CN1973205A - 诊断细胞内劳索尼亚菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物健康的领域，及特别涉及细胞内劳索尼亚菌。特别地，本发明涉及诊断细胞内劳索尼亚菌感染的方法，及利用细胞内劳索尼亚菌特异抗体的诊断试剂盒。本发明还涉及该诊断细胞内劳索尼亚菌感染的方法或试剂盒的用途。

Description

诊断细胞内劳索尼亚菌的方法
发明所属的技术领域
本发明涉及动物健康的领域，及特别涉及细胞内劳索尼亚菌(Lawsoniaintracellularis)。特别地，本发明涉及诊断细胞内劳索尼亚菌感染的方法，及利用细胞内劳索尼亚菌特异抗体的诊断试剂盒。本发明也关于诊断细胞内劳索尼亚菌感染的方法或试剂盒的用途。
背景技术
细胞内劳索尼亚菌，猪增生性肠病(“PPE”)的致病物质，实质上影响所有的动物，包括人类、兔子、雪貂、仓鼠、狐狸、马、及其它不同的动物如驼鸟及鸸(emu)。细胞内劳索尼亚菌特别在欧洲及美国为猪群损失的主因。
PPE的一致性特征为胞质内、非膜结合的弯曲杆菌出现在受感染肠部位肠细胞内。与PPE相关的细菌以往意指“弯曲杆菌属样有机体”，S.McOrist等，Vet.Pathol.，vol.26，260-264(1989)。随后，致病菌经鉴别为一种新颖分类学的属及种，俗名指回肠细胞内共生菌(Ileal symbiont，IS)，C.Gebhart等.，Int’l.J.ofSystemic Bacteriology，Vol.43，No.3，533-538(1993)。近来，这些新颖的已经给予分类学名，细胞内劳索尼亚菌(Lawsonia(L.)intracellularis)，S.McOrist等，Int’l.J.ofSystemic Bacteriology，Vol.45，No.4，820-825(1995)。这三种名字可交换地使用，意指相同于本文中的进一步鉴别及叙述有机体。
细胞内劳索尼亚菌为一种专性胞内性细菌，其无法以一般的细菌方法在常规无细胞培养基中培养，且被认为需依附在上皮细胞生长。S.McOrist等，Infection and Immunity，Vol.61，No.19，4286-4292(1993)及G. Lawson等，J.of Clinical Microbiology，vol.31，No.5，1136-1142(1993)讨论细胞内劳索尼亚菌的培养，是在常规组织物培养瓶中利用IEC-18大鼠肠道上皮细胞单层培养。此外，H.Stills，Infection and Immunity，Vol.59，No.9，3227-3236(1991)讨论在常规组织物培养瓶中利用肠407人类胚胎肠细胞单层及GPC-16荷兰猪结肠腺癌细胞单层培养。
特别地，细胞内劳索尼亚菌可用本领域所熟知的方法培养，较佳地，是根据美国专利第5,714,375及5,885,823号。例如，培养细胞首先可以用含细胞内劳索尼亚菌的接种物接种，使细菌感染细胞。多种细胞系可用于实施本发明，包括但非限于IEC-18(ATCC1589)-大鼠肠道上皮细胞、HEp-2(ATCC23)-人类表皮样癌细胞、McCoys(ATCC1696)-小鼠(非特定)细胞、BGMK(Biowhittaker#71-176)-水牛绿猴肾细胞，及猪肠道上皮细胞。较佳的培养细胞为HEp-2、McCoys或IEC-18细胞。
若使用培养细胞，在接种之前，细胞可为单层的形式。为形成单层，细胞可接种于常规培养瓶中。每瓶一般是混有生长培养基的烧瓶或滚瓶以每25、75、150、850cm2约1×105细胞至约10×105细胞进行接种。生长培养基可为任何用于细胞培养的培养基，其包括氮源，所选用培养细胞的必需生长因子，及碳源(如葡萄糖或乳糖)。较佳的培养基为Ham’s F12强化的DMEM加1-5％胎牛血清，虽然可使用其他商业上可得培养基并得到好的结果。
细胞内劳索尼亚菌的成功培养可由维持培养细胞于恒定生长状态下而增强。因此，培养细胞单层在接种时应为约百分之二十至约百分之五十融合(confluency)。较佳地，培养细胞在接种时应为约百分之三十至约百分之四十融合，最佳为约百分之三十融合。
或者，在接种之前，细胞可生长于悬浮液中，如下文所述。较佳地，细胞首先以单层形式在粘附型系统(如滚瓶系统)生长至100％融合度，然后再传代至3-3000公升瓶中并于悬浮液中生长。
接种物可为得自受感染的猪或其他动物的细胞内劳索尼亚菌培养物。
接种物可为肠匀浆，是将感染PPE的猪或其他动物的回肠中刮掉粘膜而制备。当制备肠匀浆时，挑选用于培养的回肠部位应显现出严重损伤及肠的大体增厚。由于细菌易碎特性，样品较佳应在尸体解剖后尽速地贮存于-70℃。细胞内劳索尼亚菌具抗性的抗生素，例如万古霉素、两性霉素B或抗生素的氨基糖苷类，包括例如庆大霉素(Gentamicin)及新霉素，较佳是添加至接种物中，以抑制污染菌而允许细胞内劳索尼亚菌生长。不论接种物是纯培养物或肠匀浆，培养细胞的接种可利用本领域中已知的各种技术进行，如本文中所教示者。
细菌及/或经接种的培养细胞随后在减少溶氧浓度下培养。在溶氧浓度高于10％时，细胞内劳索尼亚菌生长低于最佳状况，在氧浓度超过此范围时，最后会停止生长。较佳地，细菌及/或经接种的培养细胞是在溶氧浓度为约0％至约10％的范围中培养。更佳地，细菌及/或经接种的培养细胞是在溶氧浓度为约0％至约8％的范围中培养，而溶氧浓度为约0％至约3.0％为最佳。
适当的二氧化碳浓度对细胞内劳索尼亚菌的生长也为重要的。在二氧化碳浓度大于0％及低于4％，不发生最适的生长，在二氧化碳浓度超过此范围时，最后会停止生长。较佳地，二氧化碳浓度是在自约6％至约10％的范围，二氧化碳浓度在约8.8％时为最佳。
此外，细胞较佳是氢浓度为约73％至约96％的范围中培养。氮气可用于取代一些或全部存在的氢。最佳地，细胞是于约0至约8.0％O2、约8.8％CO2及约83.2％H2下培养。
