CN105969761B - 磁力裂解方法和装置 - Google Patents
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Abstract
公开了裂解细胞的方法。所述方法包括在存在多个细胞裂解珠的情况下,用磁力搅拌元件以足以裂解细胞的速率搅拌细胞。还公开了用于裂解细胞的装置。所述装置包括具有磁力搅拌元件和布置在其中的多个细胞裂解珠的容器。所述容器的尺寸允许磁力搅拌元件在容器内转动。
Description
相关申请
本申请要求于2009年9月21日提交的美国临时专利申请号61/272,396的优先权,其在此通过引用整体并入。
技术领域
本技术领域是生物技术,并且更具体地,是用于裂解细胞的方法和装置。
背景
细胞裂解是细胞膜或细胞壁的破坏或破碎,这裂开细胞并暴露细胞的内容物。许多技术可以用于细胞破碎,包括物理、化学(例如,基于去污剂的方法,离液盐)和生物化学(例如,诸如溶菌酶的酶)技术。诸如涡旋和珠磨的机械裂解是物理裂解的一种形式。声波降解法是物理裂解的另一种形式,其利用脉冲、高频声波来搅动和裂解细胞、细菌、芽孢以及精细切块的组织。然而,这些方法并不易于与综合的低成本的细胞裂解/核酸分析系统相兼容。基于去污剂的方法通常由于具有更有效的方案而比物理方法更容易使用。但是,去污剂的存在能干扰综合系统中的下游反应,并且对于更硬的细菌和芽孢可产生易变的裂解效率,并且需要较长的孵育步骤和/或加热处理。因此,存在对经济、有效且与综合的细胞裂解/分析系统相兼容的细胞裂解方法的需求。
概述
公开了裂解细胞、病毒颗粒和芽孢的方法。所述方法包括在存在多个细胞裂解珠的情况下,在容器内用磁力搅拌元件搅拌细胞,其中所述搅拌元件以足以裂解细胞的速率和持续时间转动。在一些实施方案中,细胞裂解珠选自聚合物珠、玻璃珠、陶瓷珠和金属珠。在一些实施方案中,细胞裂解珠的直径范围为10~1000μm。在一些实施方案中,将1mg~10g的细胞裂解珠添加到裂解室中。在一些实施方案中,将1ul~10ml的水性液体添加到裂解室中。在一些实施方案中,将样品或样本样本单独直接添加到裂解室中。在一些实施方案中,将样品与水性液体(例如,将固体样本匀浆并裂解以产生水性形式)一起直接添加到裂解室中。在一些实施方案中,磁力搅拌元件为矩形、梯形、两端分叉的音叉状(two-prongedtuning fork shape)、杆状和棒状。在一些实施方案中,细胞是真核细胞、原核细胞、内生芽孢或它们的组合,并且以1~1x1010细胞/ml的浓度范围悬浮于液体介质中。在一些实施方案中,细胞是病毒颗粒,并且以1~1x1010颗粒/ml的浓度范围悬浮于液体介质中。
还公开了裂解细胞和病毒颗粒的方法。所述方法包括将细胞或病毒颗粒悬浮于液体介质中以形成悬浮液,并且在存在多个细胞裂解珠的情况下,用磁力搅拌元件以1000~5000rpm,优选接近5000rpm的高速率搅拌悬浮液1~600秒,优选约90~120秒的时间段。
还公开了用于裂解细胞和病毒颗粒的装置。所述装置包括具有一个或多个磁力搅拌元件和布置在其中的多个细胞裂解珠的小室。小室的尺寸允许一个或多个磁力搅拌元件在室内转动。在一些实施方案中,所述装置还包括产生转动磁场的磁力搅拌器,其中所述一个或多个磁力搅拌元件在放置于转动磁场的操作范围内时能在室内转动。在一些实施方案中,所述装置还包括小室固定器,其被配置成能够将小室固定在由磁力搅拌器产生的转动磁场内。
还公开了从细胞中纯化核酸的方法。所述方法包括向包含细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起搅拌元件与多个珠子相碰撞并且产生细胞裂解物,以及从细胞裂解物中分离核酸。
