KR101306610B1 - 로소니아 인트라셀룰라리스 진단 방법 - Google Patents

로소니아 인트라셀룰라리스 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물 보건 분야 및 특히, 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법 및 로소니아 인트라셀룰라리스-특이적 항체를 사용한 진단 시험 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법 또는 시험 키트의 용도에 관한 것이다.
로소니아 인트라셀룰라리스

Description

로소니아 인트라셀룰라리스 진단 방법{Method of diagnosing Lawsonia intracellularis}
본 발명은 동물 보건 분야 및 특히, 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법 및 로소니아 인트라셀룰라리스-특이적 항체를 사용한 진단 시험 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법 또는 시험 키트의 용도에 관한 것이다.
돼지 증식성 장염("PPE")의 병원체인 엘. 인트라셀룰라리스는 실질적으로, 사람, 토끼, 흰담비, 햄스터, 여우, 말, 및 타조 및 에뮤와 같이 다양한 기타 동물을 포함하는 모든 동물에 감염된다. 엘. 인트라셀룰라리스는 특히 미국 뿐만 아니라 유럽에서 돼지 무리를 상당히 감소시키는 원인이다.
PPE의 고유 특징은 장 감염 부위에서 굽은 형태의 바실리(bacilli)가 막과 결합되지 않은 상태로 장 세포의 세포질내에 존재한다는 것이다. PPE와 관련된 세균은 "캄필로박터(Campylobacter)형 유기체"로서 언급되었다[문헌참조: S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-264 (1989)]. 이어서, 당해 발병 세균은 분류학적으로 신규한 속 및 종으로서 동정되었고 속칭으로 회장 공생자(IS) 인트라셀룰라리스로서 언급되었다[문헌참조: C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-538 (1993)]. 보다 최근에, 이들 신규 세균은 로소니아(L) 인트라셀룰라리스라는 분류명이 주어졌다[문헌참조: S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1995)]. 이들 3개의 명칭은 본원에서 추가로 동정되고 기재된 것과 동일한 유기체를 언급하는데 혼용되었다.
엘. 인트라셀룰라리스는 통상적인 무세포 배지상에서 일반적인 세균학적 방법에 의해 배양될 수 없는 절대 세포내 세균이고 상피 세포에 부착하여 증식하는 것으로 사료되었다. 문헌[참조: S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61 , No. 19, 4286-4292 (1993) 및 G. Lawson et al., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31 , No. 5, 1136-1142 (1993)]은 통상적인 조직 배양 플라스크에서 IEC-18 랫트 장 상피 세포 단층을 사용한 엘. 인트라셀룰라리스의 배양법을 논의하였다. 추가로, 문헌[참조: H. Stills, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3227-3236 (1991)]은 통상적인 조직 배양 플라스크에서 장 407 사람 배아 장 세포 단층 및 GPC-16 기니아 피그 결장 선암종 세포 단층을 사용하는 방법을 논의하였다.
특히, 엘. 인트라셀룰라리스는 바람직하게 미국 특허 제5,714,375호 및 제5,885,823호에 따라 당업계에 공지된 방법으로 배양할 수 있다. 예를 들어, 배양 세포는 먼저 엘. 인트라셀룰라리스 세균을 포함하는 접종물로 접종하여 당해 세포를 세균으로 감염시킬 수 있다. 본 발명을 수행하는데 있어서, IEC-18(ATCC 1589)-랫트 장 상피 세포, HEp-2(ATCC 23)-사람 상피형 암종 세포, McCoys(ATCC 1696)-마우스(비 특이적) 세포, BGMK(Biowhittaker #71-176)-버팔로 그린 원숭이 신장 세포 및 돼지 장 상피 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 세포주를 사용할 수 있다.
배양 세포가 사용되는 경우, 접종전에 당해 세포는 단층 형태일 수 있다. 단층을 형성하기 위해, 당해 세포는 통상적인 플라스크에 종자로서 주입될 수 있다. 각각의 플라스크는 일반적으로 성장 배지와 혼합된 25, 75, 150, 850cm2의 플라스크 또는 롤러 병당 약 1 x 105개의 세포 내지 약 10 x 105개의 세포가 씨딩된다. 증식 배지는 질소원, 선택 배양 세포용 필수 성장 인자 및 글루코스 또는 락토스와 같은 탄소원을 포함하는 세포 배양용 임의의 배지일 수 있다. 바람직한 배지는 1 내지 5%의 태아 소 혈청 함유 햄스 F 12가 보강된 DMEM이지만 기타 시판되는 배지가 양호하게 사용될 수 있다.
엘. 인트라셀룰라리스는 배양 세포를 일정한 증식 상태로 유지시킴으로써 보다 성공적으로 배양이 증진된다. 따라서, 배양 세포 단층은 접종 시점에 컨플루언시(confluency)가 약 20% 내지 약 50%이어야만 한다. 바람직하게, 세포는 접종 시점에 컨플루언시가 약 30% 내지 약 40%이어야만 하고 가장 바람직하게는 컨플루언시가 약 30%이어야만 한다.
또한, 접종하기 전에, 세포는 하기에 기재된 바와 같이 현탁 상태로 증식될 수 있다. 바람직하게, 세포는 먼저 접착형 시스템, 예를 들어, 롤러 병 시스템에서 단층 형태로 컨플루언시가 100%가 될때까지 증식시키고 3 내지 3000 리터로 이동시켜 현탁 상태로 증식시킨다.
접종물은 감염된 돼지 또는 기타 동물로부터 수득한 엘. 인트라셀룰라리스의 배양물일 수 있다.
접종물은 PPE로 감염된 돼지 또는 기타 동물의 회장으로부터 점막을 긁어내어 제조된 장 파쇄물일 수 있다. 장 파쇄물을 제조하는 경우, 배양용으로 선택된 회장 부분은 장 전체가 두터워진 중증 병변부를 나타내어야만 한다. 세균이 본래 약체이기때문에, 당해 샘플은 바람직하게 검시 후 가능한한 신속하게 -70℃에서 저장되어야만 한다. 엘. 인트라셀룰라리스가 내성인 항생제, 예를 들어, 약소하게 거론하자면, 반코마이신, 앰포테리신 B 또는 젠타마이신 및 네오마이신을 포함하는 아미노글리코사이드 그룹 항생제의 구성원을 바람직하게 접종물에 첨가하여 오염 세균을 억제시키면서 엘. 인트라셀룰라리스를 증식시킨다. 접종물이 순수한 배양물 또는 장 파쇄물이든 상관없이 배양 세포의 접종은 본원에 교시된 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다.
이어서 감소된 O2 용존 농도하에 세균 및/또는 접종 배양 세포를 배양한다. 10% 초과의 용존 산소 농도에서, 엘. 인트라셀룰라리스 증식은 최적 이하이고 궁극적으로 당해 범위를 벗어나는 산소 농도에서 결국 증식이 정지된다. 바람직하게, 세균 및/또는 접종 배양 세포는 약 0% 내지 약 10% 범위의 용존 산소 농도에서 배 양한다. 보다 바람직하게, 세균 및/또는 세포는 약 0% 내지 약 8% 범위의 산소 농도에서 배양하고 약 0% 내지 약 3.0%의 산소 농도가 가장 바람직하다.
적당한 이산화탄소의 농도는 또한 엘. 인트라셀룰라리스의 적절한 증식에 중요하다. 0% 초과 내지 4% 미만의 이산화탄소 농도에서, 비최적으로 증식하게되고 당해 범위를 벗어나는 이산화탄소 농도에서 결국 증식은 정지된다. 바람직하게, 이산화탄소 농도는 약 6% 내지 약 10% 범위이고 약 8.8%의 이산화탄소 농도가 가장 바람직하다.
추가로, 당해 세포는 바람직하게 약 73% 내지 약 96%의 수소 농도 범위에서 배양한다. 질소는 존재하는 수소의 일부 또는 전부를 대신하여 사용될 수 있다. 가장 바람직하게, 당해 세포는 약 0 내지 약 8.0%의 O2, 약 8.8%의 CO2 및 약 83.2%의 H2에서 배양한다.
