CN101851657A - 报告基因小鼠t细胞体外培养分化模型及药物筛选方法的建立 - Google Patents

Abstract

一种荧光报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及药物筛选方法，以及利用4get(IL-4/GFP-enhanced transcript)小鼠筛选治疗哮喘病药物的具体方法，包括T细胞体外培养分化、同时刻药物高通量筛选及流式细胞仪检测。本发明中的T细胞体外培养分化与药物筛选分别涉及免疫学与化学生物学领域，应用特有的荧光报告基因小鼠在T细胞分化过程中可指示特定细胞因子的产生，具备高通量筛选小分子药物及天然产物提取物的能力。基于该模型的药物筛选平台可用于筛选新药，以及开发一批对机体免疫反应和对T细胞分化、重要细胞因子分泌具有调控作用的药物。

Description

报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及药物筛选方法的建立

【技术领域】：本发明涉及免疫学中T细胞培养分化和药物筛选技术领域，更具体地，本发明涉及荧光报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及其药物筛选平台的建立方法，以及利用该方法筛选治疗哮喘病的药物。

【背景技术】：初始CD4⁺T细胞在不同的因子诱导下，分化成为功能及表型不同的效应性Th细胞和调节性T细胞(Treg)，并表达特定的细胞因子执行其功能：在IL-12和anti-IL4作用下向Th1分化，产生IFN-γ等，诱导细胞介导的免疫反应；在IL-4和anti-IFN-γ作用下向Th2分化，产生IL-4等，诱导细胞介导的免疫反应；在IL-6和TGF-β作用下向Th17分化，产生IL-17等，诱导炎症反应；在TGF-β作用下向Treg分化，产生IL-10等，实行免疫抑制。T细胞亚群含量和比例及其产生的细胞因子与各种疾病的发生密切相关，过高或过低都有可能导致疾病的发生。

报告细胞因子的荧光报告基因小鼠是转基因技术的应用，是在T细胞分化后产生的特定细胞因子(例如Th2分化中IL-4)基因下游连接荧光蛋白编码序列，使细胞因子的产生可以被荧光蛋白报告，并能被荧光探测系统检测到的一种技术。

传统T细胞体外培养分化途径如下：

(1)脾细胞的分离与计数；

(2)细胞的激活培养；

(3)再刺激与抑制蛋白分泌；

(4)表面染色与胞内染色检测分化；

T细胞体外培养分化的形态学特征如附图1所示。

传统T细胞培养分化一般需要4-5天，经激活培养、再刺激、抑制蛋白分泌、胞内染色(此时产生的大量细胞因子)等步骤检测是否分化为Th细胞或调节性T细胞(Treg)，其中再刺激、抑制蛋白分泌、胞内染色等技术是鉴定初始CD4⁺T细胞是否分化以及分化成为何种Th或Treg细胞的必要手段。要用到包被好Anti-mouse-CD3和Anti-mouse-CD28的培养板，以及Golgi-plug、甲醛、Saponin来对细胞行固定打孔，还要使用荧光标记的胞内细胞因子抗体进行胞内染色。而此过程不仅使筛选药物变得繁琐耗时、增加成本费用，也无法实现高通量筛选。基本步骤如下：

1、超净台内取哺乳动物脾脏、淋巴结，用注射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；

2、96孔包被板Anti-mouse-CD3(10μg/ml)和/或Anti-mouse-CD28(1μg/ml)中，以2×10⁶个细胞/mL密度、200μl每孔培养于RPMI培养基内，并加入抗体与细胞因子刺激初始CD4⁺T细胞分化；

3.48h换液，视细胞密度转孔，加入新鲜的IL-2(2ng/mL)刺激1天；

4.72h转到另外包被好的96孔板再刺激。37℃，2-4h；

5.加Golgi-plug，37℃ 2h；

6.收细胞于流式管，荧光抗体APC-Anti-mouse-CD4或PE-Anti-mouse-CD4，200倍稀释(即终浓度1μg/ml)表面染色，遮光冰浴15min；

7.PBS洗去未结合的抗体，离心、弃上清；

8.每管加2％甲醛(in PBS溶液)2mL，室温固定30min；

9.PBS洗去甲醛，离心、弃上清；

10.加入2mL配制好的0.5％Saponin溶液，轻轻混匀，遮光室温打孔30min；

11.离心、弃上清，加Saponin buffer 100μL，胞内染色遮光冰浴30min；

12.Saponin buffer洗2遍，PBS洗1遍；

13.每管样品重悬在0.5mL PBS中，流式细胞仪检测(表达某种细胞因子的Tcell)/CD4⁺T cell百分率。

该种T细胞体外培养分化方法存在的缺点是：步骤繁琐，耗费时间长，难以应用于药物高通量筛选。需要的成本较高，Anti-mouse-CD3，Anti-mouse-CD28，Golgi-plug，Saponin一般实验室难以获得、且价格昂贵，并非所有实验室都有这个条件，繁琐的步骤使得每组数据的平行性很难控制，并且容易受制于胞内染色技术不成熟，常常得不到好的结果。

