KR101409336B1

KR101409336B1 - 희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101409336B1
Application number: KR1020120015110A
Authority: KR
Inventors: 김윤배; 김승업; 이홍준; 김태균
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-15
Filing date: 2012-02-15
Publication date: 2014-06-27
Also published as: KR20130093890A

Abstract

본 발명은 희돌기교전구세포의 중추신경계 질환의 세포 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 희돌기교전구세포를 소아뇌성마비 및 다발성축삭경화증과 같은 중추신경계 질환 동물 모델의 뇌에 주입하는 경우 손상된 뇌 신경세포를 복구하며 신경행동장애와 인지기능장애를 정상 동물의 수준과 유사한 수준까지 개선하는 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 희돌기교전구세포는 중추신경계질환의 세포 치료제로 사용될 수 있다.

Description

희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 치료용 조성물{Composition for Treating Central Nervous System Disease Comprising Oligodendrocyte Progenitor As Active Ingredient}

본 발명은 희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

다양한 신경행동장애를 보이는 가장 심각한 신경질환 중의 하나인 소아뇌성마비(cerebral palsy, CP)는 자궁내감염 또는 주산기가사에 의해 발생된다(Hagberg et al., 2002). 이 질환은 중추신경계에서의 병리학적 특징에 따라 뇌실주위백질연화증(periventricular leukomalacia, PVL), 저산소증-허혈증 뇌병증(hypoxia-ischemia encephalopathy, HIE) 또는 백질손상(white matter injury, WMI)으로 불리기도 한다. 분만동안의 질식에 의한 가사상태가 매우 많은 경우의 PVL에서 중요한 병인 인자이긴 하지만, 감염, 염증 및 이들의 조합이 중요한 인자이기도 하다(Nelson and Willoughby, 2000). 특히, CP 발생의 발생 빈도가 높은 미숙아에서 호흡 기능장애가 우세한 인자라는 것은 잘 알려져 있다(Rezaie and Dean, 2002; Wang et al., 2006; Deng et al., 2008; Volpe, 2009). 운동능, 지각능, 시각능, 행동능 및/또는 인지능에서의 장애가 PVL에서 주로 발생되는 장애이다(Devries et al., 1993; Krageloh-mann et al., 1995; Grether et al., 1997).

인간에 있어서 희돌기교세포(oligodendrocyte) 발달은 희돌기교전구세포(O4⁺O1^- preoligodendrocytes, pre-OLs)으로부터 시작되어 미성숙 희돌기교세포(O4⁺O1⁺)로 발달되고, 이 세포는 축삭의 미엘린(myelin)을 생성하는 희돌기교세포로 분화되는 것으로 추정되고 있다(Rivkin et al., 1995; Back et al., 2007). 임신 24-32주(GW24-32) 동안에 활성 미엘린 합성과 CNS내에서의 축적이 증가하므로, GW24-32 동안의 후기 희돌기교전구세포 및 미성숙 희돌기교세포는 저산소증-허혈성 손상, 자유라디칼, 흥분세포독성, LPS 및 면역사이토카인에 대해 특히 취약하다(Oka et al., 1993; Rivkin et al 1995; Kinney et al., 1998; Fern and Moller, 2000; Back et al., 2001; Back et al., 2002). 따라서, 희돌기교세포의 탈수초화(demyelination)는 미숙아에서 PVL의 중요한 특징이다.

희돌기전구세포는 미성숙 랫드에서 HI 공격에 대해 취약하였다(Back et al., 2002). O4에 대해 면역반응을 보이나 O1에 대해 반응을 보이지 않는 희돌기전구세포는 생후 2-4일(PND 2-4)의 랫드의 백질부위에서 우세하지만(Follett et al., 2000; Back et al., 2002), 반면 O4⁺O1⁺ 세포는 PND7에서 우세하였다. 따라서, 백질이 성숙과정에 있는 생후 5일(PND5)이 인간에서의 GW24-30에 대응한다(Muse et al., 2001). 따라서, 미엘린기초단백질(myelin basic protein, MBP)의 합성이 시작되는 날인 PND7까지가, 생명에 영향을 주지 않고 WMI를 유도할 수 있는 날이 될 것이다(도 1). 종전의 연구에 의하면, 허혈증(경동맥 결찰)에 이은 저산소증(8％ O₂에서 2시간)의 경우 심각한 탈수초화(demyelination) 및 신경행동장애를 초래한다는 것이 확인되었다(Park et al., 2010). 그 이후로, 저산소증-허혈증-LPS, 즉 경동맥 결찰-저산소 환경-LPS 주입의 조합 모델이 CP를 유도하고 PVL에 이은 신경행동장애를 잘 나타낸다는 것이 증명되었다(Girard et al., 2009). 최근 연구자들은 신경줄기세포, 다능성 성체줄기세포 및 중간엽줄기세포와 같은 다양한 줄기세포가 HI 뇌 손상에 대해 치료적 효과를 가질 수 있다고 보고하였다(Daadi et al., 2010; Lee et al., 2010; Pimentel-Coelho and Mendez-Otero, 2010; Van Velthoven et al., 2010). 또한, 중간엽줄기세포가 신경세포 및 희돌기교세포로 분화할 수 있으며, 이에 의해 손상된 뇌를 회복시키는데 기여할 수 있다고 제안되었다(Mezey et al., 2000; Shen et al., 2007).