접종 세포는 적당한 수소, 산소 및 이산화탄소 농도를 함유하고 세포를 배양동안에 현탁시키는 이원 가스 배양기 또는 기타 가스 챔버에서 배양할 수 있다. 챔버는 배양된 세포의 현탁을 유지시키는 수단 및 가스 모니터, 및 적당한 가스 농도를 공급하고 유지시키는 공급원을 포함해야만 한다. 배양 온도는 30℃ 내지 약 45℃ 범위이어야만 하고 보다 바람직하게는 약 36℃ 내지 약 38℃ 범위이어야만 한다. 가장 바람직하게, 당해 온도는 약 37℃이다. 배양 및 약독화를 위한 필수 장비는 본원에 교시된 바와 같이 당업자가 용이하게 구입할 수 있다. 본 발명을 수행하는데 적합한 장비의 한 예는 현탁 상태로 세포를 유지시키는 스피너 플라스크 와 연계된 이원 가스 배양기, 예를 들어, 모델 480(Lab-Line, Melrose Park, IL)이다. 현재 바람직한 장비는, 배지를 함유하고, 적당한 농도의 가스를 내뿜거나 기계적 교반 수단으로 세포를 현탁된 상태로 유지하고 배지내 용존 O2 수준을 계속 모니터링할 수 있는 발효기, 생물반응기, 교반 플레이트 또는 회전 진탕기를 포함한다. 제조원(New Brunswick, Braun) 및 기타 회사에서 상기 목적을 위해 적합한 발효기 및 생물반응기를 제조하였다.
접종 세포를 배양동안에 현탁된 상태로 유지시킴으로써 각각의 개별 세포는 증식 배지 및 수소, 산소 및 이산화탄소의 적당한 혼합물에 대한 노출이 증가되어 세포 및 이에 따른 엘. 인트라셀룰라리스는 최대로 증식된다. 배양 세포는 예를 들어, 배양 플라스크, 롤러 병, 막 배양, 바이오백, WAVETM 생물반응기 시스템 및 스피너 플라스크를 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 교반시켜 현탁상태로 유지시킬 수 있다. 당해 세포는 배양 동안에 세포를 이원 가스 배양기 또는 유사한 장치 내부에 스피너 플라스크중에서 배양하여 현탁 상태로 유지될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "스피너 플라스크"는 패들, 프로펠러 또는 배양물을 교반시키고 거기에 포함된 세포를 현탁 상태로 유지시키는 기타 장치를 의미한다.
또한, 접종 세포는 세포가 컨플루언시에 도달할때까지 배양하고 이어서 세포를 증식 배지를 함유하는 스피너 플라스크에 위치시키고 플라스크를 회전시키면서 이원 가스 배양기에서 배양한다. 바람직하게, 접종 세포는 긁어내거나 트립신 처 리하여 스피너 플라스크에 계대시킨다. 이것은 세포를 탈리시키기 위해 세포 스크래퍼를 사용하는 것과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다. 일단 세포가 스피너 플라스크에 도입된 후, 스피너 플라스크의 패들을 통상적으로 자기 교반 플레이트상에서 약 30 내지 약 60rpm 범위로 회전시켜 감염된 세포를 현탁 상태로 유지시킨다.
이어서, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부를 새로운 배양물에 계대시켜 엘. 인트라셀룰라리스 세균의 생산을 증가시킨다. 용어 "계대" 또는 이에 대한 본원의 또 다른 용어는 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부를 새로운 세포 배양물로 이전시켜 새로운 세포를 세균으로 감염시키는 과정을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "새로운"은 엘. 인트라셀룰라리스에 의해 아직 감염되지 않은 세포를 의미한다. 바람직하게, 당해 세포는 평균적으로 약 하루가 지나지 않은 세포이다.
현탁 배양물에서 엘. 인트라셀룰라리스는 원 배양물 일부를 제거하고 이를 새로운 배양 세포를 함유하는 신규 플라스크에 첨가하여 계대시킬 수 있다. 원 배양물이 ml당 매우 많은 세균을 갖는 경우, 예를 들어, 약 104 세균/ml을 초과하는 경우, 배양물 약 1 내지 10%(용적 대 용적)을 감염된 플라스크로부터 새로운 세포를 함유하는 신규 플라스크로 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 바람직하게, 세포 50 내지 100%가 감염된 경우 수행된다. 세포 50% 미만이 감염된 경우, 배양물을 절반(1:2)으로 신규 플라스크로 분할하고 새로운 배지를 첨가하여 용적을 스케일-업함에 의해 계대한다. 어느 경우이건, 선행 기술에서와 같은 단층 배양물 의 계대와 직접 비교하여 세포 용해 및 기타 단계는 요구되지 않는다.
간접 형광 항체(IFA) 염색, TCID50 또는 기타 상응하는 방법에 의해 측정된 바와 같이, 배양 세포의 충분한 증식 및 이에 따른 엘. 인트라셀룰라리스에 의한 감염 후, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 세균의 적어도 일부를 수거한다. 수거 단계는 본원에 교시된 바와 같은 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 세균을 현탁액으로부터 분리함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게, 엘. 인트라셀룰라리스 세균은 현탁물의 일부 또는 전부를 원심분리하여 배양 세포를 펠렛화하고 수득한 세포 펠렛을 재현탁시키고 감염된 세포를 용해시킴에 의해 수거된다. 전형적으로, 당해 내용물중 적어도 일부를 약 3000xg에서 약 20분동안 원심분리하여 세포 및 세균을 펠렛화한다. 이어서 당해 펠렛을 예를 들어, 슈크로스-포스페이트-글루타메이트(SPG) 용액중에 재현탁시키고 25게이지 바늘을 통해 약 20회 통과시켜 당해 세포를 용해시킬 수 있다. 추가의 정제가 요구되는 경우, 샘플을 약 145xg에서 약 5분동안 원심분리하여 세포 핵 및 잔해물을 제거한다. 이어서 상등액을 약 20분동안 약 3000xg에서 원심분리하고 수득한 펠렛을, 태아 소 혈청이 함유된 SPG와 같은 적절한 희석제에 현탁시키거나(동결건조, 동결 또는 접종물로서 사용하기에 적합한 세포를 수거하기 위함) 또는 증식 배지에 현탁시킨다(새로운 세포에 계대시키기에 보다 적합한 세균을 수거하기 위함).
이전에 언급된 바와 같이, 대량 생산을 위한 엘. 인트라셀룰라리스의 효과적인 증식은 조직 세포를 활발한 증식 상태로 유지시킴에 의해 증진된다. 현탁 배양물의 사용은 세포의 활발한 증식 유지를 상당히 용이하게하고 연속 배양 확대 및 스케일 업을 가능하게 한다. 상기에서 설명된 바와 같이 용존 O2가 약 0 내지 3%인 발효기를 사용하여 108 세균/ml까지 증식시킬 수 있다.
McCoys 또는 IEC-18 세포를 사용하는 경우, 증식 배지와 함께 컬티스피어-G 다공성 마이크로캐리어(HyClone Laboratories, Logan Utah)와 같은 젤라틴, 아가로스, 콜라겐, 아크릴아미드 또는 실리카 비드를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, HEp-2 세포 및 기타 세포는 본원에 사용된 방법에 따른 마이크로캐리어를 요구하지 않는다.
HEp-2를 배양하면서 세포 유지 목적으로, 바람직하게 당해 배양물 25% 내지 50%를 제거하고 주 간격으로 새로운 배지로 대체한다. 마이크로캐리어 또는 비드를 사용한 세포 배양을 위해, 바람직하게 배양물 25% 내지 50%를 제거하고 주간 1 또는 2회 새로운 배지로 대체한다. 스케일 업하기 위해, 배지 또는 마이크로캐리어를 함유한 배지의 25% 내지 50%가 당해 배양물에 추가로 첨가될 수 있다.
배양 세포가 감염되는 비율에 따라, 새로운 세포로의 계대는 일반적으로 약 2일 내지 약 7일 마다 수행한다. 배양 세포가 2 내지 7일내에 70% 이상 감염된다고 가정할때, 바람직하게 계대는 약 5 내지 7일마다 수행한다.
현재 엘. 인트라셀룰라리스 항원의 진단은 직접 면역형광 및 PCR에 의해 수행되고 있다. 현재 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적인 항체의 진단은 면역 형광을 사용하여 수행된다. 이들 방법은 힘이 들고 시간 소모적이며 대규모 스크리닝을 위해서는 적합하지 않다.
PPE의 효과적인 진단은 또한 발병 세균을 배양하는데 요구되는 시간 때문에 방해된다. 본 발명의 결과로서, PPE에 민감한 돼지 및 기타 동물로부터 채취한 생물학적 샘플내에서 엘. 인트라셀룰라리스의 존재 여부에 대한 신속하고 정확한 분석을 촉진하는 진단 도구의 개발이 현재 가능하다.
