CN108841789A - 一种体外活化小鼠t淋巴细胞的方法 - Google Patents

一种体外活化小鼠t淋巴细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108841789A
CN108841789A CN201810631726.3A CN201810631726A CN108841789A CN 108841789 A CN108841789 A CN 108841789A CN 201810631726 A CN201810631726 A CN 201810631726A CN 108841789 A CN108841789 A CN 108841789A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
lymphocyte
mouse
culture
activation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810631726.3A
Other languages
English (en)
Inventor
杨加彩
刘美希
王旭
李传贵
宋亚军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Affiliated Hospital Army Medical University
Original Assignee
Second Affiliated Hospital Army Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Affiliated Hospital Army Medical University filed Critical Second Affiliated Hospital Army Medical University
Priority to CN201810631726.3A priority Critical patent/CN108841789A/zh
Publication of CN108841789A publication Critical patent/CN108841789A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外活化小鼠T淋巴细胞的方法，具体包括如下步骤：A.获取小鼠脾脏、外周淋巴结、粘膜上皮或外周血的淋巴细胞；B.筛选出CD3ε+淋巴细胞，并检测其纯度；C.用具有生物活性的抗小鼠CD3ε和CD28两种抗体包被48孔细胞培养板；D.将步骤C所得的细胞培养板中加入活化T淋巴细胞的培养基重悬细胞；E.将步骤D所得细胞板在CO2培养箱培养8～12小时。该方法可以在短时间内使T淋巴细胞的活化率达到90％以上，对于后续T淋巴细胞在多种生物学功能方面的研究具有重要的意义。

Description

一种体外活化小鼠T淋巴细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外活化小鼠T淋巴细胞的方法。
背景技术
T淋巴细胞来源于骨髓的多功能干细胞(胚胎期来源于卵黄囊和肝)，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多功能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。
“T细胞活化技术”，是将患者血液抽出体外，在实验室中进行扩增和激活，增多T细胞数量，增强T细胞活性。例如：对于肝病的治疗，是将患者的血液抽出体外，在实验室中进行扩增和激活，T细胞数量会成千上万的增加，活性增强，杀灭病毒的能力得到大幅度提升，在快递提升T细胞功能的同时该技术可以同时裂解和损毁抽出体外血液中的肝病毒的外壳层中的表面抗原蛋白、内壳层中的核心抗原蛋白和核心的双链DNA，将这些变性坏死的病毒成分成为新的抗原，促使患者机体产生针对乙肝病毒的特异性抗体。最后将这些含有超大数量、超高活性的T细胞和变性坏死病毒成分抗原回输回患者体内，进一步激活全身的体液免疫和细胞免疫系统(T细胞更大范围的激活和扩增，B细胞也被激活并持续产生针对肝炎病毒的抗体)。这些细胞和抗体，持续性追踪和杀伤乙肝病毒，直至清除干净，坏死的病毒成分逐渐被吞噬细胞清除干净，逐渐恢复肝脏功能。
T淋巴细胞具有多种生物学功能，例如杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，对身体抵御疾病感染、肿瘤具有重要作用。
T细胞在其他抗肿瘤免疫中同样具有十分重要的作用，也是目前的研究热点，目前主要是应用小鼠的T淋巴细胞作为研究对象。但是，现有技术中单纯的T细胞活化需要20～48小时，活化需要的时间过长，活化率也并不是很高。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种体外活化小鼠T淋巴细胞的方法，该方法能够加快T细胞活化速度，同时，还能够提高T细胞活化比率。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
一种体外活化小鼠T淋巴细胞的方法，具体包括如下步骤：
A.获取小鼠脾脏、外周淋巴结、粘膜上皮或外周血；
B.将小鼠脾脏、外周淋巴结或粘膜上皮研磨至匀浆，外周血则无需处理；
C.过滤并离心收集单细胞悬液，外周血则无需处理；