다발성 축삭 경화증(Multiple sclerosis, MS)은 서구 국가에서 젊은 성인에 자주 발생되는 자가 면역 관련 신경질환이다(Compston et al., 2002). MS 환자는 탈수초 및 신경손상에 의해 초래되는 신경 및 행동 장애를 겪는다(Compston et al., 2002). 따라서, MS의 초기 병인적 특징은 미엘린생성 희돌기교세포의 손상에 따른 축색돌기 전반에 걸친 탈수초인 것으로 인정되고 있다. MS의 동물모델인 실험적 자가면역성뇌척수염(experimental autoimmune encepahalomyelitis, EAE)에서, 주입된 미엘린 항원에 의해 활성화된 자가면역성 Th1 세포는 인터페론-γ (IFN-γ) 및 인터루킨-2 (IL-2)와 같은 사이토카인을 방출하고, 방출된 사이토카인은 대식세포를 중추신경계(central nervous system, CNS)로 모이게 하여 염증을 유발시킨다(Einstein et al., 2007; Mosmann et al., 1989). 종전의 연구에 의하면 탈수초 이후의 미엘린 재생은 통상적인 자발적 회복 과정이라고 알려져 있다(Bjartmar et al., 2003). 그러나, 회복과정에서 실패한 이후에 일관된 탈수초 및 축삭돌기 손실을 갖는 환자들의 대부분은 중추신경계에서 회복 불가능한 기능손상으로 진행된다(Bjartmar et al., 2003). 현재까지 MS 치료에 면역조절인자 및 신경영양인자를 사용하고 있으나, 비가역적 조건하에서는 이들의 치료효과가 거의 없었는데, 이는 이들 인자들이 심하게 손상된 미엘린을 재생시킬 수 없기 때문이다(Payne et al., 2008). 이와 대조적으로, 최근의 연구결과에 의하면 줄기세포는 세포 대체, 신경보호 및 면역조절 메카니즘을 통해 비가역적 CNS도 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 것으로 확인되었다(Karussis and Kassis, 2007; Payne et al., 2008). 예를 들어, 신경줄기세포(NSC)를 EAE 동물에 정맥을 통해 이식한 경우 주변 면역을 조절함으로써 임상적 증상들 개선시키며(Einstein et al., 2007), 뇌실내(icv)로 이식된 NSC가 손상된 세포를 대체하고 숙주세포를 보호함으로써 CNS 장애를 개선시킨다(Mi et al., 2009)는 것이 규명되었다. 또한, 불사멸화된 F3 인간 NSCs (F3 hNSCs) (Flax et al., 1998)가 신경세포와 교세포로 분화되는 다능성을 가지며(Cho et al., 2002; Kim, 2004), 뇌졸중 동물모델의 손상된 영역을 대체한다는 것이 확인되었다(Chu et al., 2004; Jeong et al., 2003). 또한, F3 hNSC으로부터 분비되는 다양한 성장인자가 신경 손상을 억제하고 내재적인 미엘린 재생을 촉진한다((Hong et al., 2006). 그러나, F3 hNSC가 시험관 및 생체내에서 희돌기교세포로 거의 분화가 되는 일은 없다(Hwang et al., 2009). 또한, 다른 인간신경줄기세포가 희돌기교세포로 분화되는 능력을 거의 갖고 있지 않다(Tamaki et al., 2002; Zhang et al., 2000). F3 NSC에 Olig2 전사인자를 도입하면, 전적으로 O4 및 CNPase 양성 희돌기교전구세포(F3.olig2)만으로 분화되고, Nkx2.2가 활성화되고 및 시험관내에서 Olig2 과발현을 나타내면서 증식한다는 점이 보고되었다(Hwang et al., 2009). 또한, F3.olig2 세포를 척수손상 랫드에 이식하면 이식된 세포 스스로 척수내의 손상된 부위로 이동하여 척수내에서 미엘린을 재생한다(Hwang et al., 2009). 또한, 인간 F3.olig2 전구세포도 F3 hNSC처럼 신경보호 및 재생활성을 갖는 성장인자 및 신경영양인자를 발현하고 분비한다는 점도 확인되었다(Hwang et al., 2009).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신경줄기세포의 이식에 의한 중추신경계 질환 세포 치료제를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 중추신경계 질환 동물 모델에서 희돌기교전구세포를 이식한 경우 손상된 신경세포가 회복되며 신경행동기능과 인지기능의 장애도 정상 수준으로 복구됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 신경행동기능 장애 또는 인지기능 장애 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “희돌기교세포(oligodendrocyte)”는 신경세포를 지지하는 신경교세포의 일종으로서, 축삭(axon)을 둘러싸고 이를 절연하는 미엘린(myelin)을 생성하는 세포로 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 “희돌기교전구세포(oligodendrocyte progenitor)" 은 상기 희돌기교세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 희돌기교전구세포는 Olig2 유전자를 인코딩하는 핵산 분자를 발현가능한 형태로 포함하는 벡터로 형질전환된 줄기세포이다.

본 명세서에서 상기 용어 “Olig2 유전자”는 "희돌기교전구세포 전사인자 2 (Oligodendrocyte transcription factor 2)”단백질을 인코딩하는 유전자를 의미한다.

본 명세서에서 상기 용어 “줄기세포”는 증식을 계속하는 능력, 즉 자기복제능력(self-renewal)을 가지고 있으며, 다양한 타입의 특정 세포 타입으로 분화할 수 있는 분화능을 갖는 세포를 의미한다.

본 발명의 희돌기교전구세포의 제조에 사용되는 줄기세포는 초대 배양(primary cultured) 줄기세포 또는 이의 유전적으로 변형된 불사멸화된(immortalized) 줄기세포이다.

바람직하게는 상기 줄기세포는 인간의 조직으로부터 분리 및 배양된 초대 배양 줄기세포(primary cultured neural stem cell)일 수 있으며, 또는 상기 초대 배양 줄기세포에 종양 유전자(예컨대, v-myc 유전자)를 발현 가능한 형태로 포함한 벡터를 도입하여 확립된 불사멸화된 줄기세포주일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 줄기세포는 “신경줄기세포”이다.

본 명세서에서 용어 “신경줄기세포”는 상기한 줄기세포로서 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron or neuronal cell), 성상교세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 등의 세포로 분화할 수 있는 다분화능력을 가진 미분화세포를 의미한다.

신경줄기세포의 구체적인 분리 방법은 미국등록특허 5,654,183에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서 참조로써 삽입된다. 신경줄기세포는 bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), 또는 FGF (fibroblast growth factor)의 성장인자를 적합한 농도 범위 예컨대 5-100 ng/㎖의 범위로 배지에 첨가하여 배양할 수 있다.

Olig2 유전자를 발현 가능한 형태로 포함하는 벡터를 줄기세포에 형질전환하여 희돌기교전구세포를 얻는 구체적인 방법은 Hwang DH, et. al., BMC Neurosci 2009; 10: 117.에 개시되어 있으며, 이의 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 희돌기교전구세포는 중추신경계 질환 치료 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에서 중추신경질환계 질환은 바람직하게는 소아뇌성마비(Cerebral palsy, Periventicular leukomalacia), 다발성축삭경화증(Multiple sclerosis), 척수손상(Spinal cord injury), 루게릭병(Lou Gehrig Disease) 또는 뇌외상이며, 보다 바람직하게는 소아뇌성마비 또는 다발성축삭경화증이다.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 희돌기교전구세포는 소아뇌성마비 및 다발성축삭경화증 질환의 동물모델을 사용한 실험에서 손상된 신경세포를 복구하며, 신경행동이상 및 인지기능의 손상을 정상 동물 수준과 유사한 수준까지 회복시키는 치료 활성을 가진다.

본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 세포를 포함하는 현탁액 형태의 주사제로 제조될 수 있다. 주사에 적합한 제약 형태는 용액 또는 분산액의 즉시 준비가 가능한 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 모든 경우에 주사액 형태의 제약제는 멸균되어야 하며, 주사가 용이할 정도로 유동성이 있어야 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

상기 용어 "약제학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되었을 때 알레르기 반응이나 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 담체로는 특정 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 활성인 물질에 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 약제학적 조성물의 담체는, 예를 들어 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 오염을 막기 위해 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제가 포함될 수 있으며, 당 또는 염화나트륨 등의 등장제도 포함될 수 있다. 또한, 체내 투여시 흡수작용을 연장시키기 위해 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴를 포함시킬 수 있다. 멸균 주사 용액은, 필요에 따라 상기 언급된 여러 다른 성분들을 가진 적합한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 비경구, 복강내, 진피내, 근육내, 정맥내 경로로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 뇌 부위에 직접 주입에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 또한, 치료될 대상의 상태 또는 조건에 따라 투여량을 조절할 수 있다. 수성의 주사 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성으로 만든다. 이들 특수한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 본 조성물에 사용될 수 있는 담체 및 제제, 매질에 대한 내용은 당업계에 공지되어 있다 ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, 15판 참조).

