CN116669747A - 具有正常核型的新型nr1 es源性神经干细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与NR1ES源性神经干细胞有关的组合物和方法。所述细胞可用于不良神经系统病症(包括但不限于卒中)的治疗方法。

Description

具有正常核型的新型NR1 ES源性神经干细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年10月12日递交的第63/090,671号美国临时专利申请的利益和优先权，所述临时专利申请的全部内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。
背景技术
迄今为止，尚无有效的治疗方法能够改善卒中引起的剩余结构和功能缺陷。卒中是成年人残疾的首位病因，在任何神经障碍(包括阿尔茨海默病、创伤性脑损伤、癫痫和帕金森病)中，卒中的年发病率最高。美国每年有79.5万人遭受卒中，目前约700万的美国人因患有卒中而致残。卒中患者每年在卒中方面的花费超过340亿美元，预计随着普通人群年龄的增长，这些数字还会上升。由于急症医疗管理的改善，卒中死亡率正在下降，从而将卒中从急症杀手变为慢性致残性疾病。然而，几乎没有针对这一卒中慢性期的治疗方案。这种恢复治疗仍然侧重于物理医学——职业疗法、物理疗法和言语/认知疗法。然而，这些方法耗时长、成本高，对功能恢复的益处非常有限，并且在卒中后6个多月无法有效地进一步改善神经功能。这些事实定义了一种常见、破坏性极大、无现成药物治疗的慢性疾病，并将卒中恢复确定为“未满足的医疗需求”的主要领域。
发明内容
本发明提供了与NR1 ES源性神经干细胞相关的组合物和方法，所述细胞表达在恢复受试者神经功能方面具有活性的营养因子，其中，所述营养因子可增强内源性神经修复过程。所述细胞并未发生基因操纵或改变。所述细胞具有正常核型。所述细胞的其他益处包括解冻后和移植前活力提升(12小时活力)；低剂量疗效，以及稳健、可扩展的cGMP生产工艺。
所公开的NR-1细胞可用于不良神经系统病症(包括但不限于卒中或创伤性脑损伤)的治疗方法。在一些方法中，NR1细胞在大脑内递送到需要治疗的患者体内。可以通过将有效剂量的细胞植入患者的大脑皮层中或其附近来施用NR-1细胞，其中，受试者的大脑皮层可包括前额皮层、运动联合皮层、初级运动皮层或初级体感皮层中的任何一种。例如，可以采用皮层或皮层下给药，其中，大脑皮层下区域可以是海马体、杏仁核、泛杏仁核、屏状核、基底神经节或基底前脑中的任何一种。
在一些实施例中，将有效剂量的NR1细胞递送到患者进行卒中治疗。在其他实施例中，将有效剂量的NR1细胞递送到患者，用于治疗从缺血性卒中、慢性出血性卒中、亚急性缺血性和出血性卒中患者、创伤性脑损伤、脊髓损伤、帕金森病、ALS(路格瑞氏症)和阿尔茨海默病患者中选择的神经系统病症。
NR1细胞可分泌通过增强多种天然(内源性)分子和细胞机制(包括免疫系统的调节、新生血管和改善神经网络兴奋性/抑制性平衡)来改善神经功能的因子。NR1细胞并非通过神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞或大脑中其他细胞的整合和细胞替代进行工作。
NR1 ES源性神经干细胞可表征为表达ColA1、LGALS1、TGF-B3、TIMP1、COL6A1、COL3A1、MMP2、SPARC、NRG3、SDF1(a)、半乳糖凝集素1、FGF18、CSF3、CCL2(又名MCP-1)、FGF7、FGF17、PAI1/丝氨酸蛋白酶抑制因子1、VEGF-A、MCP1(CCL2)和/或SDF1α中的一种或多种或其组合。所表达的营养因子可以通过增加大脑皮层和/或皮层下区域内的血流量和血管信号以及增加结构可塑性来增强神经新生血管修复过程。例如，增加的结构可塑性可涉及突触发生、树突发芽、轴突发芽等。例如，营养因子可包括生长因子、细胞因子和/或细胞外基质蛋白的组合。所述细胞外基质蛋白可以是ColA1、LGALS1、TGF-B3、TIMP1、COL6A1、COL3A1、MMP2、SPARC、NRG3、SDF1(a)、半乳糖凝集素1、FGF18、CSF3、CCL2(又名MCP-1)、FGF7、FGF17、PAI1/丝氨酸蛋白酶抑制因子1、VEGF-A、MCP1(CCL2)和/或SDF1α中的任何一种或其组合。
在一些实施例中，细胞的有效剂量为约1×106个细胞/个体剂量-约108个细胞/个体剂量，并且可以是约2.5×106/剂量-约2×107/剂量，例如约2.5×106/剂量、约5.0×106/剂量、约10×106/剂量和约20×106/剂量。递送细胞的浓度可以是约106个细胞/ml赋形剂-约108个细胞/ml赋形剂，例如约8.3×106/ml赋形剂、约16.6×106/ml赋形剂、约33.3×106/ml赋形剂和约66.6×106/ml赋形剂。
在一些实施例中，提供一种具有正常核型的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞的隔离群体，所述细胞分泌营养因子，所述营养因子包括生长因子、细胞因子和/或细胞外基质蛋白的组合。在一些实施例中，所述NR1细胞源自具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞，所述具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞培养了至少15、16、17、18、19、20或更多代，从而表现出正常核型。
在一些实施例中，提供一种在限定的细胞培养条件下生产具有正常核型的人NR1ES源性神经干细胞的方法，其中，所述方法包括：(a)在不存在饲养细胞的情况下，在含有glutamax、N2添加剂和B27(不含RA、EGF、FGF、LIF和PHS)的培养基中的固态支撑体上培养人NR1 ES源性神经干细胞；从而在限定的细胞培养条件下体外产生人NR1 ES源性神经干细胞。
NR1 ES源性神经干细胞的给药可涉及将NR1 ES源性神经干细胞植入受试者的大脑皮层中或其附近，其中，受试者的大脑皮层包括前额皮层、运动联合皮层、初级运动皮层或初级体感皮层中的任何一种。所述大脑皮层下区域可以是海马体、杏仁核、泛杏仁核、屏状核、基底神经节或基底前脑中的任何一种。所述大脑皮层区域可以是前额皮层、运动联合皮层、初级运动皮层或初级体感皮层中的任何一种。可以在卒中或创伤性脑损伤后至少一周给药，并且可以在患有稳定型缺血性卒中引起的偏瘫的个体中给药，所述稳定型缺血性卒中在之前约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月和最多约60个月内发生。