따라서, 본 발명의 바탕이 되는 기술적 문제는 엘. 인트라셀룰라리스 질환의 진단을 위한 방법을 개선시키는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 동물 보건 분야 및 특히 로소니아 인트라셀룰라리스에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법 및 로소니아 인트라셀룰라리스 특이적 항체를 사용하는 진단 시험 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법 또는 시험 키트의 용도에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 차단 ELISA의 결과이다.
도 2는 IFA 및 ELISA에서 비교되는 301개의 각종 혈청에 대한 결과이다.
도 3은 3개의 농장에서 회장염 차단 ELISA-전체 스크리닝에 대한 결과이다.
도 4는 회장염 ELISA-22개 독일 농장에서의 결과이다.
도 5는 임상적 증상과 ELISA 결과에 대한 상호 관계를 도시한다.
본원에 사용된 용어의 정의
본 발명을 기재하기에 앞서, 본원 및 첨부된 특허청구범위에서 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문장이 명백하게 달리 기재하지 않는 경우 복수의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단수 형태의 세균(a bacterium)에 대한 언급은 복수의 세균을 포함하고 세포(cell)에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 세포 및 이의 균등물등을 언급한다. 달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 본원에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 문헌은, 본 발명과 연계하여 사용될 수 있는 문헌에 보고된 바와 같은 세포주, 벡터 및 방법을 기재할 목적으로 참조문헌으로서 인용된다. 본원에 인용된 어떠한 문헌도 본 발명이 선행 발명의 기재 보다 시간적으로 뒤쳐진 것으로 인정하는 것으로서 해석되지 말아야한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엘. 인트라셀룰라리스"는 본원에 전체 내용이 참조로서 인용되는 문헌[C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-538 (1993) and S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1995)]에 상세히 기재된 세포내 굽은 그람 네가티브 세균, 즉 당업계에 공지된 사실 및 본원의 교시에 따라PPE 감염된 돼지 또는 전세계의 기타 동물로부터 수득될 수 있는 발병 세균 및 자연적으로 또는 인위적으로 수득된 당해 세균의 임의의 변이체 또는 돌연변이체, 및 벡터내에서 발현되거나 생체내 적용 후 발현되는 단백질을 포함하는, 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적인 DNA, RNA 및 세균 단백질, 및 또한 엘. 인트라셀룰라리스의 단편 또는 항원 유도체를 의미한다. 당해 용어는 또한 하기 정의된 바와 같이 개질된 분리물 및 약독화된 분리물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "개질된 분리물"은 배양 및 세포 배양중 계대 기술 또는 항원 제조의 목적으로 엘. 인트라셀룰라리스를 복제하기 위한 임의의 기타 기술에 따라 제조된 임의의 엘. 인트라셀룰라리스를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약독화된 분리물"은 본원에 교시된 배양 및 계대 기술에 따라 바이러스 독성이 제거되었지만, 숙주 동물에 투여되는 경우, 면역원 성질을 보유하도록 제조된 임의의 엘. 인트라셀룰라리스 분리물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대량 배양"은 약 2.0 내지 3.0리터를 초과하는 엘. 인트라셀룰라리스의 배양 수준을 의미하고 100리터 이상의 규모로 생산함을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "배양"은 엘. 인트라셀룰라리스의 성장, 번식 및/또는 증식을 촉진시키는 과정을 의미한다.
발명의 기재
당해 기술적 문제는 청구항에 특징화된 기재 및 양태에 의해 해결된다.
본 발명의 목적은 임상전 또는 임상 엘. 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법을 제공한다. 추가로, 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 면역 반응은 검출되고 엘. 인트라셀룰라리스 역학에 대한 도구가 제공된다.
당해 목적은 임상전 또는 임상 엘. 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법을 수단으로 명세서 및 청구항의 범위내에서 본 발명에 따라 성취되었다.
본 발명은 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하고 엘. 인트라셀룰라리스 자체를 검출하는 것에 관한 것이다. 당해 항체는 당업계에 공지된 임의의 항체 유형, 특히, 서브타입 IgA, 가용성 IgA, IgM, IgG(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) 및 또한 IgD, IgE의 면역글로불린을 포함한다.
본 발명에 따른 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적인 항체를 검출하기 위한 방법은,
a) 액상 샘플을 포유동물로부터 채취하고,
b) 당해 액상 샘플의 엘. 인트라셀룰라리스 항원으로의 특이적 결합을 검출하고,
c) 수득된 결과를 대조군과 비교하는 과정을 기초로 한다.
상기 정의된 바와 같이, 엘. 인트라셀룰라리스는 또한 상기 방법에 사용될 수 있는 엘. 인트라셀룰라리스의 단편 또는 항원성 유도체를 포함한다.
유사하게, 엘. 인트라셀룰라리스를 검출하기 위한 본 발명에 따른 방법은 다음과 같이,
a) 액상 샘플을 포유동물로부터 채취하고,
b) 당해 액상 샘플의 엘. 인트라셀룰라리스 항체로의 특이적 결합을 검출하고,
c) 수득된 결과를 대조군과 비교하는 과정을 기초로 한다.
액상 샘플은 침, 땀, 뇨, 혈액, 분비액, 배설물을 포함하는 임의의 체액 또는 당업자에게 공지된 기타 체액 샘플을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 액상 샘플은 수거 용기(뇨 또는 기타 액상용), 주사기/수거 튜브(혈액용) 또는 몇몇 유형의 수거 스와브(침, 땀등에 대한)를 사용하여 수거된다. 바람직하게, 단계 a)의 샘플이 혈액인 경우, 혈청 또는 혈장은 당해 혈액 샘플로부터 분리되고 단계 b)는 액상 샘플 대신에 혈청 또는 혈장을 사용하여 수행된다. 이어서, 단계 c)는 상기한 바와 같이 수행된다.
바람직한 양태에서, 당해 방법은 면역 시험이다. 면역 시험은 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적인 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항혈청을 사용한다. 본 발명에 따른 면역 시험은 ELISA 시험(효소 결합된 면역 흡착 분석) 또는 소위 샌드위치-ELISA 시험, 도트 블롯, 면역 블롯, 방사선면역 시험(방사선면역 RIA), 확산 기본 오크테를로니(Ouchterlony) 시험 또는 로켓 면역형광 분석법과 같은 당업계에 공지된 검출 방법을 포함한다. 기타 면역 시험은 간접적 또는 직접적인 면역형광 항체 시험("IFA")이다. 또 다른 면역 시험은 소위 웨스턴 블롯(또한 웨스턴 전달 과정 또는 웨스턴 블롯팅으로서 공지됨)이다. 웨스턴 블롯의 목적은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드를 니트로셀룰로스 필터 또는 기타 적합한 캐리어로 이동시키고 동시에 겔 전기영동으로부터 수득된 단백질 또는 폴리펩타이드의 상대적 위치를 유지하는 것이다. 이어서 웨스턴 블롯은 심의중에 있는 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체로 항온처리한다. 당해 검출방법은 통상의 당업자가 사용하여 본원에 기재된 발명을 수행할 수 있다. 당업자가 상기 방법 및 기타 검출 방법을 모색할 수 있는 참조 문헌의 목록은 하기와 같다: An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985). Solid and fluid protein chip technologies or microarray technologies using labeled or unlabeled reagents are further immune tests according to the invention. Such test are widely described, for example by Kozak KR, et al., Identification of biomarkers for ovarian cancer using strong anion-exchange ProteinChips: potential use in diagnosis and prognosis..Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Oct 14;100(21):12343-8 (2003), or by Fulton, RJ. , et al., Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix™ system. Clinical Chemistry 43 (9), 1749-1756 (1997).
본 발명은 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 임상전 또는 임상 엘. 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법을 수행하는데 필요한 모든 성분들을 함유하는, 엘. 인트라셀룰라리스 감염을 검출하기 위한 진단 시험 키트에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 특히, 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적인 항체를 함유하는 진단 시험 키트에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 특히, 본 발명에 따른 항체가 폴리클로날임을 특징으로 하는, 진단 시험 키트에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 특히, 본 발명에 따른 항체가 모노클로날임을 특징으로 하는 진단 시험 키트에 관한 것이다.