【发明内容】：本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，通过荧光报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及筛选平台的建立，提供一种省时高效、高通量完成与机体免疫系统各种细胞因子相关的药物的筛选方法。

本发明提供的T细胞体外培养分化模型及药物筛选方法，包括如下步骤：

第一、超净台内取荧光报告基因哺乳动物脾脏、淋巴结，浸于1640培养液中，用注射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；

第二、96孔板中，以1×10⁶--10⁷个细胞/mL密度、200μl每孔培养于RPMI培养基内；

第三、将第二步的96孔板分成实验组和对照组，并与第四步同时刻或早于第四步向实验组加入待筛选药物，向对照组加入待筛选药物中使用的溶剂DMSO或H₂O；

第四、向第二步的96孔板中加入抗体与细胞因子刺激初始CD4⁺T细胞分化；

第五、48h收取96孔板中细胞，行CD4表面染色后，用流式细胞仪检测荧光报告基因EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率，即分化出的T细胞占总体CD4⁺T细胞的比例；

第六、与对照组相比，能够使EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率有显著增高或者降低的药物为候选药物，并用药物剂量效应关系进一步验证。

第一步所述的哺乳动物可以是荧光报告基因小鼠或大鼠。

第二步所述的细胞接种密度为2×10⁶/mL。

第三步所述的加入药物时刻为-1h或0h。

第四步所述的抗体为包被或可溶的Anti-mouse-CD3(5μg/ml)和/或Anti-mouse-CD28(1μg/ml)。

第四步所述的抗体还可以为刀豆蛋白ConA(2.5ng/ml)。

第四步所述的细胞因子为IL-2(2ng/ml)，以及根据要求T细胞分化的方向需要加入的细胞因子，包括，向Th1分化加入IL-12(5ng/ml)和/或Anti-IL-4(10ug/ml)；向Th2分化加入IL-4(20ng/ml)和/或Anti-mouse-IFN-γ(10μg/ml)；向Treg分化加入TGF-beta(5ng/ml)；向Th17分化加入TGF-beta(5ng/ml)、IL-6(20ng/ml)、IL-21(50ng/ml)、IL-23(10ng/ml)或IL-27(20ng/ml)。

第五步所述的EGFP T cell为任一荧光标示的Tcell，例如RFP、cy5标示的T cell等。

此外，第一步所述的单细胞悬液系全脾与淋巴结细胞混合，在得到候选药物后可以将全脾与淋巴结单细胞悬液行CD44、CD62L表面染色，分选出纯度高的初始CD4⁺T细胞(CD44^LowCD62L^Hight)继续第二步至第六步验证。

此方法可以通过荧光报告基因检测荧光蛋白标记细胞因子的产生，筛选影响初始T细胞分化和细胞因子分泌的小分子药物。

本发明提供的4get小鼠(EGFP可报告Th2分化中IL-4的产生)T细胞体外培养分化模型及药物筛选方法的具体步骤如下：

(1)超净台内取4get小鼠脾脏、淋巴结浸于RPMI1640培养液中，以注射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；

(2)96孔板中(无需包被)，以2×10⁶个细胞/mL密度、200μl每孔培养于RPMI培养基内，并加入conA(2.5μg/ml)、IL-2(2ng/ml)、IL-4(20ng/ml)和或Anti-mouse-IFN-γ(10μg/ml)刺激初始CD4⁺T细胞向Th2分化；

(3)同时刻，96孔板各孔中加入药物(即0小时加药)：实验组加入待筛选药物，设立对照组加入待筛选药物溶解过程使用的溶剂DMSO或H₂O；

(4)48h收每孔细胞于流式管，荧光抗体APC-Anti-mouse-CD4(0.2mg/ml)表面染色，遮光冰浴15min；

(5)PBS洗去未结合的抗体，离心、弃上清；

(6)每管样品重悬在0.5mL PBS中，流式细胞仪检测EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率。

此方法可以通过检测EGFP标记的IL-4，筛选影响初始T细胞向Th2分化和调节IL-4分泌的小分子药物，由于该模型产生的IL-4是介导哮喘疾病发生的主要细胞因子，与人类的哮喘病发病机理相似，故可应用于筛选治疗哮喘病药物。