D.去除红细胞；
E.磷酸盐缓冲液重悬细胞
F.分选出CD3ε+淋巴细胞，并检测其纯度；
G.用具有生物活性的抗小鼠CD3ε和CD28两种抗体包被48孔细胞培养板,孵育8～11小时后弃去抗体混合液；
H.将步骤G所得的细胞培养板中加入活化T淋巴细胞的培养基重悬细胞；
I.将步骤H所得细胞板在CO2培养箱培养8～12小时。
优选地，所述步骤A中小鼠脾脏、外周淋巴结或粘膜上皮的获取与处理的方法为：将6～10周龄的清洁级小鼠，断颈处死，用70～85％酒精溶液浸泡3～10分钟；无菌取出小鼠脾脏、外周淋巴结或粘膜上皮，将其置于含有18mL磷酸盐缓冲液重悬细胞和2mL胎牛血清的直径为10cm的无菌培养皿中；外周血通过摘眼球取血法收集血液到抗凝管备用；
进一步地，所述酒精为体积分数为75％的酒精溶液。
优选地，所述步骤C中过滤匀浆使用的过滤网孔径为70μm；使用15mL无菌尖底离心管收集单细胞悬液，并在室温下300×g离心力离心3～10分钟，然后弃掉上清液。
优选地，所述步骤D中去除红细胞使用的方法是红细胞裂解液裂解法。
优选地，所述步骤E中重悬细胞的磷酸盐缓冲液中含有2％胎牛血清，并调节细胞的浓度为1*108/mL。
优选地，所述步骤F中选用磁珠法筛选CD3ε+淋巴细胞，使用的免疫荧光检测为流式细胞检测法。
进一步地，活化小鼠T淋巴细胞培养基重悬CD3ε+淋巴细胞，血球计数板计数细胞量，用活化T淋巴细胞培养基调整细胞浓度为1*106/mL。
优选地，所述步骤G中包被48孔细胞培养板所用的抗小鼠CD3ε和CD28两种抗体混合液的浓度分别为10μg/mL和2μg/mL，用pH值为7.6的无菌磷酸盐缓冲液，使用原则为现配现用，配制好后每孔加100μL抗体混合液，盖上培养板盖子，晃动培养板，使抗体混合液均匀覆盖培养板细胞培养孔内底部。用封口膜封紧培养板边缘，以防液体挥发。然后置于4℃环境中避光静止孵育8～11小时或在37°环境中避光孵育2小时。
进一步地，抗体孵育结束后应弃去培养板中的液体，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤三次以除去抗小鼠CD3ε和CD28抗体保存液中的有毒成分，此过程需保持培养板内底部湿润，以保证已包被抗体的活性。
优选地，所述步骤H中活化T淋巴细胞培养基以RPMI-1640为基础，添加如下成分，以达到如下浓度：
体积分数为10％胎牛血清，1*104μmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，20μmol/L的L-谷氨酰胺，浓度为10μmol/L的丙酮酸钠，1μmol/L的非必需氨基酸溶液，50μmol/L的β-巯基乙醇和1*105单位/L的重组小鼠白介素-2蛋白。
进一步地，所述非必需氨基酸为L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-天门冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，添加后每种非必需氨基酸的终浓度都是1μmol/L。
本发明选用的RPMI-1640培养基为gibco by life technologies生产的RPMIMedium 1640培养基，其中，RPMI-1640培养基的中的RPMI是Roswell Park MemorialInstitute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所。RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
进一步地，所述步骤H中，用活化T淋巴细胞培养基重悬细胞调整细胞浓度为1*106/mL，以500μL/孔的体积接种到步骤G处理好的培养板。
优选地，所述步骤I中，将已经接种细胞的培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养8～12小时。
使用本方法可以得到活化率高达90％的T淋巴细胞。
本发明方法只适用于实验室体外研究，不可用于临床。
本发明益处
采用本发明的方法活化小鼠T淋巴细胞，可以在8～12小时内使90％的T淋巴细胞活化，有效的提高活化效率。
本发明的方法可操作性高、精确度好。
本发明采用的是流式检测法可直观的反应T淋巴细胞的活化率，具有速度快，可以定性、定量分析细胞、灵敏度高优势，不受操作者的主观判断。
附图说明
图1为本实施例1流式细胞术检测采用磁珠分选法获得的小鼠脾脏T淋巴细胞纯度的流式检测图谱，图中所示T淋巴细胞纯度为98％。
图2为实施例1和实施例2得到的T细胞的活化率与时间的变化曲线，其中，Group1为实施例1得到的T细胞的活化率与培养时间的变化曲线，Group2为实施例2得到的T细胞的活化率与培养时间的变化曲线。
具体实施方式
以下实施例仅是对本发明的进一步阐述与说明，而不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
实施例1
一种体外活化小鼠T淋巴细胞的方法，其具体步骤如下：
A.将7周龄的清洁级小鼠，断颈处死，用体积分数为75％的酒精溶液浸泡5分钟，无菌取出脾脏，置于含有含有18mL磷酸盐缓冲液和2mL胎牛血清的直径为10cm的无菌培养皿中；
B.将步骤A所得的小鼠脾脏用无菌磨砂玻片粗糙面研磨至匀浆；
C.使用孔径为70μm的细胞筛网过滤步骤B所得的匀浆，然后使用无菌的15mL尖底离心管收集滤液，并用300×g离心力离心5分钟，弃掉上清液收集细胞沉淀；
