ES2351511T3 - Método de diagnóstico de lawsonia intracellularis. - Google Patents

Abstract

Método para el diagnóstico de infección por Lawsonia intracellularis preclínica o clínica, que comprende las siguientes etapas: a) detectar la unión específica de una muestra líquida a un anticuerpo de L. intracellularis, en donde los anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpo monoclonal 301:39 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092205, anticuerpo monoclonal 287:6 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092203, anticuerpo monoclonal 268:29 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092206, anticuerpo monoclonal 110:9 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092204, anticuerpo monoclonal 113:2 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092201 y anticuerpo monoclonal 268:18 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092202, b) comparar el resultado obtenido en a) con un control.

Description

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CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la salud animal y en particular a Lawsonia intracellularis. En particular, la invención se refiere a un método de diagnóstico de infección por Lawsonia intracellularis y a un kit de ensayo de diagnóstico usando anticuerpos específicos de Lawsonia intracellularis. La invención también se refiere al uso del método o del kit de ensayo para diagnosticar infecciones por Lawsonia intracellularis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

L. intracellularis, el agente causante de enteropatía proliferativa porcina (“EPP”), afecta prácticamente a todos los animales, incluyendo: seres humanos, conejos, hurones, hámsters, zorro, caballos y otros animales tan diversos como avestruces y emús. L. intracellularis es una causa particularmente grande de pérdidas en manadas de animales de la especie porcina en Europa así como en los Estados Unidos

Una característica coherente de la EPP es la presencia de bacilos intracitoplasmáticos curvados, no ligados a membrana, dentro de enterocitos en las porciones del intestino afectadas. Las bacterias asociadas con EPP se han referido como “organismos de tipo Campylobacter.” S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-264 (1.989). Se han identificado posteriormente las bacterias causantes como un género y una especie taxonómicos, nuevos, denominados en nuestro idioma simbionte ileal (siglas inglesas: IS) intracellular. (C. Gebhart et al., Int’l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-538 (1.993). Más recientemente, se ha dado a estas nuevas bacterias el nombre taxonómico Lawsonia (L.) intracellularis S. McOrist et al., Int’l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1.995). Se han usado estos tres nombres, de manera intercambiable, para referirse al mismo organismo como se identifica y se describe además en la presente memoria.

L. intracellularis es una bacteria intracelular obligatoria que no puede ser cultivada por métodos bacteriológicos normales en medios convencionales, exentos de células, y se ha pensado que para crecer precisa células epiteliales unidas. S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61, No. 19, 4.286-4.292 (1.993) y G. Lawson et al.,

J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, No. 5, 1.136-1.142 (1.993) discuten el cultivo de L. intracellularis usando monocapas de células epiteliales intestinales de rata IEC-18 en matraces convencionales para el cultivo de tejidos. Además, H. Stills, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3.227-3.236 (1.991) discute usar monocapas de células intestinales embriónicas humanas Intestine 407 y monocapas de células de adenocarcinoma colónico de conejillo de Indias GPC-16, en matraces convencionales para el cultivo de tejidos.

En particular, se puede cultivar L. intracellularis por métodos conocidos en la técnica, preferiblemente, de acuerdo con las patentes de EE.UU. Nos. 5.714.375 y

5.885.823. Por ejemplo, se pueden inocular primero células de cultivo con un inóculo que comprenda bacterias L. intracellularis de manera que se infecten las células con las bacterias. Se pueden usar numerosas líneas celulares en la práctica de la invención, incluyendo, pero no limitándose a, células epiteliales intestinales de rata IEC-18 (ATCC 1589)

, células de carcinoma epidermoide humano HEp-2 (ATCC 23), células (no especificadas) de ratón McCoys (ATCC 1696)

, células de riñón de mono verde y búfalo BGMK (Biowhittaker #71-176) y células epiteliales intestinales de animales de la especie porcina. Las células de cultivo preferidas son células HEp-2, McCoys o IEC-18.

Si se usan células de cultivo, previamente a que se inoculen, las células pueden estar en la forma de una monocapa. Para formar una monocapa, se pueden sembrar las células en matraces convencionales. Cada matraz se siembra generalmente con, entre aproximadamente 1x105 células y aproximadamente 10x105 células por matraz o frasco rotativo de 25, 75, 150, 850 cm2 mezclado con medio de crecimiento. El medio de crecimiento puede ser cualquier medio para cultivo celular que incluya una fuente de nitrógeno, factores de crecimiento necesarios para las células de cultivo elegidas y una fuente de carbono tal como glucosa o lactosa. El medio de cultivo preferido es DMEM enriquecido con F 12 de Ham con suero bovino fetal al 1-5%, aunque se pueden usar otros medios de cultivo comercialmente disponibles, con buenos resultados

El cultivo exitoso de L. intracellularis se incrementa manteniendo las células de cultivo en un estado de crecimiento constante. Por lo tanto, la monocapa de células de cultivo debería estar, en el momento de la inoculación, a confluencia de aproximadamente 20 por ciento a aproximadamente 50 por ciento. Preferiblemente, las células deberían estar a confluencia de aproximadamente 30 por ciento a aproximadamente 40 por ciento, en el momento de la inoculación, lo más preferiblemente a confluencia de aproximadamente 30 por ciento.

Alternativamente, las células, previamente a que se inoculen, se pueden cultivar en suspensión, como se describe infra. Preferiblemente, primero se cultivan las células a confluencia del 100% en la forma de una monocapa en un sistema de tipo adherente, por ejemplo, un sistema de frascos rotativos y después se transfieren a 3

3.000 litros y se cultivan en suspensión El inóculo puede ser un cultivo de L. intracellularis obtenido a partir de animal de la especie porcina u otros animales, infectados.

El inóculo puede ser un homogeneizado intestinal preparado raspando la mucosa del íleon de un animal de la especie porcina u otro animal, infectado con EPP. Cuando se prepara un homogenizado intestinal, los cortes del íleon seleccionados para el cultivo deberían mostrar lesiones graves, con gran engrosamiento del intestino. A causa de la naturaleza frágil de las bacterias, las muestras deberían ser conservadas con preferencia a -70°C lo más rápidamente posible tras la necropsia. Un antibiótico al que es resistente L. intracellularis tal como Vancomicina, Amfotericina B o miembros del grupo aminoglicósido de los antibióticos, incluyendo Gentamicina y Neomicina, por nombrar algunos, se añade preferiblemente al inóculo para suprimir la contaminación de las bacterias al tiempo que se permite el crecimiento de L. intracellularis. Tanto si el inóculo es un cultivo puro como un homogenizado intestinal, la inoculación de las células de cultivo se puede llevar a cabo por diversas técnicas conocidas en la materia, dadas las explicaciones en la presente memoria.

Después se incuban las bacterias y/o las células de cultivo inoculadas, bajo una concentración disminuida de O2 disuelto. A concentraciones de oxígeno disuelto por encima de 10%, el crecimiento de L. intracellularis es inferior al óptimo y eventualmente se produce el cese del crecimiento a concentraciones de oxígeno fuera de este intervalo. Preferiblemente, las bacterias y/o las células de cultivo inoculadas se incuban en una concentración de oxígeno disuelto en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 10%. Más preferiblemente, las bacterias y/o las células se incuban en una concentración de oxígeno en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 8%, siendo lo más preferido con una concentración de oxígeno de aproximadamente 0% a aproximadamente 3,0%.

También es importante para el crecimiento apropiado de L. intracellularis una concentración apropiada de dióxido de carbono. A concentraciones de dióxido de carbono superiores a 0% e inferiores a 4%, se produce un crecimiento que no es el óptimo, y eventualmente se produce el cese del crecimiento a concentraciones de dióxido de carbono fuera de este intervalo. Preferiblemente, la concentración de dióxido de carbono está en el intervalo de aproximadamente 6% a aproximadamente 10%, siendo lo más preferido con una concentración de dióxido de carbono de aproximadamente 8,8%.

Además, las células se incuban preferiblemente a una concentración de hidrógeno en el intervalo de aproximadamente 73% a aproximadamente 96%. Se puede usar nitrógeno en lugar de parte o todo el hidrógeno presente. Lo más preferiblemente, las células se incuban en aproximadamente 0 a aproximadamente 8,0% de O2, aproximadamente 8,8% de CO2 y aproximadamente 83,2% de H2.