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 신경행동기능(Neurobehavioral function) 장애 또는 인지기능(Cognitive function) 장애 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 하기 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 희돌기교전구세포는 뇌에서의 저산소증 또는 허혈증에 의해 유도되는 신경행동기능장애와 인지기능장애를 효과적으로 회복시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 희돌기교전구세포는 Olig2 유전자 인코딩 핵산 분자를 발현 가능한 형태로 포함하는 벡터로 형질전환된 줄기세포이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 줄기세포는 초대 배양(primary cultured) 줄기세포 또는 이의 유전적으로 변형되어 불사멸화된(immortalized) 줄기세포이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 신경행동기능 장애 또는 인지기능 장애는 뇌에서 저산소증 또는 허혈증 또는 이들의 조합에 의해 유도된 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 인지기능 장애는 학습능력 장애 또는 기억력 장애이다.

본 발명의 신경행동기능 장애 또는 인지기능 장애 치료용 조성물에서 희돌기교전구세포, 줄기세포, 약제학적 조성물에 관한 내용은 상기 중추신경계 질환 치료용 약제학적 조성물에서 설명된 내용과 동일하므로 중복 설명을 생략한다.

도 1은 저산소증-허혈증(경동맥 결찰)에 의해 유도되는 설치류의 백질연화증의 발달 단계를 보여준다. MBP, (미엘린 기초단백질, myelin basic protein); PND, post-natal day; WMI, 백질 손상(white matter injury).
도 2는 뇌량(corpus callosum) 및 내포(internal capsule)를 포함하는 백질부에서의 희돌기교세포 미엘린에 대한 LFB(Luxol fast blue) 염색 결과를 보여준다. 패널 A-C: 뇌손상 유발 반대측인 오른쪽 반구, 패널 D-F: 뇌손상 유발 같은 측인 왼쪽 반구; 패널 A, B, D 및 E는 뇌량 부위; 패널 C 및 F은 내포 부위임.
도 3은 HIL(저산소증-허혈증-LPS)를 행한 랫드에 대해 실린더 테스트를 PND14 (패널A), PND20 (패널 B), PND30 (패널 C) 및 PND40 (패널D)에서 각각 행하여 반대측 앞발의 사용비율(％)을 측정한 결과를 보여준다. 랫드는 HIL을 시행하고, F3.oilg2 (4 X 10⁵) 세포를 icv를 통해 PND10에서 1회 주입하거나 또는 PND10, PND17, PND27 및 PND37에서 4회 주입하였다. *모의수술 대조군(정상)과의 유의적 차이(P<0.05). #HIL과의 유의적 차이(P<0.05).
도 4는 PND14 (패널 A), PND20 (패널 B), PND30 (패널 C) 및 PND40 (패널 D)에서의 정속 12 rpm 회전봉 수행 시험에서의 머무름 시간을 측정한 결과를 보여준다. 랫드를 HIL(저산소증-허혈증-LPS)을 시행하고, F3.oilg2 (4 X 10⁵)의 세포로 PND14에서 1회 icv 이식 및 PND10, PND17, PND27, 및 PND37에서 각각 4회 icv 이식하였다. *모의수술 대조군(정상)과의 유의적 차이(P<0.05). #HIL과의 유의적 차이(P<0.05).
도 5는 PND14(패널 A), PND20(패널 B), PND30(패널 C) 및 PND40(패널 D)에서의 자발적 운동에 기초하여 분석한 활동성 측정 결과이다. ■, 정상군; ▤, 저산소증-허혈증-LPS (HIL) 시행군; ▨, F3.olig2 (4 X 10⁵) 세포를 PND10에서 1회 단일 이식한 경우; ▩, PND10, PND17, PND27 및 PND37에서 F3.olig2 세포를 반복 이식한 경우. *모의수술 대조군(정상)과의 유의적 차이(P<0.05). #HIL과의 유의적 차이(P<0.05).
도 6은 PND41 - PND44에서 수동회피반응실험(패널 A) 및 수중미로실험(패널 B)의 학습 및 기억 기능을 측정한 결과를 보여준다. ●, 정상군; ▽, 저산소증-허혈증-LPS (HIL) 처리군; ◇, PND10에서 F3.olig2 세포(4 X 10⁵)를 1회 이식한 경우; ◆, PND10, PND17, PND27 및 PND37에서 이식하여 F3.olig2 세포를 4회 반복 이식한 경우. *모의수술 대조군(정상)과의 유의적 차이(P<0.05). #HIL과의 유의적 차이(P<0.05).
도 7은 F3.olig2 세포의 분포 및 성숙화를 측정한 결과를 보여준다. 이식된 F3.olig2 세포는 손상된 부위(패널 A) 및 인간 특이적 미토콘드리아(hMito, 녹색), Olig2 염색(붉은색, 희돌기교세포 계통의 마커)에 대한 면역반응능(패널 B)에 의해 희돌기교세포로 확인되었다. 이식후 5주후에 MBP (myelin basic proteins)에 대한 면역염색에 의해, F3.olig2 전구세포가 희돌기교세포로 성숙되었음을 확인하였다(패널 C).
도 8은 PND45 랫드 뇌에서 뇌량(패널 A-D) 및 내포(패널 E-H)에서의 MBP (myelin basic protein)의 대표적인 현미경 관찰 결과의 사진이다. 패널 A 및 E는 정상동물; 패널 B 및 F는 저산소증-허혈증-LPS(HIL) 시행 동물; 패널 C 및 G는 PND10에서 F3.olig2 세포(4 X 10⁵)를 단일 이식한 경우; 패널 D 및 H는 PND10, PND17, PND27 및 PND37에서 F3.olig2 세포를 반복 이식한 경우이다.
도 9은 0일에 MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) 주입에 의해 유도된 실험적 자가면역뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 마우스의 비정상적 임상증상에 대해, 6일 시점에 이식한 F3 신경줄기세포 또는 F3.olig2 희돌기교전구세포(1 X 10⁶ 세포/마우스)가 미치는 영향을 측정한 결과이다. ●, MOG 단독; ■, MOG + F3 세포; ▲, MOG + F3.olig2 세포.
도 10는 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색된 척수 (패널 A-D), 크레실 바이올렛 염색된 척수 (패널 E-H) 또는 LFB (Luxol fast blue) 염색된 척수 (패널 I-L)의 대표 사진이다. 패널 A, E 및 I: 정상; 패널 B, F 및 J: MOG 단독 처리; 패널 C, G 및 K: MOG + F3 세포 처리; 패널 D, H 및 L: MOG + F3.olig2 세포 처리.
도 11은 T세포의 CD3 (패널 A-D) 및 대식세포의 Mac3 (패널 E-H)에 대한 대표적 면역조직화학 결과를 보여준다. 패널 A 및 E: 정상; 패널 B 및 F: MOG 단독처리; 패널 C 및 G: MOG + F3 세포 처리; 패널 D 및 H: MOG + F3.olig2 세포 처리.
도 12는 척수에서 MOG로 유도된 T 세포 및 대식세포의 침투에 대한 F3 세포 또는 F3.olig2 세포의 영향을 평가한 결과이다. *정상 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05). # MOG 단독처리와 유의성 있는 차이(P<0.05).
도 13는 MOG를 주입한 EAE 마우스의 흉부 척수에서의 이식된 인간 (hMito-양성반응) F3 세포 및 F3.olig2 세포의 수를 측정한 결과이다. hMito-양성 세포는 정맥내 이식 후 44일 시점에서 계수하였다(1 X 10⁶ 세포/마우스).
도 14은 이식후 44일 시점에서, 이식된 인간 (hMito-양성) F3의 희돌기교세포 (Olig2-양성), 성상교세포 (GFAP-양성) 또는 신경세포 (NF-양성)으로의 분화, 및 MBP-양성 희돌기교세포로의 성숙화를 조사한 결과이다. 막대 = 20 μm.
도 15은 이식후 44일 시점에서, 이식된 인간 (hMito-양성) F3 olig2 (Olig2-양성)의 성상교세포 (GFAP-양성) 또는 신경세포 (NF-양성)으로의 분화 및 MBP-양성 희돌기교세포로의 성숙화를 조사한 결과이다. 막대 = 20 μm.
도 16은 이식된 F3 및 F3.olig2의 분화 비율을 보여준다. NF: neurofilaments, Olig2: oligodendrocyte transcription factor, MBP: myelin basic proteins, GFAP: glial bibrillary acidic proteins.
도 17는 척수(패널 A) 및 림프절(패널 B)에서 MOG에 의해 유도되는 사이토카인의 증가에 미치는 F3 세포 또는 F3.olig2 세포 이식의 영향을 보여준다. 1: 정상, 2: MOG 단독 처리, 3: MOG + F3 세포 처리, 4: MOG + F3.olig2 세포 처리. IL: 인터루킨, IFN-γ: 인터페론-γ, TNF-α: 종양괴사인자-α. *정상 대조군과의 유의성 있는 차이(P<0.05). # MOG 단독처리와 유의성 있는 차이(P<0.05).
도 18은 성장인자 및 영양인자의 발현에 미치는 F3 세포 또는 F3.olig2 세포 이식의 영향을 측정한 결과이다. BDNF: 뇌유래 신경영양인자 (brain-derived neurotrophic factor); NGF: 신경성장인자 (nerve growth factor); CNTF: 섬모신경영양인자(ciliary neurotrophic factor); LIF: 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

