振能量转移(FRET)底物(LiveBLAzer-FRET B/G Substrate，Invitrogen Inc.，Calif)来定量。底物为亲脂性的酯化物，它可以很容易地进入通信细胞系。经内源性细胞质酯酶断裂，底物被转换成能够在细胞质内保留的带负电荷的底物。β-内酰胺酶的断裂空间上分成两个底物生色团，分裂FRET并产生蓝色荧光信号，波长为450nm(用409nm激发)。β内酰胺酶未裂解时，在560nm(用409nm激发)处底物产生绿色荧光信号。蓝色荧光信号比例提高即显示出β内酰胺酶活性的提高。
对Toll样受体(TLR)的刺激会导致NF-κB的激活(Hayden MS，West AP，Ghosh S(October 2006).″NF-κB and the immune response″.Oncogene 25(51)：6758-6780)。单克隆抗体激动TLR的受体激动活力可能导致由于受体细胞系内TNFα和随后的β内酰胺酶表达提高而引起的内生NF-κB的高水平激活。反之，拮抗剂活性可能导致β内酰胺酶表达水平的降低。在执行TLR的单克隆抗体存在时，TLR的调节水平可由监控得到的由FRET底物产生的蓝绿荧光信号比例变化得到，例如蓝色荧光信号比例上升是TLR催化剂的指示信号，蓝色荧光信号比例下降是TLR抑制剂的指示信号。存在给定的Mab情况下TLR活性(activity)水平可以和对照(例如，存在已知活性的化合物情况下)的TLR活性水平进行比较。
本发明的方法同样涉及到可以由恢复的V基因序列产生的治疗性抗体，该抗体可以指向靶标病原体或者抗原的不同功能抗原决定基，或者对靶标受体有功能性影响。
本发明中的方法可以应用到小分子筛选。通过鉴定与特异性功能相关的抗原决定基或者抗原决定簇，可以检测人造小分子或者天然小分子与功能性抗原决定基结合的效力和活性，其中功能性抗原决定基由本发明方法确定。
本发明中的方法同样涉及到疫苗设计方法，通过确定不同的抗原决定簇，从而能够制备指向靶标病原体或者抗原的不同部位的疫苗。
本发明中的方法同样涉及到由回复的V基因序列和。生成的治疗性抗体和。
试剂盒
本发明提供了所述的方法可以应用的试剂盒。一实施方案中，试剂盒包含有本发明中抗体组成的阵列(ARA)，优选地还包括一个或者多个内有已纯化了的抗体的容器。优选地，本发明的试剂盒进一步包括不会与目的多肽反应的对照抗体。另一特定实施方案中，本发明的试剂盒含有检测抗体和目的多肽结合的方法(例如，抗体可能与可检测底物，比如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或者发光化合物，成对结合；或者能识别第一抗体的第二抗体可能与可检测底物结合)。
试剂盒还包括独立的通信标记抗人类抗体。在本实施方案中，抗体和多肽抗原的结合可以利用所述的信号标记抗体的结合来检测。一些试剂盒中包括与胞外域蛋白质(例如受体)功能相耦合的信号系统的细胞系。一些试剂盒中包括比色试剂，荧光检测试剂或者光度检测试剂。
本发明的另一实施方案中，试剂盒为可筛选对增殖的和/或癌变的核苷酸和多肽有特异性的抗体血清的诊断性试剂盒。这样的试剂盒内包括不会和目的多肽反应的控制抗体。这样的试剂盒可能包括已充分分离的带有抗原决定基的多肽抗原，该抗原决定基对至少一种抗多肽抗原抗体有免疫活性。此外，该试剂盒包括检测所述的抗体和抗原结合的方法(例如，抗体可能与荧光化合物，如荧光素或若丹明，成对结合，即可被流式细胞术检测)。在具体实施方案中，试剂盒可能含有重组生成的或者化学合成的多肽抗原。试剂盒中的多肽抗原被固定到固体支撑物上面。
在一个实施方案中，本发明包括一种可以筛选含有本发明的多肽抗原血清的诊断性试剂盒。该诊断性试剂盒包括充分分离的对多肽或者多核苷酸抗原有特异性免疫活性的抗体库，和检测所述的多肽或者多核苷酸抗原与抗体结合的方法。
因此，本发明提供了一种测定系统(assay system)或者试剂盒来实现该诊断方法。试剂盒包括带有表面结合重组抗原的支撑物和用来检测表面结合抗抗原抗体的信号标记抗人类抗体。