Se pueden incubar las células inoculadas en un incubador de doble gas u otras cámaras de gases que contengan las concentraciones apropiadas de hidrógeno, oxígeno y dióxido de carbono y que permitan que se suspendan las células durante la incubación. La cámara debería comprender un medio para mantener en suspensión las células inoculadas y un detector de gases y una fuente de suministro para suministrar y mantener las concentraciones apropiadas de gases. La temperatura de incubación debería estar en el intervalo de 30°C a aproximadamente 45°C y es más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 36°C a aproximadamente 38°C. Lo más preferiblemente, la temperatura es aproximadamente 37°C. El equipo necesario para el cultivo y la atenuación está fácilmente disponible para aquéllos o los expertos comunes en la materia, dadas las explicaciones en la presente memoria. Un ejemplo de equipo adecuado para llevar a cabo la presente invención es un incubador de doble gas, por ejemplo, el modelo 480 (Lab-Line, Melrose Park, IL) junto con frascos giratorios para mantener en suspensión las células. El equipo preferido en el momento presente comprende: un fermentador, un biorreactor, una placa de agitación

o un agitador rotatorio conteniendo medio de cultivo y capaz de mantener en suspensión las células de cultivo por burbujeo de gas de la concentración apropiada u otros medios de agitación mecánica y controlando continuamente los niveles de O2 disuelto en el medio de cultivo. New Brunswick, Braun y otras compañías hacen fermentadores y biorreactores adecuados para este fin.

Manteniendo las células inoculadas en un estado suspendido durante la incubación, se consigue el máximo crecimiento de las células y por lo tanto de L. intracellularis aumentando cada exposición individual de las células a medio de crecimiento y la mezcla apropiada de hidrógeno, oxígeno y dióxido de carbono. Las células de cultivo se pueden agitar y mantener en suspensión por una variedad de métodos conocidos en la materia incluyendo, por ejemplo, matraces para cultivo, frascos rotativos, cultivos de membrana, biobolsas, sistemas de biorreactor WAVE™ y frascos giratorios. Se pueden mantener en suspensión las células durante la incubación, incubando las células en un matraz giratorio dentro de un incubador de doble gas o aparato similar. La terminología “matraz giratorio”, como se usa en la presente memoria, quiere decir un matraz u otro envase que emplee paletas, hélice u otros medios para agitar el cultivo y mantener en suspensión las células contenidas en el mismo.

Alternativamente, las células inoculadas se incuban hasta que las células alcanzan confluencia y después las células se ponen en un matraz giratorio que contiene medio de crecimiento y se incuban en un incubador de doble gas mientras gira el matraz. Preferiblemente, las células inoculadas se raspan o tripsinizan y se hacen pasar al matraz giratorio. Esto se puede llevar a cabo mediante diversos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo usando un rascador de células para desprenderlas. Una vez que las células se introducen en el matraz giratorio, la paleta del matraz giratorio se rota típicamente en el intervalo de aproximadamente 3 (30) a aproximadamente 6 rad/s (60 rpm) sobre una placa de agitación magnética para mantener en suspensión las células infectadas.

Una porción de las L. intracellularis cultivadas se hace pasar después a cultivo fresco para aumentar la producción de bacterias L. intracellularis. La terminología “hacer pasar” o las variaciones de la misma en la presente memoria quieren decir el procedimiento de transferir una porción de las L. intracellularis cultivadas a células de cultivo fresco para infectar las células frescas con la bacteria. La terminología “fresco”, como se usa en la presente memoria, quiere decir células que aún no se han infectado por L. intracellularis. Preferiblemente tales células no tienen de media más de aproximadamente un día.

El pase de L. intracellularis en cultivos en suspensión se puede llevar a cabo retirando una porción del cultivo original y añadiéndolo a un matraz nuevo que contenga células de cultivo frescas. Si el cultivo original tiene un alto número de bacterias/ml, por ejemplo, mayor que aproximadamente 104 bacterias/ml, es preferible añadir entre aproximadamente 1 y 10% (volumen a volumen) de cultivo del matraz infectado a un nuevo matraz que contenga células frescas. Esto se hace preferiblemente cuando están infectadas el 50-100% de las células. Si están infectadas menos de 50% de las células, el pase se lleva a cabo preferiblemente dividiendo el cultivo 1:2 en un nuevo matraz y aumentando a escala el volumen mediante la adición de medio de cultivo fresco. En cualquier caso, no son necesarias lisis celulares ni otras etapas, lo que contrasta directamente con el pase de cultivos en monocapa, tal como se realizaba en la técnica anterior.

Después de suficiente crecimiento de las células de cultivo y posterior infección por L. intracellularis, como se determina por marcado de anticuerpo fluorescente indirecto (IFA, por sus siglas en inglés), TCID50 u otro método comparable, al menos una porción de las bacterias L. intracellularis cultivadas se recoge después. La etapa de recolección se puede llevar a cabo separando las bacterias de la suspensión mediante diversas técnicas conocidas por los especialistas con una pericia ordinaria en la técnica, dadas las explicaciones en la presente memoria. Preferiblemente, las bacterias L. intracellularis se recogen centrifugando el contenido de toda la suspensión

o de una porción de la misma, para sedimentar las células del cultivo, volviendo a suspender los sedimentos de células resultantes y produciendo la lisis de las células infectadas. Típicamente, al menos una porción del contenido se centrifuga a aproximadamente 3.000xg durante aproximadamente 20 minutos para sedimentar las células y las bacterias. El sedimento se puede después volver a suspender en, por ejemplo, una solución de sacarosa-fosfato-glutamato (SFG) y se hace pasar aproximadamente 20 veces por una aguja de calibre 25 para producir la lisis de las células. Si se desea purificación adicional, se pueden centrifugar las muestras a aproximadamente 145xg durante aproximadamente cinco minutos para retirar núcleos y partículas celulares. Después se puede centrifugar el sobrenadante a aproximadamente 3.000xg durante aproximadamente veinte minutos y volver a suspender el sedimento resultante en un diluyente apropiado, tal como SFG con suero fetal bovino (para preparar las bacterias recogidas adecuadas para liofilización, congelación o uso como inoculante) o medio de crecimiento (para preparar las bacterias recogidas más adecuadas para pase a células frescas).

Como se mencionó previamente, se incrementa el crecimiento eficaz de L. intracellularis para la producción a gran escala manteniendo las células del tejido creciendo activamente. Usar cultivos de suspensión facilita enormente el mantenimiento de las células creciendo activamente y permite la expansión continua del cultivo y el aumento de escala. Usar un fermentador y entre aproximadamente 0 y 3% de O2 disuelto como se explicó anteriormente, permite el crecimiento de hasta 108 bacterias/ml.

Cuando se usan células de McCoys o IEC-18, es preferible añadir gelatina, agarosa, colágeno, acrilamida o perlas de sílice tales como microvehículos porosos Cultisphere-G (HyClone Laboratories, Logan Utah), junto con el medio de crecimiento. Sin embargo, las células HEp-2 y otras no requieren microvehículos de acuerdo con los métodos usados en la presente memoria.

Para fines de mantenimiento de cultivos, con cultivos de HEp-2, se retira preferiblemente 25% a 50% del cultivo y se reemplaza con medio de cultivo fresco a intervalos semanales. Para cultivos celulares con microvehículos o perlas, se retira preferiblemente 25% a 50% del cultivo y se reemplaza con medio de cultivo fresco 1-2 veces por semana. Para fines de aumento de escala, se puede añadir al cultivo un 25% a 50% adicional de medio de cultivo o medio de cultivo con microvehículos.

Dependiendo de la velocidad a la que llegan a estar infectadas las células de cultivo, el pase a células frescas tiene lugar generalmente entre aproximadamente cada 2 y aproximadamente 7 días. Asumiendo que las células de cultivo llegan a estar infectadas al menos el 70% dentro de 2 a 7 días, el pase tiene lugar preferiblemente entre aproximadamente cada 5 y 7 días.