진단 시험 키트는 본 발명에 따른 진단 방법을 위한 모든 성분들의 집합체이다. 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 기타 요소들에 대한 몇몇 예(포괄적인 목록이 아님)은 96-웰 플레이트 또는 미세적정 플레이트, 시험관과 같은 용기, 기타 적합한 용기, 물질 및 기질, 니트로셀룰로스 필터와 같은 막, 세척 시약 및 완충제를 포함한다. 진단 시험 키트는 또한 예를 들어, 표지된 2차 항체와 같은 결합된 항체, 발색단, 효소(예를 들어, 항체와 접합된 것) 및 이의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 기타 물질을 함유할 수 있다.
본 원에 기재되거나 당업계에 공지된 바와 같은 엘. 인트라셀룰라리스 세균 또는 당해 세균으로부터 유래하는 성분은 ELISA 또는 면역형광 항체 시험(IFA)와 같은 기타 면역분석법에 사용하여 혈청내 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체 및 당해 세균으로 감염된 것으로 의심되는 동물의 기타 체액을 검출할 수 있다. 현재 바람직한 면역분석은 하기 실시예에 기재된 바와 같은 IFA이다. 또한, 본 발명의 세균은 웨스턴 블롯 분석에 사용할 수 있다.
바람직한 웨스턴 블롯 프로토콜은 하기와 같다:
1. SDS-PAGE, 바람직하게는 12% SDS-PAGE상에 항원을 적용하고 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨다.
2. 막을 2시간동안 차단 완충제내에 유지시킨다.
3. 차단 완충제를 제거하고 1분동안 PBS로 세정한다.
4. 혈청을 차단 완충제에 희석하고 막에 첨가하고 2시간동안 실온에서 항온처리한다.
5. 세척 완충액으로 3회 세척한다(각각 5분동안 세척한다).
6. 접합된 항-엘. 셀룰라리스 특이적 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 차단 완충액중에 희석시키고 막에 첨가하며 실온에서 1시간동안 항온처리한다.
7. 세척 완충액으로 3회 세척한다.
8. 기질을 10분동안 또는 강한 밴드가 형성될때까지 첨가한다.
9. PBS로 세정한다.
10. 공기 건조시키고 암실에 저장한다.
항체에 연결된 접합체는 예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 또는 알칼린 포스파타제(AP)와 같은 효소일 수 있다. 또한, 기질의 존재하에 정량될 수 있는 발색단 또는 임의의 기타 검출 가능한 물질이 접합체로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 가장 바람직한 면역 시험은 ELISA이다. 가장 바람직하게, 당해 ELISA는 샌드위치 ELISA(= 포획 ELISA)이다. 당해 ELISA는 동일한 항원에 대한 2개의 상이한 에피토프에 대해 특이적인 2개의 항체를 사용하여 검출하기때문에 보다 특이적이다. 샌드위치 ELISA에서, 비표지된 항체는 미세적정 플레이트에 피복된다. 이어서 항원으로서 엘. 인트라셀룰라리스를 첨가한다. 세척 단계 후, 결합된 엘. 인트라셀룰라리스 항원은 엘. 인트라셀룰라리스상의 상이한 에피토프에 반응하는 제2 표지된 엘. 인트라셀룰라리스 특이적 항체를 사용하여 검출한다.
피복 과정의 예는 다음과 같다:
플레이트를, 예를 들어, ddH2O중의 10% 슈크로스/10% 표준 말 혈청에서 비표지된 항체로 피복하고 로소니아 인트라셀룰라리스 항원과 항원처리한다. 이어서 플레이트를 건조시키고 밀봉하고 37℃에서 저장한다. 또한, 항체 피복된 플레이트를 저장하고 ELISA를 수행하는 경우 항원을 첨가한다.
본 발명에 따른 바람직한 ELISA 프로토콜은 다음과 같다(항체 피복된 플레이트의 사용):
1. 피복 완충액중에 희석된 0.1ml/웰 항원을 첨가하고 4℃에서 18시간동안 항온처리한다.
2. PBS로 3회 세척한다.
3. 플레이트의 각각의 웰에 차단 완충액 0.25ml을 첨가하고 37℃에서 1시간 내지 2시간동안 항온처리한다.
4. 세척 완충액으로 3회 세척한다.
5. 차단 완충액중에 혈청을 희석하고 0.1ml을 플레이트의 제1 웰에 첨가하고, 플레이트를 가로질러 1:2의 연속 희석물을 제조하고 37℃에서 1시간동안 항온처리한다.
6. 세척 완충액으로 3 내지 5회 세척한다.
7. 접합된 항-엘. 인트라셀룰라리스 특이적 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 차단 완충액으로 희석하고 0.1ml을 플레이트 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간동안 항온처리한다.
8. 세척 완충액을 사용하여 3 내지 5회 세척한다.
9. 기질을 첨가한다.
10. 분광기로 흡광도를 측정한다.
11. 항원이 첨가되지 않은 웰을 블랭크로서 사용한다.
12. 양성 및 음성 대조군 돼지 혈청은 또한 각 시험마다 사용되어야만 한다.
바람직한 ELISA는 하기와 같이 수행한다:
당해 플레이트는 예를 들어, ddH2O중에서 10% 슈크로스/10% 표준 말 혈청중의 비표지된 항체로 피복하고 로소니아 인트라셀룰라리스 항원과 항온처리한다. 이어서 플레이트를 건조시키고 밀봉하고 37℃에 저장한다.
1. 90㎕의 완충액을 모든 웰에 첨가한다.
2. 10㎕의 혈청을 선택된 웰에 첨가한다.
3. 1시간동안 37℃에서 플레이트를 항온처리한다.
4. 플레이트를 PBST로 3회 세척한다.
5. CDS-C + 0.5M NaCl(웰당 100㎕)중에 희석된 HRP 접합된 항-엘. 인트라셀룰라리스 특이적 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 첨가한다.
6. 플레이트를 37℃에서 1시간동안 항온처리한다.
7. 플레이트를 PBST로 3회 세척한다.
8. 기질을 웰당 100㎕로 첨가하고 실온에서 10분동안 항온처리한다.
9. 웰당 50㎕의 종결 용액을 첨가한다.
10. 450nm에서 분광기로 플레이트를 판독한다.
본 발명에 따른 가장 바람직한 샌드위치 ELISA 프로토콜은 다음과 같다:
1. 피복 완충액중에 희석된 웰당 0.1ml의 mAb를 첨가하고 4℃에서 18시간동안 항온처리한다.
2. PBS로 3회 세척한다.
3. 완충액에 희석된 웰당 0.1ml의 항원을 플레이트 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 내지 2시간동안 항온처리한다.
4. 세척 완충액으로 3회 세척하고/하거나 0.25ml의 차단 완충액을 플레이트 각각의 웰에 직접 가하고 37℃에서 1시간 내지 2시간동안 항온처리한다.
5. 세척 완충액으로 3회 세척한다.
6. 혈청을 차단 완충액중에 희석시키고 플레이트의 제1 웰에 0.1ml을 가하고 플레이트를 가로질러 연속 1:2의 희석물을 제조하고 37℃에서 1시간동안 항온처리한다.
7. 세척 완충액으로 3 내지 5회 세척한다.
8. 접합된 항-엘. 인트라셀룰라리스 특이적 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 차단 완충액중에 희석시키고 0.1ml을 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간동안 항온처리한다.
9. 세척 완충액으로 3 내지 5회 세척한다.
10. 기질을 첨가한다.
11. 분광기로 흡광도를 측정한다.
12. 항원이 첨가되지 않은 웰을 블랭크로서 사용한다.
13. 양성 및 음성 대조군 돼지 혈청은 또한 각각의 시험 마다 사용되어야만 한다.
본원에 사용된 바와 같은 항원은 상기 정의된 바와 같은 엘. 인트라셀룰라리스이다. mAb는 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적인 모노클로날 항체에 관한 것이다. 바람직하게, 당해 항체는 하기된 바와 같은 항체이다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 ELISA에 사용될 특징적인 항체들이 제조되었다. 당해 항체는 하기의 참조 번호를 갖는다" 301:39. 287:6, 268:29. 110:9, 113:2 및 268:18. 모든 항체는 엘. 인트라셀룰라리스 세균의 항원에 특이적이다. 바람직하게, 샌드위치 ELISA에서 포획 항체는 110:9, 113:2 또는 287:6이고 접합된 항체는 268:18, 268:29 또는 287:6이다. 포획 항체로서 항체 110:9가 가장 바람직하고 접합된 항체로서 항체 268:29가 가장 바람직하다. 또한 상기 언급된 항체의 모든 특징을 갖는 항체(이것은 상기 언급된 항체와 거의 동일한 결합 특성을 갖고/갖거나 상기 언급된 항체와 비교하여 로소니아 인트라셀룰라리스의 동일한 항원에 지시되고/되거나 상기 언급된 항체와 비교하여 동일한 에피토프에 대해 지시되거나 이를 동정하는 것들을 의미한다)가 바람직하다.
