CN103642753A - 人cd3+cd8+cik细胞制备的专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒。该人CD3+CD8+CIK细胞专用试剂盒由强化细胞毒活性培养基、细胞激活增值培养基、CD3+CD8+T淋巴细胞诱导分化培养基和CD3+CD8+CIK细胞扩增培养基组成。上述各种培养基的溶剂均为pAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种培养基，溶质分别为1000IU／ml的IFN-γ；100ng／ml的抗CD3单抗、200ng／ml的抗CD28单抗、1ng／ml的IL-1α、1000IU／ml的IL-2；10μg/m1的BCG；1000IU／ml的IL-2。
Description
技术领域
本发明涉及一种人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒，特别涉及一种能够培养出以CD3+CD8+T淋巴细胞为主要效应细胞的专用试剂盒。
背景技术
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell，CIK)是Schmidt等于1986年报的从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中诱导出的一群异质性细胞。其主要效应细胞因同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，因此又被称为NK细胞样T淋巴细胞(NKT细胞)。体内外的实验研究表明，CIK细胞具有杀瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及杀瘤效应不受癌细胞多重耐药的影响等优势。经典的同时也是目前最常用的CIK细胞培养方法是IFN-γ、抗CD3单抗、1L-1α与IL-2共同培养产生CIK细胞，其具体步骤为：将外周血分离的PBMCs用含10％的FCS的RPMI-1640培养基悬浮，调整密度为2×106／ml，培养第0天加入1000U IFN-γ，24h加入100ng／ml的抗CD3单抗、100U IL-1α与300U IL-2，每3天补加300U IL-2及新鲜培养基，控制细胞密度为1～2×106／ml，连续培养21天，其主要效应细胞--NKT细胞，扩增约1000倍，含量占细胞群体的14％左右。上述经典的方案却存在以下问题：(1)CIK细胞中绝大部分群体为CD3+CD8+T淋巴细胞，大约占CIK细胞的60％左右，然而其杀瘤活性却受到极大的限制；这与目前的CD3+CD8+T淋巴细胞，也即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是抗肿瘤的主要免疫效应细胞的认识存在差异。(2)虽然主要效应细胞--NKT细胞，扩增1000倍左右，但整体细胞群体扩增能力较为有限，大约80～100倍左右。目前虽然有很多改进的方案，但是这两个根本的问题依然没有很好的解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够培养出以CD3+CD8+T淋巴细胞为主要效应细胞的专用试剂盒。
本发明所提供的一种能够培养出以CD3+CD8+T淋巴细胞为主要效应细胞的专用试剂盒，由强化细胞毒活性培养基、细胞激活增值培养基、CD3+CD8+T淋巴细胞诱导分化培养基和CD3+CD8+CIK细胞扩增培养基组成。
作为优选，所述强化细胞毒活性培养基的溶剂为PAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种，溶质为IFN-γ，其中IFN-γ的浓度为500-1500IU／ml。
作为优选，所述细胞激活增殖培养基的溶剂为PAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种，溶质为抗CD3单抗、抗CD28单抗、IL-1α与IL-2组成，其中抗CD3单抗浓度为50～500ng／ml、抗CD28单抗的浓度为50～500ng／ml、IL-1α的浓度为0.5～5ng／ml、IL-2的浓度为50～1000IU／ml。
作为优选，所述CD3+CD8+T淋巴细胞诱导分化培养基的溶剂为PAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种，溶质为卡介苗(bacillusCallmette-Guerin，BCG)，其中BCG的浓度为5～20μg／ml。
作为优选，所述CD3+CD8+CIK细胞扩增培养基的溶剂为PAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种，溶质为IL-2，其中IL-2的浓度为1000IU／ml。
进一步地，所述强化细胞毒活性培养基中IFN-γ的浓度为1000IU／ml。
作为优选，所述细胞激活增殖培养基中抗CD3单抗浓度为100ng／ml、CD28单抗的浓度为200ng／ml、IL-1α的浓度为1ng／ml、IL-2的浓度为1000IU／ml。
作为优选，所述CD3+CD8+T淋巴细胞诱导分化培养基中BCG的浓度为10μg／ml。
本文中的“CD3+CD8+CIK细胞”表示CD3和CD8均为阳性的CIK细胞。
进一步优选地，强化细胞毒活性培养基、细胞激活增值培养基、CD3+CD8+T淋巴细胞诱导分化培养基和CD3+CD8+CIK细胞扩增培养基的PH是7.2～7.4。
所述人CD3+CD8+CIK细胞是以CD3+CD8+T细胞为主要效应细胞的异质性细胞群体，该细胞高表达人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人αβTCR受体，约占异质性细胞群体的90％。
本发明的另一个目的是提供一种培养人CD3+CD8+CIK细胞的方法。
该方法为按照专属试剂盒操作说明书要求并补加1％～10％自体血浆的条件下，其主要效应细胞为CD3+CD8+T细胞，含量约占异质性细胞群体的90％。