结构可塑性增加可涉及突触发生、树突分支和轴突发芽中的任何一种。恢复后的神经功能可使上肢功能部分或完全恢复，例如抬起或举起受试者的手臂。例如，恢复神经功能可包括恢复行走或平衡能力，或逆转步态障碍、无法行走或失去平衡，其中，步态障碍包括行走速度下降、行走方式不对称、步长缩短、步宽增加、患肢摆动期延长、通过物理障碍的能力下降、根据地形变化调整行走的能力下降、节律性运动丧失、跨过横梁的能力减弱及其组合。逆转受试者行动障碍可包括提高行走速度、增加对称行走方式、提高步长、减小步宽、减少患肢摆动期的持续时间、提高通过物理障碍的能力、提高根据地形变化调整行走的能力、增加节律性运动、提高跨过横梁或梯子的能力中的任何一种及其组合。
通过在神经诱导条件下进行培养，祖细胞系产生了NR1，祖细胞系最初源自H9人胚胎干细胞(hESC)系。它是一种未经基因修饰的稳定细胞系。NR1可由NR1 cGMP主细胞库制成，并在向p30用药后产物的广泛传代中表现出一致的生长和质量属性。本次评估提升了对临床药物产品批次的信心，这些批次可以从MCB中仅扩增出3个传代。除了一致的生长特性外，保留在临床材料生产3个传代中的属性包括正常核型和低于0.01％的残留hESC水平。
在一些实施例中，采用一种或多种剂量的NR1对个体进行治疗，通过立体定向方式将NR1植入皮层下梗死区附近的灰质或白质部位。可采用单骨孔小骨窗开颅术，利用针道植入细胞，在损伤区周围，每个针道中的沉积深度各不相同。
在一些实施例中，脑损伤可位于受试者大脑皮层或皮层下区域外侧，例如，其中，脑损伤位于受试者大脑皮层或皮层下区域处或周围。
一种通过增加大脑皮层中的外源性营养因子，以增强受试者中的内源性神经修复过程，从而抑制、减少或逆转卒中后受试者运动缺陷的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的神经干细胞，所述神经干细胞表达营养因子，以便恢复受试者的神经功能，从而抑制、减少或逆转受试者的运动缺陷。
在一些实施例中，提供了一种通过增加大脑皮层中的外源性营养因子，以增强受试者中的内源性神经修复过程，从而治疗卒中后受试者运动缺陷的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的神经干细胞，所述神经干细胞表达营养因子，以便恢复受试者的神经功能，从而治疗受试者的运动缺陷。
在一些实施例中，提供了一种通过抑制、减少或逆转运动缺陷(例如由于卒中引起的运动缺陷)，减少或逆转受试者的运动缺陷，从而使因卒中而患有运动缺陷的受试者康复的方法。
附图说明
图1.畸胎瘤形成与H9和NR-1细胞含量的函数关系。
图2.原料药生产流程图。
图3.NR-1细胞培养和汇集流程图。
图4.运动不对称的抬高身体摇摆试验。
图5.感觉运动功能的平均神经功能评分测试。
图6.运动协调转棒测试。
图7.比较NR-1剂量的一段时间内的VP评分。
图8.比较NR-1剂量的触须-前爪(Vibrissae-Paw)反应测试。
图9.比较NR-1剂量的姿势-反射(Posture-Reflex)测试。
图10.比较NR-1剂量的改良神经功能评分测试。
图11.比较NR-1剂量效果的组织学载玻片。
图12.比较NR-1剂量效果的组织学载玻片。
图13.L2强度和反应曲线比较。
图14.NR1突触发生值。
图15.GO生物学过程图。
图16.移植后单核细胞和粒细胞图。
图17.通过M1和M2巨噬细胞进行细胞因子表达。
图18.通过M1和M2巨噬细胞进行细胞因子表达。
图19.未受刺激巨噬细胞的蛋白质表达。
图20.NR-1存活时间进程。
图21.基因表达评估。
图22.基因表达评估。
图23.PLX存在或不存在情况下的小胶质细胞。
图24.小胶质细胞组织学。
图25.脑组织学。
图26.Iba1和GFAP染色。
图27.T2 MRI分析。
具体实施方式
定义
在进一步描述本公开的实施例之前，应理解，本公开并不局限于所述的特定实施例，当然，实施例可能会有所变化。还应理解，由于本公开的范围将仅受所附权利要求书的限制，本发明中使用的术语仅旨在描述特定实施例，而非限制特定实施例。
除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。与本发明所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可用于本公开实施例的实践或测试。
必须注意，除非上下文另有明确规定，本发明和所附权利要求书中使用单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指称对象。因此，提及“一种化合物”不仅包括单一化合物，而且包括两种或多种化合物的组合，提及“一个取代基”包括单一取代基以及两个或多个取代基，等等。
在描述和要求保护本发明时，将按照如下所列的定义使用某些术语。应理解，本发明中提供的定义并非旨在相互排斥。因此，某些化学部分可能属于一个以上术语的定义范围。
本发明中使用的短语“例如(for example)”、“例如(for instance)”、“如(suchas)”或“包括(including)”旨在引入示例，进一步阐明更一般性的主题。这些示例仅作为理解本公开的辅助手段，而非旨在以任何方式限制本公开。
术语“活性剂”、“拮抗剂”、“抑制剂”、“药物”和“药理学活性剂”在本发明中可互换使用，以指代在向生物体(人或动物)给药时通过局部和/或全身作用诱导所需的药理学和/或生理学作用的化学材料或化合物。
本发明中使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等系指获得所需的药理学和/或生理学作用，例如降低病毒滴度。所述作用在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性作用，并且/或者在部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良作用方面可以是治疗性作用。本发明中使用的“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病或疾病症状在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生(例如，包括可能与原发性疾病相关或由原发性疾病引起的疾病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，即使疾病消退(例如降低病毒滴度)。
在本发明中，术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用且系指动物，包括但不限于人和非人灵长类动物(包括猿猴和人类)；啮齿动物(包括大鼠和小鼠)；牛科动物；马科动物；羊科动物；猫科动物；犬属动物；鸟类等。“哺乳动物”系指任何哺乳动物物种的一个或多个成员，例如包括犬属动物；猫科动物；马科动物；牛科动物；羊科动物；啮齿动物等，以及灵长类，例如非人灵长类和人。实验研究可采用非人动物模型(例如哺乳动物，例如非人灵长类、鼠类、兔类等)。