본 발명에 따른 항체는 하이브리도마 세포에 의해 제조된다. 본 발명에 따른 당해 하이브리도마 세포는 부다페스트 조약에 따른 특허 기탁물로서 기관[the Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR) and European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK]에 기탁되었다. 기탁일은 2004년 5월 11일이다. 하이브리도마 세포주 110:9는 ECACC 수탁 번호 제04092204호로서 성공적으로 기탁되었다. 하이브리드도마 세포주 113:2는 ECACC 수탁 번호 제04092201호로서 성공적으로 기탁되었다. 하이브리도마 세포주 268:18은 ECACC 수탁 번호 제04092202호로서 성공적으로 기탁되었다. 하이브리도마 세포주 268:29는 ECACC 수탁 번호 제04092206호로서 성공적으로 기탁되었다. 하이브리도마 세포주 287:6은 ECACC 수탁 번호 제04092203호로서 성공적으로 기탁되었다. 하이브리도마 세포주 301:39는 ECACC 수탁 번호 제04092205호로서 성공적으로 기탁되었다.
본 발명은 단지 설명을 목적으로 제공된 하기의 실시예에서 추가로 기재되지만 이는 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 실질적으로, 본 발명의 기타 변이체에 대해 당업자는 용이하게 인지할 수 있다.
본원에 인용된 모든 공개문헌 및 특허는 이의 전반전인 내용이 참조로서 인용된다.
실시예 1
1.0 재료
항-로소니아 하이브리도마 세포주: 372:13, 113:2, 268:18, 287:6, 110:9, 268:29, 301:39.
하이브리도마 세포 배양용 장치 및 배지.
모노클노날 항체(mAb)의 정제 및 HRP 접합용 장치 및 완충액.
ELISA를 위한 장치 및 용액
로소니아 항원 SF 1289 N343 12/20/00
로소니아 양성 혈청: 로트#052902돼지#26(실험상 감염됨),
로트#052902돼지#69(백신 접종됨)
로소니아 음성 혈청: p25.8#273 날짜 52 6-30-95,
116705
1.1 방법
모노클로날 항체의 제조는 기관[Svanoval Biotech]의 표준 조작 과정에 따라 수행되었다.
1.1.1 하이브리도마 세포의 배양 및 HRP 접합된 모노클로날 항체의 제조
●하이브리도마 세포주를 확보하기 위해, 각각 세포주 15개 바이엘을 준비하고 -135℃에 저장하였다.
●각 하이브리도마 세포주의 1개의 바이엘을 해동시키고 세포를 세포 배양 플라스크에서 증식시켰다.
●각 세포주로부터 500ml 내지 1000ml의 상등액을 정제하고 고추 냉이 퍼옥시다제에 접합시켰다.
1.1.2 차단 ELISA
정제되고 HRP 접합된 mAb를 ELISA에서 양성 로소니아 돼지 혈청에 의해 차단되는 이의 능력에 대해 시험하였다.
●ELISA 플레이트를 1/200의 희석으로 웰당 100㎕의 로소니아 항원으로 피복하였다.
●돼지 혈청을 웰당 100㎕의 1/10으로 희석시켰다.
●HRP 접합 mAb를 희석하고 웰당 100㎕로 첨가하였다.
당해 결과는 하기의 식에 따라 % 억제(PI)로서 나타낸다:
PI = 1-(OD 샘플/OD mAb) x 100
1.2 결과
1.2.1 하이브리도마 세포의 배양 및 HRP 접합된 모노클로날 항체의 제조
●거의 모든 mAb를 성공적으로 정제하고 HRP를 접합시켰다. 이들은 우수한 생성능을 갖는다.
●mAb 372:13은 불량한 생성능을 갖는다. 이러한 mAb는 성공적으로 HRP 접합되지 않아서 차단 ELISA에서 시험되지 않았다.
1.2.2 차단 ELISA
●2개의 양성(#26, #69) 및 2개의 음성(25.8#273, 116705) 혈청을 당해 실험에 사용하였다.
●실험적으로 감염된 혈청(#26)은 모든 6개의 HRP 접합된 mAb를 억제하였지만 상이한 수준으로 억제하였다. 백신 접종된 돼지 기원의 혈청은 훨씬 적게 mAb를 억제하였다.
●음성 혈청은 억제를 나타내지 않거나 거의 억제하지 않았다.
당해 결과는 하기 표 및 도 1에 나타낸다.
Figure 112007007389750-pct00001
1.3 토론
당해 연구 결과는 시험된 하나 이상의 모노클로날 항체가 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 차단 ELISA 시험에 적합함을 명백하게 보여준다. MAb 268:29, 287:6 및 268:18은 양성과 음성 혈청간에 가장 명백한 분별력을 보여주는데, 즉, 차단 ELISA의 개발에 강력한 후보물이다.
실시예 2
2.0 개요
로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 검출을 위한 샌드위치 b-ELISA 프로토타입의 개발 및 확립
골드 표준물로서 면역형광 시험 IFA를 사용한 민감성 및 특이성 측정 후, 하기와 같이 결론지울 수 있다:
●포획 mAb 110:9는 양성 및 음성 샘플간에 명백한 분별력을 나타낸다.
●검출 mAb 268:29 HRP는 양성 및 음성 혈청간에 명백한 분별력을 나타내고 민감성 및 특이성이 100%임을 보여준다.
●하기와 같은 프로토타입이 추천된다.
●Nunc maxi-sorp 스트립 C-8로 피복된 포획 mAb로서 mAb 110:9
●항원(Ag): 로소니아 인트라셀룰라리스 배양물(바람직하게, BI의 R&D에서 생산되는 농축 물질)
●0.5M NaCl/PBST에서 1/10으로 희석된 혈청 샘플, 37℃에서 1시간동안 항온처리
●0.5M NaCl을 함유하는 CDS-C 완충액중에 동결건조된 HRP 접합된 mAb 268:29. 37℃에서 1시간동안 항온처리
●기질 K-블루 맥스, 실온에서 10분동안 항온처리
●스바노바의 종결 용액
2.1 재료 및 방법
ELISA는 하기의 과정에 따라 수행하였다:
2.1.0 ELISA 과정
●90㎕의 완충액을 모든 웰에 첨가한다.
●10㎕의 혈청을 선택된 웰에 첨가한다.
●플레이트를 37℃에서 1시간동안 항온처리한다.
●플레이트를 PBST로 3회 세척한다.
●CDS-C + 0.5M NaCl로 희석된 HRP 접합체 mAb를 웰당 100㎕로 첨가한다.
●플레이트를 37℃에서 1시간동안 항온처리한다.
●플레이트를 PBST로 3회 세척한다.
●웰당 100㎕의 기질을 첨가하고 실온에서 10분동안 항온처리한다.
●웰당 50㎕의 종결 용액을 첨가한다.
●분광기를 사용하여 450nm에서 플레이트를 판독한다.
당해 결과는 1-OD 값 또는 2-PI(% 억제) 값, 즉, 100-샘플 OD/mAb OD x 100.
2.1.1 시험 1(ELISA 030922, 030923x2)
C-8 맥시 스트립을 웰당 300ng의 mAb 110:9, 113:2, 301:39, 287:6, 268:29로 피복하였다. 10% 2251HAS(표준 말 혈청), 10% 슈크로스/UHP H2O을 사용한 스트립의 차단. 웰당 150㎕, 실온에서 30초동안 항온처리.
PBST중에서 1/10으로 희석된 Ag#030619, 웰당 100㎕, 4℃에서 3시간동안 항온처리.
스트립을 3시간동안 37℃에서 건조시키고 4℃에서 유지시킨다.
혈청: IFA 양성: #26, #69. IFA 음성: #6, C1, D1, E1. 0.5M NaCl/PBST중에서 1/10으로 희석시킴. 접합체: 0.5M NaCl/PBST중에서 희석된 268:18, 113:2, 301:39, 110:9, 287:6, 268:29 HRP.