A. 소아뇌성마비

1. F3. olig2 세포의 제작

불사멸화된 신경줄기세포주(NSC)인 HB1.F3 (F3로 표기)는 임신 15주의 인간 태아 뇌로부터 얻은 초대배양세포에 v-myc 종양유전자를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터로 감염시켜 확립하였다(Kim, 2004; Lee et al., 2007; Kim and deVellis, 2009). Olig2 과발현 인간 NSC 세포주 (F3.olig2)를 제조하기 위해, 먼저 Olig2 cDNA를 레트로바이러스 벡터 pLPCX의 다중클로닝자리에 라이게이션시켰다. PA317 암포트로픽 패키징 세포주(amphotropic packaging cell line)를 재조합 레트로바이러스 벡터로 감염시키고, 패키징 세포의 상등액을 취하여 F3 세포에 가하였다. 안정하게 형질전환된 콜로니를 푸로마이신(puromycin) 내성 여부에 의해 선별하였다(Ahn et al., 2008; Hwang et al., 2009).

2. 소아뇌성마비( CP ) 동물모델

임신한 Sprague-Dawley 랫드는 대한바이오링크(대한민국, 음성)으로부터 구입하였다. 구입한 동물(n=7/그룹)을 일정한 온도(23±3℃), 상대습도(50±10%) 및 12-시간 명/암 사이클의 조건하에서 유지하고, 동물에게 표준 설치류 먹이 및 정제수를 자유롭게 급여하였다. 신생동물을 자연분만을 통해 수득하고, PND7의 수컷 새끼를 HIL(저산소증-허혈증-LPS)을 수행하였다; 즉, 왼쪽 경동맥을 폐쇄하고 8％ 산소/92％ 질소 인큐베이터(36℃)에 2시간 동안 두었다(Park et al., 2010). 마지막으로 새끼들을 1시간 회복시킨 후에 염증 유발을 위해 LPS를 복강내로 주입하고, 어미에게 되돌려 보냈다. 대조군 동물은 모의수술(sham operation) 대조군과 부형제 처리군으로 시행하여 나누었다.

3. F3. olig2 세포의 이식

HIL(저산소증-허혈증-LPS) 랫드에 대해, 시상봉합과 관상봉합의 접합점(bregma)으로부터 전방위/후방위 +1 mm, 오른쪽 측위 2 mm, 및 복부위 3 mm의 좌표상에서, F3.olig2 세포 (4 X 10⁵ 세포/랫드)를 뇌실안(icv)으로 주입하여 이식하였다. 랫드의 단일-용량 그룹의 경우 PND10에서만 1회 세포를 주입하였고, 반복-용량 그룹의 경우 PND10, PND17, PND27 및 PND37에서 반복하여 주입하였다.

4. LFB ( Luxol fast blue ) 염색

뇌손상을 확인하기 위해, HIL 랫드의 일부를 PVL 유도후 4일에 희생시키고 뇌조직을 10％ 파라포름알데히드 용액에서 고정시키고 파라핀 블록에 밀봉하였다. 5-마이크로미터 두께의 절편을 LFB으로 염색하고, 뇌량 및 내포를 포함하는 뇌실주위 백질영역에서의 탈수초화(demyelination) 및 저수초화(hypomyelination) 여부를 관찰하였다.

5. 신경행동기능의 측정

(1) 실린더 테스트( Cylinder test )

같은 측 뇌 손상에 의한 앞발의 사용 대칭성을 평가하기 위해서, 반대쪽 앞발의 비율을 PND14, PND20, PND30 및 PND40에 분석하였다. 각 실험동물을 유리실린더(직경: 21 cm, 높이: 34 cm)내에 3 분간 두고, 동물이 일어서는 행동 중 실린더 벽을 앞발로 접촉할 때 왼쪽(정상쪽), 오른쪽(손상된쪽), 또는 왼쪽과 오른쪽 앞발을 동시에 사용 비율을 기록하였다. 앞발 사용 선호도는 [(정상 앞발 - 손상된 앞발)/(정상 앞발 + 손상된 앞발 + 양쪽 모두) X 100％]으로 계산하여 산출하였다.

(2) 회전봉운동시험 ( rota - rod performance )

운동균형 및 근협조운동능은 로타-로드 시스템(Rota-rod system; Panlab Technology, Barocelona, Spain)을 사용하여 PND14, PND20, PND30 및 PND40에서 측정하였다. 랫드를 12 rpm의 일정한 속도로 회전하는 막대상에 두고, 랫드가 막대로부터 떨어지는 시간을 측정하여 기록하였다. 회전봉 위에서 떨어지지 않고 머무르는 시간의 평균을 3회의 연속 측정값으로부터 산출하였다.

(3) 자발운동량( Locomotor activity ) 측정시험

자발운동성 및 탐험 행동은 CCTV (Samsung, Changwon, Korea)에 연결된 비디오 추적기(Smart v2.5; Panlab Technology)를 사용하여 PND14, PND20, PND30 및 PND40에서 측정하였다. 랫드의 새끼들을 흐릿한 불빛의 조용한 방에 두고, 움직임의 종류, 즉 휴식, 느린 움직임 및 빠른 움직임에 대한 시간을 5분간 측정하여 기록하고, 이들 시간의 비율을 분석하였다.