D.向离心管中加入3mL无菌的红细胞裂解液重悬细胞，室温孵育3-5分钟；
E.向离心管中加入10mL无菌的磷酸盐缓冲液，混合均匀，室温下，300×g离心力离心5分钟；
F.弃上清，加5mL无菌的磷酸盐缓冲液，混合均匀。室温下，300×g离心力离心5分钟；
G.重复步骤F；
H.弃上清，加入含有体积分数为2％胎牛血清的无菌磷酸盐缓冲液重悬细胞，并调节细胞浓度至1*108/mL；
I.使用磁珠法筛选出CD3ε+淋巴细胞，并用流式细胞检测法检测其纯度，且细胞纯度达到95％以上；
J.用无菌磷酸盐缓冲液配制抗小鼠CD3ε和CD28抗体溶液，其浓度分别为10μg/mL和2μg/mL，往48孔细胞培养板中每孔加入100μL抗体溶液，盖上培养板盖子，晃动培养板，使液体均匀覆盖培养孔内底部。置4℃冰箱避光孵育8小时后弃去培养孔中的抗体混合液，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，过程中保持培养板内底部湿润；
K.用活化T淋巴细胞培养基重悬细胞并调整其浓度为1*106/mL，以500μL/孔的体积将其接种到步骤J处理好的48孔培养板中；
L.将步骤K所得的细胞的培养板在5％CO2培养箱中培养48小时。
M.从培养板放入培养箱开始计时，每隔2个小时收集1*106个细胞，采用流式细胞术检测细胞表达CD69情况。
本实施例中T淋巴细胞的培养用活化T淋巴细胞培养基，在RPMI-1640的基础上添加如下成分，以达到所述浓度：
体积分数为10％胎牛血清，1*104μmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，20μmol/L的L-谷氨酰胺，10μmol/L的丙酮酸钠，1μmol/L的非必需氨基酸，50μmol/L的β-巯基乙醇和1*105单位/L的重组小鼠白介素-2蛋白。
本实施例中所涉及的相关步骤均在无菌超净台中完成。
本实施例中T细胞激活培养基重悬CD3ε+淋巴细胞，采用血球计数板细胞量，所使用的标准是将T细胞激活培养基调整细胞浓度为1*106/mL；
本实施例的方法同样适用于小鼠外周淋巴结、粘膜上皮实施例的实施。
实施例2
一种体外活化小鼠T淋巴细胞的方法，其具体步骤如下：
A.将7周龄的清洁级小鼠，断颈处死，用体积分数为75％的酒精溶液浸泡6分钟，无菌取出脾脏，置于含有18mL磷酸盐缓冲液和2mL胎牛血清的直径为10cm的无菌培养皿中；
B.将步骤A所得的小鼠脾脏用磨砂玻片粗糙面研磨至匀浆；
C.使用孔径为70μm的细胞筛网过滤步骤B所得的匀浆，然后使用无菌的15mL尖底离心管收集滤液，并在300×g离心力离心5分钟，弃掉上清液收集细胞沉淀；
D.向离心管中加入3mL无菌的红细胞裂解液重悬细胞，室温孵育3-5分钟；
E.向离心管中加入10mL无菌的磷酸盐缓冲液，混合均匀。室温下，300×g离心力离心5分钟；
F.弃上清，加5mL无菌的磷酸盐缓冲液，混合均匀。室温下，300×g离心力离心5分钟；
G.重复步骤G；
H.弃上清，加入含有体积分数为2％胎牛血清的无菌磷酸盐缓冲液重悬细胞，并调节细胞浓度至1*108/mL；
I.使用磁珠法筛选出CD3ε+淋巴细胞，并用流式细胞检测法检测其纯度，且细胞纯度达到95％以上；
J.用RPMI-1640加10％胎牛血清作为培养基，重悬细胞，调整细胞浓度为1*106/mL，以500μL/孔的体积将其接种到48孔细胞培养板中；
K.将步骤J已接种细胞的培养板在5％CO2培养箱中培养48小时。
L.从培养板放入培养箱开始计时，每隔2个小时收集1*106个细胞，采用流式细胞术检测细胞表达CD69的比例。
本实施例中所涉及的相关步骤均在无菌超净台中完成。
本实施例中T细胞激活培养基重悬CD3ε+淋巴细胞，采用血球计数板细胞量，所使用的标准是将T细胞激活培养基调整细胞浓度为1*106/mL。
其中，本实施例中选用的细胞计数板的使用原理是：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
检测方法包括如下步骤：
1.视待测细胞悬液浓度，加相应培养基适当稀释，以每小格的细胞数可数为度；
2.取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片；
3.将细胞悬液用移液枪吹打均匀，用移液枪吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴(不宜过多)，让细胞悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余悬液。也可以将悬液直接滴加在计数区上(不要使计数区两边平台沾上悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高)，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)；
4.静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度；
5.计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格(即100小格)的细胞数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的细胞数(即80个小格)。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中；