모든 포획 mAb를 이 자체에 대한 것을 제외한 모든 HRP 접합된 mAb에 대해 시험하였다.
2.1.2 시험 2(ELISA 030924)
스트립을 상기 시험 1에 따라 110:9, 113:2 및 287:6을 사용하여 피복시킨다.
혈청: IFA 양성: #26, #69. IFA 음성: #6, C1, D1, E1. 0.5M NaCl/PBST중에서 1/10으로 희석시킴. 접합체: 0.5M NaCl/CDS-C중에서 희석된 mAb 268:18, 268:29, 287:6(스바노바로서 생산되는 접합체의 동결건조를 위한 표준 완충액).
2.1.3 시험 3(ELISA 030925)
스트립을 상기 시험 1에 따라 110:9, 113:2 및 287:6으로 피복시킨다.
혈청: 24개 혈청(10개 IFA 양성, 10개 IFA 음성 및 4개가 의심됨)을 시험하였다. 희석: 0.5M NaCl/CDS-C에서 1/10.
접합체: 0.5M NaCl/CDS-C중에서 희석된 268:18 HRP.
2.1.4 시험 4(ELISA 030930, 031002, 031008)
스트립을 상기 시험 1에 따라 110:9로 피복시킨다.
혈청: 21개 IFA 양성 및 69개 IFA 음성. 희석: 0.5M NaCl/PBST에서 1/10.
접합체: 0.5M NaCl/CDS-C중에서 희석된, HRP와 접합된 268:18 및 HRP와 접합된 268:29.
2.2 결과
2.2.1 시험 1(ELISA 030922, 030923 x 2)
접합체 268:18, 268:29 및 287:6과 포획 mAb 110:9, 113:2 및 287:6의 조합 이 양성 혈청에 대한 최상의 차단 능력을 나타냄으로써 샌드위치 b-ELISA에 대해 최상의 후보물인 것으로 보인다. 혈청 번호 #6은 대부분의 시험에서 양성으로 스코어되었다. 이것은 당해 혈청이 또한 이전에 개발된 b-ELISA 프로토타입에서 양성으로 스코어되었음으로써 의심스럽다.
2.2.2 시험 2(ELISA 030924)
본 시험은 주로, 접합체의 동결건조를 위해 사용되는 표준 완충액이 사용될 수 있는 가를 확실히 하기 위해 수행되었다. 당해 결과는 양성 혈청으로 차단되었음을 보여준다. 검출 mAb 268:18 또는 268:29이 최상으로 차단되는 것으로 밝혀졌다.
2.2.3 시험 3(ELISA 030925)
포획 mAb 110:9가 양성 및 음성 샘플간에 가장 명백한 분별력을 제공함으로 최상의 선택인 것으로서 밝혀졌다.
2.2.4 시험 4(ELISA 030930, 031002, 031008)
수득된 OD 및 PI값은 첨부 5에서 알 수 있다. OD값을 IFA 결과에 대해 플롯팅하는 경우, HRP 접합된 mAb 268:29는 양성 및 음성 샘플간에 가장 명백한 분별력을 제공하고 민감성 및 특이성이 100%이다. mAb 268:18은 또한 100%의 민감성 및 특이성을 제공하지만 양성과 음성 샘플간의 면적은 약간의 차이가 있다. PI값을 플롯팅하는 경우, mAb 268:18은 컷오프 20.9에서 95.7의 민감성 및 100%의 특이성을 나타내지만 mAb 268:29는 컷 오프 28.6에서 민감성 및 특이성 둘다가 100%를 나타낸다.
2.3 토론
면역형광 시험에 대한 민감성 및 특이성을 측정한 후, IFA는 다음과 같이 결론지울 수 있다:
●포획 mAb 110:9는 양성 및 음성 샘플간에 명백한 분별력을 제공함으로 최상의 선택이다.
●HRP와 접합된 검출 mAb 268:9는 양성 및 음성 혈청간에 명백한 분별력을 제공하고 민감성 및 특이성이 100%임으로 최상의 선택이다.
하기와 같은 프로토타입이 추천된다:
●Nunc maxi-sorp 스트립 C-8중에 피복된 포획 mAb로서 mAb 110-9.
●Ag: 로소니아 인트라셀룰라리스 배양물(바람직하게 BI의 R&D에서 생산된 농축 물질)
●0.5M NaCl/PBST중에서 1/10으로 희석된 혈청 샘플. 37℃에서 1시간동안 항온처리.
●HRP 접합된 mAb 268:29, 0.5M NaCl을 함유하는 CDS-C 완충액중에서 동결건조시킴. 37℃에서 1시간동안 항온처리.
●기질 K-블루 맥스, 실온에서 10분동안 항온처리.
●스바노바 종결 용액
실시예 3
3.1 개요
가속적으로 수행된 안정성 연구는 로소니아 인트라셀룰라리스 항원 포획된 ELISA 플레이트가 1년 이상 안정하고 a- 로소니아 HRP 접합체 268:29가 동결건조된 형태로 6 내지 12개월간의 안정함을 지적한다.
3.2 서론
미래의 로소니아 인트라셀룰라리스 성분의 안정성을 평가하기 위해, ELISA 키트 가속적인 안정성 시험이 수행되어야만 한다. 시험될 성분은 4주동안 37℃에서 저장하고 이후에 4℃로 유지되는 성분과 대조적으로 ELISA에서 시험한다. 37℃에서 4주 안정성은 약 12개월의 저장 수명을 나타낸다. 이러한 보고는 가속적인 안정성 연구가 항원 포회된 ELISA 플레이트 및 HRP 접합체에 대해 수행됨을 기재하고 있다.
3.3 재료 및 방법
플레이트(ELISA 031024)상의 가속적인 안정성
플레이트를 ddH2O에서 10% 슈크로스/10% 표준 말 혈청으로 차단된 로소니아 mAb 110:9로 피복시키고 로소니아 항원으로 항온처리한다. 플레이트를 건조시키고 밀봉하고 +37℃에서 유지한다. 플레이트를 1, 2, 3 및 4주에 +37℃로부터 빼내고 냉장고에 보관한다. 또한 플레이트를 표준물로서 전체 시험 기간동안 +4℃에서 저장한다. 양성 혈청 #26, #69 및 #06 및 음성 C2, D1 및 E2를 사용하여 샌드위치 ELISA의 수행능을 검사하였다. HRP 접합된 mAb 268:29 로트#030120을 사용하였다.
동결건조된 접합체(ELISA 031027)에 대한 가속적인 안정성
HRP 접합된 mAb 268:29 로트 #030120을 유리 병에 분배된 CDS-C 완충액중에 서 1/1000으로 희석하고 표준 과정에 따라 동결건조시켰다. 4개의 동결건조된 병을 1, 2, 3 및 4주동안 +37℃에서 저장하였다. 당해 병을 또한 4℃에서 저장하였다. 상이한 병을 샌드위치 ELISA에서 시험하였다. 양성 혈청으로서 #26이 사용되고 음성 혈청으로서 030926이 사용되었다. 접합된 항체의 1/1000 희석("접합체 희석")이 시험에서 매우 높은 OD 값을 나타내었다. 따라서, 접합된 항체는 플레이트에서 적정하여 시험에 대해 올바른 시그날을 수득하였다.
3.4. 결과
플레이트상의 가속적인 안정성
OD 값의 큰 하락이 +4℃로 유지되는 스트립의 OD 값과 비교하여 1주 후에 나타난다. 1주 내지 4주를 비교하는 경우 어떠한 큰 차이가 나타나지 않았다.
PI 값을 조사하는 경우, +4℃에서 1주 내지 4주간에 어떠한 유의적인 차이가 없었다.
동결건조된 접합체에 대한 가속적인 안정성
1/8000의 "접합체 희석"에서, 혈청 #26은 4주 후 0.547에서 0.398로 감소하였고 혈청 030926은 4주 후 1,654에서 0.99로 하락하였다.
3.5 토론
수행된 가속적인 안정성 연구는 로소니아 인트라셀룰라리스 ELISA 플레이트가 1년 이상 안정함을 지적한다. 항-로소니아 HRP 접합된 268:29 항체는 음성 혈청에 대한 OD 값이 4주 후에 40% 감소하였다. 이것은 몇몇 접합체가 불안정함을 지적한다. OD 값을 측정하는 경우, 1.5에서 시그날의 40% 감소는 1년 후 OD 값이 0.9임을 의미하고 이는 여전히 수용 기준 범위내에 있는 것이다.
