JPWO2020129838A1 - 特定抗原特異的抗体を産生する細胞のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法であって、下記の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する方法:
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い。
(2) ヒト抗体を産生する細胞の培養上清が、ヒトB細胞の培養上清である、(1)に記載の方法。
(3) ヒトB細胞の培養上清が、ヒトB細胞を、抗原を発現するフィーダー細胞上において培養した後の培養上清である、(2)に記載の方法。
(4) ヒトB細胞の培養上清が、ヒトB細胞を、Fasを介した刺激の存在下において培養した後の培養上清である、(2)又は(3)に記載の方法。
(5) ヒトB細胞の培養上清が、ヒトB細胞を、IL−2及びIL−21の存在下において培養した後の培養上清である、(2)から(4)の何れか一に記載の方法。
(6)特定抗原が、標的細胞の細胞膜表面に発現する膜抗原である、(1)から(5)の何れか一に記載の方法。
(7)特定抗原が、膜貫通型受容体である、(1)から(6)の何れか一に記載の方法。
(8)特定抗原が、Gタンパク質共役受容体である、(1)から(7)の何れか一に記載の方法。
(9) ヒト抗体が、ヒトIgGである、(1)から(8)の何れか一に記載の方法。
(10) 抗体依存性細胞障害活性を、死細胞が放出する酵素の検出による測定する、(1)から(9)の何れか一に記載の方法。
(11) (1)から(10)の何れか一に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清の製造方法。
(12) (1)から(10)の何れか一に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞の製造方法。
(13) (1)から(10)の何れか一に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体の製造方法。
本発明は、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法であって、下記の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する方法に関する。
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い。
本発明においては、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする。具体的には下記の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する。
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い。
本発明において、特定抗原は特に限定されないが、好ましくは、膜抗原であり、より好ましくは標的細胞の細胞膜表面に発現する膜抗原である。
本発明においては、特定抗原を発現する標的細胞、および特定抗原を発現しない標的細胞を使用する。同一のスクリーニングにおける標的細胞としては、特定抗原を発現する標的細胞、および特定抗原を発現しない標的細胞について、同一の細胞を使用することが好ましい。
フィーダー細胞の由来としては、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示することができる。フィーダー細胞として使用可能な細胞としては、線維芽細胞、上皮細胞(例えばHeLa細胞)、胎児腎臓細胞(例えば、HEK293など)、濾胞樹状細胞などを挙げることができる。なかでも、増殖速度が速く、細胞表面積が大きい、フィーダー細胞の除去が簡便であるとの観点から、線維芽細胞が好ましい。
本発明において使用する攻撃細胞(エフェクター細胞とも言う)は、抗体を認識するFcγR(Fcγレセプター)を発現する細胞であれば特に限定されず、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、マクロファージ、単球(末梢血単核細胞(PBMC)など)、樹状細胞、好中球、肥満(マスト)細胞などを使用することができる。上記の中でも、好ましくは、ナチュラルキラー(NK)細胞を使用することができる。ナチュラルキラー(NK)細胞としては、KHYG−1、iNK−92、NK−YS、NK−YT、MOTN−1、NKL、HANK−1またはNKG細胞株などが挙げられるが、特に限定されない。特に好ましくは、KHYG−1を使用できる。
本発明においては、
攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い;
ことを指標とする。
特定抗原を発現しない標的細胞、特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び培養上清を準備する。