El diagnóstico de antígeno de L. intracellularis se lleva a cabo hoy en día usando inmunofluorescencia directa y PCR. El diagnóstico de anticuerpos específicos para L. intracellularis se lleva a cabo hoy en día usando inmunofluorescencia. Estos métodos son laboriosos y exigen mucho tiempo y no son adecuados para investigaciones a gran escala.

El diagnóstico eficaz de EPP también ha estado impedido por el tiempo requerido para cultivar las bacterias causantes. Como resultado de la presente invención, ahora es posible el desarrollo de herramientas de diagnóstico que fomenten análisis rápidos y precisos para la presencia de L. intracellularis en muestras biológicas tomadas de animal de la especie porcina y de otros animales susceptibles de EPP.

Por lo tanto, el problema técnico que subraya la presente invención es proporcionar métodos mejorados para el diagnóstico de enfermedad por L. Intracellularis.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la salud animal y en particular a Lawsonia intracellularis. Se describe un método de diagnóstico de infección por Lawsonia intracellularis y un kit de ensayo de diagnóstico usando anticuerpos específicos de Lawsonia intracellularis. La invención también se refiere al uso del método o del kit de ensayo para diagnosticar infecciones por Lawsonia intracellularis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Fig. 1: Resultados de ELISA de Bloqueo de acuerdo con la invención

Fig. 2: Resultados de sueros del campo 301 comparado en IFA y ELISA.

Fig. 3: Resultados de investigaciones de ELISA de bloqueo - cortes transversales de ileítis en 3 granjas.

Fig. 4: Resultados de ELISA de ileítis - 22 granjas alemanas

Fig. 5: Correlación de resultados de ELISA con síntomas clínicos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones de terminologías usadas en la descripción:

Antes de las realizaciones de la presente invención, se debe observar que como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la", incluyen una referencia plural, a no ser que en el contexto se dicte claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una bacteria" incluye una pluralidad de tales bacterias, la referencia a la "célula" es una referencia a una o más células y equivalentes de la misma conocidos por los expertos en la materia, etcétera. A no ser que se defina de otro modo, todas las terminologías técnicas y científicas usadas en la presente memoria, tienen los mismos significados que los que entiende generalmente un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se puede usar en la práctica o someter a ensayo de la presente invención, cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria, los métodos, los dispositivos y los materiales preferidos se describen a continuación.

Como se usa en la presente memoria, la terminología “L. intracellularis” quiere decir las bacterias gramnegativas curvadas, intracelulares, descritas en detalle por C. Gebhart et al., Int’l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-538 (1.993) y S. McOrist et al., Int’l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1.995), que son la bacteria causante que puede ser obtenida de animal de la especie porcina u otros animales, infectados con EPP de todo el mundo, dado el conocimiento en la técnica y las explicaciones en la presente memoria; y variantes o mutantes de cualquiera de las bacterias anteriores, obtenidas bien espontáneamente o artificialmente y ADN, ARN y proteínas de bacterias específicas para L. intracellularis, incluyendo proteínas expresadas en vectores o después de aplicación in vivo y también fragmentos o derivados antigénicos de L. intracellularis. Esta terminología también incluye aislados adaptados y aislados atenuados, como se define a continuación.

Como se usa en la presente memoria, la terminología ‘aislado adaptado’ quiere decir cualquier aislado de L. intracellularis que se prepare de acuerdo con las técnicas de cultivo y de pase en cultivo celular o cualquier otra técnica para replicar L. intracellularis para fines de preparación de antígeno.

Como se usa en la presente memoria, la terminología “aislado atenuado” quiere decir cualquier aislado de L. intracellularis que se prepare de acuerdo con las técnicas de cultivo y de pase explicadas en la presente memoria para conseguir avirulencia al tiempo que se mantengan propiedades inmunogénicas cuando se administre a un animal hospedante.

Como se usa en la presente memoria, la terminología “cultivo a gran escala” quiere decir un nivel de cultivo de L. intracellularis mayor que aproximadamente 2,0 a 3,0 litros e incluye la producción sobre una escala de 100 litros o más. “Cultivo” como se usa en la presente memoria, quiere decir el procedimiento de fomentar el crecimiento, la reproducción y/o la proliferación de L. intracellularis.

Descripción de la invención

La solución al problema técnico anterior se consigue por la descripción y las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico de infección preclínica o clínica por L. intracellularis. Además, se detectará una respuesta inmunitaria a L. intracellularis y se tiene que proporcionar una herramienta para epidemiología de L. intracellularis.

Este objetivo se ha conseguido de acuerdo con la presente invención dentro del alcance de la memoria descriptiva y las reivindicaciones por medio de un método de diagnóstico de infección preclínica o clínica por L. intracellularis.

Se describe la detección de anticuerpos contra L. intracellularis y la detección de L. intracellularis misma. Tales anticuerpos incluyen cualquier tipo de anticuerpo conocido por los expertos, en particular inmunoglobulinas de los subtipos: IgA, IgA soluble, IgM, IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) y también IgD, IgE.

Para detectar anticuerpos específicos para L. intracellularis, de acuerdo con la invención, el método se basa en el hecho de que:

a) se toma una muestra líquida de un mamífero b) se detecta la unión específica de tal muestra líquida a antígeno de L.

intracellularis

c) se compara el resultado obtenido con un control.

Como se definió anteriormente, L. intracellularis también incluye fragmentos o derivados antigénicos de L. intracellularis, que se pueden usar en un método como anteriormente.

Similarmente, se describe un método para detectar L. intracellularis, como sigue:

el método se basa en el hecho de que:

a) se toma una muestra líquida de un mamífero

b) se detecta la unión específica de tal muestra líquida a anticuerpos de L.

intracellularis

c) se compara el resultado obtenido con un control.

La muestra líquida puede incluir fluidos corporales incluyendo muestras de: saliva, sudor, orina, sangre, secreciones, excreciones u otros fluidos corporales conocidos por el experto en el campo. En una realización preferida, la muestra líquida se recoge usando bien un envase de recogida (para orina u otro líquido), una jeringa/tubo de recogida (para sangre) o algún tipo de hisopo de recogida (para saliva, sudor, etc.). Preferiblemente, si la muestra en la etapa a) es sangre, suero o plasma se aísla de esta muestra de sangre y se lleva a cabo la etapa b) con suero o plasma en vez de la muestra líquida. Con posterioridad, se lleva a cabo la etapa c) como anteriormente.

En una realización preferida, el método es un inmunoanálisis. En un inmunoanálisis se usan anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales específicos a L. intracellularis. Los inmunoanálisis de acuerdo con la invención incluyen los métodos de detección conocidos en la materia tales como el ensayo ELISA (inmunoanálisis ligado a enzimas) o el denominado ensayo ELISA de tipo sándwich, dot-blots, inmunotransferencias, pruebas radioinmunológicas (radioinmunoanálisis RIA), ensayo de Ouchterlony basado en difusión o fluoroinmunoanálisis de cohete. Otros inmunoanálisis son el ensayo de anticuerpos inmunofluorescentes indirecto o directo (“IFA, por sus siglas en inglés”). Otro inmunoanálisis es la denominada inmunotransferencia (también conocido como procedimiento de transferencia Western o inmunotransferencia). El fin de la inmunotransferencia es transferir proteínas o polipéptidos aparte por electroforesis de gel de poliacrilamida sobre un filtro de nitrocelulosa u otro vehículo adecuado y al mismo tiempo retener las posiciones relativas de las proteínas o polipéptidos obtenidos a partir de la electroforesis de gel. La inmunotransferencia se incuba después con un anticuerpo que se une específicamente a la proteína o al polipéptido en consideración. Estos métodos de detección se pueden usar por el experto medio para llevar a cabo la invención descrita en la presente memoria. Las referencias bibliográficas en las que el experto puede encontrar los métodos mencionados anteriormente y otros métodos de detección, se enumeran como sigue: An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Países Bajos (1.986); Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1.982), Vol. 2 (1.983), Vol. 3 (1.985); Tijssen,

Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Países Bajos (1.985). Las tecnologías de circuitos integrados de proteínas sólidas y fluidas o tecnologías de micromatriz que usan reactivos marcados o no marcados son inmunoanálisis adicionales de acuerdo con la invención. Tal ensayo se describe ampliamente por ejemplo por Kozak KR, et al., Identification of biomarkers for ovarian cancer using strong anion-exchange ProteinChips: potential use in diagnosis and prognosis..Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2.003 Oct 14;100(21):12.343-8 (2.003) o por Fulton, R.J., et al., Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrixTM system. Clinical Chemistry 43 (9), 1.749-1.756 (1.997).

