CN115011548B - 细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法 - Google Patents

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Abstract

细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，包括：S1.将固定于Matrigel中的PDLO消化下来，添加培养基制备成PDLO悬液并计数；S2.悬浮培养PDLO悬液，以修复消化下来的PDLO；S3.将单克隆菌落培养制备为定量细菌悬液；S4.将定量细菌悬液加入PDLO悬液中，建立细菌感染肺类器官模型；以及S5.提取原代PBMC计数后加入细菌感染肺类器官模型中，以构建细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系。本方法构建了多细胞种类的PDLO并与常见致病菌及外周血单个核细胞共培养，能够显著提高PDLO细菌感染肺类器官模型与免疫微环境混合共存体系的构建效率，有效且稳定地模拟人体肺部感染后的机体抗感染反应及免疫反馈的过程。

Description

细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法
技术领域
本发明涉及细胞感染技术领域，尤其涉及一种细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法。
背景技术
“类器官(Organoid)”一词早在1946年便被用来描述肿瘤的某些组织学特征[1]。然而，直到2009年肠类器官的发展[2]，它才开始专用于描述自组织的体外结构。类器官可用于模拟人体器官发育和各种疾病的病理变化[3]，而患者来源的类器官(Patient-derivedOrganoid,PDO)则可以进行广泛的分子诊断和药物筛选，有望以个体化的方式预测机体对药物反应。目前，对于PDO的研究主要应用于各类肿瘤的免疫调节方面，在感染性疾病免疫调节中的应用很少。
在COVID-19的疾病进程中，患者的自身免疫功能也同时影响着病情变化。疾病早期患者仅表现为病毒性感染的一般症状，如果患者的免疫系统过度激活、炎症因子急剧增加，形成炎症因子风暴后，死亡率由轻型或普通型的＜4％显著增长至重型或危重型的＞50％[5-8]。因此，病程早期进行免疫调节治疗对降低重症转化率和死亡率有重要意义[9,10]。不仅针对病毒性感染，全身免疫功能失调是多种病原体感染性疾病的病理生理基础的基本分子机制，可以导致严重的脓毒症和败血症性休克[11]。免疫系统在炎症性疾病中发挥的重要作用也备受关注。
肺类器官(Lung organoid)主要由两种来源的细胞构建而成：从成熟肺组织分离的上皮干/祖细胞[12]和人类多能干细胞[13-15]，前者来源的肺类器官称之为患者来源肺类器官(Patient-derived Lung Organoid,PDLO)，主要包括基底祖细胞、气道分泌细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial type 2,AT2 cells) 等。建立PDLO有助于进一步了解人类肺部的发育过程和肺部疾病的病理生物学，这两点都是寻找治疗呼吸系统疾病新方法的关键。目前为止，人类肺部发育、修复和再生的几个重要研究结果都是从小鼠模型中推断出来的[16]。然而，人与鼠的肺组织之间存在着许多内在差异，如基底细胞遍布于人体气道，但在小鼠中仅限于气管，亦如杯状细胞在人呼吸道中常见，但在小鼠中少见等。虽然肺上皮细胞系能够表现出人类肺组织的一些表性特征，但这些细胞系只能单层培养，并且很难通过其进一步了解肺组织发育和形成过程的影响因素，如上皮-间充质相互作用和分支形态发生等[17]。因此，建立能够还原人体环境的体外模型是准确研究人肺发育和疾病病程的关键。