本发明中使用的术语“测定(determining)”、“测量(measuring)”、“评估(assessing)”和“测定(assaying)”可互换使用，并且同时包括定量和定性测定。
术语“多肽”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，系指任何长度的氨基酸的聚合形式，可包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或源性氨基酸以及具有经修饰肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和天然前导序列的融合蛋白(具有或不具有N端甲硫氨酸残基)；免疫标记蛋白；具有可检测融合配偶体的融合蛋白，例如包括作为融合配偶体的荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等的融合蛋白；等等。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”可互换使用，并且系指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、控制区、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线型或环状分子。
“治疗有效量(therapeutically effective amount)”或“有效量(efficaciousamount)”系指当向哺乳动物或其他受试者给药以治疗疾病、病症或紊乱时，足以实现对该疾病、病症或紊乱的治疗的化合物的量。根据化合物、疾病及其严重程度以及接受治疗的受试者的年龄、体重等，“治疗有效量”会有所不同。
本发明中使用的术语“单位剂型”系指适合作为人类和动物受试者的一次剂量的物理离散单位，每个单位含有预定数量的化合物，该化合物按照足以与药学上可接受的稀释剂、载体或溶媒联合产生所需作用的量进行计算。单位剂型的规格取决于所采用的特定化合物和要实现的作用，以及与宿主中每种化合物相关的药效动力学。
“药学上可接受的辅料”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的佐剂”系指可用于制备药物组合物的辅料、稀释剂、载体和佐剂，这些药物组合物一般安全无毒，无论从生物学上还是其他方面都能满足需要，并且包括可接受用于兽医以及人类药物用途的辅料、稀释剂、载体和佐剂。说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的辅料、稀释剂、载体和佐剂”同时包括一种或多种这类辅料、稀释剂、载体和佐剂。
本发明中使用的“药物组合物”旨在包括适合向受试者(如哺乳动物，特别是人类)给药的组合物。“药物组合物”一般是无菌的，优选地，药物组合物不含有能够在受试者体内引起不良反应的污染物(例如，药物组合物中的化合物是医药级化合物)。药物组合物可以旨在通过多种不同的给药途径(包括口服、口腔给药、直肠给药、胃肠外给药、腹腔给药、皮内给药、气管内给药、肌内给药、皮下给药等)向有需要的受试者或患者给药。
NR1细胞
NR1(神经再生1)细胞系是一种独特的研究性细胞治疗产品，旨在通过直接脑内注射治疗卒中和创伤性脑损伤的运动后遗症。这类运动缺陷的致残率极高，手臂和/或腿部运动控制的任何改善都会显著改善受试者的健康和生活质量。在动物卒中模型中，NR1已显示出改善运动功能控制的功效，并且NR1展示了出色的安全特性。
通过在神经诱导条件下进行培养，祖细胞系产生了药物产品NR1，祖细胞系最初源自H9人胚胎干细胞(hESC)系。它是一种未经基因修饰的稳定细胞系。NR1(药物产品)由NR1cGMP主细胞库(NR1 MCB)制成，并在向p30用药后产物的广泛传代中表现出一致的生长和质量属性。根据qPCR对Oct和Rex1的评估，除了一致的生长特性外，保留在临床材料生产3个传代中的属性包括正常核型和残留hESC水平。
所述药物(即NR1)是一款独特的胚胎干细胞源性产品，目前该产品正处于研发阶段，可用于治疗伴有运动缺陷的慢性缺血性皮层下卒中。由于卒中的核心由在没有血液流动的情况下不能存活的组织组成，在这个区域内，移植的细胞甚至无法短暂存活。因此，NR1的给药靶点是皮层下卒中附近脑组织的皮层下部分，在功能性人脑成像和非临床研究中，这一区域显示出其在组织修复和重组中的积极作用。这种给药与非临床药理学研究一致，在这些研究中，基于这些模型中预先确定的平均损伤尺寸和位置，确定注射坐标，从而将NR1直接递送到皮层下和皮层缺血性卒中啮齿类动物模型中的卒中损伤附近的组织中。利用该模型，动物模型的感觉运动和其他神经功能结果为阳性，表明大脑皮层下卒中组织受到刺激后可以至少部分恢复皮层下和皮层区域的神经功能。由于卒中后人的大脑中也会出现相同的活性并伴随神经回路的恢复和临床改善，因此提出本研究并设计了如下所述的辅助非临床研究。
NR1移植后显著增加了梗死周围皮层的运动回路活性，同时抑制连接的幅度减小，发病也有所延迟。NR1细胞通过从抑制性控制中释放梗死周围区域内的单个神经元来增加运动回路活性。NR1细胞可以影响神经元细胞的可塑性，例如，通过分泌因子，增强视网膜神经节神经元细胞(RGC)的突触发生。NR1移植与可塑性相关基因的表达有关。NR1细胞引起参与刺激成人神经前体细胞增殖、神经分化、直接参与神经元电生理特性的门控通道、轴突导向、轴突生成和突触发生的基因的特异性和差异性表达。
NR1分泌与大脑修复相关的蛋白质，包括细胞外基质(ECM)重塑(参与大多数大脑修复机制)以及与炎症和轴突导向相关的过程。具体而言，在体内卒中环境中，上调NRG3和TGFβ3。
NR1移植后的免疫应答将巨噬细胞从M1/促炎状态变为M2/抗炎状态。T2-FLAIR磁共振成像(MRI)可作为卒中受试者中NR1诱导的功能恢复的临床预测指标。T2-MRI FLAIR信号与炎症有关。它可与第二非侵入性成像模态(即转运蛋白18kDa(TSPO)的PET成像，称为TSPO-PET)配合使用。TSPO包括活化的免疫细胞，包括脑部驻留免疫细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞，以及浸润骨髓细胞，如单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞。健康大脑中的TSPO水平较低，但在炎症条件下，TSPO水平上调。因此，TSPO-PET放射性配体成为了有用的神经炎症指标。这些测定表明NR1具有促进卒中康复的免疫调节作用。