经接种的细胞可在双重气体培养器或其他含有适当氢、氧及二氧化碳浓度的室内培养，其可允许细胞在培养期间悬浮。该室应包括维持经接种细胞于悬浮液中的工具，及气体监视器及供应源，以供应及维持适当的气体浓度。培养温度应在30℃至约45℃的范围中，最佳是在约36℃至约38℃的范围中。最佳地，温度为约37℃。培养及减毒必需的设备是熟悉此项技术者或具一般技术者可易于获得者，如本文中所教示。适用于进行本发明的设备的实例为双重气体培养器，如模型480(Lab-Line，Melrose Park，IL)及旋转瓶，维持细胞于悬浮液中。目前较佳的设备包括发酵器、生物反应器、搅拌盘，或含培养基及经由喷射适当浓度的气体能够维持培养细胞于悬浮液的旋转混合器，或其他机械式搅动工具，及连续监测培养基的溶氧浓度。New Brunswick，Braun及其他公司制造用于此目的的适当发酵器及生物反应器。
通过将经接种的细胞在培养中维持在悬浮状态下，由增加各单个细胞暴露至生长培养基及适当的氢、氧及二氧化碳混合物中，可达到细胞及细胞内劳索尼亚菌的最大生长。培养细胞可通过本领域中已知的多种方法，包括如培养瓶、滚瓶、膜培养物、生物袋、WAVETM生物反应器系统及旋转培养瓶等，搅动并维持于悬浮液中。细胞可在培养期间，通过培养细胞在旋转培养瓶中，置于双重气体培养器或类似装置内，而维持于悬浮液中。本文中所使用的“旋转培养瓶”一词，是意指烧瓶或其他容器，其使用桨、推进器或其他工具搅动培养物并使其内所含细胞维持于悬浮液中。
或者，经接种的细胞培养直到细胞达到融合，随后将细胞置于含有生长培养基的旋转培养瓶中，并在双重气体培养器中旋转该培养瓶培养。较佳地，该经接种的细胞经刮除或胰蛋白酶作用，并传代至旋转培养瓶中。此可通过本领域中已知的多种方法达成，例如利用细胞刮刀分离细胞。一旦细胞导入旋转培养瓶中，旋转培养瓶的桨典型地以约30至60rpm范围的速度在磁力搅拌器平台上旋转，以维持经感染细胞于悬浮液中。
将所培养的细胞内劳索尼亚菌的一部分随后传代至新鲜培养物中，以增加细胞内劳索尼亚菌的生产。本文中的“传代(passaging)”一词或其变化，意指将部分培养的细胞内劳索尼亚菌传代至新鲜培养物细胞中，以使细菌感染新鲜细胞。本文中所使用的“新鲜”一词，意指尚未经细胞内劳索尼亚菌感染的细胞。较佳地，这些细胞平均不超过约一天。
悬浮液培养物中的细胞内劳索尼亚菌的传代，可通过移动部分的原始培养物并将其加至含有新鲜培养细胞的新烧瓶中。若原始培养物含有高数量细菌/毫升，例如多于约104细菌/毫升，较佳是添加感染瓶中约1至10％(体积对体积比)的培养物至含有新鲜细胞的新瓶中。此较佳是在当50-100％细胞被感染时进行。若少于50％细胞感染，则该传代较佳是通过将培养物以1∶2分离至新的烧瓶中并添加新鲜培养基增加体积而完成。在这二种情况下，不需细胞裂解及其他步骤，与现有技术中单层培养物完全相反。
在培养细胞足够生长及随后细胞内劳索尼亚菌感染后，由间接萤光抗体(IFA)染色、TCID50或其他相当的方法测定后，收集至少一部分培养的细胞内劳索尼亚菌。收集步骤的进行，可通过本领域一般技术者已知的不同技术将细菌自悬浮液分离，如本文所教示者。较佳地，该细胞内劳索尼亚菌是利用离心所有或部分悬浮液内容物将培养细胞形成沉淀，将最后细胞沉淀再悬浮，及裂解经感染的细胞而收集的。典型地，至少一部分的内容物是在约3000×g下离心约20分钟，以使细胞及细菌形成沉淀。随后沉淀可再悬浮于例如蔗糖-磷酸盐-谷胺酸(SPG)溶液中，并通过25号针约二十次，以裂解细胞。若欲进一步纯化，样品可在约145×g离心约五分钟，以移除细胞核及碎片。上清液随后可在约3000×g离心约二十分钟，并将最后的沉淀再悬浮于适当的稀释剂中，例如含胎牛血清的SPG(是用于制备适用于冷冻干燥、冷冻、或作为接种物的收获的细菌)或生长培养基(是用于制备更适用于传代至新鲜细胞的收获的细菌)。
如前述，用于大量制造的细胞内劳索尼亚菌的有效生长，可通过保持组织细胞活跃地生长而增强。使用混悬培养物可大大促经保持细胞活跃生长，并且可以有连续的培养扩张和放大。如上说明，利用发酵器及介于约0至3％溶氧，可使生长高达108细菌/毫升。
当使用McCoys或IEC-18细胞时，较佳是添加明胶、琼脂糖、胶原蛋白、丙烯酰胺或硅珠(silica bead)，例如Cultisphere-G多孔微载体(HyCloneLaboratories，Logan Utah)，及生长培养基。然而，根据本文所使用的方法，HEp-2细胞及其他细胞不需微载体。
为了培养物的维持目的，HEp-2的培养物，较佳是每周移除25％至50％的培养物并以新鲜培养基取代。对于微载体或小珠的细胞培养物，较佳是每周移除25％至50％的培养物并以新鲜培养基代替一至二次。为了大量生产的目的，可添加额外的25％至50％培养基或含微载体的培养基至培养物中。
依培养细胞被感染的比例而定，传代至新鲜细胞一般是发生在约每2至约7天。假设培养细胞在2至7天内变成至少70％被感染，较佳地该传代发生在约每5至7天。
细胞内劳索尼亚菌抗原的诊断现今是利用直接免疫萤光及PCR进行。对细胞内劳索尼亚菌特异的抗体的诊断现今是利用免疫-萤光进行。这些方法是费力且耗时，不适用于大量筛选。
PPE的有效诊断因需培养致病菌时间而受阻碍。本发明的结果，促进迅速及正确分析猪及对PPE敏感的其他动物的生物样品中细胞内劳索尼亚菌存在的诊断工具发展，现在是为可能的。
因此，在本发明的技术问题是提供改善诊断细胞内劳索尼亚菌疾病的方法。
发明简述
本发明涉及动物健康的领域，及特别涉及细胞内劳索尼亚菌(Lawsoniaintracellularis)。特别地，本发明涉及诊断细胞内劳索尼亚菌感染的方法，及利用细胞内劳索尼亚菌特异抗体的诊断试剂盒。本发明也关于诊断细胞内劳索尼亚菌感染的方法的用途或试剂盒的用途。
附图简单说明
图1：根据本发明的阻断性ELISA的结果。
图2：301农场血清在IFA及ELISA中比较的结果。
图3：在3个农场中回肠炎阻断性ELISA-横切面筛选的结果。
图4：回肠炎ELISA-22个德国农场的结果。
图5：ELISA结果与临床症状的相关性。
发明详述
本文中所使用术语的定义：