目前，在寻找哮喘和肺囊性纤维化等疾病的新疗法以及内源性修复在慢性阻塞性肺病、肺气肿、家族性和特发性肺纤维化和闭塞性细支气管炎综合征等疾病中作用的研究方面，PDLO具有很大的应用前景[18,19]。但在呼吸系统细菌性感染疾病的领域中，却很少见到应用PDLO的研究报道。既往的研究中，为了能够控制感染类器官的病原体数量从而得到固定的感染复数(multiplicity of infection，MOI)，同时观察感染类器官与免疫细胞之间的相互作用，制备的类器官感染模型则采用将定量的衣原体显微注射入单个子宫内膜类器官的方法构建[20]。而在肺类器官感染性疾病的研究中，制备的肺类器官病毒感染模型大多数使用的是人类多能干细胞(human pluripotent stem cell，hPSC)诱导分化而来的肺类器官[21-23]，少部分采用了只具备单一细胞种类的PDLO[24]。仅有的两篇肺类器官非病毒感染的研究中，也都采用了隐孢子虫和结核分枝杆菌显微注射进肺类器官的感染方式[25,26]。hPSC的获得方式主要有两种：一种为商品化的细胞株；另一种则是获得人类胚胎组织。而hPSC诱导分化而来的肺类器官更适用于探索人类肺部的发育和成熟过程，对于疾病的病理生理过程研究， PDLO则更接近于实际的肺组织，也更适用于肺部感染性疾病的研究。而只具备单一细胞种类的PDLO虽然能够很好的反映感染性疾病的病变过程，但建立此种感染模型的前提是明确病原体作用于肺组织中的何种细胞，并不适用于研究细菌感染情况下肺组织整体的抗感染反应及免疫系统的反馈。
在体外构建更接近于人体肺部感染实际情况的模型，仅通过PDLO和病原体的共培养系统远不能达到与患者疾病进程相似的病理生理过程，因为免疫系统在任何疾病的过程中都起着至关重要的作用。迄今为止，体外培养的肺类器官或移植到小鼠体内培养的、分化成熟的肺类器官中都缺乏免疫系统、循环系统和细胞外基质[27]。循环系统是肺类器官进行气体交换和适当的营养和废物运输所必需的，而血液中的免疫细胞(单核细胞)是炎症环境或是损伤条件下补充肺泡巨噬细胞的重要来源[28]，也是肺类器官感染过程中抵抗病原体的关键环节。在探索机体抗感染过程中的免疫反应时，研究者们都会采用感染的类器官与特定的免疫细胞共培养的方式，病毒感染模型都会与淋巴细胞共培养[29,30]，衣原体感染模型会与中性粒细胞共培养[20]，结核分枝杆菌感染模型会与巨噬细胞共培养[26]，幽门螺旋杆菌感染模型会与树突状细胞共培养[31]。之所以这些感染模型会选择与特定的免疫细胞共培养，是由于这种特定的免疫细胞证实了在该类感染中发挥主要免疫反应。
发明内容
基于上述问题，本发明提供了一种细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，构建了多细胞种类的PDLO并与常见致病菌及外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cell,PBMC)共培养，能够显著提高PDLO 细菌感染肺类器官模型与免疫微环境混合共存体系的构建效率，有效且稳定地模拟人体肺部感染后的机体抗感染反应及免疫反馈的过程。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
本发明的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，包括以下步骤：S1.将固定于基底膜基质(Matrigel)中的患者来源肺类器官(PDLO) 消化下来，添加培养基制备成患者来源肺类器官(PDLO)悬液并计数；S2.悬浮培养患者来源肺类器官(PDLO)悬液，以修复消化下来的患者来源肺类器官(PDLO)；S3.将单克隆菌落培养制备为定量细菌悬液；S4.将定量细菌悬液加入患者来源肺类器官(PDLO)悬液中，建立细菌感染肺类器官模型；以及S5.提取原代外周血单个核细胞(PBMC)计数后加入细菌感染肺类器官模型中，以构建细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系。
优选地，在上述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法中，在步骤S1中，用II型胶原酶将固定于基底膜基质(Matrigel)中的患者来源肺类器官(PDLO)消化下来。
优选地，在上述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法中，用浓度为2mg/mL的II型胶原酶将固定于基底膜基质(Matrigel)中的患者来源肺类器官(PDLO)在37℃消化10min，用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗以洗净II型胶原酶。