NR1细胞可引起参与刺激成人神经前体细胞增殖、神经分化、直接参与神经元电生理特性的门控通道、轴突导向、轴突生成和突触发生的基因的特异性和差异性表达。这些细胞通过从抑制性控制中释放梗死周围皮层中的单个神经元，以及通过分泌刺激突触发生的因子来调节可塑性，促成了卒中后梗死周围区域的可塑性。
在体内通过NR1高表达的大多数分泌性基因中的部分基因包括：Col1A1(1型胶原α1链)，其参与ECM组织，并能影响白细胞迁移和炎症4；LGALS1(半乳糖凝集素1)，已显示其在卒中后将巨噬细胞极化在体内转变为M2样(具有更强的抗炎作用)状态5；TGFβ3，其调节ECM形成并具有促炎和抗炎作用；TIMP1，一种参与ECM降解的MMP抑制剂。它还具有MMP非依赖性作用，并作为生长因子，在髓鞘修复中发挥作用。与可塑性有关的基因包括：COL6A1、COL3A1、MMP2、SPARC、NRG3和SDF1。
NR1由可扩增的均质长期体外培养物形成，这些培养物具有稳定性且能无限培养，表型没有变化，未失去核型稳定性。NR1生产过程无需重复使用hESC和分化为神经祖细胞，相反，在无饲养层的贴壁培养中，传代至15代(p15)时冻存的NR1主细胞库(MCB)小瓶在限定的培养基中解冻并扩增至p18，即可生产出NR1原料药(DS)。DS生产是连续过程(包括作为NR1 DP进行灌封和冻存)的一部分，因此任何NR1 DS小瓶都不会以这样的方式生产。
NR1生产
按照cGMP符合性原则，在cGMP NR1 MCB产生时开始进行NR1原料药和药物产品的生产。图2提供了NR1生产工艺的示例性“高水平”工艺流程图。在细胞扩增过程中，在单层暴露于胰蛋白酶之后，培养传代数增加一次；(例如，当接种第16代细胞，然后将其扩增为接近汇合的单层并进行胰蛋白酶化时，将由此产生的悬浮液视为第17代，依此类推)。在工艺流程图中，将原料药确定为“单元操作”栏5中的收获和第一次重悬步骤，并在当天连续处理原料药，以制备NR1。NR1药物产品由6×106个规定的传代NR1细胞组成，细胞冻存在1mL最终冻存配制物中，每瓶配制物由7.5％的二甲基亚砜(DMSO)、42.5％的ProFreeze和50％的完全生长培养基组成。
可以检测NR1批次的：1)无菌性(USP)，2)抑菌作用和抑真菌作用，3)支原体(USP)，4)支原体抑制，5)内毒素，6)体外的外源病毒，7)细胞活力，8)细胞计数(强度)，9)核型，10)同一性(通过流式细胞术表达CD73)，11)纯度(通过流式细胞术表达β-Tubulin-III)，12)杂质(通过流式细胞术表达Tra-1-60，以及通过RT-qPCR表达OCT4和REX1)中的一项或多项，并仅在满足这些参数的标准时使用所述NR1批次。
内源性神经修复通路和潜在机制
在亚急性或慢性时间段内给药时，NR1的给药可同时实现皮层和皮层下卒中的长期神经功能恢复。神经炎症的减少和梗死周围新生血管的增加是早期的已知作用机制。迄今为止，在使用NR1进行的所有体内研究中，观察、数据和结果均未显示出明显的临床毒性迹象，未显示出肿瘤或畸胎瘤形成的宏观或微观证据，也未显示出与供试品相关的不良结果。
在一些实施例中，NR1的给药靶点是与皮层下卒中相邻的脑组织皮层下部分，根据功能性人脑成像中观察到的情况，该区域在卒中后的组织修复和重组中显示出高活性。在同样使用相同给药部位的研究中，该区域在组织修复和重组中显示出高活性。基于对各个模型中创伤的平均大小和位置的预先确定，确定注射坐标，将NR1直接递送到卒中创伤附近的组织中。
在一些实施例中，通过临床和放射学反应以及疗效测量工具的效用进行疗效评价。受试者可以与自身的稳定移植前基线进行比较。既定量表和疗效的初步评估可作为移植后6个月Fugl-Meyer(FM)运动功能评分的神经功能结果。探索性终点结果测量将包括NIHSS、舒适步速(CGS)测试、mRS和神经生活质量(QOL)以及治疗后6个月的FM总分。
慢性卒中的治疗
迄今为止，尚无有效的治疗方法能够改善卒中引起的剩余结构和功能缺陷。卒中是成人残疾的主要原因，是所有神经障碍中年发病率最高的疾病。由于急症医疗管理的改善，卒中死亡率正在下降，从而将卒中从急症杀手变为慢性致残性疾病。然而，几乎没有针对这一卒中慢性期的治疗方案。这种恢复治疗仍然侧重于物理医学——职业疗法、物理疗法和言语/认知疗法。然而，这些方法耗时长、成本高，对功能恢复的益处非常有限，并且在卒中后6个多月无法有效地进一步改善神经功能。这些事实定义了一种常见、破坏性极大、无现成药物治疗的慢性疾病，并将卒中恢复确定为“未满足的医疗需求”的主要领域。
移植来源于脐带血、骨髓或脑组织(胎儿和成人)的细胞可分泌增强卒中实验模型中感觉运动功能的因子。然而，用于这些研究的正常人源性成体干细胞并不适合大规模细胞生产。缺血性皮层下卒中(ISS)模型的动物研究表明，脑内移植NR1(神经干细胞药物产品)可以分泌增强运动功能内源性恢复的因子，无显著毒性。然而，与先前使用的干细胞不同，NR1适合大规模生产。
脑内移植
患者接受有效剂量的NR1细胞(单剂量或多剂量)，通过立体定向方式将NR1细胞植入皮层下梗死区附近的灰质或白质部位。有效剂量可以是约2.5×106个细胞、5.0×106个细胞、10×106个细胞、20×106个细胞、50×106个细胞或100×106个细胞的固定剂量。
在一些实施例中，采用单骨孔小骨窗开颅术，利用多个针道植入细胞，在损伤区周围，每个针道中的沉积(1次、2次、3次、4次、5次等)深度各不相同。在一些实施例中，使用递送系统(包含稳定插管，并配有探针和注射针)手动施用细胞。
由于NR1及其伴随制剂的异基因性质，受体可以接受免疫抑制方案治疗，包括但不限于他克莫司、标准剂量环孢菌素A(CsA)、低剂量CsA等。
实验性示例
示例1
示例1
斯坦福大学神经移植项目(SUNTP)从自己的NR1(神经再生1)细胞系中开发出一种新的细胞药物产品NR1。NR1是一种独特的研究用细胞疗法产品，旨在通过直接脑内注射治疗卒中的运动后遗症。这类运动缺陷的致残率极高，手臂和/或腿部运动控制的任何改善都会显著改善受试者的健康和生活质量。在动物卒中模型中，NR1已显示出改善运动功能控制的功效，并且NR1展示了出色的安全特性。
通过在神经诱导条件下进行培养，祖细胞系产生了药物产品NR1，祖细胞系最初源自H9人胚胎干细胞(hESC)系。它是一种未经基因修饰的稳定细胞系。NR1(药物产品)由NR1cGMP主细胞库(NR1 MCB)制成，并在向p30用药后产物的广泛传代中表现出一致的生长和质量属性。本次评估提升了对临床药物产品批次的信心，这些批次可以从MCB中仅扩增出3个传代。根据qPCR对Oct4(低于测定检出限0.01％)和Rex1(未检出)的评估，除了一致的生长特性外，保留在临床材料生产3个传代中的属性包括正常核型和残留hESC水平。