本专利说明书中引用的所有出版物和专利申请在此通过引证并入本申请，就如同单个出版物或者专利申请是在具体情况下和分别被引用并入本申请。
尽管为了清楚起见，已经用说明和举例的方式对前述发明进行了一些详细描述，依照本发明的教导、在没有脱离附上的权利要求书的精神或者范围的情况下，对本申请进行一些改变和修饰，，对于本领域技术人员是容易的。

Claims (62)

1.用于制备抗体库阵列(ARA)的方法，该方法包括：
(a)从每个有效数量的人类供体中获得至少104记忆B细胞；
(b)制备人类B细胞群，所述的其中所述的细胞群含有至少105不同种类的自然生成抗体，其中每个抗体有自然配对的重链和轻链；
(c)将所述的B细胞群分成B细胞亚群，每个细胞亚群产生至少1种不同种类的抗体；
(d)扩增每个B细胞亚群以产生扩增的B细胞培养；
(e)在所述的B细胞能够分泌抗体到培养基的条件下，在所述的培养基中培养所述的每个B细胞培养；和
(f)将所述的分泌到培养基中的抗体置于固体表面，从而产生含有抗体库的抗体库阵列(ARA)。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
(g)用靶标物探测抗体库阵列来确定对所述的靶标有特异性的抗体或者抗体可变区或者其部分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中B细胞被永生化以产生永生化的B细胞培养。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
(h)决定哪个B细胞培养能够产生所述的靶标抗体；和
(i)从所述的B细胞培养中分离能够产生所述的靶标抗体的B细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中抗体被放置于阵列表面，所述的表面包括依次捕获抗体的Fc区的蛋白质A或者蛋白质G。
6.根据权利要求1所述的方法，其中b步骤中的B细胞被置于微梯度板的孔内。
7.根据权利要求1所述的方法，其中b步骤中的B细胞群含有至少107种不同种类的自然生成的抗体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的有效的人类供体数至少为10。
9.根据权利要求1所述的方法，其中抗体库包含至少105自然生成的有自然配对的VH区和VL区的人类抗体，其中所述的抗体为从足够多样的病人群体采集得到的永生化人类B细胞分泌得到的，以至于所述的库内的抗体有与人类整体免疫实质上相似的结合活性的多样性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中自然生成的人类抗体是由可以识别至少102不同靶标的人类B细胞表达的。
11.根据权利要求9所述的方法，其中的B细胞进一步是永生化的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中永生化的B细胞能够表达埃-巴二氏病毒抗原。
13.根据权利要求11所述的方法，其中永生化的B细胞分泌抗病原体的抗体，所述的病原体从下述组成的组中选择：RNA病毒，DNA病毒，细菌，酵母，寄生虫和真菌。
14.根据权利要求11所述的方法，其中永生化B细胞分泌针对由恶性或者良性肿瘤细胞所表达抗原的抗体
15.根据权利要求11所述的方法，其中永生化的B细胞分泌抗体，其中抗原从下述物质组成的组中选择：与神经退行性疾病结合的多肽；细胞因子，趋化因子，生长因子，黏附分子和共刺激分子及其受体。
16.制备自然配对的免疫球蛋白的方法，该方法包括下述步骤：
(a)从非永生化B细胞群中分离RNA样本，其中每个B细胞群平均可以表达1-100不同种类的抗体；
(b)利用众多RNA样本实施逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；和
(c)分离可以自然配对的VH区和VL区对应的DNA；
(d)在合适的可以可以表达所述的VH区和VL区的宿主内克隆所述的VH区和VL区对应的DNA；和