还公开了从细胞中扩增多核苷酸的方法。所述方法包括向包含细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起搅拌元件与多个珠子相碰撞并且产生细胞裂解物,以及从细胞裂解物中扩增多核苷酸。
还公开了从细胞中检测多核苷酸的方法。所述方法包括向包含细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起搅拌元件与多个珠子相碰撞并且产生细胞裂解物,以及从细胞裂解物中检测多核苷酸。在某些实施方案中,检测步骤包括从细胞裂解物中分离核酸,从所分离的核酸中扩增多核苷酸,以及检测所扩增的多核苷酸。
本申请还公开了以下项所述的实施方案:
项1.裂解细胞的方法,所述方法包括:在存在多个珠子的情况下,在小室内磁力搅拌元件搅拌包含一种或多种目的细胞的液体悬浮液,其中所述磁力搅拌元件以足以裂解所述一种或多种目的细胞的速率转动。
项2.如项1所述的方法,其还包括:将所述一种或多种细胞悬浮于液体介质中以形成所述液体悬浮液。
项3.如项1所述的方法,其中所述珠子包含选自以下的材料:塑料、玻璃、陶瓷和金属。
项4.如项3所述的方法,其中所述珠子是硅珠。
项5.如项1所述的方法,其中所述珠子的直径范围为10~1000μm。
项6.如项1所述的方法,其中所述磁力搅拌元件包含金属或合金。
项7.如项1所述的方法,其中所述磁力搅拌元件具有选自以下的形状:圆形,方形,矩形,曲杆状,截面为矩形的形状,盘状,杆状,环状,月牙形以及梯形,两端分叉的音叉状。
项8.如项1所述的方法,其中所述目的细胞是真核细胞或原核细胞,并且其中所述液体悬浮液包含浓度范围为1~1x1010细胞/ml的所述细胞。
项9.如项1所述的方法,其中所述细胞是病毒颗粒,并且其中所述液体悬浮液包含浓度范围为1~1x1013颗粒/ml的所述病毒颗粒。
项10.裂解细胞的方法,所述方法包括:向包含目的细胞、搅拌子元件和多个珠子的小室施加磁场,其中所述磁场引起所述搅拌子元件与所述珠子相碰撞,所产生的力足以使所述细胞破碎。
项11.如项10所述的方法,其中所述珠子包括玻璃珠、塑料珠、陶瓷珠、金属珠或它们的混合物。
项12.如项10所述的方法,其中所述搅拌子元件包含不锈钢。
项13.如项10所述的方法,其中所述搅拌子元件包含涂有聚合物的合金核心。
项14.如项13所述的方法,其中所述合金核心包含钕铁硼或钐钴。
项15.如项13所述的方法,其中所述聚合物是生物相容性聚合物。
项16.如项15所述的方法,其中所述生物相容性聚合物是PTFE或聚对二甲苯。
项17.在一个或多个器皿内裂解细胞的方法,所述方法包括:将一个或多个器皿沿着第一轴线放置在表面上,其中每一个器皿包含一种或多种细胞,一个或多个磁力搅拌子和多个珠子;以及围绕所述一个或多个器皿附近的第二轴线转动磁体,其中所述第二轴线穿过所述磁体中心,所述磁体的转动引起每一个器皿中的所述一个或多个磁力搅拌子翻转。
项18.如项17所述的方法,其中所述第二轴线平行于所述第一轴线。
项19.如项17所述的方法,其中所述第二轴线与所述第一轴线形成角度,并且其中所述角度大于0度且小于180度。
项20.如项17所述的方法,其中所述磁体是永久性磁体。
项21.如项17所述的方法,其中所述转动的磁体引起至少一个器皿中的所述一个或多个磁力搅拌子以大于1000rpm的速率转动。
项22.如项17所述的方法,其中所述转动的磁体引起每一个器皿中的所述一个或多个磁力搅拌子转动约1分钟至约15分钟的时间。
项23.如项17所述的方法,其中所述第一轴线垂直于所述表面,并且所述磁体的转动引起每一个器皿中的所述一个或多个磁力搅拌子围绕垂直于所述表面的轴线转动。
项24.如项17所述的方法,其中所述第一轴线垂直于所述表面,并且所述磁体的转动引起每一个器皿中的所述一个或多个磁力搅拌子围绕平行于所述表面的轴线转动。