如上所述，NR1细胞是来源于威州细胞研究所WA09(H9)人胚胎干细胞(hESC)(hESC)系的人神经干细胞系，同时也是药物产品(DP)NR1中的活性组分。NR1由可扩增的均质长期体外培养物形成，这些培养物具有稳定性且能无限培养，表型没有变化，未失去核型稳定性。NR1生产过程无需重复使用hESC和分化为神经祖细胞，相反，在无饲养层的贴壁培养中，传代至15代(p15)时冻存的NR1主细胞库(MCB)小瓶在限定的培养基中解冻并扩增至p18，即可生产出NR1原料药(DS)。DS生产是连续过程(包括作为NR1 DP进行灌封和冻存)的一部分，因此任何NR1 DS小瓶都不会以这样的方式生产。
NR1临床评价
1期/2期合并临床研究旨在评估NR1脑内移植(ICT)在慢性缺血性皮层下卒中(cISS)受试者中的安全性、耐受性并获得疗效适应症。这是一项在18-75岁稳定型缺血性卒中引起偏瘫的受试者中，利用立体定向颅内注射NR1细胞进行的开放标签的安全性和耐受性研究。通过确定手术前筛查和基线期(至少间隔一周)保持稳定的受试者进行稳定性评价。虽然以安全性研究为主，但是也要对疗效参数进行评价。
4个分组分别接受单剂量的NR1，按分组递增，通过立体定向方式将NR1植入皮层下梗死区附近的灰质或白质部位。采用单骨孔小骨窗开颅术，利用3个针道植入细胞，在损伤区周围，每个针道中的5次沉积深度各不相同。细胞移植采用标准化体积(20μL/沉积)和输注速率(10μL/分钟)，每次植入间隔约5-6mm。每次沉积预计需要约2-3分钟，每个针道在15分钟内完成。
利用递送系统手动施用NR1，该递送系统包括博士伦(Bausch&Lomb)公司生产的带有探针和注射针的定制稳定插管以及Hamilton Gastight 1700系列100μL硼硅酸盐玻璃注射器组成。目前，获得美国食品药品监督管理局(FDA)市场许可的注射针或注射器与NR1给药所需的给药剂量体积均不一致。为了消除盲区，最大限度地减少针插管对组织产生的损伤，最大限度地提高剂量精度，采用定制NR1注射针和带探针的稳定插管。
建议使用的NR1递送系统与卒中干细胞治疗的六项前期(和一项正在进行的)临床测试中采用的递送系统完全相同。该系统旨在提供并且经证明可以确保干细胞剂量在动物和人类中的一致、准确递送。在本次研究中，利用递送系统手动施用NR1，该递送系统由稳定植入插管和固定到硼硅酸盐玻璃100μL注射器的注射针组成。NR1递送系统规格的设计与Leksell立体定向系统设备相适应。此外，在先前的1期和2期临床测试中就已经使用了这种定制设计的注射针和稳定插管配置。
由于NR1及其伴随制剂的异基因性质，为了最大限度地减少急性宿主排异反应的任何可能性，所有受试者均将接受预治疗并同时给予口服他克莫司(普乐可复)。已公布的关于多种免疫抑制剂的研究发现，他克莫司比标准剂量的环孢菌素A(CsA)和低剂量的CsA更加有效。临床方案附录中涵盖了免疫治疗方案的选择，该附录介绍了他克莫司的原理及其在临床中的使用。本次研究的免疫抑制选用了低剂量他克莫司，剂量和治疗持续时间将遵循斯坦福大学关于他克莫司临床使用的临床方案。
所有入选的受试者都将接受最佳医疗实践和支持性护理。预计待测试的4种剂量以非临床评价的剂量为基础，这4种剂量分别为固定体积(300μL)的2.5×106、5.0×106、10×106和20×106个细胞，并在最后一名受试者接受治疗后的一个月内，在转入下一个更高剂量的分组之前，确认每个分组的安全性。为了确定在安全且耐受良好的剂量中哪种剂量最有利于使临床症状改善朝着恢复正常功能的方向发展，除了对安全性和耐受性进行评估以外，还将评价多个神经和功能参数。
NR1生产
在希望之城GMP生产工厂的应用技术开发中心(CATD)进行的NR1原料药和药物产品制造符合cGMP要求。在cGMP NR1 MCB产生时开始进行NR1原料药和药物产品的生产，2012年9月1日装瓶并冻存。为了生产出NR1 DS和NR1 DP，从“源”材料开始，到目前为止已进行了三次cGMP运行。由NR1 MCB(p15)生产NR1的工艺的“高水平”工艺流程图如图2所示。在细胞扩增过程中，在单层暴露于胰蛋白酶之后，培养传代数增加一次；(例如，当接种第16代细胞，然后将其扩增为接近汇合的单层并进行胰蛋白酶化时，将由此产生的悬浮液视为第17代，依此类推)。在工艺流程图中，将原料药确定为“单元操作”栏5中的收获和第一次重悬步骤，并在当天连续处理原料药，以制备NR1。NR1药物产品由6×106个18代(p18)NR1细胞组成，细胞冻存在1mL最终冻存配制物中，每瓶配制物由7.5％的二甲基亚砜(DMSO)、42.5％的ProFreeze和50％的完全生长培养基组成。需要强调的是，针对临床使用而生产并用于关键 性非临床研究的NR1药物产品在CATD希望之城(COH)GMP生产工厂处按照cGMP要求进行生产。
拟用于确定性非临床和临床研究的所有批次NR1药物产品已经并将继续在符合cGMP要求的条件下生产。在应用适合现阶段前期临床开发的放行标准之后，对NR1药物产品进行了全面表征和放行使用。已经检测了拟用于临床研究的三个cGMP NR1批次的：1)无菌性(USP)，2)抑菌作用和抑真菌作用，3)支原体(USP)，4)支原体抑制，5)内毒素，6)体外的外源病毒，7)细胞活力，8)细胞计数(强度)，9)核型，10)同一性(通过流式细胞术表达CD73)，11)纯度(通过流式细胞术表达β-Tubulin-III)，12)杂质(通过流式细胞术表达Tra-1-60，以及通过RT-qPCR表达OCT4和REX1)。采用NR1 DS进行了支原体(USP)、支原体抑制、体外的外源病毒和核型检测。为了确保安全、一致的NR1药物产品生产，制定了规范。
基于非临床研究毒理学结果的优势，提供前导性和GLP非临床实验研究数据，在非临床研究中，这些数据与NR1一致。
内源性神经修复通路和潜在机制
在亚急性或慢性时间段内给药时，NR1的给药同时实现了皮层和皮层下卒中的长期神经功能恢复。来自这些模型的数据表明，神经炎症的减少和梗死周围新生血管的增加是早期的已知作用机制。
在新生和成年动物以及遗传免疫缺陷和药物免疫抑制动物中，对多个原始态卒中模型的研究已经证明NR1具有极佳的安全特性。在数量繁多的动物模型中，涵盖了许多可能存在的免疫学上的年龄和健康受到损害的情况，结合使用细胞制剂，可以优化细胞产品的持久性，相对于NR1功效的长期持续，NR1的持久性有所改良。在体内研究中，在多个实例中，持久性、持续疗效和机制数据按动物和组平均相互关联。迄今为止，在使用NR1进行的所有体内研究中(MPI，USF，斯坦福)，观察、数据和结果均未显示出明显的临床毒性迹象，未显示出肿瘤或畸胎瘤形成的宏观或微观证据，也未显示出与供试品相关的不良结果。
对功能恢复的潜能测试进行了研究，并对几个基于组织学的量化终点(包括宿主脑损伤大小和宿主脑修复通路，如新生血管、炎症和通过宿主神经元增加的轴突发芽，称为可塑性)进行了研究。先前对这些内源性修复通路进行研究时，将其作为替代性恢复措施和潜在的人神经祖细胞(hNPC)体内作用机制。此外，经评估，移植细胞在大脑中的存活可表征NR1的持久性及其在移植后分化、迁移、异位组织形成和致瘤性中的潜力。