6. 학습 및 기억 기능의 측정

(1) 수동회피분석( Passive avoidance performance )

기억습득능 평가를 위해 PND41-PND44에 4일 연속으로 하루에 1회 셔틀박스(ENV-010MD; Med associates Inc., Vermont, USA)를 이용한 실험을 수행하였다. 셔틀박스 기구는 명실(light chamber)과 암실(dark chamber)의 2개의 방으로 구성되어 있고, 명실은 램프가 설치되어 있으며, 암실의 경우는 전기충격을 가할 수 있는 철망바닥이 설치되어 있다. 길로틴 도어(guillotine door)를 통해 명실로부터 암실로 들어서는 랫드에 전기충격(1 mA를 5초간)을 가하여 분석을 수행하였다. 4일간의 실험 동안에 명실에 머무르는 시간을 기록하였다. 머무르는 시간의 최종 기간은 300초로 정하여 최대 기억 습득 기준으로 규정하였다.

(2) 수중미로실험 ( Morris water - maze performance )

공간기억능의 평가를 위해, 랫드를 수중미로실험기(Smart v2.5; Panlab Technology)에 의한 실험을 수행하였다. 수중미로실험은 22±2℃의 수온으로 유지되는 물로 채워진 원형 수조(직경 180 cm, 깊이 27 cm)에서 수행하였다. 수조는 4개의 사분면으로 나누고 숨겨진 탈출 플랫폼(직경 10 cm, 높이 26 cm)을 한 사분면의 중앙에 수면 2 cm 아래로 잠기도록 설치하였다. 미로에 대해 몇 가지의 외부 신호에 기초하여 물 표면상의 백색 스티로폼 입자(직경 5 cm)에 의해 감추어진 플랫폼을 찾는 실험을 PND41로부터 하루 1회 총 4회 실험을 행하였다. 실험동안 신호를 준 위치는 변경하지 않았다. 실험동안의 플랫폼 상으로 탈출하는데 소요되는 탈출 지연 시간을 기록하였다.

7. 이중 면역 염색

이식된 F3.olig2 세포의 분포 및 생존 여부를 조사하기 위해, 랫드의 뇌를 10％ 파라포름알데히드 용액으로 관류-고정하였고, 동일한 용액을 사용하여 48시간 동안 후-고정한 후에, 30％ 수크로오스 용액에서 72시간 동안 냉해방지 과정을 행하였다. 30μm 두께의 관상면 냉동 절편을 준비하고, 각각 인간 유래 세포 및 희돌기교세포에 대한 마커로서 인간 미토콘드리아(hMito) 및 Oig2 또는 MBP에 대한 이중면역염색을 실시하였다. 뇌 절편은 hMito에 대한 1차 항체(1:100, mouse monoclonal, Chemicon, Temecula, USA), 및/또는 Olig2에 대한 1차 항체(1:200 rabbit polyclonal, Chemicon) 또는 MBP에 대한 1차 항체(1:400 rabbit polyclonal, Chemicon)와 4℃에서 하룻밤 반응시키고, Alexa Fluor-488 또는 594가 결합된 2차 항체(1:1,000, Molecular Probes, Eugene, USA)와 상온에서 2시간 반응시켰다. 미엘린(myelin)의 온전성 여부를 검사하기 위해, MBP에 대한 면역염색을 MBP 항체(1:400 rabbit polyclonal, Chemicon)를 1차 항체로 사용하여 행하였다. Alexa Fluor-594가 결합된 2차 항체(1:1,000, Molecular Probes, Eugene, USA)를 사용하여 Olig2 면역 염색을 행하였다. 모든 샘플들은 염색 직후에 평가하였고, 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 통해 사진을 촬영하였다(LSM710; Zeiss, New York, USA).

8. 통계분석

데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. 행동측정 데이터에 대한 그룹간 비교에서 통계학적 유의성은 일원변량분석(ANOVA) 및 Tukey’s 다중-비교 테스트로 결정하였다. P<0.05의 결과를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

B. 다발성축삭경화증

1. F3. olig2 세포의 제작

인간 희돌기교전구세포로서 F3.olig2 세포는 상기 소아뇌성마비에서의 F3.olig2 세포의 제작에서 설명된 내용과 동일한 방법으로 제작하였다.

2. 다발성축삭경화증 동물모델 ( EAE , Experimental autoimmune encephalomyelitis)의 유도 및 F3. olig2 세포의 이식

6주령 수컷 C57B/6 마우스를 대한바이오링크(충북음성, 대한민국)로부터 구입하였다. 구입한 동물은 일정한 온도(23±3℃), 상대습도(50±10％) 및 12-시간 명/암 사이클의 조건으로 조절되는 환경하에서 유지하였다. 동물에게 표준 설치류 먹이(대한바이오링크)를 급여하였다. 7주령 동물에서 EAE의 유도는 300 μL의 PBS내의 300 μg의 정제된 미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG, myelin oligodendrocyte glycoprotein) 펩티드 (Ana Spec Inc., Fremont, CA, USA) 및 1.2 mg의 결핵균(M. tuberculosis; stain H37RA)(Difco, Detroit, MI, USA)과 면역보조제(동일 부피)를 포함하는 에멀젼을 주입하여 피하 면역화에 의해 행하였다. 또한, 0.1 mL의 PBS내의 300 ng의 백일해균 (Bordetella pertusis) 독소 (Sigma-Genosys, Cambridge, UK)를 0일 및 2일에 정맥내 주사하였다. EAE의 임상증상 점수(clinical score)는 다음의 기준에 따라 50일까지 매일 기록하였다: 등급 0 (증상 없음), 등급 1 (꼬리 근육 탄력성 일부 소실), 등급 2 (꼬리 근육 탄력성 소실), 등급 3 (뒷다리 약함 및/또는 구르기 어려움), 등급 4 (뒷다리 마비), 등급 5 (4개 다리 마비), 및 등급 6 (EAE에 의한 사망) (Einstein et al., 2006, 2007; Constantin et al., 2009; Lu et al., 2009; Gordon et al., 2010). MOG 주입 6일 후에, F3 또는 F3.olig2 세포 (2 mL의 식염수내의 1 X 10⁶ 세포/마우스)를 정맥을 통해 이식하였다.

3. 염증반응에 대한 평가

EAE 동물은 세포이식 후 44일 (MOG 주입후 50일)에 희생시키고, 면역시스템의 반응을 평가하기 위해, 비장, 흉선 및 림프절의 중량을 측정하였다. 흉부 척수는 10％ 중성 포르말린에서 고정시키고, 파라핀 봉매 절편과 동결절편은 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 면역조직화학을 행하여 병리학적 변화 및 염증세포의 침윤을 조사하였다. 척수내의 T 세포 및 대식세포는 면역조직화학에 의해 확인하였다. 척수의 동결절편(30μm 두께)은 항-마우스 CD3 항체 (1:1,000, 랫드 폴리클로날, Serotec, Bicester, UK) 및 랫드 항-마우스 Mac3 항체 (1:100, 랫드 폴리클로날, Pharmingen, San Diego, CA, USA)로 상온에서 1시간 반응시켰다. 절편은 비오틴 결합 2차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 반응시키고, 아비딘-비오틴 복합 키트 (Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 처리한 후에, 디아미노벤지딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 반응시켰다. 척수내에서의 염증성 세포는 X200 배율의 광학현미경을 사용하여 계수하였다.