本发明通过在经典的CIK细胞制备方法的基础上，添加新的细胞因子及非特异性免疫刺激剂，开发出更加有效的人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒，从而使其选择性强，可以从人PBMCs中诱导出以CD3+CD8+T细胞为主要效应细胞的异质性细胞群体。用该人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒获得的人CD3+CD8+CIK细胞能够直接配合传统的手术、化疗和放疗等治疗方式进行体内回输，直接用于癌症病人的治疗，可达到在常规疗法清除大量肿瘤细胞后，进行清除少量残留或扩散的肿瘤细胞，以提高、巩固肿瘤治疗效果，减少复发、提高生活质量的目的；或者对癌症高危人群进行直接回输进行预防。
附图说明
1.图1不同培养方式培养的外周血来源PBMCs生长曲线(n=8)；外周血来源的PBMCs。通过不同方式培养，在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数，将当前细胞总数除以开始培养时(第0天)的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍数。CIK组：指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；CD3CD8CIK组：指本发明采用的培养方法。
2.图2采用流式细胞仪进行免疫表型检测(n=8)。外周血来源的PBMCs，通过不同方式培养，在第14天取细胞进行流式荧光抗体：抗CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PECY5.5、CD56-APC进行表面染色并检测。CIK组：指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；CD3CD8CIK组：指本发明采用的培养方法。
3.图3采用CCK-8细胞毒活性检测试剂盒对不同培养方式培养的外周血来源PBMCs进行细胞毒性检测。通过不同方式培养，在第14天取细胞通过CCK-8试剂盒进行细胞毒活性检测。CIK组：指采用经典最常用的培养法培养的CIK细胞；CD3CD8CIK组：指本发明采用的培养方法；CD3CD8T组：培养13天的CD3+CD8+CIK细胞，首先对CD3+细胞进行流式分选，然后通过抗CD8流式荧光抗体进行分选，所获得的细胞则为CD3+CD8+T淋巴细胞；NKT组：培养13天的CD3+CD8+CIK细胞，首先对CD3+细胞进行流式分选，然后通过抗CD56流式荧光抗体进行分选，所获得的细胞则为NKT淋巴细胞。横坐标：E：T=10：1表示效应细胞与靶细胞的比值为10：1，E：T=20：1表示效应细胞与靶细胞的比值为20：1，E：T=40：1表示效应细胞与靶细胞的比值为40：1。
具体实施方式
下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
实施例1
本实施例1是分离获得的PBMCs并进行CD3+CD8+CIK细胞的培养。包括以下步骤：
1.采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为：1500转／分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1：2的比例加入离心管中，2000转／分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转／分，1300转／分，均离心7分钟，即得到PBMCs。
2.将上述PBMCs重悬于含10％自体灭活血浆的PAATM或者GT-T551TM等商品化无血清培养基中，调整细胞密度2×106／ml左右，并加入IFN-γ至终浓度1000IU／ml，最后转移入培养瓶内进行培养。
3.培养24小时后加入抗CD3单抗、抗CD28单抗、IL-1α、IL-2，48小时后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin，BCG)连续培养14～21天，其中每2～3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在1～2×106／ml。
4.24小时后所使用的抗CD3单抗浓度为100ng／ml，抗CD28单抗的浓度为200ng／ml，IL-1α的浓度为1ng／ml，IL-2的浓度为1000IU／ml；48小时后加入BCG的浓度为10μg／m。
实施例2
本实施例2是对CD3+CD8+CIK细胞进行形态学和增值能力检测。包括以下步骤：
1.细胞培养24小时即可见CD3+CD8+CIK细胞沉于培养瓶的底部，仍呈单细胞状态，48小时趋于集落化，培养3天后就可以看到大的集落和不规则的单个核细胞。对培养12～14天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见1个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。取培养12～14天的细胞100μl，加入100μl0.4％台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。本发明制备的细胞活力大于95％。
2.在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数，将当前细胞总数除以开始培养时的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍数，以此进行动态观察细胞增殖情况并作为细胞补加新鲜培养基时的参考，细胞增殖倍数见图1、表1。
表1：不同培养方式培养的外周血来源PBMCs扩增倍数(n=8)
结果显示，随着培养时间的延长，两组细胞的扩增倍数均在提高，CD3CD8CIK组在每个时间节点上的扩增倍数均高于CIK组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组细胞的高速扩增期均集中在10～19天，到21天达到最高峰。
实施例3
本实施例3是对CD3+CD8+CIK细胞进行免疫表型检测。步骤如下：