拟定的NR1临床评价：总结
拟定临床研究的首要目标是，在患有或未患有皮层卒中的慢性ISS受试者受到损伤后的单个时间点进行脑内给药时，在固定体积中，利用不断增加的细胞，评估递增剂量的NR1细胞的安全性和耐受性。本研究将采用4个分组进行剂量递增，每个分组都处于单剂量水平的NR1细胞脑内给药。附加目标则是对临床和放射学反应以及既定疗效测量工具的效用进行评价。将受试者与自身的稳定移植前基线进行比较。进一步的探索性研究终点包括监测磁共振(MR)扩散张量成像(DTI)、液体衰减反转恢复(FLAIR)和静息态功能磁共振成像(fMRI)的变化，并与基线进行比较。
首要目标是，在患有或未患有皮层卒中的慢性缺血性皮层下卒中(ISS)受试者受到损伤后的单个时间点，评价脑内给药的递增剂量的NR1(固定体积中，细胞数量不断增加)的安全性和耐受性。由于超过90％的缺血性卒中受试者在卒中后90天内病情稳定，因此本研究在患有先前6-60个月内发生稳定型缺血性卒中引起的偏瘫的成年受试者(18-75岁)中进行。
拟定的研究采用NR1细胞脑内给药的剂量递增设计。NR1的给药靶点是与皮层下卒中相邻的脑组织皮层下部分，根据功能性人脑成像中观察到的情况，该区域在卒中后的组织修复和重组中显示出高活性。在同样使用相同给药部位的非临床研究中，该区域在组织修复和重组中显示出高活性。这种临床给药与非临床药理学研究一致，在这些研究中，基于这些模型中预先确定的平均损伤尺寸和位置，确定注射坐标，从而将NR1直接递送到皮层下和皮层缺血性卒中啮齿类动物模型中的卒中损伤附近的组织中。考虑到大脑尺寸的差异，在非临床研究中，夸大剂量下经证明的安全性、耐受性和疗效构成了拟定临床研究的依据。
次要目标包括对伴随临床和放射学反应以及疗效测量工具的效用进行评价。受试者将与自身的稳定移植前基线进行比较。在研究期间，将会对受试者术后1天、1周、1个月、2个月、3个月和6个月的NR1安全性和耐受性进行评价。通过对临床症状、水肿、炎症、其他病理变化和临床实验室检查结果进行监测来评估安全性和耐受性。在相同的时间点，使用既定量表收集疗效数据，疗效的初步评估将作为移植后6个月Fugl Meyer(FM)运动功能评分的神经功能结果。探索性终点结果测量将包括NIHSS、舒适步速(CGS)测试、mRS和神经生活质量(QOL)以及治疗后6个月的FM总分。
4个连续分组接受递增单剂量的NR1，通过立体定向方式将NR1植入皮层下梗死区附近的灰质或白质部位。创建单骨孔小骨窗开颅术，利用3个针道植入细胞，在损伤区周围，每个针道中的5次沉积深度各不相同。细胞移植将采用标准化体积(20μL/沉积)和速率(10μL/分钟)，每次植入间隔约5-6mm。每次沉积预计需要约3分钟，每个针道在20分钟内完成。视患者病情，可以根据手术情况对该手术程序进行修改。一旦确定需要进行修改，将通知FDA和IRB。
采用传统的3+3测试设计，用增加的NR1剂量治疗受试者分组，每个受试者仅接受单剂量。基于从动物毒理学研究中得出的推断，前3名受试者将以动物安全性剂量接受NR1。后续分组采用固定体积的NR1进行治疗，并按事先确定的量增加NR1剂量。如果某个分组中的受试者没有出现使用CTCAE量表限定的剂量限制性毒性(DLT)，则在为期4周的分组间观察之后，另外3名受试者将在下一个更高剂量水平分组中开始治疗。如果该分组的前三名受试者中仅有一名受试者出现DLT，则需在此剂量水平下再额外治疗3名受试者，如果在此剂量水平下未出现其他DLT，则该分组中接受治疗的受试者总人数为6人。
在第5版CTCAE量表上，将DLT定义为3级或4级临床事件，经研究人员确定，该DLT可能与NR1有关。剂量递增将会持续，直至一个分组(最多6名受试者)中至少有2名受试者出现DLT(即该剂量下≥33％的受试者)。将最大耐受剂量(MTD)指定为剂量水平刚好低于2名受试者已经出现DLT时的剂量，或者在没有剂量限制性毒性的情况下，如果达到最大剂量。另外6名受试者将在该剂量下接受治疗，以建立MTD。
通过临床症状、MRI(水肿、炎症和其他病理变化)和临床实验室检查结果进行安全性监测。NR1植入后，受试者将接受为期15年的随访。
NR1临床研究的详细情况
所述药物(即NR1)是一款独特的胚胎干细胞源性产品，目前该产品正处于研发阶段，可用于治疗伴有运动缺陷的慢性缺血性皮层下卒中。由于卒中的核心由在没有血液流动的情况下不能存活的组织组成，在这个区域内，移植的细胞甚至无法短暂存活。因此，NR1的给药靶点是皮层下卒中附近脑组织的皮层下部分，在功能性人脑成像和非临床研究中，这一区域显示出其在组织修复和重组中的积极作用。这种给药与非临床药理学研究一致，在这些研究中，基于这些模型中预先确定的平均损伤尺寸和位置，确定注射坐标，从而将NR1直接递送到皮层下和皮层缺血性卒中啮齿类动物模型中的卒中损伤附近的组织中。利用该模型，动物模型的感觉运动和其他神经功能结果为阳性，表明大脑皮层下卒中组织受到刺激后可以至少部分恢复皮层下和皮层区域的神经功能。由于卒中后人的大脑中也会出现相同的活性并伴随神经回路的恢复和临床改善，因此提出本研究并设计了如下所述的辅助非临床研究。
首要目标是，在患有或未患有皮层卒中的慢性ISS受试者受到损伤后的单个时间点，评价脑内给药的最多4种递增剂量水平的NR1(固定体积300μL中，细胞数量不断增加)的安全性和耐受性。预计本研究的总持续时间为2.5年，允许有2年的研究入组时间。
NR1的给药靶点是与皮层下卒中相邻的脑组织皮层下部分，在功能性人脑成像和非临床研究中，该区域在组织修复和重组中显示出高活性。本次给药与非临床药理学研究一致，该研究证明，在将NR1直接注射到缺血性卒中损伤附近的组织中之后，皮层下和皮层缺血性卒中的啮齿动物模型的功能得到了改善。
在研究期间，对受试者术后1周、1个月、2个月、3个月和6个月的安全性进行评价。在第12个月和第24个月的研究安全性随访期间，将继续跟进疗效适应症。同时，在研究期间，受试者安全监测将对临床症状、水肿和其他病理变化的磁共振成像(MRI)以及临床实验室检查结果进行评估。主要疗效评估即为移植后6个月Fugl Meyer(FM)运动功能评分的神经功能结果，次要结果测量将包括其他时间点的NIHSS、舒适步速(CGS)测试、mRS、神经生活质量(QOL)及FM运动功能评分。
设计并进行非临床研究，旨在支持安全性和活性，并对待测试的拟定NR1剂量下的给药风险进行评价，临床上固定体积(300μL)的细胞数为2.5×106、5.0×106、10×106和20×106个。针对临床研究中的安全评价，设计出安全性和耐受性参数，对这些参数进行评价，并在转入下一个更高剂量的分组之前，确认每个分组的安全性。至少有11名且不超过30名受试者将会接受治疗。在标准3+3研究设计中，受试者将接受单次递增剂量的NR1。分组通常由3名受试者组成，如果一名受试者出现剂量限制性毒性(DLT)，分组中将再增加3名受试者。如前所述，除非任何一个分组中前3-6名受试者中有2名受试者出现剂量限制性毒性(DLT≥33％)，否则剂量将继续递增。将最大耐受剂量(MTD)指定为刚好低于达到DLT的剂量的剂量水平，或者如果任何剂量都未引起DLT，则指定为最高剂量分组(分组4)中达到的最大剂量。另外6名受试者将接受MTD。