4. 척수 손상에 대한 평가

척수의 축삭 손상 및 탈수초는 EAE 유발 후 50일 시점에서 평가하였다. 파라핀-봉매된 척수 절편(4 μm 두께)은 크레실 바이올렛 또는 LFB (Luxol fast blue)으로 염색하였다. 축삭 손상에 대한 평가는 크레실 바이올렛으로 염색한 후 현미경하에서 축삭 벌브, 회전타원체, 타원체, 부풀음 또는 영양실조성 축삭 및 축삭 손실과 같은 병리학적 변화에 기초하여 수행하였다. 미엘린의 파괴 및 손실에 대해서는 LFB 염색상의 분절화 또는 약해짐을 검사하여 평가하였다.

5. 이식된 F3. olig2 세포의 분포, 성숙화 및 분화 측정

척수내에서 이식된 F3.olig2 세포의 분포를 확인하고 분석하기 위해서, 동결절편을 인간 미토콘드리아에 대한 특이 항체 (hMito; 1:100, 마우스 모노클로날, Milipore, Molsheim, France) 및/또는 Olig2에 대한 특이 항체 (1:100, 토끼 폴리클로날, Milipore)로 2중 면역염색하였다. 절편을 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 반응시키고, Alexa Fluor-488 또는 594가 결합된 2차 항체 (1:200, Invitrogen, Cergy Pontoise, France)와 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이식된 F3.olig 세포의 희돌기교세포로의 성숙을 평가하기 위해서는 척수 절편을 항-hMito 항체 및 항-MBP (myelin basic protein) 항체 (1:200, rabbit polyclonal, Milipore)을 사용하여 이중 면역염색을 시행하였고, 이식된 F3.olig2 세포의 신경세포로의 분화를 평가하기 위해서 척수 절편을 항-hMito 항체 및 항-NF (neurofilament) 항체 (1:200, 토끼 폴리클로날, Milipore)를 사용하여 이중 면역염색을 수행하였으며, 이식된 F3.olig2 세포의 성상세포로의 분화를 평가하기 위해서는 척수 절편을 항-hMito 항체 및 항-GFAP (glial fibrillary acidic protein) 항체 (1:200, 토끼 폴리클로날, Milipore)를 사용하여 반응시켰다.

6. 중추신경계 및 말초에서의 사이토카인에 대한 분석

염증 반응에 관련된 중추신경계 및 말초에서의 사이토카인을 분석하기 위해서, 척수 및 림프절에서의 Th1 및 Th2 사이토카인을 Bio-plex 사이토카인 분석 키트(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 간략하게 설명하면, 항-사이토카인 항체가 부착된 비드를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 넣고, 진공 여과에 의해 제거하였다. 이어서, 샘플, 검출항체, 및 스트렙타비딘-PE를 순차적으로 첨가하고, 300 rpm에서 혼합하면서 30분간 반응시켰다. 최종 샘플을 Bio-plex 어레이-시스템을 사용하여 즉시 분석하고, 사이토카인의 농도를 Bio-plex 소프트웨어(Bio-Rad)를 이용해 자동 산출하였다.

7. 신경영양인자( neurotrophic factor )의 발현 측정

척수를, 10배 부피의 0.5 M Tris-HCl 완충액(pH6.8)내에서 균질화시키고, 상등액을 얻기 위해 4℃에서 13,500 rpm으로 6분간 원심분리하였다. 척수 균질물은 10％ SDS 및 10％ 암모늄 퍼설페이트를 포함하는 Tris 완충액내에서 95℃에서 5분간 끓여서 변성시키고, 10％ SDS-폴리아크릴아미드젤상에서 전기영동에 의해 분리하고, 20％ 메탄올, 1％ SDS 및 192 mM 글리신을 포함하는 25 mM Tris 완충액내에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드막상으로 옮겼다. Tris-buffered saline-Tween 20 (TBS-T; 20 mM Tris, pH7.6, 137 mM NaCl and 0.1% Tween 20)내의 5％ 탈지유로 2시간 동안 블로킹한 후에, 상기 막을 뇌유래 신경영양인자(BDNF; 토끼 폴리클로날), 신경성장인자(NGF; 토끼 폴리클로날), 섬모신경영양인자(CNTF; 폴리클로날) 및 백혈병억제인자(LIF; 폴리클로날)에 대한 항체들 (1:500 in 1％ BSA; Santa Cruz Biotechnology, Delaware, CA, USA)과 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 막을 TBS-T으로 세정한 후에, 양고추냉이 퍼옥시다아제를 갖는 2차 항체 (1:200 in 2％ 탈지유; Santa Cruz Biotechnology)와 상온에서 2시간 반응시켰다. 막은 ECL (electrochemiluminesence) 용액 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 반응시켰다.

8. 통계분석

데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. 임상점수 및 기관중량에 대한 통계학적 분석은 일원변량분석(ANOVA) 및 Tukey’s 다중-비교 테스트로 행하였다. 사이토카인 농도, 침투된 T 세포 및 대식세포를 계수하기 위해서 Mann-Whitney U-테스트를 사용하였다. 각 군사이의 유의성 있는 차이는 P<0.05으로 결정하였다.

실험결과

A. 소아뇌성마비

1. HIL -유도된 저수초화 ( hypomyelination )

LFB 염색결과 HIL(저산소증-허혈증-LPS) 유발을 위해 왼쪽 경동맥을 결찰시킨 반대측인 오른쪽 뇌반구에서 뇌량, 피질하백질부 및 내포내에서 주로 관찰되었다(도 2의 패널 A - C). 경동맥 결찰과 같은 쪽인 왼쪽 반구에서 뇌실주변부는 비교적 약한 미엘린이 관찰되어(도 2의 패널 D - F), 혈관결찰 반대쪽 미엘린의 심한 손실 및 중성호성백혈구의 연화증을 암시하였다. 이러한 심각한 탈수초화는 현저한 신경행동적 이상을 보여주는 편측 및 양측 경동맥결찰 모델을 사용하여 행한 선행 실험에서 얻은 결과와 유사하였다(Park et al., 2010).

2. 신경행동손상에 미치는 이식된 F3. olig2 세포의 영향

실린더 테스트에서, 정상 동물은 PND14, PND20, PND30 및 PND40에서 행한 실험에서 왼쪽 앞발과 오른쪽 앞발을 거의 동일한 비율 50:50％으로 사용하였다(도 3). 그러나, PND7에서 HIL을 행한 랫드에 대해 PND20, PND30 및 PND40에서 행한 실험 결과. 반대측 앞발의 사용이 현저하게 감소하였다(<40％). 그러나, PND10 시점에서 F3.olig2 세포로 1회 이식하고, PND30-PND40의 시점에서 측정한 결과, 상기와 같은 반대측 앞발사용의 감소가 거의 정상 수준까지 회복되었다. HIL에 의해 유도된 반대측 앞발의 신체적인 기능손실은 PND10, PND17, PND27 및 PND 37에서 F3.olig2 세포를 반복적으로 이식함에 의해서도 유사한 정도로 회복되었다.