项25.如项17所述的方法,其中所述第二轴线在所述一个或多个器皿之上。
项26.如项17所述的方法,其中所述第二轴线在所述一个或多个器皿之下。
项27.如项17所述的方法,其中所述第二轴线在所述一个或多个器皿的一侧。
项28.如项17所述的方法,其中所述一个或多个器皿为选自以下的形式:小瓶、试管、微板孔和流动腔。
项29.如项17所述的方法,其中所述一个或多个器皿具有在平行于所述第一轴线的方向上延伸的形状,并且其中所述磁体具有在平行于所述第二轴线的方向上延伸的形状。
项30.如项17所述的方法,其中所述一个或多个器皿包含两种或更多种类型的细胞,并且其中所述转动步骤包括:以致使第一种类型的细胞裂解的第一速率转动所述磁体。
项31.如项30所述的方法,其中所述转动步骤还包括:以致使第二种类型的细胞裂解的第二速率转动所述磁体。
项32.用于裂解细胞的装置,所述装置包括:包含磁力搅拌元件和布置在其中的多个珠子的容器,其中所述容器的尺寸允许所述磁力搅拌元件在所述容器内转动。
项33.如项32所述的装置,其中所述珠子包括玻璃珠、塑料珠、陶瓷珠或它们的混合物。
项34.如项32所述的装置,其还包括:产生转动磁场的磁力搅拌器,其中所述磁力搅拌元件在放置于所述转动磁场的操作范围内时能够在所述容器内转动。
项35.如项32所述的装置,其还包括容器固定器,所述容器固定器被配置成能够将所述容器固定于所述转动磁场内。
项36.如项32所述的装置,其还包括控制所述容器温度的温度控制组件。
项37.从细胞中纯化核酸的方法,所述方法包括:向包含所述细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起所述搅拌元件与所述多个珠子相碰撞并产生细胞裂解物;以及从所述细胞裂解物中分离核酸。
项38.从细胞中扩增多核苷酸的方法,所述方法包括:向包含所述细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起所述搅拌元件与所述多个珠子相碰撞并产生细胞裂解物;以及从所述细胞裂解物中扩增所述多核苷酸。
项39.从细胞中检测多核苷酸的方法,所述方法包括:向包含所述细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起所述搅拌元件与所述多个珠子相碰撞并产生细胞裂解物;以及从所述细胞裂解物中检测所述多核苷酸。
项40.如项39所述的方法,其中所述检测步骤包括:从所述细胞裂解物中分离核酸;从所分离的核酸中扩增所述多核苷酸;以及检测所扩增的多核苷酸。
附图简要说明
将参考以下附图进行详细描述,其中:
图1是显示裂解细胞方法的一个实施方案的流程图。
图2是显示裂解细胞方法的另一实施方案的流程图。
图3是显示磁体和裂解室的相对位置的图。
图4显示了来自未裂解的大肠杆菌细胞(未裂解的),通过珠磨器裂解2分钟的大肠杆菌细胞(2m珠磨),以及通过珠子/搅拌子裂解30秒(30s混合)或2分钟(2m混合)的大肠杆菌细胞的特定基因组区的实时PCR扩增图。
图5显示了来自未裂解的大肠杆菌细胞(未裂解的),通过珠磨器裂解2分钟的大肠杆菌细胞(2m珠磨),以及通过珠子/搅拌子裂解1分钟(1m混合)或2分钟(2m混合)的大肠杆菌细胞的特定基因组区的实时PCR扩增图。
图6显示了来自未裂解的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)芽孢(未裂解的),通过珠磨器裂解2分钟的苏云金芽孢杆菌芽孢(2m珠磨),以及通过珠子/搅拌子裂解2分钟(2m混合)的苏云金芽孢杆菌芽孢的特定基因组区的实时PCR扩增图。
图7显示了来自未裂解的苏云金芽孢杆菌芽孢(未裂解的),通过珠磨器裂解2分钟的苏云金芽孢杆菌芽孢(2m珠磨),以及通过珠子/搅拌子裂解1.5分钟(1.5m混合)或2分钟(2m混合)的苏云金芽孢杆菌芽孢的特定基因组区的实时PCR扩增图。