按照常规护理实践，受试者需要在围手术期停止抗血栓治疗，并给予他克莫司，以最大限度地降低给予的NR1出现急性排异反应的可能性。入选的受试者将接受最佳医疗实践和支持性护理。
作为冻存的NR1细胞，将NR1装在一次性小瓶中提供给临床中心，每个小瓶内含6×106个细胞，并存放在气相液氮中。“现场制备”NR1细胞将进行解冻、洗涤、重新悬浮在由勃脉力ATM缓冲液和人血清白蛋白(HSA)组成的递送溶液中，然后通过革兰氏染色法(立即)和14天USP无菌(回顾性)检查是否存在活力和是否存在可检测到的有机体，最后装入冷冻小瓶中，运送到手术室。NR1细胞将于剂量制备完成后6小时内给药。
在旨在检测毒性的非临床研究中，按照临床评价计划制备的NR1细胞并未表现出任何可辨别的安全方面的担忧。如此制备的NR1仍然停留在注射部位而未发生迁移，并且在采用NR1治疗的350+只动物中，NR1未出现任何肿瘤产生的迹象。当然，理论性风险的确存在，包括一般毒性、致瘤性/畸胎瘤形成、未被发现的人或鼠病毒的传播或者对细胞移植的免疫反应。为了研究实际可能性并最大限度地减少NR1细胞的不良影响，已经进行了所有尝试，包括：利用灵敏度为0.01％的Oct4和Rex1 qPCR测定，证明不存在可检测的残留H9细胞。此外，已经对可能的外源因子进行了广泛研究，发现其水平低于检测水平。
利用免疫抑制避免NR1细胞死亡已成为两项非临床研究的标准做法，临床研究中建议采用这种做法。通过在第30天之前保持低全血谷水平，以及从第41天到第60天逐渐减少他克莫司的用量，以及在NR1注射后第60天停止使用他克莫斯，就可以尽可能地降低他克莫司引起的风险。此外，为了安全起见，将通过频繁的实验室测试，对受试者进行仔细监测，判定是否存在潜在的他克莫司毒性。
在未实施全身麻醉的情况下，在开始监测麻醉(MAC)后的开放式手术过程中，需要脑内注射NR1细胞。手术需要进行MAC、注射局部麻醉剂、安装立体定向头架、颅骨钻孔和打开硬脑膜。通过利用最佳外科手术实践，可以减轻这一程序的风险。所述递送模型和手术方法已成功用于其他干细胞生物制剂的临床测试。
NR1非临床评价
NR1是一款人胚胎干细胞源性产品，目前该产品正处于研发阶段，可用于治疗伴有运动缺陷的慢性缺血性皮层下卒中。NR1的给药靶点是与皮层下卒中相邻的脑组织皮层下部分，在功能性人脑成像和非临床研究中，该区域在组织修复和重组中显示出高活性。
为了评价动物的活性机制，进行了药理学研究，同时还进行多项研究，以选出毒性/致瘤性/畸胎瘤评价所需的最佳动物模型。动物模型中的NR1给药与临床给药途径一致，基于这些模型中预先确定的平均损伤尺寸和位置，确定注射坐标，从而将NR1直接递送到皮层下和皮层缺血性卒中啮齿类动物模型中的卒中损伤附近的组织中。如此治疗后动物的功能得到改善。
活性评价
对NR1药物产品进行了药理学、生物分布和毒理学研究，以评估其疗效、体内持久性和迁移及其引起不良事件(包括畸胎瘤发展)的可能性。所有研究均采用选定的免疫缺陷或免疫抑制动物模型，以最大限度地减少人NR1细胞排异反应的可能性。
两项药理学研究的目的是测量通过脑内(IC)注射移植的NR1的疗效。在免疫抑制Sprague-Dawley(SD)大鼠缺血性皮层下卒中(ISS)模型中，完成了初步药理学研究；该模型为良好表征的ISS模型，该模型通常用于卒中领域，能够提供与慢性ISS受试者的拟定靶标适应症最接近的匹配。支持性药理学研究采用了免疫缺陷无胸腺裸大鼠的缺血性皮层卒中(ICS)模型。该模型还广泛用于卒中领域，并可用于评估针对皮层损伤的NR1疗效。
活性和作用机制评价
药理学研究的进行旨在测试功能研究方面的改进以及缺血性皮层下卒中(ISS)和缺血性皮层卒中(ICS)非临床大鼠模型中NR1治疗的行为恢复，利用一组运动和行为测试测量部分功能恢复，从而量化感觉运动功能的损伤后恢复。利用组织学评价，探究两项研究中与NR1诱导的变化存在潜在相关性的候选作用机制。关键性疗效研究利用ISS大脑中动脉闭塞模型中的免疫抑制SD大鼠，对ISS大鼠模型中NR1的脑内移植的潜在治疗价值进行了评价。包括免疫抑制，以减少人NR1细胞在该大鼠模型中的排异反应。该系统为良好表征的ISS模型，该模型通常用于卒中领域，能够提供与慢性ISS受试者的拟定靶标适应症最接近的匹配。
主要终点是验证以下假设，即在卒中后7天或28天进行NR1治疗在抬高身体摇摆试验(EBST)中将产生统计学改善，次要终点是在神经系统检查和转棒测试中产生改善。研究表明，根据动物模型(包括慢性卒中的ISS模型，该模型与慢性ISS受试者的拟定NR1靶标适应症最匹配)中运动和神经行为终点的测量结果，卒中后NR1药物产品的移植有可能至少部分恢复感觉运动功能。ICS模型中的支持性研究提供数据，并利用几个不同的终点测量改进后的感觉运动功能(Vibrissae-Paw和姿势恢复测试以及神经系统综合评估)。NR1药物产品移植后，神经功能恢复持续了至少3个月(研究的总持续时间)。在治疗后第3个月进行的组织学评估表明，在卒中后亚急性期(7天)，以及在卒中后慢性期(28天)高剂量NR1下的梗死周围小胶质细胞/免疫细胞活化减少与NR1相关的功能恢复增强之间，当施用NR1时，梗死周围血管密度增加与NR1相关功能恢复增强之间存在联系。
在Stanford-5研究中，该ICS模型的主要终点是比较单独使用测试溶媒(勃脉力A加0.5％人血清白蛋白)处理的动物的功能恢复与使用含有NR1的测试溶媒(4×105或1×105细胞/大鼠)处理的动物的功能恢复。选择一种称为触须-前爪反应测试的感觉运动行为测试，作为功能恢复的首要衡量标准，这是因为该测试可重复地显示出皮层缺血性卒中和hNPC治疗后功能恢复增加的情况。次要终点包括姿势-反射测试，研究发现该测试与触须-前爪反应测试呈正相关，并将该测试作为对功能恢复可持续性的评估。三级终点包括利用改良神经功能评分测试，对两种积极治疗的剂量效应趋势进行比较。虽然是部分恢复，但其属于持久性恢复，有证据表明NR1治疗后的恢复可持续长达2个月(研究的总持续时间)。基于组织学的量化终点(包括宿主脑损伤大小和宿主脑修复通路，如新生血管、炎症和通过宿主神经元增加的轴突发芽，称为可塑性)称为可塑性。先前对这些内源性修复通路进行研究时，将其作为替代性恢复措施和潜在的hNPC体内作用机制。此外，经评估，移植细胞在大脑中的存活可表征NR1的持久性及其在移植后分化、迁移、异位组织形成和致瘤性中的潜力。