在本发明的实施方式之前，须注意本文及权利要求所使用的单数“a”，“an”及“the”是包括复数含义，除非内文另有清楚规定。因此，例如提到“细菌”是包括此细菌的复数，提到“细胞”是一或多个细胞及熟悉此项技术者所知的等价物等等。除非另有定义，本文中所使用的所有技术及科学名词，具有与本发明所属领域的一般技术人员所了解者的相同意义。虽然相似或等同于本文所述的任何方法及材料可用于实施或测试本发明，较佳的方法、装置及材料将如下所述。本文中所提及的所有出版物在此并入参考，其是用以作为叙述及揭示细胞系、载体及发表于这些出版物中可能用于本发明的方法的目的。在此不能解释为由于先前发明而使本发明无权利主张早于这些揭示。
本文所使用的“细胞内劳索尼亚菌”一词，是指在细胞内、弯曲的革兰氏阴性细菌，如C.Gebhart等，Int’l.J.of Systemic Bacteriology，vol.43，No.3，533-538(1993)及S.McOrist等，Int’l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.45，No.4，820-825(1995)所详述者，每篇全部内容在此并入本文参考；致病菌可为本领域已知及本文所教示的得自全世界受PPE感染的猪或其他动物；及任何上述细菌的变异株或突变株，不论是自然发生或人工获得者，及DNA，RNA及对细胞内劳索尼亚菌特异的细菌蛋白质，包括在载体表达或在活体内应用之后表达的蛋白质，及细胞内劳索尼亚菌的片段或抗原衍生物。
本文所使用的“适当的分离株(adapted isolate)”一词，是指经根据细胞培养中培养及传代技术或任何其他复制细胞内劳索尼亚菌作为抗原制备物的技术，所制备的任何细胞内劳索尼亚菌分离株。
本文所使用的“弱化分离株”一词，是指根据本文所教示的培养及传代技术以达到当施用至宿主动物时无毒性而仍维持免疫原性质，所制备的任何细胞内劳索尼亚菌分离株。
本文所使用的“大量培养”一词，是指细胞内劳索尼亚菌的培养程度大于约2.0至3.0升及包括100升或更多量规模的制造。本文所使用的“培养”一词，是指促进细胞内劳索尼亚菌的生长、再生及/或增生。
发明内容
上述技术问题的解决方案，是由本发明的叙述及权利要求所特定的实施方式而达成。
本发明的目标是提供一种诊断临床前或临床细胞内劳索尼亚菌感染的方法。再者，可检测到对细胞内劳索尼亚菌的免疫反应，并提供细胞内劳索尼亚菌流行病学的工具。
根据本发明说明书及权利要求的范畴，此目标已通过诊断临床前或临床细胞内劳索尼亚菌感染的方法达成。
本发明涉及检测抗细胞内劳索尼亚菌的抗体及检测细胞内劳索尼亚菌本身。此抗体包括任何熟悉此项技术者所已知的任何抗体，特别是亚型IgA、可溶性IgA、IgM、IgG(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)及IgD、IgE的免疫球蛋白。
根据本发明，为检测细胞内劳索尼亚菌特异的抗体，该方法是基于下列事实：
a)从哺乳动物采集液体样品；
b)检测该液体样品对细胞内劳索尼亚菌抗原的特异性结合；
c)将所得结果与对照组比较。
如上所述，细胞内劳索尼亚菌也包括细胞内劳索尼亚菌的片段或抗原衍生物，其可用于上述的方法中。
同样地，根据本发明，为检测细胞内劳索尼亚菌，根据本发明的方法是如下：
该方法是基于下列事实：
a)从哺乳动物采集液体样品；
b)检测该液体样品对细胞内劳索尼亚菌抗体的特异性结合；
c)将所得结果与对照组比较。
该液体样品可包括任何体液，包括唾液、汗液、尿液、血液、分泌物、排泄物或其他本领域专家已知的体液样品。在一较佳实施方式中，液体样品是利用收集容器(尿液或其他液体)，注射器/收集管(血液)或其他类型的收集拭子(唾液、汗液等)。较佳地，若步骤a)的样品为血液，则自该血液中分离出血清或血浆，并在步骤b)以血清或血浆代替液体样品进行。随后，步骤c)如上述进行。
在一较佳实施方式中，该方法是免疫测试。免疫测试是使用对细胞内劳索尼亚菌特异的单克隆抗体或多克隆抗血清。根据本发明的免疫测试包括本领域已知的检测方法，例如ELISA测试(酶联免疫吸附测定法)或所谓的三明治ELISA测试、印迹法、免疫印迹法、放射性免疫测试(放射性免疫分析RIA)、基于扩散的Ouchterlony测试或火箭免疫萤光分析。其他免疫测试为间接或直接免疫萤光抗体测试(“IFA”)。另一免疫测试为所谓的Western印迹(Western blot)(也已知为Western转移方法或Western印迹法(Westernblotting))。Western印迹的目的是将由聚丙烯酰胺胶体电泳所分离的蛋白质转移至硝化纤维素滤纸或其他适当载体，同时保留胶体电泳所得的蛋白质或多肽的相对位置。Western印迹随后与考虑中的蛋白质或多肽特异结合的抗体培养。熟悉此项技术者可使用这些检测方法实行在此所述的本发明。熟悉此项技术者可发现上述方法及其他检测方法的参考文献如下：AnIntroduction to Radioimmunoassay and Related Techniques，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands(1986)；Bullock等，Techniques inImmunocytochemistry，Academic Press，Orlando，FL Vol.1(1 982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays：LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers.Amsterdam，The Netherlands(1985)。利用标记或未标记反应剂的固体及液体蛋白质芯片技术或微阵列技术为根据本发明的进一步免疫测试。此测试是广泛叙述于例如Kozak KR，等，Identification ofbiomakers for ovarian cancerusing strong anion-exchange ProteinChips：potential use in diagnosis andprognosis.，Proc Natl Acad Sci USA.2003 Oct 14；100(21)：12343-8(2003)或Fulton，R.J.，等，Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrixTM system.Clinical Chemistry 43(9)，1749-1756(1997)。