特定抗原を発現しない標的細胞、及び特定抗原を発現する標的細胞を、96ウェルプレートに播種する。次いで、培地をスクリーニング用の培養上清に交換し、培養を行う。その後、攻撃細胞を各ウェルに添加する。特定抗原を発現する標的細胞と、攻撃細胞と、培養上清とを使用する実験系、特定抗原を発現しない標的細胞と、攻撃細胞と、培養上清とを使用する実験系、並びに特定抗原を発現する標的細胞と、培養上清とを使用する実験系とを行う。適当な時間培養した後に、培養上清を用いてADCC活性を、死細胞が放出する酵素(例えば、LDHなど)を測定することで評価することができる。
本発明においては、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清をスクリーニングする。
ヒト抗体の種類は、特に限定されず、ヒトIgG、ヒトIgA、ヒトIgM、ヒトIgD、ヒトIgEの何れでもよいが、好ましくはヒトIgGである。
ヒトB細胞の培養上清としては、好ましくは、ヒトB細胞を、抗原を発現するフィーダー細胞上において培養した後の培養上清を使用することができる。
ヒトB細胞の培養上清としては、好ましくは、ヒトB細胞を、Fasを介した刺激の存在下において培養した後の培養上清を使用することができる。
ヒトB細胞の培養上清としては、好ましくは、ヒトB細胞を、IL−2及びIL−21の存在下において培養した後の培養上清を使用することができる。
B細胞にBach2遺伝子を導入するためには、Bach2遺伝子を有する組み換えベクターを構築し、この組み換えベクターをB細胞に導入すればよい。
IL−21は、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。IL−21の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、例えばマウス、ヒトなどを挙げることができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する分子であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
本明細書で用いられるもの等の従来方法に関する詳細な説明は、引用文献において見出すことができる。以下に別途示されない限り、関心対象の特異性ならびにそれらの組換え発現および抗CXCR2抗体の分子クローニングは、国際公開WO2008/081008号として公開された国際出願第PCT/EP2008/000053号、およびWO2010/069603号として公開された国際出願第PCT/EP2009/009186号の実施例および捕捉方法に記載されるように行われてきたか、または行うことができ、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
また、抗原特異的B細胞選択法(FAIS法)については、特許第5550132号公報及び国際公開WO2018/131698号公報に記載の方法を参照することができ、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
B細胞の培養は、特に断らない限り、RPMI−1640(10%(v/v)FCS(ウシ胎児血清)、ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、55nM 2−メルカプトエタノール、10mM HEPES及び1mMピルビン酸ナトリウム添加)をB細胞培養培地として用いて、5%(v/v)CO2、37℃の条件下で行った。
ADCC活性を利用したスクリーニング法を行うため、抗原発現細胞として40LB−Her2細胞及び40LB−CXCR2細胞を用い、抗原非発現細胞として40LB細胞を用いた。
ADCC活性を利用したスクリーニング法の検討には40LB細胞、40LB−Her2細胞、KHYG−1細胞を用いた。また抗原特異性を持つ抗体としてトラスツズマブ型抗体を、抗原非特異的抗体として市販のヒトIgG抗体を1μg/mLに調製して用いた。この時用いたトラスツズマブ型抗体は、レンチウィルスベクターであるCSIV−CMV−MCS−IRES2−Venusベクター(Cancer Science, Vol.105, pp.402-408(2014))を組み換え、Her2抗原特異的B細胞受容体(トラスツズマブ抗体遺伝子)の重鎖及び軽鎖を組み込んだCSIV−CMV−mGK(トラスツズマブ抗体kappa軽鎖遺伝子発現ベクター)−IRES2−mGH(トラスツズマブ抗体重鎖遺伝子発現ベクター)を作製し、トラスツズマブ型抗体遺伝子発現ベクターを構築し、CHO−K1細胞に遺伝子導入することで抗体生産細胞を作製した後、その培養上清をProteinA担体(KANEKA社製)で精製したものを使用した。ADCC活性を測定する12時間前に40LB細胞及び40LB−Her2細胞を96ウェルプレートに1×104個/ウェルになるよう播種した。細胞播種12時間後に、KHYG−1細胞培養培地で1μg/mLに調製した抗体溶液50μLに培地交換を行い、5%(v/v)CO2、37℃の条件下で30分間培養を行った。その後、KHYG−1細胞培養培地で1×104個/50μLに調製したKHYG−1細胞を各ウェルに添加した。この時、コントロール群としてKHYG−1細胞を添加しないウェルには培地のみを等量添加した。添加12時間後、培養上清を用いてADCC活性を死細胞が放出するLDHを測定することで評価した。LDHの測定にはLDH Cytotoxicity Assay Kit((Dojindo社製))を用いた。培養プレートを250×gで2分間遠心し、40μLの培養上清を回収し、96ウェルMaxisorpプレート(Nunc社製)に分注した。次いでWorking Solutionを40μL添加し、常温暗所にて30分間振とう培養を行った。30分後、20μLのStop Solutionを添加し反応を停止させ、490nmの吸光度を測定した。図1で示すように、抗原を発現する細胞と攻撃細胞に加え、抗原特異的抗体が存在する場合のみ細胞死が誘導されLDHが放出され、図2で示すように高い吸光度が測定できることが確認できた。