La invención además se refiere a un kit de ensayo de diagnóstico para detectar infección por L. intracellularis que contiene todos los elementos requeridos para llevar a cabo un método de diagnóstico de infección por L. intracellularis preclínica o clínica, como se describe en la presente memoria.

La invención además se refiere, en particular, a un kit de ensayo de diagnóstico que contiene anticuerpos específicos para L. intracellularis.

La invención además se refiere, en particular, a un kit de ensayo de diagnóstico, caracterizado por que los anticuerpos de acuerdo con la invención son policlonales.

La invención además se refiere, en particular, a un kit de ensayo de diagnóstico, caracterizado por que los anticuerpos de acuerdo con la invención son monoclonales.

Un kit de ensayo de diagnóstico es una colección de todos los componentes para un método de diagnóstico de acuerdo con la invención. Algunos ejemplos (no una lista exhaustiva) de otros elementos para llevar a cabo un procedimiento de acuerdo con la invención incluyen envases tales como placas de 96 pocillos o placas de microtitulación, tubos de ensayo, otros envases, superficies y sustratos, adecuados, membranas tales como filtro de nitrocelulosa, reactivos de lavado y amortiguadores. Un kit de ensayo de diagnóstico también puede contener reactivos que pueden detectar anticuerpos ligados tales como por ejemplo anticuerpos secundarios marcados, cromóforos, enzimas (por ejemplo, conjugadas con anticuerpos) y los sustratos de los mismos u otras sustancias que sean capaces de unir anticuerpos.

Las bacterias L. intracellularis se describen en la presente memoria o se conocen en la técnica o los componentes procedentes de tales bacterias, se pueden usar como antígeno en un ELISA u otro inmunoanálisis, tal como un ensayo de anticuerpos inmunofluorescentes (“IFA”), para detectar anticuerpos para L. intracellularis en el suero y otros fluidos corporales de animales que se sospecha que están infectados con las bacterias. El inmunoanálisis preferido en el momento presente es un IFA, como se describe en el ejemplo a continuación. Alternativamente, las bacterias de la invención inmediata se pueden usar en un ensayo de inmunotransferencia.

El protocolo de la transferencia Western preferida es como sigue:

1.

Hacer antígeno sobre SDS-PAGE al 12% y transferir a membrana de nitrocelulosa.

2.

Poner membrana en amortiguador de bloqueo durante 2 horas.

3.

Retirar amortiguador de bloqueo y enjuagar con PBS durante 1 minuto.

4.

Diluir suero en amortiguador de bloqueo y añadir a membrana. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.

5.

Lavar 3 veces con amortiguador de lavado (5 minutos para cada lavado).

6.

Diluir un anticuerpo específico de anti-L.intracellularis conjugado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, en amortiguador de bloqueo y añadir a membrana. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.

7.

Lavar 3 veces con amortiguador de lavado.

8.

Añadir sustrato durante 10 minutos o hasta que tenga lugar bandeo intenso.

9.

Enjuagar con PBS.

10.

Secar al aire y conservar en la oscuridad.

El conjugado unido al anticuerpo podía ser por ejemplo una enzima, tal como una peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) o fosfatasa alcalina (FA). Alternativamente, un cromóforo o cualquier otra substancia detectable que se pueda cuantificar en presencia de un substrato, se puede usar como conjugado.

El inmunoanálisis más preferido de acuerdo con la invención es un ELISA. Lo más preferiblemente, tal ELISA es un ELISA de tipo sándwich (= ELISA de captura). Tal ELISA es más específico, ya que detecta con dos anticuerpos específicos a dos diferentes epítopos sobre el mismo antígeno. En un ELISA de tipo sándwich, se recubren los anticuerpos no marcados en las placas de microtitulación. La L. intracellularis como antígeno se añade con posterioridad. Después de una etapa de lavado, el antígeno de L. intracellularis ligado se detecta con un segundo anticuerpo específico de L. intracellularis marcado, reactivo con un diferente epítopo sobre L. intracellularis.

Un procedimiento de recubrimiento ejemplar es como sigue:

Las placas se recubren con anticuerpo no marcado, por ejemplo, en sacarosa al 10%/Suero Normal de Caballo al 10% en ddH2O y se incuban con antígeno de Lawsonia intracellularis. Las placas se secan después y se sellan y se conservan a 37°C. Alternativamente, se conservan las placas recubiertas de anticuerpo y se añade el antígeno cuando se realiza el ELISA.

Un protocolo ELISA preferido de acuerdo con la invención es como sigue (uso de placas recubiertas de anticuerpo):

1.

Añadir 0,1 ml/pocillo de antígeno diluido en amortiguador de recubrimiento. Incubar durante 18 horas a 4°C.

2.

Lavar 3 veces con PBS.

3.

Añadir 0,25 ml de amortiguador de bloqueo a cada pocillo de la placa. Incubar 1 a 2 horas a 37°C.

4.

Lavar 3 veces con amortiguador de lavado.

5.

Diluir suero en amortiguador de bloqueo y añadir 0,1 ml a los primeros pocillos de la placa. Hacer series de diluciones 1:2 de un lado a otro de la placa. Incubar durante 1 hora a 37.

6.

Lavar 3 a 5 veces con amortiguador de lavado.

7.

Diluir un anticuerpo específico de anti-L.intracellularis conjugado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, en amortiguador de bloqueo y añadir 0,1 ml a pocillos de la placa e incubar durante 1 hora a 37°C.

8.

Lavar 3 a 5 veces con amortiguador de lavado.

9.

Añadir sustrato.

10.

Medir la absorbancia de la luz con un espectrofotómetro.

11.

Se usan los pocillos en que no se añadió antígeno como muestras para ensayo en blanco.

12.

También se debería usar suero de animal de la especie porcina de control,

positivo y negativo, con cada ensayo. Un ELISA preferido se lleva a cabo como sigue: Las placas se recubren con anticuerpo no marcado, por ejemplo, en sacarosa

al 10%/Suero Normal de Caballo al 10% en ddH2O y se incuban con antígeno de Lawsonia intracellularis. Las placas se secan después y se sellan y se conservan a 37°C.

1.

Añadir 90 µl de amortiguador a cada pozo.

2.

Añadir 10 µl de suero en pozos seleccionados.

3.

Incubar la placa durante 1 hora a 37ºC.

4.

Lavar la placa 3 veces con PBST.

5.

Añadir anticuerpo específico de anti-L.intracellularis conjugado de HRP, preferiblemente un anticuerpo monoclonal diluido en CDS-C+NaCl 0,5M, 100µl /pocillo.

6.

Incubar la placa durante 1 hora a 37ºC.

7.

Lavar la placa 3 veces con PBST.

8.

Añadir sustrato, 100 µl/pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

9.

Añadir 50 µl interrupción/pocillo.

10.

Leer la placa a 450 nm en un espectrofotómetro.

El protocolo ELISA de tipo sándwich más preferido de acuerdo con la invención es como sigue:

1.

Añadir 0,1 ml/pocillo de mAb diluido en amortiguador de recubrimiento. Incubar durante 18 horas a 4°C.

2.

Lavar 3 veces con PBS.

3.

Añadir 0,1 ml/pocillo de antígeno diluido en amortiguador a cada pocillo de la placa. Incubar 1 a 2 horas a 37°C.

4.

Lavar 3 veces con amortiguador de lavado y/o añadir directamente 0,25 ml de amortiguador de bloqueo a cada pozo de la placa. Incubar 1 a 2 horas a 37°C.

5.

Lavar 3 veces con amortiguador de lavado.

6.

Diluir suero en amortiguador de bloqueo y añadir 0,1 ml a los primeros pocillos de la placa. Hacer series de diluciones 1:2 de un lado a otro de la placa. Incubar durante 1 hora a 37.

7.

Lavar 3 a 5 veces con amortiguador de lavado.

8.