图8显示了来自未裂解的苏云金芽孢杆菌芽孢(未裂解的),通过珠磨器裂解2分钟的苏云金芽孢杆菌芽孢(2m珠磨),以及通过珠子/搅拌子裂解1.5分钟(1.5m混合)的苏云金芽孢杆菌芽孢的特定基因组区的实时PCR扩增图。
图9显示了裂解时间和珠子混合器速率对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)细胞的实时PCR反应的影响。当珠子混合器以高速率运转时,金黄色葡萄球菌细胞在2分钟内实现有效裂解。较低的速率需要较长的裂解时间。未裂解的芽孢具有无裂解(0分钟)就可检测到的低水平的细胞外DNA。少量游离DNA结合到玻璃珠上。珠子混合器速率为100相当于5000rpm。
图10显示了裂解时间和珠子混合器速率对苏云金芽孢杆菌芽孢的实时PCR反应的影响。当珠子混合器以高速率运转时,苏云金芽孢杆菌芽孢在2分钟内实现有效裂解。较低的速率需要较长的裂解时间。未裂解的芽孢具有无裂解(0分钟)就可检测到的低水平的细胞外DNA。少量游离DNA结合到玻璃珠上。珠子混合器速率为100相当于5000rpm。
发明详述
在描述本发明的优选实施方案时,为了清楚而采用了特定术语。然而,本发明并不意欲限于所选择的特定术语。应当理解的是,每个特定元件包括以相似方式操作以实现相似目的的所有技术等同物。
公开了裂解细胞的方法的实施方案。现在参考图1,在一些实施方案中,方法100包括将细胞样品添加到小室内(步骤110),将多个细胞裂解珠添加到容器内(步骤120),将磁力搅拌元件添加到容器内(步骤130),以及用磁力搅拌元件以足以裂解细胞的转动速率(1000~5000rpm)搅拌细胞样品(步骤140)。现在参考图2,在其他实施方案中,方法200包括形成包含细胞、液体介质、细胞裂解珠和磁力搅拌元件的混合物(步骤210),以及利用变化的磁场驱动混合物中磁力搅拌元件的运动来裂解细胞(步骤220)。
如本文所使用,术语“细胞”是指真核细胞、原核细胞、病毒、内生芽孢或它们的任意组合。因而细胞可包括细胞、细菌芽孢、真菌、病毒颗粒、单细胞真核有机体(例如,原生动物、酵母等)、从多细胞有机体(例如,原代细胞、培养细胞、组织、整个有机体等)中分离或聚集的细胞或以上的任意组合等。
术语“细胞样品”是指任何含有细胞的样品。如本文所使用,细胞样品包括人类、植物、动物、食物、农业或环境来源的样本,如鼻拭物子、血液、粪便、血浆、组织、叶片、水和土壤样品。优选地,细胞样品包含以不干扰磁力搅拌元件运转的浓度悬浮于液体介质的细胞。
关于细胞的术语“裂解”意指破碎细胞至少一部分的完整性,以从破碎的细胞中释放细胞内组分,如核酸和蛋白。
术语“均质化”是指混合(不同的成分,例如粪便、组织、痰、唾液)成均匀的混合物。
可以任意适合的浓度悬浮真核细胞、原核细胞和/或病毒。在一些实施方案中,以1~1x1010细胞/ml,1~1x105细胞/ml,或1x103~1x104细胞/ml等浓度范围悬浮真核细胞和/或原核细胞。在一些实施方案中,以1~1x1013颗粒/ml,1~1x1010颗粒/ml,或1x105~1x107颗粒/ml的浓度范围悬浮病毒颗粒。
液体介质可以是等渗的、低渗的或高渗的。在一些实施方案中,液体介质是水性的。在某些实施方案中,液体介质包含缓冲液和/或至少一种盐或盐的组合。在一些实施方案中,液体介质的pH范围为约5至约8,约6至8,或约6.5至约8.5。可使用各种pH缓冲液以达到期望的pH。适合的缓冲液包括但不限于,Tris、MES、Bis-Tris、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、TEA、HEPPS、Tricine、Gly-Gly、Bicine以及磷酸盐缓冲液(例如,磷酸钠或磷酸钠-钾等)。液体介质可包含约10mM至约100mM的缓冲液,约25mM至约75mM的缓冲液或约40mM至约60mM的缓冲液等。液体介质中所使用的缓冲液的种类和量可因应用而不同。在一些实施方案中,液体介质具有约7.4的pH,其可以利用约50mM的Tris缓冲液来达到。在一些实施方案中,液体介质是水。