优选地，在上述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法中，在步骤S2中，悬浮培养患者来源肺类器官(PDLO)悬液一周。
优选地，在上述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法中，在步骤S2中，使用流式管或低吸附孔板进行悬浮培养。
优选地，在上述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法中，在步骤S3中，将细菌于MHA琼脂板中培养传代至对数生长期后，挑取单克隆菌落至MHB肉汤培养基中，随后使用麦氏比浊仪对细菌悬液进行定量。
优选地，在上述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法中，在步骤S3中，将挑取的单克隆菌落在MHB肉汤培养基中在37℃振荡培养16h，随后使用麦氏比浊仪对细菌悬液进行定量，根据需要的感染复数(MOI) 比浊至1.5×10^7CFU/mL特定浓度的细菌悬液。
优选地，在上述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法中，在步骤S5中，提取原代外周血单个核细胞(PBMC)并进行计数后，在适当的时间点将外周血单个核细胞(PBMC)悬液加入细菌感染肺类器官模型中。
优选地，在上述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法中，外周血单个核细胞(PBMC)悬液的浓度为1.5×10^5个/mL。
本发明的有益效果为：
本发明首次采用患者来源肺类器官(PDLO)而非人类多能干细胞(hPSC) 诱导分化而来的肺类器官与临床常见致病细菌构建类器官细菌感染肺类器官模型，其更接近人体肺组织构成；首次采用将基底膜基质(Matrigel)中的PDLO 消化修复后，在培养液中细菌通过自主侵入方式，而非在通过显微注射往hPSC 诱导分化而成肺类器官直接注射病原的方式，建立细菌感染肺类器官模型(即， PDLO细菌感染模型)，更加便捷高效；首次提出在PDLO细菌感染模型建立后，加入人外周血单个核细胞(PBMC)而非单一种类免疫细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)从而营造与体内免疫微环境更为相似的共培养体系(即，共存体系)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法 的流程图；
图2为PDLO培养1个月的HE染色图和光镜观察图(物镜40X)；
图3是PDLO培养1个月的免疫荧光染色及qRT-PCR鉴定；
图4是PDLO在Matrigel中固定培养的示意图；
图5是细菌感染在基底膜基质(Matrigel)中固定培养PDLO的示意图；
图6是使用显微注射法将定量致病原注射入类器官的示意图；
图7是向固定于基底膜基质(Matrigel)中培养的PDLO中注射稀释后瑞氏吉姆萨染色液的图；
图8是在PDLO悬液中加入不同浓度的肺炎克雷伯菌悬液不同时间后的肉眼图或光镜图；
图9是将1.5×10^7CFU/mL肺炎克雷伯菌悬液加入PLDO悬液不同时间点的HE染色图；
图10是将1.5×10^7CFU/mL肺炎克雷伯菌悬液加入PLDO悬液不同时间点的革兰氏染色图；
图11是在PDLO肺炎克雷伯菌感染模型中加入两种浓度的PBMC，感染的不同时程的HE染色图以及促炎因子和抗炎因子的酶联免疫吸附测定(ELISA) 检测的结果。
图12是本发明的建立PDLO体外细菌感染模型，随后将定量的PBMC悬液加入PDLO体外细菌感染模型中以及模拟机体对肺部感染性疾病的免疫防御体系的示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