Diluir anticuerpo específico de anti-L.intracellularis conjugado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal en amortiguador de bloqueo y añadir 0,1 ml a pocillos de la placa e incubar durante 1 hora a 37°C.

9.

Lavar 3 a 5 veces con amortiguador de lavado.

10.

Añadir sustrato.

11.

Medir la absorbancia de la luz con un espectrofotómetro.

12.

Se usan los pocillos en que no se añadió antígeno como muestras para ensayo en blanco.

13.

También se debería usar suero de animal de la especie porcina de control, positivo y negativo, con cada ensayo.

El antígeno como se usa en la presente memoria es L. intracellularis, como se definió anteriormente. mAb se refiere a un anticuerpo monoclonal específico para L. intracellularis. Preferiblemente, tal anticuerpo es un anticuerpo como se describe a continuación.

Sorprendentemente, los anticuerpos relevantes se generaron para que se usaran en el ELISA de acuerdo con la invención. Los anticuerpos tienen los siguientes números de referencia: 301:39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2 y 268:18. Todos los anticuerpos son específicos para antígenos de bacterias L. intracellularis. Preferiblemente como anticuerpos de captura en un ELISA de tipo sándwich son: 110:9, 113:2 ó 287:6 y como anticuerpos conjugados 268:18, 268:29 ó 287:6. Como anticuerpo de captura el más preferido es el anticuerpo 110:9 y como anticuerpo conjugado es el anticuerpo 268:29.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se producen por células de hibridoma. Dichas células de hibridoma de acuerdo con la invención están depositadas en el Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR) y European Collection of Cell Cultures (ECACC)“, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, como depósito de patentes de acuerdo con el Tratado de Budapest. La fecha de depósito fue 11 de mayo de 2.004. LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 110:9 se deposita con éxito bajo ECACC Reg. No. 04092204. LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 113:2 se deposita con éxito bajo ECACC Reg. No. 04092201. LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 268:18 se deposita con éxito bajo ECACC Reg. No. 04092202. LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 268:29 se deposita con éxito bajo ECACC Reg. No. 04092206. LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 287:6 se deposita con éxito bajo ECACC Reg. No. 04092203. LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 301:39 se deposita con éxito bajo ECACC Reg. No. 04092205.

La presente invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no deben ser considerados limitantes. Por supuesto, otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto en la materia.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

1.0 Material

Línea celular de hibridoma anti-Lawsonia: 372:13, 113:2, 268:18, 287:6, 110:9, 268:29, 301:39.

Equipo y medios de cultivo para cultivo de células de hibridoma.

Equipo y amortiguadores para la purificación y la conjugación de HRP de anticuerpos (mAb) monoclonales.

Equipo y soluciones para ELISA

Antígeno de Lawsonia SF 1289 N343 12/20/00

Sueros positivos de Lawsonia: lote#052902cerdo#26 (infectado experimentalmente),

lote#052902cerdo#69 (vacunar)

sueros negativos de Lawsonia: p 25,8#273 Día 52 6-30-95,

116705

1.1 Métodos

La preparación de los anticuerpos monoclonales se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos de operación clásicos en Svanova Biotech.

1.1.1 Cultivo de células de hibridoma y preparación de anticuerpos monoclonales conjugados de HRP

•

Para asegurar las líneas celulares de hibridoma se prepararon 15 viales de cada línea celular y se conservaron a –135ºC.

•

Se descongeló un vial de cada línea celular de hibridoma y las células se cultivaron en matraces para cultivo de células.

•

Se purificaron 500 ml a 1.000 ml de sobrenadante de cada línea celular y se conjugaron a peroxidasa de rábano.

1.1.2 ELISA de Bloqueo

Se ensayó en el mAb purificado y conjugado de HRP su capacidad para que se bloquee por sueros de cerdo de Lawsonia positivos en ELISA.

•

La placa de ELISA se recubrió con antígeno de Lawsonia en una dilución de 1/200, 100 µl/pozo

•

Los sueros de cerdo se diluyeron 1/10, 100 µl/pozo

•

Se diluyó el mAb conjugado de HRP y se añadió, 100 µl/pozo. Los resultados se expresan como Porcentaje de inhibición (PI) de acuerdo con

la siguiente fórmula: PI = 1 - (muestra OD / mAb OD) x 100.

1.2 Resultados 1.2.1 Cultivo de células de hibridoma y preparación de anticuerpos monoclonales conjugados de HRP

•

Todos los mAb menos uno se purificaron con éxito y se conjugaron de HRP. Tuvieron buena capacidad de producción.

•

mAb 372:13 tuvo una capacidad de producción deficiente. Este mAb no se conjugó con éxito a HRP y por lo tanto no se ensayó en el ELISA de bloqueo.

1.2.2 ELISA de Bloqueo

•

Se usaron dos sueros positivos (#26, #69) y dos negativos (25,8#273, 116705) en los experimentos.

•

Los sueros (#26) infectados experimentalmente inhibieron los seis mAb conjugados de HRP, pero en niveles diferentes. Los sueros de un cerdo vacunado inhibieron el mAb en mucha menor medida.

•

Los sueros negativos no mostraron inhibición o muy baja. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y en la Fig. 1.

mAb

Suero 301 : 39 110 : 9 268 : 29 287 : 6 113 : 2 268 :18

#26 exp

+

57 45 78 74 42 72 #vac 69

+

18 23 52 43 45 25 25,8#273

-7 3 27 20 14 21 116705 --7 -9 -24 -13 18 -19

1.3 Discusión

5 Los resultados de este estudio muestran claramente que uno o más de los anticuerpos monoclonales ensayados son adecuados para un ensayo ELISA de bloqueo contra Lawsonia intracellularis. Los mAb 268:29, 287:6 y 268:18 muestran la distinción más clara entre los sueros positivo y negativo, es decir, son fuertes candidatos en el desarrollo del ELISA de bloqueo.

10 EJEMPLO 2 2.0 Sumario

15 Desarrollo y establecimiento de un prototipo de b-ELISA de tipo sándwich para la detección de anticuerpos para Lawsonia intracellularis: Después del cálculo de la sensibilidad y la especificidad usando análisis de inmunofluorescencia IFA como patrón de oro se pudo concluir lo siguiente:

•

Capturar mAb 110:9 da una clara distinción entre muestras positivas y 20 negativas.

•

La detección de mAb 268:29 HRP da una clara distinción entre sueros positivo y negativo, que muestra una sensibilidad y especificidad de 100%.

•

Se recomienda que el prototipo sea como sigue:

•

mAb 110:9 como mAb de captura, recubierto en tiras C-8 de maxi-sorc de 25 Nunc

•

Antígeno (Ag): Cultivo de Lawsonia intracellularis (preferiblemente el

material concentrado producido en R&D a BI)

•

Muestras de suero diluidas 1/10 en NaCl 0,5M/PBST. Incubación durante 1 hora a 37C.

•

mAb conjugado de HRP 268:29, liofilizado en amortiguador CDS-C que contenía NaCl 0,5M. Incubación durante 1 hora a 37C.

•

Sustrato K-Blue Max, incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente.

•

solución de interrupción de Svanova

2.1 Material y métodos

Se llevó a cabo el ELISA de acuerdo con el siguiente procedimiento:

2.1.0 Procedimiento ELISA

•

Añadir 90 µl de amortiguador a todos los pocillos.

•

Añadir 10 µl de suero a los pocillos seleccionados.

•

Incubar la placa durante 1 hora a 37C.

•

Lavar la placa 3 veces con PBST

•

Añadir mAb conjugado de HRP diluido en CDS-C+NaCl 0,5M, 100 µl /pocillo.

•

Incubar la placa durante 1 hora a 37C.

•

Lavar la placa 3 veces con PBST.

•

Añadir substrato, 100 µl/pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

•

Añadir 50 µl interrupción/pozo

•

Leer la placa a 450 nm en un espectrofotómetro.

Los resultados se presentaron como 1- valores OD o 2- valores PI (porcentaje de inhibición) es decir 100 – OD muestra/ OD mAb x 100.