本发明进一步涉及一种检测细胞内劳索尼亚菌感染的诊断试剂盒，其含有进行本文所述诊断临床前或临床细胞内劳索尼亚菌感染的方法所需的所有元件。
本发明进一步特别涉及一种含有对细胞内劳索尼亚菌特异的抗体的诊断试剂盒。
本发明进一步特别涉及一种诊断试剂盒，其特征在于根据本发明的抗体是为多克隆。
本发明进一步特别涉及一种诊断试剂盒，其特征在于根据本发明的抗体是为单克隆。
诊断试剂盒是根据本发明的诊断方法所有元件的集合。实施根据本发明的方法的一些其他元件实例(并非详尽列出)，包括容器(例如96孔板或微滴盘，试管)，其他适当容器、表面及基质，膜(例如硝基纤维素膜)，清洗试剂及缓冲液。诊断试剂盒也可包含可检测受结合抗体的反应物，例如经标记的二级抗体、发色团、酶(如与抗体缀合)及其底物或其他能与抗体结合的物质。
本文中所揭示或本领域已知的细胞内劳索尼亚菌，或衍生自此细菌的成份，可作为ELISA或其他免疫分析(例如免疫萤光抗体测试(“IFA”))中的抗原，以检测怀疑感染此细菌的动物的血清及其他体液中对细胞内劳索尼亚菌特异的抗体。如下列实施例所述，此较佳的免疫分析为IFA。或者，本发明的此细菌可用于Western印迹分析。
较佳的Western印迹方法如下：
1.将抗原于SDS-PAGE中优选在12％SDS-PAGE上跑胶并转移至硝化纤维素膜。
2.将膜置于封闭缓冲液中二小时。
3.移除封闭缓冲液并以PBS冲洗一分钟。
4.将血清稀释于封闭缓冲液中并加至膜上，于室温下培养2小时。
5.以清洗缓冲液清洗三次(每次清洗五分钟)。
6.将缀合抗细胞内劳索尼亚菌的特异抗体，较佳为单克隆抗体，稀释于封闭缓冲液中并加至膜上，于室温下培养1小时。
7.以清洗缓冲液清洗三次。
8.添加底物(substrate)10分钟或直至强烈色带出现。
9.以PBS冲洗。
10.空气干燥并贮存于黑暗中。
联结至抗体的缀合物可为例如酶、如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。或者，发色团或其他可在底物存在下定量的可侦测物质，可作为缀合物。
根据本发明的最佳的免疫测试为ELISA。最佳地，此ELISA为三明治ELISA(即捕捉ELISA)。此种ELISA较具特异性，因其侦测同一抗原上特异于二种不同抗原决定部位的二种抗体。在三明治ELISA中，未标记的抗体涂布到微量滴定板上。随后加入细胞内劳索尼亚菌作为抗原。在清洗步骤之后，被结合的细胞内劳索尼亚菌抗原以对细胞内劳索尼亚菌上不同抗原决定部位具反应性的二级、经标记的细胞内劳索尼亚菌特异抗体检测。
示范性涂覆程序如下：
将培养板以未标记抗体，例如在ddH2O中10％蔗糖/10％正常马血清中的未标记抗体涂覆，并以细胞内劳索尼亚菌抗原培养。培养板随后干燥及密封，并贮存于37℃。或者，以抗体涂覆的培养板贮存，当进行ELISA时再加入抗原。
根据本发明的较佳ELISA方法是如下所述(使用抗体涂覆的培养板)：
1.加入稀释于涂覆缓冲液的0.1ml/孔的抗原，在4℃下培养18小时。
2.以PBS清洗三次。
3.加入0.25ml封闭缓冲液至培养板的每一孔中，在37℃下培养1至2小时。
4.以清洗缓冲液清洗三次。
5.将血清稀释于封闭缓冲液中并添加0.1ml至培养板第一排的孔中，横过培养板上以序列1∶2稀释，在37℃下培养1小时。
6.以清洗缓冲液清洗三至五次。
7.将缀合抗细胞内劳索尼亚菌的特异抗体，较佳为单克隆抗体，稀释于封闭缓冲液中并添加0.1ml至培养板的孔中，并于37℃下培养1小时。
8.以清洗缓冲液清洗三至五次。
9.加入底物。
10.在分光光度计中测量吸光值。
11.未加入抗原的孔是作为空白组。
12.阳性及阴性对照猪血清也应用于每个测试中。
较佳的ELISA是如下进行：
将培养板以未标记抗体，在例如于ddH2O中10％蔗糖/10％正常马血清中的未标记抗体涂覆，并以细胞内劳索尼亚菌抗原培养。培养板随后干燥及密封，并贮存于37℃。
1.添加90μl缓冲液至所有孔中。
2.加入10ul血清至选定的孔中。
3.在37℃下培养培养板1小时。
4.以PBST清洗三次。
5.添加HRP缀合抗细胞内劳索尼亚菌的特异抗体，较佳为单克隆抗体，稀释于CDS-C+0.5M NaCl，100μl/孔。
6.在37℃下培养培养板1小时。
7.以PBST清洗板三次。
8.加入底物，100μl/孔，并在室温下培养10分钟。
9.加入50ul终止缓冲液/孔。
10.在分光光度计中于450nm下读取培养板。
根据本发明的最佳三明治ELISA方法如下：
1.加入稀释于涂覆缓冲液的0.1ml/孔mAb。在4℃下培养18小时。
2.以PBS清洗三次。
3.加入稀释于缓冲液的0.1ml/孔的抗原至培养板每一孔中，在37℃下培养1至2小时。
4.以清洗缓冲液清洗三次及/或直接加入0.25ml的封闭缓冲液至培养板每一孔中，在37℃下培养1至2小时。
5.以清洗缓冲液清洗三次。
6.将血清稀释于封闭缓冲液中并添加0.1ml至培养板第一排的孔中，横过培养板上以序列1∶2稀释，在37℃下培养1小时。
7.以清洗缓冲液清洗三至五次。
8.将缀合抗细胞内劳索尼亚菌的特异抗体，较佳为单克隆抗体，稀释于封闭缓冲液中并添加0.1ml至培养板的孔中，并于37℃下培养1小时。
9.以清洗缓冲液清洗三至五次。
10.加入底物。
11.在分光光度计中测量吸光值。
12.未加入抗原的孔是作为空白组。
13.阳性及阴性对照猪血清也应用于每个测试中。
本文中所使用的抗原是如上所定义的细胞内劳索尼亚菌。mAb涉及对细胞内劳索尼亚菌特异的单克隆抗体。较佳地，此抗体为如下所揭示的抗体。