CXCR2抗原特異的受容体発現B細胞を含むB細胞小集団は以下のようにして得た。
ヒトB細胞の調製は以下のように行った。
即ち、健常人のヒト末梢血からLymphoprepチューブ(AXIS SHIELD社製)を用いて単核球を分離し、FcR Blocking Reagent(Miltenyi Biotec社製)を用いた後、さらにCD2陰性細胞及びCD235a陰性細胞を、ビオチン−抗ヒトCD2抗体(Biolegend社製)、ビオチン−抗ヒトCD235a抗体(eBioscience社製)、Streptavidin−Particle Plus−DM(BD Pharmingen社製)を使用し、BD iMag Cell Separation Magnet(BD Bioscience社製)及びMACS Separation Columns(Miltenyi Biotec社製)を用いて回収した。回収した細胞の内CD19陽性細胞を、PE−抗ヒトCD19抗体(Biolegend社製)を使用し、セルソーター(BD FACS AriaIII)を用いて回収した。さらに、取得したB細胞に長期生存遺伝子を導入することで、長期に培養できるB細胞を作製した。長期培養B細胞は以下のようにして得た。
上記で得られた抗原特異的B細胞を含む集団は、単一層を形成させた40LB細胞上で、7日間一次培養した。培養時はヒトIL−4(50ng/mL、PEPROTECH 社製)、ヒトIL−2(50unit/mL、PEPROTECH 社製)を含有するB細胞培地を用いて、1×105個/cm2の細胞密度でCO2インキュベーターにて培養した。
培養10日目に、CXCR2抗原特異的B細胞の選択培養を行うため、回収した培養B細胞から(5)と同様にしてフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。フィーダー細胞を除去したB細胞は、新たに準備された40LB細胞が播種された90mmディッシュに、ヒトIL−24(100ng/mL、PEPROTECH 社製)、ヒトIL−2(50unit/mL、PEPROTECH 社製)を含有するB細胞培地を用いて2×105個/cm2の細胞密度で播種し、抗原刺激前培養を行った。
Claims (13)
- ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法であって、下記の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する方法:
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い。 - ヒト抗体を産生する細胞の培養上清が、ヒトB細胞の培養上清である、請求項1に記載の方法。
- ヒトB細胞の培養上清が、ヒトB細胞を、抗原を発現するフィーダー細胞上において培養した後の培養上清である、請求項2に記載の方法。
- ヒトB細胞の培養上清が、ヒトB細胞を、Fasを介した刺激の存在下において培養した後の培養上清である、請求項2又は3に記載の方法。
- ヒトB細胞の培養上清が、ヒトB細胞を、IL−2及びIL−21の存在下において培養した後の培養上清である、請求項2から4の何れか一項に記載の方法。
- 特定抗原が、標的細胞の細胞膜表面に発現する膜抗原である、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 特定抗原が、膜貫通型受容体である、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
- 特定抗原が、Gタンパク質共役受容体である、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
- ヒト抗体が、ヒトIgGである、請求項1から8の何れか一項に記載の方法。
- 抗体依存性細胞障害活性を、死細胞が放出する酵素の検出による測定する、請求項1から9の何れか一項に記載の方法。
- 請求項1から10の何れか一項に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清の製造方法。
- 請求項1から10の何れか一項に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞の製造方法。
- 請求項1から10の何れか一項に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体の製造方法。
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