2.1.1 Ensayo 1 (ELISA 030922, 030923 x2)

Maxitiras C-8 recubiertas con mAb 110:9, 113:2, 301:39, 287:6, 268:29, 300 ng/pozo. Bloqueo de tiras con 10% de 2251HÄS(suero normal de caballo), sacarosa al

10% /UHP H2O. 150 µl/pocillo, incubados durante 30 segundos a temperatura

ambiente. Ag # 030619 diluido 1/10 en PBST, 100 µl/pocillo, 3 horas de incubación en 4C. Tiras secadas en 37C durante 3 horas. Conservadas en 4C. Sueros: IFA pos: #26, #69. IFA neg: #6, C1, D1, E1. Diluido 1/10 en NaCl

0,5M/PBST Conjugado: 268:18, 113:2, 301:39110:9, 287:6, 268:29 HRP diluido en NaCl 0,5M/PBST. Todo el mAb de captura se ensayó frente a todo el mAb conjugado de HRP salvo frente a sí mismo.

2.1.2 Ensayo 2 (ELISA 030924)

Tiras recubiertas con 110:9, 113:2 y 287:6 de acuerdo con el ensayo 1 anterior. Sueros: IFA pos: #26, #69. IFA neg: #6, C1, D1, E1. Diluido 1/10 en NaCl 0,5M/PBST

mAb conjugado de HRP 268:18, 268:29, 287:6 diluido en NaCl 0,5M/CDS-C (amortiguador clásico para liofilización de conjugados como Svanova en la producción).

2.1.3 Ensayo 3 (ELISA 030925)

Tiras recubiertas con 110:9, 113:2 y 287:6 de acuerdo con el ensayo 1 anterior. Sueros: se ensayaron 24 sueros (10 IFA pos, 10 IFA neg y 4 dudosos). Dilución: 1/10 en NaCl 0,5M/PBST. Conjugado: 268:18 HRP diluido en NaCl 0,5M/CDS-C.

2.1.4 Ensayo 4 (ELISA 030930, 031002, 031008)

Tiras recubiertas con 110:9 de acuerdo con el ensayo 1 anterior. Sueros: 21 IFA positivo y 69 IFA negativo. Dilución: 1/10 en NaCl 0,5M/PBST Conjugado: 268:18 conjugado con HRP y 268:29 conjugado con HRP diluido

en NaCl 0,5M/CDS-C.

2.2 Resultados 2.2.1 Ensayo 1 (ELISA 030922, 030923 x2)

Los mAb de captura 110:9, 113:2 y 287:6 con los conjugados 268:18 y 268:29 y 287:6 parece que son los mejores candidatos para el b-ELISA de tipo sándwich, ya que estas combinaciones mostraron la mejor capacidad de bloqueo en los sueros positivos. Los sueros Nº #6 obtuvieron positivo en la mayoría de los ensayos. Esto se sospechó debido a que este suero también obtuvo positivo en el prototipo b-ELISA desarrollado previamente.

2.2.2 Ensayo 2 (ELISA 030924)

Este ensayo se llevó a cabo principalmente para asegurar que se podía usar el amortiguador patrón usado para liofilizar el conjugado. Los resultados muestran que el bloqueo se consiguió con los sueros positivos. El mejor bloqueo se encontró con la detección de mAb 268:18 ó 268:29.

2.2.3 Ensayo 3 (ELISA 030925)

Se encontró que el mAb de captura 110:9 era la mejor elección ya que daba la diferenciación más clara entre muestras positivas y negativas.

2.2.4 Ensayo 4 (ELISA 030930, 031002. 031008)

Se pueden encontrar valores de OD y PI obtenidos en el apéndice 5. Cuando se representan gráficamente los valores OD frente a los resultados IFA el mAb 268:29 conjugado de HRP da la distinción más clara entre muestras positivas y negativas con una sensibilidad y especificidad del 100 %. mAb 268:18 también da una sensibilidad y especificidad de 100% pero el área entre muestras positivas y negativas es ligera. Cuando se representan gráficamente los valores PI, el mAb 268:18 da una sensibilidad de 95,7 y una especificidad de 100% a corte 20,9 mientras que el mAb 268:29 da tanto una sensibilidad como una especificidad de 100% a corte 28,6.

2.3. Discusión

Después del cálculo de la sensibilidad y la especificidad frente al análisis de inmunofluorescencia IFA, se puede concluir lo siguiente:

• mAb 110:9 de captura es la mejor elección ya que da una distinción clara entre muestras positivas y negativas.

• Detección de mAb 268:29 conjugado con HRP es la mejor elección ya que 5 da una distinción clara entre sueros positivos y negativos con una

sensibilidad y una especificidad del 100%. Se recomienda que el prototipo sea como sigue:

• mAb 110:9 como mAb de captura, recubierto en tiras C-8 de maxi-sorc Nunc

• Ag: Cultivo de Lawsonia intracellularis (preferiblemente el material 10 concentrado producido en R&D a BI)

•

Muestras de suero diluidas 1/10 en NaCl 0,5 M/PBST. Incubación durante 1 hora a 37C.

•

mAb 268:29 conjugado de HRP, liofilizado en amortiguador CDS-C que contenía NaCl 0,5M. Incubación durante 1 hora a 37C.

15 • Substrato K-Blue Max, incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente.

• solución de interrupción de Svanova EJEMPLO 3

3.1 Resumen

Los estudios de estabilidad acelerada realizados indican que la placa de ELISA capturada por antígeno de Lawsonia intracellularis tiene una estabilidad de al menos un año y que el conjugado 268:29 de HRP a- Lawsonia tiene una estabilidad de 6 a 12 meses en una forma liofilizada.

3.2 Introducción

Para estimar la estabilidad de los componentes de un futuro kit de ELISA de Lawsonia intracellularis se tienen que llevar a cabo ensayos de estabilidad acelerada. El componente que se tiene que ensayar se conserva a 37C durante 4 semanas y se ensaya después en el ELISA en comparación con un componente conservado a 4C. La estabilidad de 4 semanas en 37C indica un tiempo de durabilidad de aproximadamente 12 meses. Este informe describe estudios de estabilidad acelerada realizados sobre placa ELISA capturada de antígeno y en el conjugado de HRP.

3.3 Materiales y métodos

Estabilidad acelerada sobre placas (ELISA 031024)

Las placas se recubrieron con mAb 110:9 de Lawsonia bloqueado con sacarosa al 10%/suero normal de caballo al 10% en ddH2O y se incubaron con antígeno de Lawsonia. Las placas se secaron y se sellaron y se pusieron a +37ºC. Se tomaron placas de 1, 2, 3 y 4 semanas, de +37C, y conservadas en un refrigerador. Las placas también se almacenaron en +4C durante el periodo de ensayo completo como referencia.

Se usaron sueros positivos #26, #69 y #06 y negativos C2, D1 y E2 para comprobar la realización del ELISA de tipo sandwich.

Se usó mAb 268:29 conjugado de HRP lote #030120.

Estabilidad acelerada sobre conjugado liofilizado (ELISA 031027)

Se diluyó 1/1.000 mAb 268:29 conjugado de HRP, lote #030120, en amortiguador CDS-C distribuido en frascos de vidrio y liofilizado de acuerdo con procedimientos clásicos. Se conservaron cuatro frascos liofilizados a +37C durante 1, 2, 3 y 4 semanas. También se conservaron frascos a 4C. Se ensayaron los diferentes frascos en el ELISA de tipo sandwich.

Se usó como suero positivo #26 y se usaron como suero negativo 030926.

Se encontró que una dilución de 1/1.000 del anticuerpo conjugado (“dilución de conjugado”) daba valores OD demasiado altos en el ensayo. El anticuerpo conjugado se valoró por lo tanto en la placa para obtener una señal correcta para el ensayo.

3.4. Resultados

Estabilidad acelerada sobre placas

Se vio una gran caída en los valores OD después de 1 semana comparado con el valor OD de las tiras mantenidas a +4oC. No se vieron grandes diferencias cuando se comparó la semana 1 a 4. Cuando se miran los valores PI no se encontró nada significativo entre la semana 1 a 4 y +4ºC.

Estabilidad acelerada sobre conjugado liofilizado

A una “dilución de conjugado” de 1/8.000 el suero # 26 mostró una disminución de 0,547 a 0,398 después de 4 semanas y el suero 030926 cayó de 1,654 a 0,99 después del periodo de 4 semanas.