실시예 4
4.1 개요
프로토타입(플레이트 배치 040107)은 프로토타입을 개발하기 위해 이전에 사용된 50개의 혈청을 시험하여 입증하였다. 당해 입증 연구는 양성 혈청과 100% 일치함을 보여주는 반면, 25개의 음성 혈청중 2개가 입증된 배치에서 양성인 것으로 스코어되었다.
표준 말 혈청이, 현재 돼지 혈청 대신 CDS-C 완충액중에서 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
0.042% PVP 함유 PBST가 PBST 정제(PVP를 함유함)를 사용하는 것과 유사한 결과를 보여주는 것으로 밝혀졌다.
4.2 서론
샌드위치 ELISA 프로토타입을 입증하기 위해, 다수의 혈청은 대규모로 생산된 플레이트 배치에서 시험되어야만 한다. 당해 연구는 프로토타입을 개발하기 위해 이전에 사용되었던 50개의 혈청 샘플을 조사함에 의해 시험된 플레이트 배치 040107에 대해 수행하였다.
완충액 CDS-C는 HRP 접합체를 동결건조시키는 경우 방부제로서 사용한다. 당해 완충액은 돼지 혈청을 함유한다. 미래에는 이것이 CDS-C 완충액중에서 사용되어 로소니아 음성 혈청을 밝히는데 문제가 될 수 있기 때문에, 또 다른 대안물이 시험되어야만 한다. 이러한 연구에서, 표준 말 혈청 및 태아 소 혈청을 시험하였다.
당해 ELISA에 대한 다수의 연구는 PBST 정제를 사용하여 수행하였다. 스바노비르 키트에 포함된 20 x 농축 PBST가 사용될 수 없는 것으로 나타나는데 이는 당해 시험이 양성 및 음성 샘플을 올바르게 구분하지 못하기때문이다. 정제와 20 x 농축 PBST의 처방을 비교하는 경우, 안정화 요소로서 0.042%의 PVP(폴리비닐피롤리돈 K25)가 정제에 포함된다는 것을 제외하고는 모든 성분이 동일한 것으로 밝혀졌다. 실험은, PVP를 20 x PBST로 첨가하는 경우, 정제와 동일한 결과가 성취됨을 보여주었다.
4.3. 재료 및 방법
프로토타입의 입증(ELISA 040312)
프로토타입 ELISA에서 이전에 시험된 50개의 혈청(Bioscreen으로부터 수득됨)은 대규모 플레이트 배치 #040107에 대해 시험하였다. 0.042%의 PVP를 갖는 PBST 20x 농축 완충액을 사용하였다. 동결건조된 접합체 배치 040308을 사용하였다.
표준 말 혈청을 갖는 CDS-C 완충액
시험 ELISA 040203
CDS-C 완충액을 1-돼지 혈청(TJ4/05F에서와 같은), 2-표준 말 혈청 및 3-태아 소 혈청을 사용하여 제조하였다. 당해 완충액을 ELISA에서 접합체 완충액으로서 시험하였다. 시험된 혈청은 gris 2, 4, 13 및 17, 1-29664, 3-29664, A-27239, B-27239, #26 및 C2이었다. HRP 접합된 mAb 268:29 로트 #030318을 사용하였다. 0.042% PVP를 갖는 20 x 농축 PBST를 사용하였다.
시험 ELISA 040311
표준 말 혈청을 함유하는 CDS-C 완충액을 사용하여 2종류의 동결건조된 접합체(040211, 040308)를 제조하였다. 최종적으로 1/20k, 1/25k 및 1/30k로 희석시키기 위하여 접합체를 제조하였다. 새롭게 제조된 접합체를 병행하여 시험하였다. 혈청 #26, 1-29664, 3-29664, A-27239, B-27239, 양성 풀 030926 및 음성 풀 030926을 사용하였다. HRP 접합된 mAb 268:29 로트 #030318을 사용하였다. 0.042%의 PVP를 갖는 20 x 농축 PBST를 사용하였다.
PVP를 갖는 PBST(ELISA 040301)
20x 농축된 PBST 완충액을 1/20으로 희석하고 최종 농도 0.042%의 PVP를 첨가하였다. 당해 완충액을 PBST 정제(이미 PVP를 함유함)과 병행하여 시험하고 20 x 농축 PBST 완충액을 1/20으로 희석하였다. 모든 단계에서 완충액, 즉 세척 완충액 뿐만 아니라 샘플 및 접합체 희석 완충액을 사용하였다.
혈청 #26, E1, 1-29664, 3-29664, A-27239, B-27239 및 gris 13을 사용하였다. HRP 접합된 mAb 268:29 로트 #030318을 사용하였다. 접합체로서 돼지 혈청을 갖는 완충액 CDS-C를 사용하였다.
4.4 결과
프로토타입의 입증
당해 결과는, 이전에 양성인 모든 25개의 혈청이 또한 입증 배치에서 양성인 것으로 스코어됨을 보여준다. 이전의 25개 음성 혈청중 2개는 양성으로 스코어되었다.
표준 말 혈청을 갖는 CDS-C 완충액
표준 말 혈청 함유 완충액은 돼지 혈청을 갖는 것과 유사한 결과를 나타내었다.
동결건조된 HRP 접합된 mAb의 판독은 새롭게 제조된 접합체와 비교하는 경우, 대부분 0.4OD에서 감소하였다. 이와 같은 하락은 동결건조된 접합체의 양 배치에 나타났다. 측정된 PI 값은 수득된 OD 값과 무관하에 양호하게 상응함으로써 이는 시험 수행능에 영향을 주지 않는다.
PVP를 갖는 PBST
당해 결과는 0.042% PVP가 첨가된 1/20 희석의 20 x 농축 PBST 용액이 PBST 정제와 유사한 결과를 나타내는 반면 PVP로 1/20으로 희석된 20 x 농축 PBST는 거짓 음성 결과를 나타내었다.
4.5 토론
프로토타입(플레이트 배치 040107)의 입증은 프로토타입을 개발할때 이전에 사용된 50개의 혈청을 시험함에 의해 수행하였다. 입증 연구는 양성 혈청과 100% 일치함을 보여주는 반면, 25개의 음성 혈청중 2개는 입증된 배치에서 양성으로 스코어되었다. 당해 주요 시험에서 중요한 것이 양성 샘플을 검출하는 것이기때문에 "거짓" 음성 결과는 수용될 수 있다. 또한 이전 시험 결과가 실질적으로 사실인지는 입증되지 않았다.
0.042% PVP 함유 PBST는 PBST 정제(PVP를 함유함)를 사용한 결과와 유사한 것으로 밝혀졌다. 따라서 미래의 키트는 당해 완충액을 함유할 것이다. PVP를 갖는 PBST 20x 농축물의 안정성 연구는 키트의 타당성을 확인하기 위해 수행되어야만 한다.
실시예 5
5.1 서론 및 목적
지금까지 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 혈청 항체의 검출은 IFA 시험(1)을 사용하여 수행한다. 이들 시험은 결과를 해석하는데 있어서 개개인의 매우 주관적인 판단 에 달려있다. 최근에, 샌드위치 차단 ELISA는 로소니아 인트라셀룰라리스에 대해 매우 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 개발되었다. 당해 시험 데이타는 재현성, 반복성 및 비교 분석을 개선시키는 개관적 기준으로 측정하고 평가할 수 있다. 본 연구에서, 새로운 시험의 적합성 및 수행능을 입증하는, IFA 시험에 대한 비교 데이타를 처음으로 제공한다.