本发明的优点和积极效果：

本发明与传统T细胞体外培养分化的方法比较具有如下优点：

1、极大地节省了时间、工作量。48h既能完成上百种药物的筛选，缩短了时间；该方法应用简单，并且不需要复杂的包板再刺激与胞内染色，大大节省了劳动量。

2、降低成本。由于应用荧光报告基因小鼠及可溶性抗体(无需包板)，省略了包板、再刺激、胞内染色等繁琐步骤，节省了昂贵的包板抗体与胞内荧光染色抗体。

3、确保高通量筛选平台的建立。由于应用了可溶性抗体(ConA)以及不需要人工的包板、转孔、换液等步骤，可以达到计算机控制的自动化水平，现有的多种类荧光报告基因小鼠可以确保高通量药物筛选平台的建立。

4、结果准确。采用荧光报告基因小鼠，化合物的药效结果可以通过光学强度的改变表现出来，避免了因胞内染色技术不成熟导致的实验结果不稳定或失败，是国际前沿的高通量筛选体系。

5、应用广泛。机体免疫功能的改变直接与体系的荧光强度相连，这些重要的免疫过程与很多重大疾病相关，包括各种癌症，糖尿病，病毒感染，自身免疫疾病红斑狼疮，类风湿性关节炎等。我们的筛选模型可以用于广泛疾病的新药筛选。

【附图说明】：

图1是初始T细胞培养向Th2分化示意图，图1(a)0h初始T细胞培养，细胞相对圆而小；图1(b)24h T细胞培养及向Th2分化情况，细胞出现变形；图1(c)48h T细胞培养及向Th2分化情况，更多细胞发生变形，并有明显集落形成；放大倍数：40×10；黑色箭头：激活的T细胞形成的集落。图1(d)T细胞体外培养48h向Th2分化流式散点图，经流式细胞仪检测对照组(不加药物)EGFP T细胞/CD4+T细胞百分率为59％。

图2、图3、图4是实施例1示意图，从1-8号药物中初步筛选出4号药物可抑制初始T细胞向Th2分化。图2：1-8号药物结构式；图3：初筛(a)加入药物溶剂DMSO对照组，(b)-(i)加入1-8号药物组；(j)结果统计，流式细胞仪检测加入4号药物组EGFP T细胞/CD4+T细胞百分率为22％；图4-1药物剂量效应关系(a)-(l)0h施加不同浓度4号药物，48h后初始T细胞向Th2分化情况；每排为一个浓度梯度的三次重复，浓度如图中标出；图4-2(m)结果统计，误差线为三次独立重复实验的标准差；与DMSO control比较，5μg/ml浓度下4号药物具有显著的抑制Th2分化作用，EGFP T细胞/CD4+T细胞百分率为22.37％(以control为100％)p＜0.01；

图5、图6是实施例2示意图，从1-81种天然提取物中初步筛选出27、29号小分子化合物可抑制初始T细胞向Th2分化过程中IL-4细胞因子的产生。图5：初筛(a)R1画门在淋巴细胞；(b)R2画门在CD4+T细胞；(c)加入药物溶剂DMSO对照组，(d)-(g)加入26-29号药物组(散点图显示为R1&R2门)；(h)结果统计，流式细胞仪检测加入27，29号药物组EGFP T细胞/CD4+T细胞百分率分别为38％、13％(以control为100％)；图6-1药物剂量效应关系(a)-(n)号，图6-2药物剂量效应关系(o)-(w)号及结果统计(x)，其中，(a)R1画门在淋巴细胞；(b)R2画门在CD4+T细胞；(c)-(e)加入药物溶剂DMSO对照组，(f)-(w)0h施加不同浓度27、29号药物，48h后初始T细胞向Th2分化情况；每排为一个浓度梯度的三次重复，药物及浓度如图左所示；图(x)结果统计，误差线为三次独立重复实验的标准差；与DMSO control比较，10nmol/ml浓度下29号药物具有显著的抑制Th2分化作用，EGFP T细胞/CD4+T细胞百分率为21.64％(以control为100％)，p＜0.01；。

【具体实施方式】：

实施例1：

应用4get小鼠从1-8号药物中初步筛选出4号药物可抑制初始T细胞向Th2分化过程中IL-4细胞因子的产生

(1)超净台内取4get小鼠脾脏、淋巴结浸于1640培养液中，以注射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；

(2)96孔板中(无需包被)，以2×10⁶个细胞/mL密度、200μl每孔培养于RPMI培养基内，并加入conA(2.5μg/ml)与IL-2(2ng/ml)、IL-4(20ng/ml)刺激初始CD4⁺T细胞向Th2分化；

(3)同时刻，96孔板各孔中加入药物(即0小时加药)：实验组加入待筛选1-8号药物【结构式见图2(1-8)，终浓度1μg/ml】，对照组加入待筛选药物溶剂DMSO；