6.测数完毕，取下盖玻片，用水将细胞计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存；
7.细胞计数板-计数公式
①.16格×25格的细胞计数板计算公式:细胞数/mL＝100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数；
②.25格×16格的细胞计数板计算公式:细胞数/mL＝80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数。
将本实施例获得的小鼠脾脏T淋巴细胞通过流式细胞术检测其活化纯度，结果如图1所示。
由图1可知，本发明的方法得到的T淋巴细胞的大部分细胞都已经活化，且活化纯度高达98％。由此证明，本发明活化T细胞的方法可以得到活化纯度高的T淋巴细胞，该方法具有实用性。
其中，流式细胞术的检测原理为：在一定的压力下，鞘液带着细胞通过喷嘴中心进入到流式照射室，在流式照射室的分析点，激光照射到细胞发生散射和折射，发射出散射光(包括前向散射光和侧向散射光)；同时细胞所携带的荧光素被激光激发并发射出荧光。
前向散射光(Forward scatter,FSC)和侧向散射光(side scatter,SSC)检测器把散射光转变成电信号。而荧光则被聚光器收集，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增检测器，把荧光信号也转变成电信号。这些电信号再经过数据化处理后输入电脑并储存，即可对细胞进行分析或分选。
使用检测方法包括如下步骤：
1.用1.5mL离心管分别收集培养不同时间的T淋巴细胞；
2.300×g离心力室温离心5分钟；
3.弃上清，加1mL磷酸盐缓冲液重悬细胞；
4.300×g离心力室温离心5分钟；
5.弃上清，适量磷酸盐缓冲液重悬细胞，血球计数板计数细胞数；
6.取1*106个细胞到新的1.5mL离心管中，用磷酸盐缓冲液调整体积到0.2mL；
7.加入1μL PE-anti mouse CD69流式抗体，移液枪轻轻吹打均匀，同时设置空白管和同型对照管；
8.室温避光孵育45分钟；
9.加1mL磷酸盐缓冲液轻轻吹打均匀，300×g离心力室温离心5分钟；
10.弃上清，加1mL磷酸盐缓冲液轻轻吹打均匀，300×g离心力室温离心5分钟；
11.加200μL磷酸盐缓冲液轻轻吹打均匀；
12.流式仪上机检测。
将实施例1与实施例2得到的T细胞进行活化率对比，结果如图2所示，其中，Group1为实施例1得到的T细胞的活化率与培养时间的变化曲线，Group2为实施例2得到的T细胞的活化率与培养时间的变化曲线。
由图2可知，实施例2得到的T细胞的活化率随着培养时间的延长缓慢升高，培养48小时后T细胞活化率依然很低；实施例1得到的T细胞的活化纯度随着时间延长明显递增，培养4小时后，T淋巴细胞活化率已经达到83％，培养8小时后T淋巴细胞活化率是90％，培养12小时后已经达到95.6％，并且继续培养到48小时的过程中，T淋巴细胞活化率没有明显变化。由此证明，本发明的方法有效的刺激了T淋巴细胞的活化，在8～12小时的时间内可以使得90％以上的T细胞活化。
本实施例的方法同样适用于小鼠外周淋巴结、粘膜上皮或外周血实施例的实施。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种体外活化小鼠T淋巴细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A.获取小鼠脾脏、外周淋巴结、粘膜上皮或外周血的淋巴细胞；
B.选出CD3ε+淋巴细胞，并检测其纯度；
C.用具有生物活性的抗小鼠CD3ε和CD28两种抗体包被48孔细胞培养板；
D.将步骤C所得的细胞培养板中加入活化T淋巴细胞的培养基重悬细胞；
E.将步骤D所得细胞板在CO2培养箱培养8～12小时。
2.根据权利要求1所述的活化小鼠T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤A中小鼠脾脏、外周淋巴结或粘膜上皮的获取与处理的方法为：将6～10周龄的清洁级小鼠，断颈处死，用体积分数为70～85％的酒精溶液浸泡3～10分钟；无菌取出脾脏、外周淋巴结或粘膜上皮，将其置于直径为10cm的培养皿中，所述培养皿中包括18mL磷酸盐缓冲液和2mL胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的活化小鼠T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤B中选用磁珠法筛选CD3ε+淋巴细胞，所述检测为流式细胞检测法。
4.根据权利要求1所述的活化小鼠T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤C中用于包被48孔细胞培养板所用的抗小鼠CD3ε和CD28两种抗体混合液的浓度分别为10μg/mL和2μg/mL，用pH值为7.6的磷酸盐缓冲液，现配现用，配制好后每孔加入100μL抗体混合液。
5.根据权利要求4所述的活化小鼠T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述抗小鼠CD3ε和CD28两种抗体混合液包被48孔细胞培养板后盖上培养板盖子，晃动培养板，使抗体混合液均匀覆盖培养板细胞培养孔内底部。