(e)在免疫球蛋白重链和轻链环境下表达所述的VH区和VL区，从而形成自然配对的免疫球蛋白。
17.根据权利要求16所述的方法，其中平均可以表达1-100不同种类的抗体非永生化B细胞群采用下述方法制备：
(a)从每个有效数量的人类供体中获得至少104记忆B细胞；
(b)制备人类B细胞群，其中所述的细胞群含有至少105不同种类的自然生成抗体，每个抗体有自然配对的重链和轻链；
(c)将所述的B细胞群分成B细胞亚群，每个细胞亚群平均产生1-100种不同种类的抗体；
(d)任选地，扩增每个B细胞亚群以产生扩增的B细胞培养；和
(e)在适合保存其RNA内容物的条件下，存储每个细胞亚群，
其中产生平均表达1-100种不同种类的抗体的非永生化B细胞群的库。
18.制备靶标特异性抗体的方法，该方法包括：
(a)从受靶标影响的人类供体中获得B细胞，其中所述的B细胞群含有至少105不同种类的自然生成抗体，每个抗体有自然配对的重链和轻链；
(b)将所述的B细胞群分成B细胞亚群，每个细胞亚群平均产生1-100种不同种类的抗体；
(c)在所述的B细胞能够将抗体分泌到所述的培养基的条件下，扩增每个B细胞亚群以产生扩增的B细胞培养；
(d)将所述的B细胞培养分泌到培养基中抗体置于固体表面的特定位置以生成抗体库阵列(ARA)；和
(e)用天然靶标分子探测抗体库阵列来确定对所述的靶标有特异性的一个或者多个抗体群。
19.根据权利要求18所述的方法，进一步包括下述步骤：
(f)对所述的靶标有特异性的抗体库对应的B细胞培养中制备RNA样本；
(g)利用众多RNA样本实施逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；
(h)分离可以自然配对的VH区和VL区对应的DNA；
(i)在合适的可以表达所述的VH区和VL区的宿主内克隆所述的VH区和VL区区对应的DNA；和
(j)在免疫球蛋白重链和轻链环境下表达所述的VH区和VL区，从而形成自然配对的免疫球蛋白。
20.根据权利要求19所述的方法，其中的靶标是病毒，细菌，酵母，寄生虫和真菌或者其他病原体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中靶标是人类免疫缺陷病毒(HIV)。
22.根据权利要求20所述的方法，其中天然靶标分子是病毒粒，病毒样粒子，病毒感染的细胞，病毒蛋白质及其片段。
23.根据权利要求18所述的方法，进一步包括下述步骤：确定交叉反应抗体，其中靶标包括多种类的靶标或者这些靶标的多种血清型。
24.基于抗原决定基成簇筛选抗体的方法，所述的方法包括：
(a)提供从代表部分靶标蛋白的基因片段中生成的基因片度噬菌体显示(GFPD)库，其中依据一个或多个抗原决定基相互作用，GFPD库成员是成簇的；
(b)提供完整的靶标蛋白质；
(c)提供依据权利要求1从研究对象血样中生成的抗体库阵列(ARA)，其中研究对象事先暴露在足够引起其免疫反应的靶标物剂量下；
(d)用完整的靶标和/或从靶标得到的GFPD库成员中的抗原决定基特异性簇对ARA进行探测；和
(e)确定对一个或者多个对所述的完整靶标和至少一个抗原决定簇有特异性抗体群。
25.根据权利要求24所述的方法，进一步包含下述步骤：
(f)由对应于对所述的抗原决定簇有特定性的抗体群的B细胞培养制备RNA样本；
(g)利用众多RNA样本实施逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；
(h)分离可以自然配对的VH区和VL区对应的DNA。
(i)在合适的可以表达所述的VH区和VL区的宿主内克隆所述的VH区和VL区对应的DNA；和
(j)在免疫球蛋白重链和轻链环境下表达所述的VH区和VL区，从而形成自然配对的免疫球蛋白。
26.根据权利要求24所述的方法，进一步包括：利用完整靶标和GFPD库成员，基于ARA的识别模式确定新的抗原决定簇。
27.根据权利要求24所述的方法，依据一个或多个抗原决定基的关系，其中GFPD库成员是成簇的，该方法包括：
提供能够编码靶标蛋白质的基因；
将所述的基因分成基因片段；