3. 회전봉에서의 머무름 시간( latency time ) 측정 결과

정상동물의 12-rpm 회전봉(rota-rod)상에서의 머무름 시간은 PND14에서 평균 12.5초에서 PND30 - PND40에서 270-290초로 동물이 성장에 따라 점진적으로 증가하였다(도 4). 그러나, HIL에 의해 초래된 운동기능과 근협조운동능의 손상에 의해 머무름 시간이 PND14에서 35％ 및 PND20 - 40에서 65-70％으로 급격하게 감소되었다. 하지만, 상기와 같이 급격하게 감소된 회전봉 수행능은 PND10에서의 F3.olig2 세포 1회 이식에 의해 모든 시점에서 거의 완전히 회복되었다. 또한, HIL 랫드의 기능손상은 후속의 F3.olig2 세포의 반복된 이식에 의해 현저한 정도로 회복되었다.

4. 자발운동량( locomotor activity ) 측정 결과

정상동물에서는 PND14 - PND40에서 모든 전체 활동량 분석에서 움직이는 시간이 움직이지 않고 휴식하는 시간보다 더 길었다(도 5). 그러나, HIL 시행 랫드에서 휴식시간이 크게 증가하여, PND14 PND40 전기간에 걸쳐 느리게 움직이는 시간 및 빠르게 움직이는 시간이 크게 감소하였다. 이에 반해, F3.olig2 세포로 1회 이식한 경우에 HIL에 의해 유도된 전체 운동량의 감소가 PND20에서 거의 완전하게 회복되었다. 이러한 회복활성은 PND10, PND17, PND27 및 PND37에서 F3.olig2 세포를 반복적으로 이식한 경우에도 얻어졌다.

5. 인지기능손상에 미치는 이식된 F3. olig2 세포의 영향

PND7에서 HIL를 시행하고, PND41 - PND44에서 수동회피반응분석 및 수중미로실험을 통해 평가한 결과 학습 및 기억 기능이 심각하게 손상되었음을 확인하였다. 즉, HIL을 시행한 랫드는 반복된 수동회피반응분석 및 수중미로실험에서 각각 머무름 시간의 증가가 크게 지연되었고, 긴 머무름 시간을 보였으나, 정상동물에서는 4회째 시도에서 완전한 기억 습득이 이루어졌다(도 6). 이에 반해, F3.olig2 세포로 PND10에서 1회 또는 PND10, PND17, PND27 및 PND37에 4회 이식한 경우, 수동회피반응분석에서 손상된 학습 및 기억능력이 현저히 회복되었다. 또한, 수중미로실험에서 F3.olig2 세포이식에 의해 인지기능손상이 개선됨을 확인하였는데, 이 수중미로실험에서는 반복하여 이식한 경우가 단일회 이식한 경우에 비해 효과가 더 우수하였다.

6. 이식된 F3. olig2 세포의 분포 및 성숙화

hMito에 대한 면역염색을 행한 결과 PND10에서 icv 이식된 hMito-양성 F3.olig2 세포는 손상된 백질부에서 발견되었는데(도 7의 패널 A), 이는 F3 NSC에서 보여지는 바와 같이 손상 부위 친화적 특성을 암시한다(Park et al., 2011). 또한, hMito-양성 세포는 Olig2를 강하게 발현하고 있음을 확인하였는데(도 7의 패널 B), 이는 hMito 및 Olig2에 대한 이중면역염색으로부터 이식된 세포가 희돌기교세포임을 확인하여 주는 결과이다. 또한, hMito 및 MBP에 대한 면역염색에 의해 확인되는 바와 같이 이식된 세포가 희돌기교세포로 성숙되었음을 확인하였다(도 7의 패널 C).

7. 탈수초화에 미치는 이식된 F3. olig2 세포의 영향

정상동물에서는 희돌기교세포 미엘린의 MBP에 대한 강한 면역반응성이 뇌량 및 내포와 같은 백질에서 관찰되었다(도 8). 즉, MBP-면역반응성은 PND45에서 관찰되는 바와 같이 HIL 동물의 뇌량 및 내포 모두에서 현저하게 감소되어, 심각한 탈수초화가 진행되었음을 암시하였다. 그러나, HIL에 의해 유도된 MBP의 손실은 PND10에서 F3.olig2 세포의 단일 이식에 의해 현저하게 약해졌다. MBP 고갈에 미치는 더욱 현저한 보효 효과는 F3.olig2 세포를 PND10, PND17, PND27 및 PND37에 반복 이식한 경우에 더 확실하게 나타났다.

B. 다발성축삭경화증

1. EAE 마우스 임상 증상에 미치는 이식된 F3. olig2 세포의 영향 평가 결과

EAE 유발된 마우스는 MOG 주입후 평균 9.23일 시점에 신경행동학적 손상이 개시되어, 유발 후 15-20일 경에 최대 점수 2.80에 도달하였다(도 9). 이러한 증상들은 F3 또는 F3.olig2 세포를 6일에 이식함으로써 증상의 개시 시점에는 영향이 없었으나, 최대 점수가 각각 2.35 및 1.85으로 낮아져 현저한 증상완화 효과가 나타났다. 주목할 만한 것은 임상증상이 F3.olig2 세포를 이식한 경우 신속하게 회복되었는데, 50일간의 관찰기간동안 축적 점수는 부형제 처리군의 89.07점으로부터 F3.olig2 세포 이식군에서 37.80점으로 낮아졌으며, 이러한 F3.olig2 세포 이식군의 임상점수는 F3-처리된 동물의 점수 70.69점 보다 우수하였다.

2. 척수 손상에 미치는 영향 평가 결과

대조군 동물에서의 정상 모습(도 10의 패널 A)와 비교하여 회백질에서 축삭 수축을 보여주는 바와 같이(도 10의 패널 B) MOG 주입에 의한 척수 손상이 확인되었다. 이러한 EAE 마우스에서의 축삭 변화는 크레실 바이올렛 염색에 의해서도 확인되었다(도 10의 패널 F). 또한, MOG-주입한 척수의 회백질은 LFB 염색에서 염색 강도가 매우 약하게 나타나는데(도 10의 패널 J), 이는 심각한 탈수초화를 나타내는 것이다. 그러나, 흥미롭게도 F3 세포를 이식한 경우, H-E과 크레실 바이올렛 염색에 의해 확인되는 축삭 수축(도 10의 패널 C 및 G)과, LFB 염색에 의해 확인되는 탈수초화(도 10의 패널 K)가 현저하게 약해졌다. F3.olig2 세포를 사용한 경우에 축삭 및 미엘린이 정상적으로 유지되고 있다는 것을 암시하는, 축삭 수축의 최소화 및 LFB 염색 강도 회복(도 10의 패널 D, H 및 J)을 나타냄으로써, 축삭 및 미엘린 변형에 대해 더 우수한 회복 효과가 있음이 확인되었다.