6.根据权利要求1所述的活化小鼠T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤D中细胞接种的48孔板，接种的细胞悬液的浓度为1*106/mL，每孔接种500μL细胞悬液。
7.根据权利要求1所述的活化小鼠T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤D中活化T淋巴细胞培养基以RPMI-1640为基础，添加如下成分，以达到如下浓度：体积分数为10％胎牛血清，1*104μmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，20μmol/L的L-谷氨酰胺，10μmol/L的丙酮酸钠，1μmol/L的非必需氨基酸溶液，50μmol/L的β-巯基乙醇和1*105单位/L的重组小鼠白介素-2蛋白。
CN201810631726.3A 2018-06-19 2018-06-19 一种体外活化小鼠t淋巴细胞的方法 Pending CN108841789A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810631726.3A CN108841789A (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种体外活化小鼠t淋巴细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810631726.3A CN108841789A (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种体外活化小鼠t淋巴细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108841789A true CN108841789A (zh) 2018-11-20

Family

ID=64202884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810631726.3A Pending CN108841789A (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种体外活化小鼠t淋巴细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108841789A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849891A (zh) * 2020-08-12 2020-10-30 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 培养实验鼠淋巴细胞的组合物及其培养方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090291498A1 (en) * 2004-02-26 2009-11-26 Immunovative Therapies Ltd. Biodegradable T-cell activation method
CN101851657A (zh) * 2010-04-06 2010-10-06 南开大学 报告基因小鼠t细胞体外培养分化模型及药物筛选方法的建立
CN106566806A (zh) * 2016-07-11 2017-04-19 英威福赛生物技术有限公司 体外培养富集cd8+t细胞的方法
CN106834228A (zh) * 2017-01-17 2017-06-13 上海市公共卫生临床中心 一种体外扩增cd8+t细胞及其细胞亚群的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090291498A1 (en) * 2004-02-26 2009-11-26 Immunovative Therapies Ltd. Biodegradable T-cell activation method
CN101851657A (zh) * 2010-04-06 2010-10-06 南开大学 报告基因小鼠t细胞体外培养分化模型及药物筛选方法的建立
CN106566806A (zh) * 2016-07-11 2017-04-19 英威福赛生物技术有限公司 体外培养富集cd8+t细胞的方法
CN106834228A (zh) * 2017-01-17 2017-06-13 上海市公共卫生临床中心 一种体外扩增cd8+t细胞及其细胞亚群的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIAO LI ET AL: "Therapeutic effects of tumor reactive CD4+ cells generated from tumor-primed lymph nodes using anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies", 《J IMMUNOTHER》 *
周俐斐 等: "CD3/CD28共刺激调节T细胞多重信号转导通路的基因mRNA表达", 《中国免疫学杂志》 *