小室可以是任何适合的材料、大小和形状的容器。在某些实施方案中,小室是塑料容器。小室的形状可以是,例如微离心管(例如Eppendorf管)、离心管、小瓶、微孔板。小室可以是仅限定用于容纳细胞、珠子和搅拌元件的一个隔室/小室,或者是用于容纳相互隔离的混合物(细胞、珠子和搅拌元件)的多个离散的隔室/小室(例如孔阵列)。小室可以是密封的或可密封的容器,如具有盖、帽或套的容器。内表面可以是化学惰性的,以保持目的分析物的完整性。
细胞裂解珠可以是硬度大于细胞硬度的任何颗粒样和/或珠子样结构。细胞裂解珠可以由塑料、玻璃、陶瓷、金属和/或任何其他适合的材料制成。在某些实施方案中,细胞裂解珠可以由非磁性材料制成。在某些实施方案中,细胞裂解珠围绕至少一个轴线旋转对称(例如,球形、圆形、卵形、椭圆形、蛋形和滴状颗粒)。在其他的实施中,细胞裂解珠具有多面体形状。在一些实施方案中,细胞裂解珠是不规则形状的颗粒。在一些实施方案中,细胞裂解珠是具有突起的颗粒。在某些实施方案中,添加到每个裂解容器内的珠子的量的范围是1~10,000mg,1~1000mg,1~100mg,1~10mg等。
在某些实施方案中,细胞裂解珠的直径范围为10~1,000μm,20-400μm或50-200μm等。
磁力搅拌元件可以是任何形状,并且应当小到足以能够放置于容器中,并在容器内移动或旋转或搅动。磁力搅拌元件可以是棒状、柱形、十字形、V-形、三角形、矩形、杆或盘状搅拌元件等。在一些实施方案中,磁力搅拌元件具有矩形形状。在一些实施方案中,磁力搅拌子具有两端分叉的音叉状。在一些实施方案中,磁力搅拌子具有V-样形状。在一些实施方案中,磁力搅拌子具有梯形形状。在某些实施方案中,搅拌元件的最长尺寸略微小于容器的直径(例如,为容器的直径的约75-95%)。在某些实施方案中,磁力搅拌元件涂有化学惰性材料,如聚合物、玻璃或陶瓷(例如瓷)。在某些实施方案中,聚合物为生物相容性聚合物如PTFE和聚对二甲苯(paralyne)。
可以将细胞悬浮液、细胞裂解珠和磁力搅拌元件按任意顺序放置到小室中。在一些实施方案中,将细胞悬浮液在细胞裂解珠和磁力搅拌元件之前添加到小室中。在其他实施方案中,将细胞裂解珠和/或磁力搅拌元件在细胞之前(例如,细胞悬浮液之前)放置到小室中。
小室,特别是细胞、珠子和磁力搅拌元件位于变化磁场的操作范围内。例如,小室可以位于转动磁场的操作范围内(例如通过在磁力搅拌器上或邻近磁力搅拌器放置容器)。变化的磁场驱动搅拌元件运动,如转动运动、往复运动或它们的组合等,其依次驱动珠子、细胞和液体介质。在一些实施方案中,用磁力搅拌元件以足以裂解容器内的细胞的转动速率和持续时间来搅拌细胞悬浮液。适当的转动速率和持续时间由应用而定,并且可以由本领域技术人员根据经验来确定。一般而言,足以裂解细胞的转动速率由诸如以下的因素决定:细胞种类、细胞悬浮液的浓度、细胞悬浮液的体积、磁力搅拌元件的大小和形状、细胞裂解珠的量/数量、大小、形状和硬度、以及小室的大小和形状。
在某些实施方案中,磁力搅拌元件以1000~6000rpm,优选约5000rpm的速率转动1-600秒,优选约90~120秒的时间段。在某些实施方案中,将小室(例如试管或微离心管形状)放置于在磁力搅拌器(例如VP710C1旋磁回转式搅拌器,5000RPM,14cm长的可用搅拌平台,具有电机外壳和板夹,搅动2深孔微板或6标准微板-115伏AC-60Hz,V&P Scientific)的架子上,并且以最高速率设置(>1000rpm)搅动。在其他实施方案中,小室是微板,如ELISA板中的孔。在其他实施方案中,小室是具有细胞入口和细胞出口的柱形小室。