制备含有GFPD库成员的噬菌体显示库；
根据靶标特异性抗体淘选GFPD库；和
依据与一个或者多个抗原决定簇的关系将每个GFPD库成员分组。
28.根据权利要求27所述的方法，进一步包括将GFPD库成员分组，将GFPD库成员覆盖在靶标的已知三维结构上。
29.根据权利要求24所述的方法，进一步包括检测两个或者多个抗原决定基功能的协同作用，所述的方法为：
制备通过表达VH区和VL区形成的第一自然配对免疫球蛋白，其中VH区和VL区的序列得自于对抗原决定簇有特异性的抗体群；
制备通过表达VH区和VL区形成的第二自然配对免疫球蛋白，其中VH区和VL区的序列得自于对抗原决定簇有特异性的抗体群；
分别或者联合对检测系统施用第一和第二自然配对的免疫球蛋白来检测完整靶标的活性；和
确定与已知功能相关的新抗原决定基的活性和协同活性。
30.一种疫苗制备方法，包括对根据权利要求24所述方法决定的功能性抗原决定基有效的抗体。
31.一种治疗性抗体制备方法，包括在调节根据权利要求24所述方法决定的与一个或多个抗原决定簇结合靶标的功能方面有效的抗体。
32.一种筛选单克隆抗体以确定于细胞表面靶标分子生理功能的方法，该方法包括：
提供根据权利要求1所述方法生成的抗体库阵列(ARA)，该ARA包括一系列位于表面离散点的单克隆抗体，其中抗体指向存在于细胞表面特异性靶标分子；
用包括存在于细胞表面的特异性靶标分子的细胞接触所述的ARA；和确定这些单克隆抗体中哪些对细胞表面的靶标分子有抑制作用或者激活作用。
33.根据权利要求32所述的方法，进一步包括：
用通信细胞接触所述的ARA，其中通信细胞经过改造当与通信细胞表面的细胞表面靶标分子激动剂或者拮抗剂接触时能够表达可检测性信号；
在能生成可检测信号底物存在的条件下用单克隆抗体培养此通信细胞，其中可检测信号水平的变化能够显示单克隆抗体的细胞表面靶标分子激动剂或者拮抗剂的存在。
34.根据权利要求32所述的方法，其中细胞表面的特异性靶标分子是受体分子。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述的受体可以从本组中选择，本组包括：外周膜蛋白受体，跨膜受体，代谢性受体，G蛋白偶联受体(GPCR)，受体酪氨酸激酶，鸟苷酸环化酶受体，对胞外配体响应的离子型受体，受体酪氨酸激酶，细胞因子受体，受体鸟苷酸环化酶，受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体，人生长激素受体，葡萄糖转运，转铁蛋白受体，表皮生长因子受体，低密度脂蛋白受体，瘦素受体，白细胞介素受体，IL-1受体，IL-2受体，毒蕈碱乙酰胆碱受体，腺苷受体，肾上腺素受体，GABA受体，血管紧张素受体，大麻受体，胆囊收缩素受体，多巴胺受体，胰高血糖素受体，代谢型谷氨酸受体，组胺受体，嗅觉受体，阿片受体，视紫红质，分泌素受体，血清素受体，生长激素抑制素受体，钙敏感受体，生长因子受体，共刺激因子受体，蛋白酶活化受体，T细胞受体，B细胞受体，含ITIM受体，含ITAM受体，TNFR总科成员，TNF总科成员，离子通道和趋化因子受体。
36.根据权利要求35所述的方法，其中抗体功能为全激动剂，部分激动剂，拮抗剂或受体蛋白的反激动剂。
37.根据权利要求32所述的方法，其中可检测性信号为荧光基团，化学染料，放射形结合试剂，化学发光结合试剂，电化学发光试剂，磁性结合试剂，顺磁性结合，热磁性结合试剂，能产生有色物质的酶，能产生化学发光物质的酶，能产生磁性物质的酶或者钌。
38.根据权利要求32所述的方法，其中细胞表面分子的激活和与作用于底物的酶的活性相联系胞外离子通道是耦合的。
39.根据权利要求38所述的方法，其中酶是选自下述组中：β-内酰胺酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，β-甘露糖苷酶，酸性磷酸酶，碱性磷酸酶和磷酸二酯酶II。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述的底物从下列物质中选择：对氨基苯-β-D-半乳糖苷，对氨基苯-α-D-半乳糖苷，对氨基苯-α-D-葡萄糖苷，对氨基苯-β-D-葡萄糖苷，对氨基苯α-D-吡喃甘露糖苷，对氨基苯-β-D-吡喃甘露糖苷，对氨基苯磷酸盐，和对氨基苯磷酸胆碱及其衍生物。