取第14天的细胞，用含5％新生牛血清和0.1％叠氮纳的PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106／ml，每个检测管内加入50μ1细胞悬液，加入荧光标记抗体(抗CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PECY5.5、CD56-APC)染色，4℃避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有1％多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用WinMDI软件分析，结果见图2、表2。
表2：不同培养方式对外周血来源PBMCs表型影响(n=8)
结果显示，培养第14天，两组细胞中CD3+、CD3-CD56+细胞之间差异无统计学意义；CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞中，CD3CD8CIK组高于CIK组，且差异均有统计学意义(P<0.01)；CD3+CD4+细胞中，CD3CD8CIK组低于CIK组，差异有统计学意义(P<0.01)。
实施例4
本实施例4是对CD3+CD8+CIK细胞及其不同亚型进行细胞毒活性检测。包括以下步骤：
1.取一半培养13天的CD3+CD8+CIK细胞，首先对CD3+细胞进行流式分选，然后分别通过抗CD8和抗CD56流式荧光抗体进行分选，所获得的细胞则分别为CD3+CD8+T淋巴细胞和NKT细胞，然后进行过夜培养。
2.取培养第14天的CD3+CD8+CIK细胞以及经过分选并过夜培养获得的CD3+CD8+T淋巴细胞和NKT细胞，检测对K562肿瘤细胞株的杀伤活性。
3.调整K562的细胞密度为4×104／孔，96孔板，每孔100μ1，按1：10、1：20、1：40的比例分别与CD3+CD8+CIK细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞和NKT细胞混合，各浓度均设置3复孔，同时设置单独靶细胞(肿瘤细胞)对照、单独效应细胞(CD3+CD8+CIK细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞、NKT细胞和CIK细胞)对照和单独培养基空白对照。
4.置于37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱内培养24小时后，每孔加入10μl的CCK-8溶液，再培养4h，然后用酶标仪于450nm波长处测定吸光度(OD)值。
5.根据公式：杀瘤率(％)=[1一(实验组OD值一效应细胞组OD值)]／(效应细胞组OD值)×100％，计算杀瘤效率。其中，公式中各OD值均为减去空白对照组OD值后的值。结果见图3表3。
表3：不同培养方式对外周血来源PBMCs细胞毒活性影响(n=8)
结果显示，不同效靶比之下，CIK组与CD3CD8CIK、CD3CD8T及NKT细胞组之间差异具有统计学意义(P<0.01)；CD3CD8CIK、CD3CD8T及NKT细胞组之间差异无统计学意义。这说明CD3+CD8+CIK细胞经过改进的方案诱导后，占绝大部分比例的CD3+CD8+T细胞的细胞毒活性明显提高，其杀伤活性与原CIK培养方案中主要效应细胞NKT细胞的细胞毒活性相当，从而使CD3+CD8+CIK细胞整体细胞毒活性也明显提高，与NKT细胞的细胞毒活性相当。
Claims (7)
1.一种人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒，其特征在于，包括：
(1)强化细胞毒活性培养基；
(2)细胞激活增殖培养基；
(3)CD3+CD8+T淋巴细胞诱导分化培养基；
(4)CD3+CD8+CIK细胞扩增培养基。
2.根据权利要求1所述人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒，其特征在于，所述强化细胞毒活性培养基的溶剂为PAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种，溶质为IFN-γ，其中IFN-γ的浓度为500-1500IU／ml。
3.根据权利要求1或2所述人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒，其特征在于，所述细胞激活增殖培养基的溶剂为PAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种，溶质包括抗CD3单抗、抗CD28单抗、IL-1α与IL-2中的一种或者几种，其中抗CD3单抗浓度为50～500ng／ml，抗CD28单抗的浓度为50～500ng／ml，IL-1α的浓度为0.5～5ng／ml，IL-2的浓度为50～1000IU／ml。
4.根据权利要求3所述人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒，其特征在于，所述CD3+CD8+T淋巴细胞诱导分化培养基的溶剂为PAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种，溶质为BCG，其中，BCG的浓度为5～20μg／ml。
5.根据权利要求1或2或4所述人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒，其特征在于，所述CD3+CD8+CIK细胞扩增培养基的溶剂为PAATM培养基、GT-T551TM培养基、Opti-MEMTM培养基、RPMI-1640培养基中的任意一种，溶质为IL-2，其中IL-2的浓度为1000IU／ml。
6.根据权利要求1所述人CD3+CD8+CIK细胞制备的专用试剂盒，其特征在于，所述强化细胞毒活性培养基、细胞激活增殖培养基、CD3+CD8+T淋巴细胞诱导分化培养基和CD3+CD8+CIK细胞扩增培养基的PH是7.2～7.4。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述专用试剂盒培养人CD3+CD8+CIK细胞的方法，其特征在于，所述专用试剂盒需要与1％～10％的自体血浆配合使用，其主要效应细胞为CD3+CD8+T细胞，含量约占异质性细胞群体的90％。
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