在某些实施方案中,通过在磁力搅拌元件附近转动磁体,优选永久性磁体,来产生变化的磁场。磁体可以围绕穿过磁体中心的轴线在裂解室之上、之下或侧面转动。在某些实施方案中,将小室放置在垂直于小室所在的表面的位置,并且磁体围绕同样垂直于小室所在的表面的轴线转动。在其他实施方案中,将小室放置在垂直于小室所在的表面的位置,并且磁体围绕平行于小室所在的表面的轴线转动。在其他实施方案中,将小室放置在垂直于小室所在的表面的位置,并且磁体围绕与小室所在的表面形成角度的轴线转动。所述角度大于0度且小于180度。在其他实施方案中,磁体还具有细长的形状,并且围绕沿着磁体最长的尺寸延伸的轴线转动。
图3给出柱形磁体301和裂解室303的相对位置。磁体301围绕轴线A转动并引起小室303中的磁力搅拌元件305以同一方向沿着轴线B转动。转动的磁力搅拌元件305与珠子307相碰撞并且在该过程中裂解细胞309。磁体301可以定位在小室303的侧面、之上、之下或对角。在本实施方案中,小室303具有入口311和出口313,以便于小室的装卸。
在某些实施方案中,提高搅拌子元件的转动速率以提高裂解效率并减少实现裂解所需的时间。在某些其他实施方案中,调节转动的速率使得仅裂解某些种类的细胞。例如,在含有多种细胞的细胞悬浮液中,搅拌元件可以第一速率转动以裂解第一组细胞,然后以第二速率转动以裂解第二组细胞。在其他实施方案中,将容器与温度调节组件相结合,所述温度调节组件控制裂解过程之前、期间和/或之后的细胞悬浮液温度。在某些实施方案中,细胞悬浮液的温度保持在8-2℃。
在某些实施方案中,在搅拌步骤之前和/或期间通过将添加剂添加到细胞悬浮液中可促进特定细胞种类的裂解。添加剂的例子包括酶、去污剂、表面活性剂和其他化学品如碱和酸。已发现碱性条件(例如10mM NaOH)可在搅拌期间提高某些细胞种类的裂解效率。在搅拌期间还可以或可选择地加热细胞悬浮液以提高裂解效率。然而,添加剂对下游处理步骤包括核酸扩增和检测可能是有害的。期望的是在消除需要添加剂的情况下实现有效裂解,因为可以极大地简化样本处理。
搅拌子/珠子组合提供许多优于常规裂解方法的优点。搅拌子/珠子法比化学法和酶法更快速,并且提供比许多其他类型的物理裂解法改善的细胞或病毒裂解。搅拌子/珠子法还适于利用机器人学和/或微流体学的自动化。磁源是可重复使用的,并且无需精确对准器皿,可以驱动多个小室。磁力搅拌子元件的低成本使其可以是一次性的。
还公开了用于裂解细胞的装置。所述装置包括具有磁力搅拌元件和放置在其中的多个细胞裂解珠的小室。使用者可以简单地将细胞悬浮液添加到小室内,将小室放置在磁力搅拌器上,并且用磁力搅拌元件以足以裂解细胞的速率搅拌细胞悬浮液。
还公开了用于裂解细胞的系统。所述系统包括具有磁力搅拌元件和放置在其中的多个细胞裂解珠的小室,以及产生转动磁场的磁力搅拌器,其中所述磁力搅拌元件在放置于转动磁场的操作范围内时能够在小室内转动。
在某些实施方案中,所述系统还包括配置以固定小室的架子。架子可以被配置成固定多个小室,并且可以被放置在磁力搅拌器的支撑表面,用于同时处理多个样品。为了贮存的目的,架子还可以被用作小室的固定器。例如,可以将多个小室放置在架子上并贮存于冰箱或冰柜,用于进一步的分析。小室可以与外部仪器(例如液体处理机器人,微流体装置,分析仪器)连接。
还公开了从细胞中纯化核酸的方法。所述方法包括向包含细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起搅拌元件与多个珠子相碰撞并产生细胞裂解物;以及从细胞裂解物中分离核酸。