肺上皮干/祖细胞定向分化为肺类器官。取肺叶切除患者术中送检冰冻病理的病变旁健康肺叶组织，约3cm3大小。使用无菌组织剪及齿镊将组织剪为0.5 cm3大小置于培养皿中，并使用1mL注射器向组织中注射适量2mg/mL的II 型胶原酶，向培养皿中加入适量液体培养基没过组织即可。将培养皿放入37℃、 5％CO2培养箱过夜消化，消化下来的细胞使用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗4-5次，将清洗后的细胞与基底膜基质(Matrigel)混合，滴入24孔板的孔中，约25μL/孔，将24孔板倒置放入37℃培养箱约1h，待基底膜基质(Matrigel) 凝固后，向每孔中加入1mL液体培养基，并将24孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待肺类器官形成后进行细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建。
如图1所示，本发明的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，包括以下步骤：
S1.将固定于基底膜基质(Matrigel)中的PDLO消化下来，添加培养基制备成PDLO悬液并计数。
使用浓度为2mg/mL的II型胶原酶将固定于基底膜基质(Matrigel)中的 PDLO消化下来，具体地，37℃消化10min，用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS) 清洗2次尽量洗净胶原酶，添加培养基制备成PDLO悬液并计数。PDLO在悬浮培养的过程中体积会随时间延长而增大，但数量并不会增多。
S2.悬浮培养PDLO悬液一周，以修复消化下来的PDLO。
将PDLO悬浮培养一周，给予消化下来的PDLO修复期，使得胶原酶消化过程中破坏的PDLO外层细胞能够愈合以及恢复细胞与细胞之间的紧密连接。优选的，悬浮培养使用流式管或低吸附孔板。
S3.将单克隆菌落培养制备为定量细菌悬液。
将细菌于MHA琼脂板中培养传代至对数生长期后，挑取单克隆菌落至 MHB肉汤培养基中，在37℃振荡培养16h，随后使用麦氏比浊仪对细菌悬液进行定量，根据需要的MOI比浊至1.5×10^7CFU/mL特定浓度的细菌悬液。
S4.将定量细菌悬液加入PDLO悬液中，建立细菌感染肺类器官模型，即 PDLO体外细菌感染模型。
S5.提取原代外周血单个核细胞(PBMC)计数后加入细菌感染肺类器官模型中，以构建细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系。
PDLO体外细菌感染模型建立后，随后提取原代PBMC并进行计数后，即模拟了人体肺部感染后免疫系统激活，可逐渐募集血液中的免疫细胞趋化至感染部位(炎症部位)，在适当的时间点将PBMC悬液(1.5×10^5个/mL)加入 PDLO体外细菌感染模型中，构建PDLO体外细菌感染模型与免疫微环境共存体系，即可模拟机体对肺部感染性疾病的免疫防御体系。
本发明首次采用患者来源多细胞种类肺类器官(PDLO)而非人类多能干细胞(hPSC)诱导分化而来的肺类器官与临床常见致病细菌构建类器官感染模型，更接近人体肺组织构成。取肺叶切除患者术中送检冰冻病理的病变旁的健康肺叶组织，获得肺上皮干/祖细胞经过培养形成肺类器官(图2)后，做免疫荧光及qRT-PCR鉴定所含细胞种类(如图3所示，其中，HOPX及RAGE 为I型肺泡上皮细胞表达，SFTPB及SFTPC为II型肺泡上皮细胞表达，I型肺泡上皮细胞：PDPN、HOPX；II型肺泡上皮细胞：HT2-280、SFTPB、SFTPC、ABCA3、LAMP3；纤毛细胞：FOXJ1；离子细胞：FOXI1；祖细胞：ID2、NMYC；杯状细胞：MUC5AC；分泌细胞：SCGB1A1；近端祖细胞：SOX2；远端祖细胞：SOX9；上皮样蛋白：ECADERIN；神经内分泌细胞：CGRP；簇状细胞： TRPM5；基底细胞：P63；肺泡巨噬细胞：CD68)，结果证实本发明培养的PDLO 为多细胞种类PDLO，更接近于实际人体肺组织的细胞构成，也更适用于构建肺类器官体外细菌感染模型。
本发明首次采用将基底膜基质(Matrigel)中的PDLO消化并修复后，在培养液中细菌通过自主侵入方式，而非在通过显微注射往hPSC诱导分化而成肺类器官直接注射病原的方式，建立PDLO体外细菌感染模型，更加便捷高效。
肺类器官通常于基底膜基质(Matrigel)中固定培养[32,33]，培养时需在培养皿内添加液体培养基以提供相应浓度的生长因子等营养物质，这些小分子营养物质可以穿透并进入基底膜基质(Matrigel)中的PDLO(图4)。目前肺类器官病毒感染模型的构建常用显微注射法和共培养法两种方式，由于病毒体积远远小于细菌等其他病原体且能够穿透培养肺类器官的载体基底膜基质 (Matrigel)，因而这种使用基底膜基质(Matrigel)固定了类器官的共培养法 (称之为固定共培养(fixed co-culture))只能适用于病毒感染。