3. 염증반응에 대한 영향 평가 결과

주변 T세포 및 대식세포의 척수로의 침투 및 활성화를 보이는 염증과정은 EAE에서 부정적 임상 증상 발현과 미엘린 및 축삭의 심각한 병리적 변화와 관련되어 있다. 정상세포의 관찰결과(도 11의 패널 A 및 E)와 비교하여 볼 때, MOG으로 면역화한 경우 T세포의 CD3 및 대식세포의 Mac3에 대한 면역조직화학을 통해 회백질에서 염증 세포의 현저한 침투(도 11의 패널 B 및 F)가 관찰되었다. 또한, CD3 및 Mac3 면역반응성은 F3 또는 F3.olig2 세포로 처리한 동물의 척수 회백질에서 더욱 낮게 나타났으며(도 11의 패널 C 및 G), F3.olig2 세포 이식의 경우가 F3 세포 이식의 경우에 비해 더 우수한 효과를 보였다(도 11의 패널 D 및 H). 정량적 평가에서, MOG-주입한 EAE 마우스에서 CD3-양성 T세포 및 Mac3-양성 대식세포의 수는, 대조군의 수준 (CD3의 경우 0.51 세포/mm² 및 Mac3의 경우 0.10 세포/mm²)에 비해, 각각 15 배(0.76 세포/mm²) 및 6 배(0.60 세포/mm²) 증가하였다(도 12). MOG로 유도된 염증세포의 침윤은 F3 세포 또는 F3.olig2 세포에 의해 현저히 감소하였으며, F3.olig2 세포의 항염증 효과가 가장 크게 나타났다.

4. 이식된 세포의 분포 및 분화 측정 결과

인간 F3 세포(1 X 10⁶ 세포/마우스)를 EAE 마우스에 정맥을 통해 이식한 후 44일 시점에, 69 세포/mm²가 흉부 척수에서 관찰되었다(도 13). 주목할 만하게도, 더 많은 수의 F3.olig2세포 (207 세포/mm²)가 척수에서 검출되었는데, 이는 F3.olig2 세포가 F3 세포보다 이동활성이 더 높다는 것을 암시한다. 또한, 분포 패턴의 면에서, 대부분의 F3.olig2 세포는 척수의 회백질 부분과 백질 및 회백질의 경계 부분과 같은 병소 부위에서 관찰된 반면, F3 세포는 병소강(lesion cavity) 주위 또는 백질의 내부에 위치하였다. EAE 마우스에 F3 세포를 정맥내 이식한 후, 세포의 일부는 희돌기교세포(Olig2-양성) 및 MBP (myelin basic protein)을 생성하는 성숙세포 (MBP-양성)으로 분화되었다(도 14). 또한, 세포들은 신경세포(NF-양성)으로 분화되었으나, 성상교세포(GFAP-양성)로는 분화되지 않았다. 이식된 F3.olig2 희돌기교전구세포도 성숙되어 MBP를 발현하였다(도 15). F3 세포와 비교하여, F3.olig2 세포는 신경세포 또는 성상교세포으로 분화되지 않았는데, 이는 희돌기교전구세포는 역분화과정을 행하지 않는다는 것을 암시한다. 분화의 비율 측면에서 보면, 이식된 인간 (hMito-양성) F3 신경줄기세포의 18.55％가 뇌 환경에서 NF-양성 신경세포로 분화되었고, 세포의 4.75％만이 희돌기교세포 계열 (Olig2-양성)로 분화되었으며, 3.15％가 MBP를 발현하는 희돌기교세포로 성숙화되었다(도 16의 패널 A). F3는 GFAP-양성 성상세포로 분화하지 않았다. 이와 비교하여, 이식된 F3.olig2 희돌기교전구세포의 90.50％가 Olig2를 발현하였고, 이들의 32.12％가 성숙화(MBP-양성)되었다(도 16의 패널 B). 주목할 만한 점은 F3.olig2 세포는 신경세포 또는 성상교세포로 분화하지 않았다.

5. 염증성 사이토카인에 미치는 영향 평가 결과

메카니즘으로서 면역-매개된 염증성 반응을 규명하기 위해, 척수와 주변 림프절에서 Th1/Th2 세포-매개된 사이토카인을 Bio-plex 분석을 통해 조사하였다. 양쪽 기관 모두에서, T세포 활성화에 관련된 인터루킨-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-10 및 인터페론-γ (IFN-γ)와 같은 다양한 사이토카인의 생성이 MOG 주입한 후 50일 시점에서 크게 증가하였다(도 17). TNF-α (tumor-necrosis factor-α)도 척수에서 크게 증가하였는데(도 17의 패널 A), 이는 대식세포를 포함하는 염증성 세포의 활성화를 암시하는 것이다. F3 세포 및 F3.olig2 세포는 척수에서 T세포 및 대식세포에 의해 생성되는 사이토카인을 하향 조절하였으며(도 17의 패널 A), F3.olig2 세포가 F3 세포에 비해 더 효과적으로 작용하였다. 주목할 만한 점은, F3.olig2 세포는 림프절에서 사이토카인을 감소시켰으나, F3 세포는 이러한 작용을 나타내지 않았다는 점이다(도 17의 패널 B). 특히, F3.olig2 세포는 IL-2 및 IFN-γ와 같은 Th1 세포-매개성 사이토카인을 현저하게 하향 조절함으로써 Th1/Th2 (IFN-γ/IL-4)의 비율을 감소시켰는데, 이는 Th2 반응으로의 이동을 암시하는 것이다.

6. 신경영양인자( neurotrophic factor )발현의 조절 결과

메카니즘에 대한 추가 연구로서, 면역조절, 신경보호 및 신경재생 활성을 보유하는 성장인자 및 영양인자를 측정하였다. EAE 마우스의 척수에서 BDNF, NGF, CNTF 및 LIF의 발현이 감소하였다(도 18). 그러나, F3 및 F3.olig2 세포의 이식에 의해 성장인자/영양인자의 발현이 상향 조절되었고, 특히 NGF 및 CNTF 발현은 F3 세포 이식된 동물에서 보다 F3.olig2 세포 처리된 마우스에서 더 높게 나타났다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환 치료용 조성물로서, 상기 희돌기교전구세포는 Olig2 유전자 인코딩 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 줄기세포이고, 상기 중추신경계 질환은 소아뇌성마비(Cerebral palsy, Periventicular leukomalacia), 다발성축삭경화증(Multiple sclerosis), 척수손상(Spinal cord injury), 루게릭병(Lou Gehrig Disease) 또는 뇌외상인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 초대 배양(primary cultured) 줄기세포 또는 이의 유전적으로 변형되어 불사멸화된(immortalized) 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 신경행동기능(Neurobehavioral function) 장애 또는 인지기능(Cognitive function) 장애 치료용 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 희돌기교전구세포는 Olig2 유전자 인코딩 핵산 분자를 발현가능한 형태로 포함하는 벡터로 형질전환된 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 줄기세포는 초대 배양(primary cultured) 줄기세포 또는 이의 유전적으로 변형되어 불사멸화된(immortalized) 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 신경행동기능 장애 또는 인지기능 장애는 뇌에서 저산소증 또는 허혈증 또는 이들의 조합에 의해 유도된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 인지기능 장애는 학습능력 장애 또는 기억력 장애인 것을 특징으로 하는 조성물.