另外惊讶地，产生杰出的抗体用于根据本发明的ELISA中。这些抗体具有下列参考编号：301:39、287:6、268:29、110:9、113:2及268:18。所有抗体均特异于细胞内劳索尼亚菌的抗原。较佳地，作为三明治ELISA中的捕获抗体为110:9、113:2或287:6，缀合抗体为268:18、268:29或287:6。最佳地，捕获抗体为110:9，缀合抗体为268:29。也优选具有所有上述抗体特征的抗体，即意味着具有与上述抗体近似于相同的结合特征，和/或与上述抗体比较，特异于细胞内劳索尼亚菌的相同抗原，和/或与上述抗体比较，特异于或识别相同抗原决定部位。
根据本发明的抗体是由杂交瘤所制造。根据本发明的该杂交瘤是保藏于Centre for Applied Microbiology and Research(CAMR)及EuropeanCollection of Cell Cultures(ECACC)，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，UK，根据布达佩斯条约的专利保藏。保藏日期为2004年5月11日，杂交瘤细胞系110:9是成功地保藏，编号为ECACC存取号04092204；杂交瘤细胞系113:2是成功地保藏，编号为ECACC存取号04092201；杂交瘤细胞系268:18是成功地保藏，编号为ECACC存取号04092202；杂交瘤细胞系268:29是成功地保藏，编号为ECACC存取号04092206；杂交瘤细胞系287:6：是成功地保藏，编号为ECACC存取号04092203；杂交瘤细胞系301:39是成功地保藏，编号为ECACC存取号04092205。
本发明是进一步叙述于下列实施例中，其是为例示的目的，不应解释为限制本发明。确实，本发明的其他变体对本领域的一般人士是显而易见的。
本文中所引用的所有出版物及专利在此全部并入参考。
实施例
实施例1
1.0材料
抗细胞内劳索尼亚菌杂交瘤细胞系：372:13、113:2、268:18、287:6、110:9、268:29及301:39。
杂交瘤细胞培养用的设备及培养基。
单克隆抗体(mAb)纯化及HRP缀合的设备及缓冲液。
ELISA用的设备及溶液
劳索尼亚菌抗原SF1289 N34312/20/00
劳索尼亚菌阳性血清：批号#052902猪#26(经实验感染)
批号#052902猪#69(接种疫苗者)
劳索尼亚菌阴性血清：p25.8#27352天6-30-95
116705
1.1方法
单克隆抗体的制备是根据Svanova Biotech的标准操作程序。
1.1.1杂交瘤细胞的培养及HRP缀合单克隆抗体的制备
·为确保杂交瘤细胞系，各细胞系制备15管并贮存于-135℃。
·各杂交瘤细胞系之一管解冻后让细胞于细胞培养瓶中生长。
·各细胞系取500ml至1000ml上清液纯化并缀合至辣根过氧化物酶。
1.1.2阻断性ELISA
测试纯化的及HRP缀合的mAb被阳性劳索尼亚菌猪血清在ELISA中阻断的能力。
·ELISA培养板以稀释1/200，100μl/孔的劳索尼亚菌抗原涂覆。
·猪血清稀释1/10，100μl/孔。
·HRP缀合的mAb被稀释并加入，100μl/孔。
结果是根据下式以抑制百分比(PI)表示：
PI＝1-(OD样品/OD mAb)×100
1.2结果
1.2.1杂交瘤细胞的培养及HRP缀合单克隆抗体的制备
·除了一种mAb以外，所有的mAb均成功地被纯化及HRP缀合。它均具有良好的产制能力。
·mAb 372:13具有不良的产制能力。此mAb并未成功地HR缀合，因此未于阻断性ELISA中测试。
1.2.2阻断性ELISA
·两阳性(#26，#69)及两阴性(25.8#273，116705)血清用于试验中。
·实验感染血清(#26)抑制所有六种HRP缀合mAb，但为不同水平。自疫苗接种猪的血清抑制mAb至更低的程度。
·阴性血清显示无或非常低的抑制。
结果如下表及图1所示。
               mAb
血清           301:39   110:9   268:29   287:6   113:2   268:18
#26实验感染
+              57       45      78       74      42      72
#69疫苗接种
+              18       23      52       43      45      25
25.8#273
-              7        3       27       20      14      21
116705
-              -7       -9      -24      -13     18      -19
1.3讨论
本研究的结果清楚显示一或多种经测试的单克隆抗体适用于阻断性ELISA测试中对抗细胞内劳索尼亚菌。mAb268:29、287:6及268:18在阳性及阴性血清显示最清楚的差异，即它们是发展阻断性ELISA的强力候选者。
实施例2
2.0概述
用于检测细胞内劳索尼亚菌抗体的三明治b-ELISA原型(prototype)的发展及建立：
在利用免疫萤光测试IFA作为黄金标准，计算灵敏度及特异性之后，可结论如下：
·捕获mAb 110:9在阳性及阴性样品中产生清楚的差异。
·检测mAb 268:29 HRP在阳性及阴性血清中产生清楚的差异，显示100％的灵敏度及特异性。
·推荐该原型应为如下：
·mAb 110:9为捕获mAb，涂覆于Nunc maxi-sorp测试条C-8上。
·抗原(Ag)：细胞内劳索尼亚菌培养物(较佳为BI在R&D所产制的浓缩材料)。
·血清样品以1/10稀释于0.5M NaCl/PBST中。在37℃下培养1小时。
·HRP缀合的mAb 268：29，于含有0.5M NaCl的CDS-C缓冲液中冷冻干燥。在37℃下培养1小时。
·底物K-Blue Max，在室温下培养10分钟。
·Svanova终止溶液。
2.1材料及方法
ELISA是根据下列程序进行：
2.1.0 ELISA程序
·添加90μl缓冲液至所有孔中。
·加入10μl血清至选定的孔中。
·在37℃下培养培养板1小时。
·以PBST清洗板三次。
·添加稀释于CDS-C+0.5M NaCl的HRP缀合抗mAb，100μl/孔。
·在37℃下培养培养板1小时。
·以PBST清洗板三次。