5.2 재료 및 방법
McCoy 세포 배양물상에서 증식하고 미세역가 플레이트상에서 특이적 모노클로날 항체 의해 포획된 엘. 인트라셀룰라리스 항원를 사용하여 돼지 혈청 샘플에서 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하였다. 혈청을 1 대 10으로 희석하여 시험하였다. 37℃에서 1시간 항온처리 한 후, 플레이트를 PBS 트윈 용액으로 세척하고 서양 고추냉이 퍼옥시다제 표지된 모노클로날 항체(포획 항체와는 상이함)를 첨가하였다. 당해 플레이트를 37℃에서 추가의 시간동안 항온처리하였다. 비결합된 항체를 세척하여 제거하였다. 실온에서 10분동안 TMB 기질과 항온처리 한 후, 종결 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 각각의 웰에 대해 광도계를 사용하여 OD450을 판독하였다. 무혈청 대조군 % 억제로서 결과를 측정하였다. 엘. 인트라셀룰라리스의 항체에 대해 실증된 IFA 시험(2)에서 시험된 301개 필드 혈청을 사용하여 새로운 ELISA를 평가하였다. 추가로, 확실히 회장염을 갖는 2개의 농장 및 회장염으로 의심되는 1개의 농장에서 전체 샘플(9년차 그룹 각각으로부터 10개의 샘플)을 사용하여 IFA와 비교되는 ELISA의 진단 값을 입증하였다.
5.3 결과
많은 음성 혈청은 음성 억제값을 나타내었다. 따라서, 가장 낮게 측정된 값은 0으로 설정하고 모든 다른 값은 이에 상대적인 값이다. 이들 데이타는 "상대적 ELISA 값"으로 명명하였다.
301개 필드 혈청에서의 결과는 도 2에 요약하였다. ELISA는 명백하게 음성(ELISA 평균 상대값 36) 및 양성(ELISA 평균 상대값 89) 혈청을 구분한다. IFA에서 의심되는 대다수의 샘플은 ELISA에서 양성이었다. 3개의 농장에서 전체 스크리닝으로부터의 결과는 도 3에 나타낸다. 2개 시험은 명백하게 3개의 농장에서 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출한다.
5.4 토론
IFA 시험 결과와 비교하여, ELISA는 보다 높은 민감성을 제공한다. 3개의 시험된 농장의 몇몇 그룹에서, ELISA의 결과는 비특이적 형광성때문에 많은 결과가 의심될 수 있는 IFA 시험에서 보다 훨씬 명확하다. 3개 가축중에 혈청학적 프로필은 유럽 가축에 대해 이미 공개된 데이타와 잘 상응하였다. IFA 시험 결과와 비교하여 10 내지 16주된 돼지 그룹간의 ELISA 값의 증가는 ELISA 상대값이 55를 초과하는 혈청이 양성으로서 판단될 수 있음을 지적한다.
새로운 시험은 통상적인 샘플에서 회장염 진단의 개선을 도와줄 수 있다. 새로운 차단 회장염 ELISA는 객관적인 기준으로 다량의 샘플을 신속하고 민감하게 스크리닝하는 도구를 제공한다.
참조문헌
Figure 112007007389750-pct00002
실시예 6
6.1 서론 및 목적
지금까지 회장염의 특정 진단은 항체 검출(1,2)을 위한 IFA 시험(1,2) 또는 PCR(3,4), 배설물 또는 장 조직 샘플에서 항원 검출을 위한 조직학적 및 면역 염색 방법(2,5,6)을 사용하여 수행되었다. 모든 이들 방법은 특이성, 오염 위험 또는 작업량에 관한 특정 단점을 갖고 대규모의 통상적인 무리 스크리닝을 위해서는 적합하지 않다. 대부분의 진단 시험은 무리에서 단지 소수의 돼지에 대해서만 수행되었다. 최근에 개발된 차단 ELISA를 사용함으로써, 혈청학적 시험이 보다 용이해 지고 보다 신뢰감 있고 무리 프로파일링을 위해 적합하다. 독일의 22개 농장에서의 전체 스크리닝을 수행하여 새로운 시험의 진단 수행능을 입증하였다.
6.2 재료 및 방법
22개의 독일 농장으로부터의 전체 샘플을 ELISA에서 시험하였다. 4, 7, 10, 13, 16, 20 및 24주령의 처녀 암퇘지, 성숙된 암퇘지 및 돼지로부터 각각의 농장(각각의 연령 그룹에서 10개 샘플)에서 샘플을 채취하였다. 실시예 5에 기재된 바와 같이 ELISA를 수행하였다.
6.3 결과
모든 22개의 농장으로부터의 ELISA 평균 상대값을 도 4에 요약하였다. 처녀 암퇘지 및 성숙된 암퇘지로부터의 혈청은 ELISA에서 상대적으로 반응성인 반면, 4 내지 10주령 새끼 돼지로부터의 결과는 낮다. 13에서 24주된 살찐 돼지에서는 ELISA값이 증가한다.
도 5에서 ELISA 상대값이 농장에서의 임상 증상과 관련이 있음을 의미한다. 농장 번호 5, 6 및 15는 샘플 채취시에 어떠한 임상적 장 문제를 갖지 않았다. 농장 번호 3에서, 4주 내지 13주된 새끼 돼지가 장 문제를 가졌고 이 콜리 설사병으로서 진단되었다. 농장 번호 18에서, 사전의 혈청학적 시험은 임상적 증상이 없는 농장에서 로소니아 인트라셀룰라리스의 존재를 지적했다. 농장 번호 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 21 및 22에서, 본 연구를 위한 샘플 채취전에 회장염으로서 진단되었다. 농장 번호 4, 13, 14, 16 및 20은 보다 성숙되고 살찐 돼지에서 장 문제를 보고하고 농장 번호 4 및 13은 회장염으로 의심되는 임상적 결과를 나타낸다. 농장 번호 17에서는 설사에 대한 어떠한 임상적 징후가 관찰되지 않았지만 보다 자라고 살찌기 시작할 무렵에 항생제가 사용되었다.
6.4 토론
22개 농장으로부터 요약된 혈청 프로필은 성숙된 암퇘지 및 처녀 암퇘지에서 높은 반응성을 나타내고 항체 반응이 13주 내지 14주에서 상승하기 시작한다. 이들 발견은 지금까지 회장염(7,8,9)에 대해 공개된 혈청학적 데이타와 일치한다. 설사병이 없는 농장의 돼지(5번, 6번, 15번 및 18번) 및 이 콜리 설사병을 갖는 농장(3번)은 ELISA에서 어떠한 유의적인 혈청 전환을 나타내지 않았다. 회장염이 확실한 농장(1번, 2번, 7번, 8번, 9번, 10번, 11번, 12번, 19번, 21번 및 22번)에서, 명백한 혈청 전환이 7주 내지 13주에서 검출될 수 있다.
흥미롭게도, 성숙된 암퇘지 및 처녀 암퇘지 집단 대부분의 샘플은 ELISA에서 고도로 반응성이지만 이들 돼지의 대부분은 어떠한 뚜렷한 장 문제를 갖지 않았다. 이것은 로소니아 인트라셀룰라리스에 의한 무증상 감염때문일 수 있다. 농장 번호 17번으로부터의 결과는 무증상 회장염을 지적하는 것으로 보인다.
본 발명에 따른 새로운 ELISA는 대형 샘플 크기 및 전체 무리 스크리닝의 통상적인 시험을 위해 적합한 회장염의 혈청학적 진단을 위한 강력한 도구를 제공한다.
참조문헌
Figure 112007007389750-pct00003

Claims (12)

  1. a) 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092205호로부터 수득된 모노클로날 항체 301:39, 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092203호로부터 수득된 모노클로날 항체 287:6, 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092206호로부터 수득된 모노클로날 항체 268:29, 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092204호로부터 수득된 모노클로날 항체 110:9, 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092201호로부터 수득된 모노클로날 항체 113:2 및 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092202호로부터 수득된 모노클로날 항체 268:18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 항체에 대한 액상 샘플의 특이적 결합을 검출하는 단계 및
    b) 상기 a) 단계에서 수득된 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는,
    임상전 또는 임상 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 감염을 사람을 제외한 포유 동물에서 진단하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 면역 시험인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, ELISA인 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 항체 110:9를 분비하는 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092204호.
  7. 항체 113:2를 분비하는 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092201호.
  8. 항체 268:18을 분비하는 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092202호.
  9. 항체 268:29를 분비하는 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092206호.
  10. 항체 287:6을 분비하는 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092203호.
  11. 항체 301:39를 분비하는 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092205호.
  12. 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092205호에 의해 분비된 항체 301:39, 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092203호에 의해 분비된 항체 287:6, 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092206호에 의해 분비된 항체 268:29, 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092204호에 의해 분비된 항체 110:9, 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092201호에 의해 분비된 항체 113:2 및 하이브리도마 세포주 ECACC 수탁번호 제04092202호에 의해 분비된 항체 268:18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모노클로날 항체를 포함하는 진단 키트.
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