(4)48h收每孔细胞于流式管，荧光抗体APC-Anti-mouse-CD4(终浓度1μg/ml)表面染色，遮光冰浴15min；

(5)PBS洗去未结合的抗体，离心、弃上清；

(6)每管样品重悬在0.5mL PBS中，流式细胞仪检测EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率。结果如图3(a)-(i)，4号药物可显著降低EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率如图3(j)。

(7)为进一步验证4号药物的抑制作用，于T细胞体外培养分化0小时加入不同浓度的4号药物：实验组加入4号药物浓度分别为0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml，每浓度设三个重复，对照组加入待筛选药物溶剂DMSO；48h检测EGFP T cell/CD4⁺Tcell百分率，4号药物浓度在5μg/ml时可显著抑制IL-4产生【见图4(m)】。

实施例2

应用4get小鼠从1-81种天然提取物中初步筛选出27、29号小分子化合物可抑制初始T细胞向Th2分化过程中IL-4细胞因子的产生

(1)超净台内取4get小鼠脾脏、淋巴结浸于1640培养液中，以注射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；

(2)96孔板中(无需包被)，以2×10⁶个细胞/mL密度、200μl每孔培养于RPMI培养基内，并加入conA(2.5μg/ml)与IL-2(2ng/ml)、IL-4(20ng/ml)刺激初始CD4⁺T细胞向Th2分化；

(3)同时刻，96孔板各孔中加入药物(即0小时加药)：实验组加入待筛选1-81种天然提取物(终浓度10nmol/ml)，对照组加入待筛选药物溶剂DMSO或H₂O；

(4)48h收每孔细胞于流式管，荧光抗体APC-Anti-mouse-CD4(终浓度1μg/ml)表面染色，遮光冰浴15min；

(5)PBS洗去未结合的抗体，离心、弃上清；

(6)每管样品重悬在0.5mL PBS中，流式细胞仪检测EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率。

其中加入27、29号小分子化合物组EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率分别为38％、13％(以control为100％)【见图5(h)，仅附1-81种天然提取物中四种化合物的检测结果】。

(7)药物剂量效应关系：为进一步验证初筛结果(即27、29号小分子化合物的抑制作用)，于T细胞体外培养分化0h加入不同浓度的27、29号小分子化合物：三个浓度梯度分别为0.1nmol/ml、1nmol/ml、10nmol/ml，每浓度设三个重复，对照组加入待筛选药物溶剂DMSO；48h检测EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率，29号小分子化合物浓度在10nmol/ml时可显著抑制IL-4产生【见图6(x)】。

Claims (10)

1.一种报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及药物筛选的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

第一、超净台内取荧光报告基因哺乳动物脾脏、淋巴结，浸入1640培养基，用注射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；

第二、96孔板中，以1×10⁶--10⁷个细胞/mL密度、200μl每孔培养于RPMI培养基内；

第三、将第二步的96孔板分成实验组和对照组，并与第四步同时刻或早于第四步向实验组加入待筛选药物，向对照组加入待筛选药物中使用的溶剂DMSO或H₂O；

第四、向第二步的96孔板中加入抗体与细胞因子刺激初始CD4⁺T细胞分化；

第五、48h收取96孔板中细胞，行CD4表面染色后，用流式细胞仪检测分化出的T细胞占总体CD4⁺T细胞的比例，即EGFPT cell/CD4⁺T cell百分率；

第六、与对照组相比，能够使EGFP T cell/CD4⁺T cell百分率有显著增高或者降低的药物为候选药物，并用药物剂量效应关系进一步验证。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一步所述的哺乳动物是荧光报告基因小鼠或大鼠。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于第二步所述的细胞接种密度为2×10⁶/mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于第三步所述的加入药物时刻为-1h或0h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的抗体为包被或可溶的浓度为5μg/ml的Anti-mouse-CD3和/或浓度为1μg/ml的Anti-mouse-CD28。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的抗体为刀豆蛋白浓度为2.5ng/ml的ConA。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的细胞因子为2ng/ml IL-2，以及根据要求T细胞分化的方向需要加入的细胞因子，包括，向Th1分化加入5ng/ml IL-12和/或10ug/ml Anti-IL-4；向Th2分化加入20ng/ml IL-4和/或10μg/ml Anti-mouse-IFN-γ；向Treg分化加入5ng/ml TGF-beta；向Th17分化加入5ng/ml TGF-beta、20ng/ml IL-6、50ng/ml IL-21、10ng/ml IL-23或20ng/ml IL-27。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于第五步所述的EGFP T cell为任一荧光标示的T cell。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于第五步所述的EGFP T cell为RFP或cy5标示的T cell。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一步所述的单细胞悬液含有全脾与淋巴结细胞混合，在得到候选药物后可以将全脾与淋巴结单细胞悬液行CD44、CD62L表面染色，分选出纯度高的CD44^LowCD62^LHight初始CD4⁺T细胞继续第二步至第六步验证。

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