体外构建PDLO的细菌感染模型，重要的是模拟病原微生物/致病菌进入到肺组织中这一步骤。在共培养体系中，虽然可以将定量的病原微生物加入液体培养基中，但其并不与PDLO直接接触，病原微生物体积远大于生长因子等分子，因此病原体并不能较好的完成穿透并进入基底膜基质(Matrigel)中的 PDLO，而基底膜基质(Matrigel)则成为致病菌能否感染PDLO的关键屏障 (图5)。这一过程中，虽然会有部分病原菌动力较强，可以完成感染PDLO 这一过程，但无法计算这一部分细菌的数量，更无法保证每一次模型构建的感染效率。
因此，在已发表的所有类器官非病毒(隐孢子虫和结核分枝杆菌)感染模型的研究中[20,25,26,34-37]，研究者们均选用了显微注射的方法(图6)，通过对类器官及病原菌的定量(固定MOI值)以达到每次感染效果的一致性。其中，使用显微注射法将定量致病原注射入类器官的过程为：准备两个装有液体培养基的培养皿，一个盛有未注射致病原的类器官，另一个盛注射致病原后的感染类器官，显微注射时，一侧使用负压固定针/持卵针将待注射的类器官固定，另一侧将显微注射针内的致病原悬液注入类器官中，随后将注射后的感染类器官转移至待盛注射后致病原后感染类器官的培养皿中，直到将致病原向所有的类器官中注射完毕。
显微注射这种方法虽然可以很好地控制感染类器官的病原体数量，但需要具备显微注射仪、拉针仪、磨针器及高倍显微镜等仪器，更需要漫长的练习过程，且注射过程本身也需要耗费大量的时间。作为探索病原体MOI的预实验过程，过于费时费力，且大部分细菌感染的病程较快，显微注射的方法会导致感染时间不可控，对于构建急性感染模型来说并不是最佳适用的方法。前期本发明通过向固定于基底膜基质(Matrigel)中培养的PDLO中注射稀释后的瑞氏吉姆萨染色液进行显微注射练习(参见图7，其中，红色箭头(a和b图中下面的两箭头)：稀释后瑞氏吉姆萨染色液注射进入PDLO空腔；绿色箭头(a 和b图中上面的两箭头)：稀释后瑞氏吉姆萨染色液并不能通过PDLO的空腔间隔进入邻近的空腔；黄色箭头(c和d图中的箭头)：通过注射口漏出的稀释后瑞氏吉姆萨染色液)，过程中发现PDLO的各个空腔之间并不全相通，导致注射过程中需不停调整进针方向和位置才能使该PDLO的所有细胞均匀接触染液，人为造成了一个PDLO有多处破裂口，注射进PDLO的液体也会有所漏出，并且无法在同一感染时间点获得大量的感染模型。
因此，本发明尝试将PDLO从基底膜基质(Matrigel)中消化下来，悬浮培养待其外层细胞修复后，加入定量的细菌悬液与PDLO悬液共培养，构建 PDLO体外细菌感染模型，称之为混合共培养(mixed co-culture)(图8、图9、图10和图12)。其中，图8中在PDLO悬液中加入不同浓度的肺炎克雷伯菌悬液，加菌后前半天每隔1h肉眼及镜下观察一次，后半天每隔6h肉眼及镜下观察一次，第二天起每24h肉眼及镜下观察一次，从而确定细菌悬液的浓度(1.5×10^7CFU/mL)及作用时间(24h)；从图9可以看出随细菌感染时间延长，PDLO的空泡状结构逐渐消失，且细胞水肿、边界不清；图10中，肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性杆菌，革兰氏染色后呈红色短棒状，可以看到随细菌感染时间延长，PDLO的空泡状结构周围的细菌逐渐感染整个PDLO。
本发明首次提出在PDLO体外细菌感染模型建立后，加入人外周血单个核细胞(PBMC)而非单一种类免疫细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)从而营造与体内免疫微环境更为相似的混合共培养体系。
单一种类的免疫细胞仅能反映体外抗感染过程中主要的免疫反应，并没有一个动态的免疫反馈过程，本发明首次提出在PDLO体外细菌感染模型建立后，加入PBMC从而营造与体内免疫微环境更为相似的共培养体系，可以在不同的感染时程观察不同种类免疫细胞的作用方式。