还公开了从细胞中扩增多核苷酸的方法。所述方法包括向包含细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起搅拌元件与多个珠子相碰撞并产生细胞裂解物;以及从细胞裂解物中扩增多核苷酸。
还公开了从细胞中检测多核苷酸的方法。所述方法包括向包含细胞、搅拌元件和多个珠子的器皿施加磁场,其中所述磁场引起搅拌元件与多个珠子相碰撞并产生细胞裂解物;以及从细胞裂解物中检测多核苷酸。在某些实施方案中,检测步骤包括从细胞裂解物中分离核酸,从所分离的核酸中扩增多核苷酸,以及检测所扩增的多核苷酸。
实施例
实施例1:大肠杆菌细胞的裂解
将大肠杆菌细胞以104细胞/ml的浓度悬浮于Tris-EDTA缓冲液中。将1毫升细胞悬浮液添加到包含800mg玻璃珠(106μm或更细,Sigma G8893)和磁力搅拌盘(VP-7195超回转式搅拌盘,V&P Scientific)的小室(2ml塑料小瓶,Wheaton)中。
然后将塑料小瓶放置在磁力搅拌器(VP 710C1旋磁回转式搅拌器,5000RPM,V&PScientific)上,并于5000rpm下搅拌30秒、1分钟或2分钟。利用珠磨器(Mini Bead Beater-1,Biospec)根据厂商说明书于4800rpm下处理阳性对照样品2分钟。未处理的细胞悬浮液用作对照。然后利用Roche LightCycler 480对所裂解的细胞和对照的特定基因进行实时PCR扩增。扩增条件如下:95℃,250秒;接着进行45个循环(95℃,10秒;60℃,20秒;和72℃,10秒);以及最后循环40℃,10秒。
如图4和图5所示,珠子/搅拌子法(30s混合,1m混合和2m混合)提供了比珠磨法(2m珠磨)更好的细胞裂解。
实施例2:苏云金芽孢杆菌芽孢的裂解
将苏云金芽孢杆菌芽孢以104细胞/ml的浓度悬浮于水中。将500μl细胞悬浮液添加到包含800mg玻璃珠(106μm或更细,Sigma G8893)和磁力搅拌盘(VP-7195超回转式搅拌盘,V&P Scientific)的2ml塑料小瓶(Wheaton)中。
然后将塑料小瓶放置在磁力搅拌器(VP 710C1旋磁回转式搅拌器,5000RPM,V&PScientific)上,并于5000rpm下搅拌1.5分钟或2分钟。利用珠磨器(Mini Bead Beater-1,Biospec)根据厂商说明书处理阳性对照样品2分钟。未处理的细胞悬浮液用作对照。然后利用Roche LightCycler480,在实施例1所述条件下,对所裂解的细胞和对照苏云金芽孢杆菌的特定基因进行实时PCR扩增。
如图3至图6所示,珠子/搅拌子法(1.5m混合和2m混合)提供了比珠磨法(2m珠磨)更好的细胞裂解。
实施例3:裂解时间和珠子混合器速率对金黄色葡萄球菌细胞的实时PCR反应的影响
利用实施例2所述的相同仪器和步骤,将金黄色葡萄球菌细胞悬浮并在不同的混合器速率下裂解不同的时间段。
图9显示了裂解时间和珠子混合器速率对金黄色葡萄球菌细胞的实时PCR反应的影响。当珠子混合器以高速率运转时,金黄色葡萄球菌细胞在2分钟内实现有效裂解。较低的速率需要较长的裂解时间。未裂解的芽孢具有无裂解(0分钟)就可检测到的低水平的细胞外DNA。少量游离DNA结合到玻璃珠上。珠子混合器速率为100相当于5000rpm。
实施例4:裂解时间和珠子混合器速率对苏云金芽孢杆菌芽孢的实时PCR反应的影响
利用实施例2所述的相同仪器和步骤,将苏云金芽孢杆菌芽孢悬浮并在不同的混合器速率下裂解不同的时间段。
图10显示了裂解时间和珠子混合器速率对苏云金芽孢杆菌芽孢的实时PCR反应的影响。当珠子混合器以高速率运转时,苏云金芽孢杆菌芽孢在2分钟内实现有效裂解。较低的速率需要较长的裂解时间。未裂解的芽孢具有无裂解(0分钟)就可检测到的低水平的细胞外DNA。少量游离DNA结合到玻璃珠上。珠子混合器速率为100相当于5000rpm。