·加入底物，100μl/孔，并在室温下培养10分钟。
·加入50ul终止液/孔。
·在分光光度计中于450nm下读取培养板。
结果是表示为1-OD值或2-PI(抑制百分比)值，即100-样品OD/mAbOD×100
2.1.1测试1(ELISA 030922，030923×2)
将mAb 110:9、113:2、301:39、287:6、268:29，量为300ng/孔涂覆于C-8 maxi测试条。以10％2251HS(正常马血清)，10％蔗糖/UHP H2O，150μl/孔，封闭测试条。在室温下培养30秒。
Ag#030619在PBST中以1/10稀释，100μl/孔，在4℃下培养3小时。
测试条在37℃下干燥3小时。保持于4℃。
血清：IFA阳性：#26，#69。IFA阴性：#6、C1、D1、E1。以1/10稀释于0.5M NaCl/PBST中。
缀合物：268:18、113:2、301:39、110:9、287:6、268:29 HRP稀释于0.5MNaCl/PBST中。
所有捕获mAb经测试抗所有HRP缀合mAb(除了抗自身抗体)。
2.1.2测试2(ELISA 030924)
根据上述试验1，将110:9、113:2及287:6涂覆于测试条上。
血清：IFA阳性：#26，#69。IFA阴性：#6、C1、D1、E1。以1/10稀释于0.5M NaCl/PBST中。HRP缀合物mAb 268：18、268:29、287:6稀释于0.5M NaCl/CDS-C(如Svanova制造的缀合物冷冻干燥用标准缓冲液)中。
2.1.3测试3(ELISA 030925)
根据上述试验1，将110:9、113:2及287:6涂覆于测试条上。
血清：24组血清(10组IFA阳性，10组IFA阴性及4组可疑)测试。稀释：1/10于0.5M NaCl/PBST中。
缀合物：268:18 HRP稀释于0.5M NaCl/CDS-C中。
2.1.4测试4(ELISA 030930，031002，031008)
根据上述试验1，将110:9涂覆于测试条上。
血清：21组IFA阳性及69组IFA阴性。稀释：1/10于0.5M NaCl/PBST。
缀合物：268:18缀合以HRP且268:29缀合以HRP稀释于0.5MNaCl/CDS-C中。
2.2结果
2.2.1测试1(ELISA 030922，030923×2)
捕获mAb 110:9、113:2及287:6及缀合物268:18及268:29及287:6似乎为三明治b-ELISA的最佳候选物，乃因这些组合显示对阳性血清的最佳阻断能力。血清no#6在大部分测试中评定为阳性。此是令人怀疑的，因为该血清在先前发展的b-ELISA原型中也评定为阳性。
2.2.2测试2(ELISA 030924)
此测试主要是进行以确定用于缀合物冷冻干燥用的标准缓冲液可以使用。此结果显示该阻断在阳性血清中可达成。最佳的阻断被发现在检测mAb268:18或268:29的检测中。
2.2.3测试3(ELISA 030925)
捕获mAb 110:9被发现为最佳的选择，因为其在阳性及阴性样品之间产生最清楚的差异。
2.2.4测试4(ELISA 030930，031002，031008)
所得的OD及PI值可在附录5中发现。当以OD值对IFA结果绘图时，HRP缀合mAb 268:29在阳性及阴性样品之间产生最清楚的差异，具有100％灵敏度及特异性。mAb 268:18也产生100％灵敏度及特异性，但在阳性及阴性样品间的区域为微弱。当以PI值绘图时，mAb 268:18在截断值(cut-off)20.9时产生95.7灵敏度及100％的特异性，而mAb 268:29在截断值值28.6时产生100％灵敏度及特异性。
2.3讨论
在计算抗免疫萤光测试IFA的灵敏度及特异性之后，可结论如下：
·捕获mAb 110:9为最佳选择，因其在阳性及阴性样品中产生最清楚的差异。
·经HRP缀合的mAb 268:29检测为最佳选择，因其在阳性及阴性血清中产生清楚的差异，具100％的灵敏度及特异性。
推荐该原型应为如下：
·mAb 110:9作为捕获mAb，涂覆于Nunc maxi-sorp测试条C-8上。
·Ag：细胞内劳索尼亚菌培养物(较佳为BI在R&D所产制的浓缩材料)。
·血清样品以1/10稀释于0.5M NaCl/PBST中。在37℃下培养1小时。
·HRP缀合的mAb 268:29，于含有0.5M NaCl的CDS-C缓冲液中冷冻干燥。在37℃下培养1小时。
·底物K-Blue Max，在室温下培养10分钟。
·Svanova终止溶液。
实施例3
3.1概述
所进行的加速稳定性研究显示细胞内劳索尼亚菌抗原捕获ELISA培养板具有至少一年的稳定性，及抗劳索尼亚菌HRP缀合物268:29的冻干形式具有6至12个月的稳定性。
3.2介绍
为评估未来成份的稳定性，需进行细胞内劳索尼亚菌ELISA试剂盒的加速稳定性测试。将测试成份于37℃下贮存4周，随后在ELISA中测试，与保持在4℃的成份进行比较。37℃下贮存4周的稳定性显示保存期限约为12个月。此报告叙述对抗原捕获ELISA培养板及HRP缀合物所进行的加速稳定性研究。
3.3材料及方法
培养板加速稳定性(ELISA 031024)
培养板以劳索尼亚菌mAb 110:9涂覆，以于ddH2O中10％蔗糖/10％正常马血清阻断，及以劳索尼亚菌抗原培养。将培养板干燥并密封，至于+37℃下。将培养板自+37℃下贮存1、2、3及4周取出，并贮存于冰箱中。培养板也于整个测试期贮存于+4℃下作为参考。
使用阳性血清#26，#69及#06及阴性C2，D1及E2，检查三明治ELISA的性能。
使用HRP缀合的mAb 268:29批号#030120。
冻干缀合物加速稳定性(ELISA 031027)
将HRP缀合的mAb 268:29批号#030120以1/1000稀释于CDS-C缓冲液中，并分装至玻璃瓶中，并根据标准程序进行冷冻干燥。取四瓶冻干瓶贮存于+37℃中1、2、3及4周。瓶子也贮存于4℃。将不同的瓶子用于三明治ELISA中测试。
使用阳性血清#26及阴性血清030926。