本发明在建立PDLO体外细菌感染模型后，将定量的PBMC悬液加入 PDLO体外细菌感染模型中，模拟机体对肺部感染性疾病的免疫防御体系(图 11和图12)。在图11中，示出了在PDLO肺炎克雷伯菌感染模型中加入两种浓度的PBMC，感染的不同时程做HE染色，以及促炎因子和抗炎因子的ELISA 检测结果，选择合适的PBMC浓度进行后续实验(浓度高的PBMC可延缓肺炎克雷伯菌对PDLO的破坏速度，结合ELISA检测结果，选用1.5×10^5个/mL浓度的PBMC进行下一步体系的构建)。
本发明采用细菌直接作用于PDLO的方式，使PDLO中的细胞能够均匀接触到相同浓度的细菌，使得构建PDLO体外细菌感染模型的效率大幅提高。并通过对PDLO、细菌及PBMC的定量过程，使得最终构建的PDLO体外细菌感染模型及其与免疫微环境的共存体系都具备较稳定的可重复性。
以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或改进，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
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Claims (8)

1.一种细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将固定于基底膜基质(Matrigel)中的患者来源肺类器官(PDLO)消化下来，添加培养基制备成患者来源肺类器官(PDLO)悬液并计数；
S2.使用流式管或低吸附孔板悬浮培养所述患者来源肺类器官(PDLO)悬液，以修复消化下来的所述患者来源肺类器官(PDLO)；
S3.将单克隆菌落培养制备为定量细菌悬液；
S4.将所述定量细菌悬液加入所述患者来源肺类器官(PDLO)悬液中，建立细菌感染肺类器官模型；以及
S5.提取原代外周血单个核细胞(PBMC)计数后加入所述细菌感染肺类器官模型中，以构建所述细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系；
其中，所述细菌为肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)。
2.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，其特征在于，在步骤S1中，用II型胶原酶将固定于所述基底膜基质(Matrigel)中的患者来源肺类器官(PDLO)消化下来。
3.根据权利要求2的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，其特征在于，用浓度为2mg/mL的II型胶原酶将固定于所述基底膜基质(Matrigel)中的患者来源肺类器官(PDLO)在37℃消化10min，用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗以洗净所述II型胶原酶。
4.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，悬浮培养所述患者来源肺类器官(PDLO)悬液一周。
5.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，其特征在于，在步骤S3中，将细菌于MHA琼脂板中培养传代至对数生长期后，挑取单克隆菌落至MHB肉汤培养基中，随后使用麦氏比浊仪对细菌悬液进行定量。
6.根据权利要求5的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，其特征在于，在步骤S3中，将挑取的所述单克隆菌落在所述MHB肉汤培养基中在37℃振荡培养16h，随后使用麦氏比浊仪对细菌悬液进行定量，根据需要的感染复数(MOI)比浊至1.5×10^7CFU/mL特定浓度的细菌悬液。
7.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，其特征在于，在步骤S5中，提取原代外周血单个核细胞(PBMC)并进行计数后，在适当的时间点将外周血单个核细胞(PBMC)悬液加入所述细菌感染肺类器官模型中。
8.根据权利要求7的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞(PBMC)悬液的浓度为1.5×10^5个/mL。
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