娄强 等: "联合应用CD3/CD28单克隆抗体对小鼠T淋巴瘤细胞EL4活化的影响", 《中国免疫学杂志》 *
巴德年 主编: "《当代免疫学技术与应用》", 30 November 1998 *
张艳: "黄芩苷和黄芩素的抗炎和免疫调控作用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库电子期刊医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849891A (zh) * 2020-08-12 2020-10-30 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 培养实验鼠淋巴细胞的组合物及其培养方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dulbecco Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus
Rosenberg et al. A quantitative assay for transformation of bone marrow cells by Abelson murine leukemia virus.
CN103667176B (zh) 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用
Vogt et al. Localization of infectious virus and viral antigen in chick fibroblasts during successive stages of infection with Rous sarcoma virus
CN101638637B (zh) 人类骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒及干细胞分离方法
Galbraith et al. Identification of fusion of plant protoplasts II: Conditions for the reproducible fluorescence labelling of protoplasts derived from mesophyll tissue
CN106047804B (zh) 一种脂肪干细胞的纯化方法及干细胞在成骨诱导及成软骨诱导上的应用
CN102002475A (zh) 人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法
Walker et al. Characterization of subsets of bone marrow‐derived macrophages by flow cytometry analysis
CN106980018B (zh) 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用
CN106244553A (zh) 循环肿瘤细胞的分离和检测方法
CN107929751A (zh) 一种载药体系的建立及合成方法
CN107952078A (zh) 一种载药体系的合成方法及其新用途
CN104152409A (zh) 同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法
CN110241071A (zh) 一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用
CN108841789A (zh) 一种体外活化小鼠t淋巴细胞的方法
Danner et al. In vitro studies on Borna virus: I. The use of cell cultures for the demonstration, titration and production of Borna virus
CN108277199B (zh) 广谱低致瘤性mdck细胞系及其应用
CN107715117A (zh) 一种四面体结构的载药体系及制药用途
Sharma et al. Characterisation of Pasteuria isolated from Heterodera cajani using morphology, pathology and serology of endospores
CN105462917B (zh) 一种牙周膜干细胞成脂分化诱导液及方法
CN107227296A (zh) 一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法
Noyes Studies on the human wart virus II. Changes in primary human cell cultures
CN101550409B (zh) 一种增强骨髓间充质干细胞抗细胞凋亡能力的处理方法
Adam et al. Isolation and culture of aphid cells for the assay of insect-transmitted plant viruses

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181120