发现1/1000稀释的缀合抗体(“缀合稀释”)在此测试中产生过高OD值，因此将缀合抗体于培养板上滴定(titrated)，以得到正确的测试讯号。
3.4结果
培养板加速稳定性
相较于保持在+4℃下的测试条的OD值，可发现1周后OD值明显下降。当比较1至4周时，未发现明显差异。
当观察PI值时，在1至4周及+4℃未有明显差异。
冻干缀合物加速稳定性
以1/8000“缀合稀释”时，血清#26显示在四周后从0.547下降至0.398，血清030926在四周期间后从1.654掉至0.99。
3.5讨论
所进行的加速稳定性研究，显示细胞内劳索尼亚菌ELISA培养板具有至少一年的稳定性。抗劳索尼亚菌HRP缀合物268:29抗体显示出在4周后抗阴性血清的OD值减少40％。此可能显示缀合物的一些不稳定性。当计算OD值时，在1.5平均值时讯号减少40％，在一年后OD值为0.9，其仍在可接受的范围内。
实施例4
4.1概述
原型(培养板批号040107)的确认，是以测试先前发展原型时使用的50组血清来进行。此确认研究显示与阳性血清100％一致，而25组阴性血清中有2组评定为阳性。
发现正常马血清可用于CDS-C缓冲液中取代当今所使用的猪血清。
发现含0.042％PVP的PBST显示与使用PBST片剂(含有PVP)具有类似结果。
4.2介绍
为确认三明治ELISA原型，需测试大规模生产的培养板批次的大量血清。本研究是针对培养板批次040107进行测试，检测先前用于发展原型时的50组血清样品。
当冷冻干燥HRP缀合物时，使用缓冲液CDS-C作为防腐剂。此缓冲液含猪血清。由于发现用于CDS-C缓冲液的劳索尼亚菌阴性血清可能在未来有问题，因此需测试出替代品。在本研究中，是测试正常马血清及胎牛血清。
实验室工作中对此ELISA主要是以PBST片剂进行。已发现包含在Svanovir试剂盒内的20×浓缩PBST无法使用，因为此测试将无法正确地区别阳性及阴性样品。当比较片剂配方及20×浓缩PBST时，发现所有成份均相同，除包含在片剂中作为稳定因子的0.042％PVP(聚乙烯吡咯烷酮K25)。实验显示当添加PVP至20×PBST时，可达到与片剂相同的结果。
4.3材料及方法
原型的确认(ELISA 040312)
先前测试用于原型ELISA的50组血清(自Bioscreen所得)，是用于测试大规模培养板批次#040107。使用含0.042％PVP的PBST 20×浓缩缓冲液。使用冻干缀合物批次040308。
含正常马血清的CDS-C缓冲液
测试ELISA 040203
CDS-C缓冲液与1-猪血清(如在TJ4/05F种)、2-正常马血清及3-胎牛血清制备。这些缓冲液在ELISA中作为缀合物缓冲液测试。所测试的血清为gris 2、4、13及17、1-29664、3-29664、A-27239、B-27239、#26及C2。使用HRP缀合的mAb 268:29批号#030318。使用含0.042％PVP的PBST 20×浓缩缓冲液。
测试ELISA 040311
含正常马血清的CDS-C缓冲液是用于制备两种情况的冻干缀合物于二组(040211，040308)。制备缀合物以得到最终稀释为1/20k、1/25k及1/30k。平行测试新鲜制备的缀合物。使用血清#26、1-29664、3-29664、A-27239、B-27239、阳性池030926及阴性池030926。使用HRP缀合mAb 268:29批号#030318。使用含0.042％PVP的20×浓缩PBST。
含PVP的PBST(ELISA 040301)
20×浓缩的PBST缓冲液以1/20稀释，并加入最终浓度0.042％的PVP。此缓冲液平行地与PBST片剂(已含PVP)及以1/20稀释的20×浓缩PBST缓冲液进行测试。这些缓冲液使用于所有步骤，即在样品及缀合稀释缓冲液及清洗缓冲液中使用。
使用血清#26、1-29664、3-29664、A-27239、B-27239及gris 13。使用HRP缀合mAb 268:29批号#030318。使用含猪血清的缀合缓冲液CDS-C。
4.4结果
原型的确认
该结果显示所有25组先前使用的阳性血清在确认批次中也评定为阳性，25组阴性血清中的二组评定为阳性。
含正常马血清的CDS-C缓冲液
含正常马血清的CDS-C缓冲液显示与含猪血清相似的结果。
冻干HRP缀合mAb的读值，当与新鲜制缀合物比较时，最多减少0.4OD。此下降在二批冻干缀合物中被注意到。不论所得OD值为何，因所计算的PI值相符合，因此并不影响测试性能。
含PVP的PBST
结果显示以1/20稀释的添加0.042％PVP的20×浓缩PBST溶液，与PBST片剂产生相似的结果，而以1/20稀释的未添加PVP的20×浓缩PBST溶液则显示为假阴性结果。
4.5讨论
原型(培养板批号040107)的确认，是以测试先前用于发展原型时的50组血清进行的。此确认研究显示与阳性血清100％一致，而25组阴性血清中有2组评定为阳性。此“假”阴性结果是为可接受的，因此测试的主要重要性是用以检测阳性样品；且先前测试的结果也未被证实确实为真。
发现含0.042％PVP的PBST显示与使用PBST片剂(含有PVP)具有类似结果，因此未来的试剂盒将含此缓冲液。需进行含PVP的20×浓缩PBST的稳定性研究，以确认此试剂盒的有效性。
实施例5
5.1介绍及目的
抗细胞内劳索尼亚菌的血清抗体的检测，目前是利用IFA测试(1)进行。此测试在解释结果时，依个人及高度主观评断。近来，三明治阻断性ELISA是利用高度特异性抗细胞内劳索尼亚菌的单克隆抗体发展的。此测试的数据可在客观基础上被测量及评估，其可改进再现性、重复性及比较性分析。在本研究中，对IFA测试的第一组比较数据被提出，显示此新颖测试的适当性及性能。
5.2材料及方法
生长于McCoy细胞培养物及由特异性单克隆抗体在微滴盘捕获的细胞内劳索尼亚菌抗原，用于猪血清样品中侦测抗细胞内劳索尼亚菌的抗体。血清是以1比10稀释，在37下培养1小时后，以PBS Tween溶液清洗培养板，加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体(不同于捕获抗体)。将培养板在37℃下再培养1小时。将未结合的抗体通过清洗而移除。在以TMB底物在室温下培养10分钟后，加入终止溶液停止反应。在光度计中读取每一孔的OD450值。结果以不含血清的对照组的抑制百分比计算。