3.5. Discusión

Los estudios de estabilidad acelerada llevados a cabo indican que la placa ELISA de Lawsonia intracellularis tiene una estabilidad de al menos un año. El anticuerpo 268:29 conjugado de HRP de anti-Lawsonia mostró una disminución del 40% en el valor OD frente a los sueros negativos y después de 4 semanas. Esto podía indicar alguna inestabilidad del conjugado. Cuando se calcula en los valores OD una disminución del 40% de una señal a la media de 1,5 y el valor OD de 0,9 después de 1 año que está aún dentro de los criterios de aceptación.

EJEMPLO 4

4.1 Resumen

Se llevó a cabo la verificación del prototipo (lote de placa 040107) ensayando 50 sueros usados previamente cuando se desarrolló el prototipo. El estudio de verificación mostró un acuerdo del 100% con los sueros positivos mientras 2 de los 25 sueros negativos obtuvieron positivo en el lote verificado.

Se encontró que se podía usar suero normal de caballo en el amortiguador de CDS-C en vez de sueros de animal de la especie porcina que es el caso hoy en día.

Se encontró que PBST que contenía PVP al 0,042% mostraba resultados similares que usando los comprimidos de PBST (que contenían PVP).

4.2 Introducción

Para verificar el prototipo ELISA de tipo sandwich se tiene que ensayar un gran número de sueros en un lote de placa producido a gran escala. El estudio se realizó sobre el lote de placa 040107 que se ensayó examinando 50 muestras de suero que previamente se habían usado para desarrollar el prototipo.

Se usó amortiguador CDS-C como conservante cuando se estaba liofilizando el conjugado de HRP. Este amortiguador contiene sueros de animal de la especie porcina. Como puede ser problemático en el futuro encontrar sueros negativos de Lawsonia para que se usen en el amortiguador de CDS-C se tiene que ensayar una alternativa. En este estudio se ensayaron suero normal de caballo y suero bovino fetal.

La mayoría del trabajo de laboratorio en este ELISA se ha llevado a cabo con comprimidos de PBST. Se ha visto que el PBST conc.20x que está incluido en kits Svanovir no se puede usar puesto que el ensayo no diferenciará correctamente entonces entre muestras positivas y negativas. Cuando se comparan las recetas de los comprimidos y el PBST conc. 20x se encontró que todos los componentes eran el mismo salvo PVP al 0,042% (polivinilpirrolidona K25) que se incluyó en los comprimidos como un factor de estabilización. Los experimentos mostraron que cuando se añadía el PVP al PBST 20x se conseguían los mismos resultados que con los comprimidos.

4.3 Materiales y métodos

Verificación de prototipo (ELISA 040312)

50 sueros (recibidos de Bioscreen) ensayados previamente en el ELISA prototipo se ensayaron en el lote # 040107 de placa de gran escala. Se usó amortiguador de PBST conc 20x con PVP al 0,042%. Se usó lote 040308 de conjugado liofilizado.

Amortiguador CDS-C con suero normal de caballo

Ensayo ELISA 040203

El amortiguador de CDS-C se preparó con; 1- suero de animal de la especie porcina (como en TJ4/05F), 2- con suero normal de caballo y 3- con suero bovino fetal. Los amortiguadores se ensayaron como amortiguador conjugado en el ELISA. Los sueros ensayados fueron gris 2, 4, 13 y 17, 1-29664, 3-29664, A-27239, B-27239, #26 y C2. Se usó mAb conjugado de HRP 268:29 lote #030318. Se usó PBST conc 20 x con PVP al 0,042%.

Ensayo ELISA 040311

Se ha usado suero normal de caballo que contenía amortiguador CDS-C para preparar conjugado liofilizado en dos ocasiones (040211, 040308). Se preparó el conjugado para obtener una dilución final de 1/20k, 1/25k y 1/30k. Se ensayó conjugado recién preparado en paralelo. Se usaron los sueros: #26, 1-29664, 3-29664, A-27239, B-27239, conjunto pos 030926 y conjunto negativo 030926. Se usó mAb conjugado de HRP, 268:29, lote #030318. Se usó PBST conc 20 x con PVP al 0,042%.

PBST con PVP (ELISA 040301)

Amortiguador PBST concentrado 20x se diluyó 1/20 y se añadió una concentración final de PVP al 0,042%. Se ensayó este amortiguador en paralelo con comprimidos de PBST (que ya contenían PVP) y amortiguador PBST conc 20x diluido 1/20. Se usaron los amortiguadores en todas las etapas, es decir en el amortiguador de la muestra y de dilución del conjugado así como en el amortiguador de lavado.

Se usaron los sueros: #26, E1, 1-29664, 3-29664, A-27239, B-27239 y gris 13. Se usó mAb 268:29 conjugado de HRP, lote #030318. Se usó como amortiguador CDS-C conjugado con suero de animal de la especie porcina.

4.4. Resultados

Verificación de prototipo

Los resultados muestran que todos los 25 sueros previamente positivos también obtenían positivo en el lote de verificación. Dos de los 25 sueros previamente negativos obtuvieron positivo.

Amortiguador CDS-C con suero normal de caballo

El amortiguador que contenía suero normal de caballo mostró resultados similares al de con sueros de animal de la especie porcina.

La lectura del mAb conjugado de HRP liofilizado disminuyó a lo sumo 0,4 OD cuando se compara con el conjugado recién preparado. Esta caída se observó en ambos lotes de conjugado liofilizado. No está afectando a la realización del ensayo ya que los valores de PI calculados correspondían bien sin tener en cuenta los valores de OD obtenidos.

PBST con PVP

Los resultados muestran que solución de PBST concentrada 20x, diluida 1/20 con adición de PVP al 0,042% daba resultados similares que los comprimidos de PBST mientras PBST conc 20x diluido 1/20 sin el PVP mostraba resultados falsos negativos.

4.5. Discusión

Se llevó a cabo la verificación del prototipo (lote de placa 040107) ensayando 50 sueros usados previamente cuando se desarrolló el prototipo. El estudio de verificación mostró un acuerdo del 100% con los sueros positivos mientras 2 de los 25 sueros negativos obtuvieron positivo en el lote verificado. Los resultados “falsos” negativos son aceptables ya que la mayor importancia de este ensayo es detectar muestras positivas. No se ha demostrado tampoco que los resultados del ensayo previo sean por supuesto verdaderos.

Se encontró que PBST que contenía PVP al 0,042% mostraba resultados similares que usando los comprimidos de PBST (que contienen PVP). Los kits futuros contendrán por lo tanto este amortiguador. Se tiene que llevar a cabo un estudio de estabilidad del PBST conc 20x con PVP para asegurar la validez de los kits.

EJEMPLO 5

5.1 Introducción y Objetivos

La detección de anticuerpos de suero frente a Lawsonia intracellularis se hace hasta ahora por el uso de ensayos IFA (1). Estos ensayos confían en un criterio individual y altamente subjetivo en la interpretación de resultados. Recientemente se desarrolló un ELISA de bloqueo de tipo sandwich usando anticuerpos monoclonales altamente específicos frente a L. intracellularis. Los datos de este ensayo se pueden medir y evaluar sobre una base objetiva, que mejora la reproducibilidad, repetitividad y análisis comparativos. En este estudio se presentan los primeros datos comparativos al ensayo IFA, demostrando la idoneidad y realización del nuevo ensayo.

5.2 Material y Métodos

Se usó el antígeno de L. intracellularis crecido en un cultivo de células McCoy y capturado por un anticuerpo monoclonal específico en placas de microtítulo, para detectar anticuerpos frente a L. intracellularis en muestras de suero porcino. Se ensayaron sueros en una dilución 1 a 10. Después de 1 hora de incubación a 37 °C se lavaron placas con solución de PBS y Tween, se añadió anticuerpo monoclonal marcado de peroxidasa de rábano (diferente al anticuerpo de captura). Las placas se incubaron durante una hora adicional a 37 °C. Se retiraron anticuerpos no ligados por lavado. Después de incubación con substrato TMB, durante 10 min., a temperatura ambiente, se detuvo la reacción añadiendo una solución de interrupción. Se leyó el OD450 en un fotómetro para cada pozo. Se calcularon los resultados como porcentaje de inhibición de controles sin suero. Se usaron sueros de campo 301, ensayados en un ensayo (2) IFA validado para anticuerpos frente a L. intracellularis, para evaluar el nuevo ELISA. Además se usaron muestras de corte transversal (10 muestras cada una de grupos de edad 9) de dos granjas con ileítis conocida y una granja con ileítis sospechada, para demostrar el valor de diagnóstico del ELISA en comparación con el IFA.