为了便于理解本发明的结构和实施原理,本发明已根据具体实施方案结合详述进行了描述。本文这种对具体实施方案及其详述的参照并不意欲限制所附权利要求书的范围。本领域技术人员显而易见的是,在不脱离本发明实质和范围的情况下,可以对所选择的实施方案进行修改。
Claims (13)
1.在器皿内裂解细胞的方法,所述方法包括:
将所述器皿放置在支撑表面上,其中所述器皿位于垂直于所述支撑表面的位置并且包含悬浮于液体介质中的一种或多种细胞、一个或多个磁力搅拌子和多个珠子;以及
沿着轴线转动柱形磁体,其中所述轴线穿过所述柱形磁体中心,在所述器皿附近并平行于所述支撑表面以使得所述器皿位于由所述柱形磁体产生的转动磁场的操作范围内,以及其中所述转动所述柱形磁体引起所述器皿中的所述一个或多个磁力搅拌子与所述珠子相碰撞,所产生的力足以使所述一种或多种细胞破碎,从而在所述器皿内裂解所述一种或多种细胞;
其中所述转动所述柱形磁体引起所述器皿中的所述一个或多个磁力搅拌子以大于1000rpm的速率转动1分钟至15分钟的时间;
其中所述珠子的直径范围为10~1000μm。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述磁体是永久性磁体。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述器皿为选自以下的形式:小瓶、试管、微板孔和流动腔。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述器皿包含两种或更多种特定类型的细胞,所述细胞包括真核细胞、原核细胞、病毒或其任意组合,以及其中所述转动步骤包括:
以致使第一特定类型的细胞裂解而不裂解器皿中其他类型的细胞的第一速率转动所述磁体。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述转动步骤还包括:
以致使第二特定类型的细胞裂解的第二速率转动所述磁体,所述第二特定类型的细胞不同于所述第一速率致使其先裂解的细胞类型。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述多个珠子包括玻璃珠、塑料珠、陶瓷珠、金属珠或它们的混合物。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述一个或多个磁力搅拌子包含金属或合金。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述一个或多个磁力搅拌子包含涂有聚合物的合金核心。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述聚合物包含生物相容性聚合物。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述生物相容性聚合物包含聚四氟乙烯(PTFE)或聚对二甲苯。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种细胞是真核细胞或原核细胞,并且其中所述真核细胞或原核细胞以1~1x1010细胞/ml的浓度范围悬浮于液体介质中。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种细胞是病毒颗粒,并且其中所述病毒颗粒以1~1x1013颗粒/ml的浓度范围悬浮于液体介质中。
13.如权利要求4所述的方法,其中所述原核细胞包括内生芽孢。
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