301群血清，于经确认的IFA测试(2)中测试抗细胞内劳索尼亚菌的抗体，用于评估新的ELISA。此外，使用从有已知回肠炎的二个农场及怀疑有回肠炎的一个农场所取得的横切面(cross-sectional)样品(10个样品各来自于9个年龄组)，用于显示ELISA相较于IFA的诊断值。
5.3结果
多个阴性血清产生阴性抑制值。因此，所测量的最低值设定为0，所有其他数值是相对于此。这些数量称为“相对ELISA数值”。
301群血清的结果概述于图2中。ELISA清楚地区别阴性(平均相对ELISA值36)及阳性血清(平均相对ELISA值89)。多数在IFA中评定为可疑的样品在此ELISA中为阳性。
三个农场所得的横切面筛选结果如图3所示。二种测试清楚地侦测出在三个农场中的抗细胞内劳索尼亚菌抗体。
5.4讨论
相较于IFA测试结果，ELISA提供较高的灵敏度。在3个所测试农场的某些族群中，ELISA所得的结果较IFA测试为明确，IFA测试由于不具特异性的萤光，产生了许多有疑问的结果。在3个群中所得的血清分布型与先前欧洲群发表的数据相符合(3，4)。ELISA值在10及16周龄大猪族群中相较于IFA测试结果的增加，显示相对性ELISA值大于55的血清，可判断为阳性。
此新颖的测试有助于改良常规样品中回肠炎的诊断。此新颖的阻断性回肠炎ELISA提供了一种在客观基础上快速及灵敏筛选大量样品的工具。
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实施例6
6.1介绍及目的
回肠炎的特异诊断目前是利用IFA测试侦测抗体(1，2)或PCR(3，4)，组织学及免疫染色方法侦测粪便或肠组织样品中的抗原(2，5，6)所完成。所有方法均关于特异性、污染危险或工作量具有其特别的缺点，并不适用于常规群大量筛选用。所以大部分的诊断测试仅对群中少数猪所完成。利用近来发展的阻断性ELISA血清测试使此变得较为容易，更可靠且更适合于群的模式。进行22个德国农场的横切面筛选，以显示此新颖测试的诊断性能。
6.2材料及方法
从22个德国农场的所得的横切面样品，用于ELISA测试。从每一农场中针对小母猪、大母猪及4、7、10、13、16、20及24周龄的猪取样(每一种年龄组10个样品)。ELISA是如实例5所述完成。
6.3结果
在图4中概述所有22个农场中的平均相对ELISA值。从小母猪及大母猪所得的血清，在ELISA中显示高度反应性，而从4至10周龄的小猪所得的结果则为低的。在养肥猪中，13至24周龄ELISA值增加。
在图5中，平均相对ELISA值与农场中的临床症状相关。5、6及15号农场在采样时没有临床性的肠问题。在3号农场中，4至13周龄猪具有肠问题，经诊断为大肠杆菌腹泻。在18号农场中，先前的血清测试显示细胞内劳索尼亚菌在此农场中的存在，但不具临床症状。在1、2、7、8、9、10、11、12、19、21及22号农场中，在此研究采样前诊断具有回肠炎。4、13、14、16及20号农场在养殖猪及养肥猪中显示具有肠问题，4及13号农场具临床可疑的回肠炎。在17号农场，未观察到临床症状，但将抗体用于养殖猪及养肥过程的开始。
6.4结论
22个农场所概述的血清分布型，小母猪及大母猪显示出高度反应性，及在13至24周龄上升的抗体反应。此发现与目前有关回肠炎所发表的血清数据一致(7，8，9)。无腹泻农场(5、6、15及18号)的猪及大肠杆菌腹泻的农场(3号)的猪，显示ELISA中不明显的血清转变。在已知有回肠炎的农场(1、2、7、8、9、10、11、12、19、21及22)中，在7及13周之间可测得明显的血清转变。
有趣的是，大部分的小母猪及大母猪族群样品在ELISA中具高度反应性，虽然大部分的猪没有明显的肠问题。此可能是由于细胞内劳索尼亚菌的亚临床(subclinical)感染。17号农场所得的结果似乎显示出亚临床回肠炎。
根据本发明的新颖ELISA提供了回肠炎血清诊断的有力工具，适用于大量样品程度的常规测试及横切面群筛选。
参考文献
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Claims (12)

1.一种诊断临床前或临床细胞内劳索尼亚菌感染的方法，包括下列步骤：
a)从哺乳动物采集液体样品；
b)检测该液体样品对细胞内劳索尼亚菌的特异性结合；
c)将所得结果与对照比较。
2.如权利要求1所述的方法，其中该方法是免疫测试。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该方法是ELISA。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该方法是阻断性ELISA。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用一种或多种选自下列的单克隆抗体：
抗体301:39、抗体287:6、抗体268:29、抗体110:9、抗体113:2及抗体268:18。
6.ECACC存取号为04092204的杂交瘤细胞系，其分泌抗体110:9。
7.ECACC存取号为04092201的杂交瘤细胞系，其分泌抗体113:2。
8.ECACC存取号为04092202的杂交瘤细胞系，其分泌抗体268:18。
9.ECACC存取号为04092206的杂交瘤细胞系，其分泌抗体268:29。
10.ECACC存取号为04092203的杂交瘤细胞系，其分泌抗体287:3。
11.ECACC存取号为04092205的杂交瘤细胞系，其分泌抗体301:39。
12.一种部件试剂盒，其包括选自抗体301:39、抗体287:6、抗体268:29、抗体110:9、抗体113:2及抗体268:18的单克隆抗体，以及进行如权利要求1至6任一项的方法所需的任何其他元件。
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