5.3 Resultados

Muchos sueros negativos dieron como resultado valores de inhibición negativos. Por lo tanto, el valor medido más bajo se fijó a 0 y todos los demás valores se refirieron a éste. Se declaran estos datos como “valores ELISA relativos”.

Los resultados de los sueros del campo 301 se resumen en la Figura 2. El ELISA discrimina claramente entre sueros negativos (valor ELISA relativo medio 36) y positivos (valor ELISA relativo medio 89). La mayoría de las muestras que obtuvieron dudoso en el IFA fueron positivas en el ELISA.

Los resultados de las investigaciones de cortes transversales en las 3 granjas se muestran en la Figura 3. Ambos ensayos detectan claramente anticuerpos frente a

L. intracellularis en las 3 granjas.

5.4 Discusión

En comparación con los resultados del ensayo IFA el ELISA proporciona una sensibilidad mayor. En algunos grupos de las 3 granjas ensayadas el resultado del ELISA es mucho menos ambiguo que en el ensayo IFA, que da un montón de resultados cuestionables debido a fluorescencia no específica. Los perfiles serológicos en las 3 manadas correspondían bien con datos publicados previamente de manadas europeas (3,4). El aumento de los valores ELISA entre el grupo de cerdos de 10 y 16 semanas en comparación con los resultados del ensayo IFA indican que los sueros con valores ELISA relativos mayores de 55 se pueden juzgar como positivos.

Este nuevo ensayo podía ayudar a mejorar el diagnóstico de ileítis en muestras de rutina. ELISA de ileítis de bloqueo nuevo proporciona una herramienta para investigación rápida y sensible de grandes cantidades de muestras sobre una base objetiva.

Referencias

1.

Guedes RMC et al., 2.002. Can J Vet Res 66:99-107.

2.

Knittel JP et al.,1.998. AJVR 59:722-726.

3.

Biksi I et al., 2.002. Proc. 17th IPVS, Ames, Iowa, EE.UU.

4.

van Aken N et al., 2002. Proc. 17th IPVS, Ames, Iowa, EE.UU.

EJEMPLO 6

6.1 Introducción y Objetivos

El diagnóstico específico de ileítis se hace hasta ahora por el uso de ensayos IFA para detección de anticuerpos (1,2) o PCR (3,4), métodos histológicos y de inmunomarcado (2,5,6) para detección de antígeno en muestras de heces o de tejido intestinal. Todos estos métodos presentan desventajas específicas que conciernen a la especificidad, riesgo de contaminación o carga de trabajo y no son adecuados para investigaciones de rutina de manadas en una gran escala. Así la mayoría de los ensayos de diagnóstico se hacen sólo para unos cerdos de una manada. Por el uso de un ELISA de bloqueo desarrollado recientemente el ensayo serológico se hace más fácil, más fiable y adecuado para perfil de manada. Las investigaciones de cortes transversales de 22 granjas en Alemania se llevaron a cabo para demostrar la realización de diagnóstico del nuevo ensayo.

6.2 Material y Métodos

Se ensayaron en ELISA muestras de cortes transversales de veintidós granjas alemanas. Se tomaron muestras de primerizas, cerdas y cerdos de 4, 7, 10, 13, 16, 20 y 24 semanas en cada granja (10 muestras en cada grupo de edad). Se hizo el ELISA como se describió en el ejemplo 5.

6.3 Resultados

En la Figura 4 se resumen los valores medios relativos de ELISA de las 22 granjas. Sueros de primerizas y cerdas son altamente reactivos en el ELISA, mientras son bajos los resultados de lechones destetados de 4 a 10 semanas de edad. En los cebados los valores ELISA aumentan de 13 a 24 semanas.

En la Figura 5 se correlacionan valores medios relativos de ELISA con los síntomas clínicos en las granjas. Las granjas No. 5, 6 y 15 no tuvieron problemas entéricos clínicos al tiempo del muestreo. En la granja No. 3, lechones de 4 a 13 semanas tuvieron problemas entéricos que se diagnosticaron como diarrea por E. coli. En la granja No. 18, ensayos serológicos previos indicaron la presencia de Lawsonia intracellularis en la granja sin síntomas clínicos. En las granjas No. 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 21 y 22 se diagnosticó ileítis antes del muestreo para este estudio. Las granjas No. 4, 13, 14, 16 y 20 indican problemas entéricos en productores y cebadores, en las granjas No. 4 y 13 se sospecha ileítis clínica. En la granja No. 17 no se observan señales clínicas de diarrea pero se usan antibióticos en productores y en el comienzo del engorde.

6.4 Discusión

El seroperfil resumido de las 22 granjas muestra alta reactividad en cerdas y primerizas y aumento de la reacción de anticuerpos que empieza a las 13 semanas hasta 24 semanas. Estas observaciones están de acuerdo con datos serológicos publicados hasta ahora para ileítis (7,8,9).

Los cerdos de las granjas sin diarrea (No. 5, 6, 15 y 18) y la granja con diarrea por E. coli (No. 3) no mostraron seroconversión significativa en el ELISA. En las granjas con ileítis conocida (No. 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 21 y 22) se puede detectar una seroconversión clara entre las semanas 7 y 13. Interesantemente, las muestras de la mayoría de los grupos de cerdas y primerizas son altamente reactivos en el ELISA, aunque la mayoría de estos cerdos no tenían problemas entéricos aparentes. Esto podía ser debido a una infección subclínica con Lawsonia intracellularis. Los resultados de la granja No. 17 parecen indicar una ileítis subclínica. El nuevo ELISA de acuerdo con la invención proporciona una herramienta poderosa para diagnóstico serológico de ileítis adecuado para ensayo de rutina de investigaciones de manadas de tamaños de muestra grandes y de cortes transversales.

Referencias

1.

Knittel JP et al.,1.998. AJVR 59:722-726.

2.

Guedes RMC et al., 2.002. Can J Vet Res 66:99-107.

3.

Jones GF et al., 1.993. J Clin Microbiol 31: 2.611-2.615.

4.

Suh-DK et al., 2.000. J Vet Sci 1:33-37.

5.

McOrist S et al., 1.989. Vet Pathol 26: 260-264.

6.

Huerta B et al., 2.003. J Comp Path 129: 179-185.

7.

Biksi I et al., 2.002. Proc. 17th IPVS, Ames, Iowa, EE.UU.

8.

van Aken N et al., 2.002. Proc. 17th IPVS, Ames, Iowa, EE.UU.

9.

Holyoake PK et al., 1.994. J Clin Microbiol 32: 1.980-1.985.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para el diagnóstico de infección por Lawsonia intracellularis preclínica o clínica, que comprende las siguientes etapas:

   a) detectar la unión específica de una muestra líquida a un anticuerpo de L. intracellularis, en donde los anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpo monoclonal 301:39 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092205, anticuerpo monoclonal

   287:6 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092203, anticuerpo monoclonal 268:29 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092206, anticuerpo monoclonal 110:9 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092204, anticuerpo monoclonal 113:2 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092201 y anticuerpo monoclonal

   268:18 obtenido de la línea celular de hibridoma ECACC Registro No.

   04092202, b) comparar el resultado obtenido en a) con un control.

2. 2.

   Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que tal método es un inmunoanálisis.

3. 3.

   Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que tal método es un ELISA.

4. 4.

   Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092204 que segrega anticuerpo 110:9

5. 5.

   Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092201 que segrega anticuerpo 113:2

6. 6.

   Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092202 que segrega anticuerpo 268:18

7. 7.

   Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092206 que segrega anticuerpo 268:29

8. 8.

   Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092203 que segrega anticuerpo 287:3

9. 9.

   Línea celular de hibridoma ECACC Registro No. 04092205 que segrega anticuerpo 301:39