41.根据权利要求38所述的方法，其中酶对底物的作用是与化学反应，发光反应，比色反应或者荧光反应相耦合的。
42.根据权利要求32所述的方法，其中ARA置于96或者384孔板内，每个孔内含有从单个B细胞克隆中得到的单克隆抗体，进一步，其中单克隆抗体的浓度足以诱发细胞表面靶标分子发出信号。
43.根据权利要求42所述的方法，其中每个孔都会与至少103通信细胞接触。
44.根据权利要求42所述的方法，其中可检测性标签不是通信细胞分泌的。
45.根据权利要求42所述的方法，其中可检测性标签是通信细胞分泌的。
46.根据权利要求42所述的方法，其中每个孔都与通信细胞接触，其中通信细胞在适合细胞生长的条件下培养，直至达到大于103通信细胞的浓度。
47.根据权利要求32所述的方法，其中的筛选是高通量筛选。
48.根据权利要求32所述的方法，其中的筛选是高含量筛选。
49.根据权利要求32所述的方法，其中细胞表面靶标分子的激活包含与β-内酰胺酶表达耦合的信号途径的激活。
50.根据权利要求49所述的方法，其中β-内酰胺酶的表达是荧光共振能量转移(FRET)底物来定量的。
51.根据权利要求32所述的方法，其中ARA包括表面每个离散点的抗体浓度足以引发细胞表面的特异性靶标分子接触的信号。
52.用权利要求1所述方法制备的抗体库阵列(ARA)。
53.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中ARA包括至少104由人类B细胞表达的，可识别至少102不同靶标的人类自然抗体，每个抗体是由不同B细胞分泌的，含有自然配对的VH区和VL区链。
54.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中ARA中的抗体可识别至少103不同靶标。
55.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中ARA中的抗体包含至少103被表达的人类自然抗体。
56.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中的ARA包含至少105自然生成的有自然配对的VH区和VL区的人类抗体，其中所述的抗体是由永生化的人类B细胞分泌得到的，B细胞是从足够不同的病人中采集的，从而所述的库内的抗体有与整体人类免疫实质上相似的结合活性的多样性。
57.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中ARA包括针对病原体的自然生成的人类抗体，病原体从下面组内选择：RNA病毒，DNA病毒，细菌，酵母，寄生虫和真菌。
58.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中ARA包括针对由恶性肿瘤或者良性肿瘤细胞表达抗原的自然生成的人类抗体。
59.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中ARA包括针对抗原的自然生成的人类抗体，病原体从下面组内选择：与神经变性疾病结合的多肽；细胞因子，趋化因子，生长因子，黏附分子和共刺激分子及其受体。
60.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中ARA包含自然生成的针对从代表靶标的基因片段噬菌体显示库(GFPD)得到的抗原决定基特异性簇的抗体。
61.根据权利要求52中的抗体库阵列(ARA)，其中ARA包含自然生成的针对细胞表面靶标分子的人类抗体。
62.根据权利要求61中的抗体库阵列(ARA)，其中细胞表面分子指的是受体分子。
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