USF-1和Stanford-5中的恢复均为部分恢复，但其属于持久性恢复，有证据表明NR1治疗后的恢复时间长达2-3个月。人们尚未完全理解NR1细胞对其有效作用进行介导时所采取的确切机制，但这种机制似乎至少部分与免疫调节功能有关，具体反映在与治疗相关的免疫细胞活化减少，这种现象与NR1治疗后观察到的部分功能恢复以及对神经可塑性的可能影响有关。有证据表明，正是由于卒中恢复核心过程(包括炎症过程和细胞外基质的组织)的刺激，且部分由于基因表达增加(众所周知，基因表达增加会在体内将巨噬细胞极化转变为更有益的M2样(具有更强的抗炎作用)状态)，使NR1具有此影响。此外，NR1似乎改善了卒中后皮层内的兴奋性/抑制性平衡。NR1细胞持久性数据还表明，细胞在移植到大脑中后可以存活长达6个月，从而有可能增强观察到的恢复效果。
与USF-1中的情况相同，Stanford-5研究中的恢复虽然是部分恢复，但其属于持久性恢复，有证据表明NR1治疗后的恢复时间长达2个月(研究的总持续时间)。人们尚未完全理解NR1细胞对其有效作用进行介导时所采取的确切机制，但这种机制似乎至少部分与免疫调节功能有关，具体反映在与治疗相关的免疫细胞活化减少，这种现象与NR1治疗后观察到的部分功能恢复以及对神经可塑性的可能影响有关。有证据表明，正是由于卒中恢复核心过程(包括炎症过程和细胞外基质的组织)的刺激，且部分由于基因表达增加(众所周知，基因表达增加会在体内将巨噬细胞极化转变为更有益的M2样(具有更强的抗炎作用)状态)，使NR1具有此影响。此外，NR1似乎改善了卒中后皮层内的兴奋性/抑制性平衡。NR1细胞持久性数据还表明，细胞在移植到大脑中后可以存活长达6个月，从而有可能增强观察到的恢复效果。
关于生物分布和毒理测试动物模型选择的讨论
在选定的动物模型中，NR1细胞的持久性对于获得疗效、分布和毒性的准确测量至关重要。对几种不同的方法进行评价，选出细胞持久性最好的动物模型。比较不同免疫缺陷啮齿动物模型(包括成年和新生无胸腺裸大鼠和成年NSG小鼠)中NR1的存活率。在免疫缺陷成年无胸腺裸大鼠中，测量最高细胞存活率和持久性，用于进一步测试通过耗竭特定免疫细胞群来提高持久性的方法。在成年无胸腺裸大鼠中，小胶质细胞(在CNS中起到巨噬细胞的作用)耗竭和自然杀伤细胞数量耗竭都不会增加NR1的存活率。通过在细胞注射中加入基质胶，增加了NR1细胞持久性。基质胶是一种结构蛋白和细胞生长因子的非均匀混合物，众所周知，基质胶可提高干细胞的存活率。在前导性研究中，基质胶的加入显著提高了NR1细胞的长期存活率。由于可能存在混淆作用，药理学和分布研究中未使用基质胶，仅在毒理学研究中的注射介质中含有基质胶，作用是改善NR1的存活率和生长。
关于GLP生物分布研究和NR1持久性的讨论
对免疫抑制Sprague-Dawley大鼠的ISS模型进行了GLP生物分布研究，旨在为卒中动物中脑内注射NR1细胞的持久性和迁移提供最完整的评估，最大限度地模拟患有慢性卒中的人类受试者的临床状况。在移植后24小时-60天的时间点，提取大脑切片制备载玻片，并选用外周组织，通过IHC分析是否存在NR1细胞，然后收集冷冻样本进行qPCR分析。根据IHC显示，在移植后的45天内，急性和慢性卒中组动物大脑中NR1细胞的最低至轻度至中等数量级NR1的发生率和数量级均呈总体下降趋势。NR1细胞的存在局限于细胞注入的大脑半球，在任何动物的其他器官中均未检测到细胞。qPCR分析显示，在治疗后1周，动物的注射部位存在NR1细胞。利用IHC或qPCR进行检测时，在远离注射部位的大脑的任何区域内或外周组织中均未发现NR1细胞，少数动物可能会出现的例外情况是在非故意的情况下细胞被注射进入脑室中，以及尸体剖验时或通过组织处理程序获得的与污染有关的检查结果。
在进行GLP毒理学研究的同时，还进行了细胞持久性研究，但后者在有基质胶的情况下进行。在治疗后180天，在大多数已经接受治疗的动物中，同时利用IHC和qPCR分析，检测到最低至中等水平的NR1细胞。与生物分布研究相同，注射部位存在NR1细胞，显微镜下的NR1细胞呈现为脑实质内的空穴化空隙，在脑室空隙内则较少出现，没有证据表明NR1细胞离开注射部位发生了迁移。在移植过程中，细胞在非故意的情况下被注射进入脑室中，由此导致脑室中存在NR1细胞。
总体而言，NR1生物分布研究清楚地表明，NR1细胞并未离开注射部位发生迁移。关于GLP毒理学/致瘤性/畸胎瘤形成的讨论
如上所述，在对免疫功能低下的啮齿动物模型和NR1在作用部位的持久性进行广泛评价的基础上，选用无胸腺裸大鼠模型进行为期六个月的GLP毒理学研究。对NR1在大脑中的持久性进行评价的研究包括：在原始态(非卒中)NSG小鼠或裸大鼠中进行的三项前导性毒理学研究，以及在原始态裸大鼠中进行的小规模持久性研究。本表格还列出了在免疫抑制SD大鼠ISS模型的药理研究中，在移植后10周，大脑中未检测到NR1细胞，其中，在移植后9周和3个月，在任一研究中，大脑中均未检测到NR1细胞。
使用无胸腺裸大鼠进行的毒理学研究旨在评价NR1的致瘤性和注射部位持久性，以及一般毒理学终点，包括广泛的组织病理学评价。由原始态(非卒中)雄性和雌性裸大鼠组成的九个治疗组接受cGMP NR1细胞或NR1细胞和H9细胞组合的脑内移植。通过立体定向方式将细胞注入大脑每个半球的两个(一个皮层和一个纹状体)注射部位。基质胶是一种结构蛋白和细胞生长因子的非均匀混合物，细胞培养基中就含有基质胶，提高了畸胎瘤细胞存活和生长的可能性。研究中包含采用接受NR1和H9细胞组合的治疗组，即掺入H9细胞的治疗组，以表明无胸腺大鼠模型支持H9干细胞源性畸胎瘤的发展。这些H9加标组显示了线性剂量相关的畸胎瘤形成，其范围分别从高H9加标NR1剂量(50％)下已接受治疗动物的约67％到低H9加标NR1剂量(0.1％)下已接受治疗动物的约5％(1/19)。毒理学研究中使用的细胞培养基中含有基质胶，人们并未完全了解基质胶在促进畸胎瘤生长方面的总体作用。然而，研究表明，基质胶的使用明显能够支持NR1的生长和持久性，而不会产生畸胎瘤或毒性，该研究比较了基质胶存在和不存在情况下的细胞持久性。基质胶是一种来源于小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤细胞的复合蛋白质混合物，据报道，基质胶中含有鼠类生长因子。基质胶仅用于促进人体细胞在啮齿动物中的存活，而临床NR1药物产品的注射介质中不会含有基质胶。
在最高2×106个NR1细胞(脑内注射)或1×107个细胞(肌肉注射)的剂量下，施用NR1与任何意外死亡率、临床发现、体重或摄食量的变化、临床病理学或骨髓终点的变化或宏观或微观观察无关。不存在与NR1相关的早期死亡和/或安乐死，并且在任何仅有NR1的治疗组的大脑或外周组织中均未发现畸胎瘤形成。在给药后180天，NR1在低剂量和高剂量(分别为4×105个和2×106个细胞/只)下耐受性良好。当向大脑中单独脑内注射H9细胞时，或者当进行NR1或掺入H9细胞的NR1的肌肉注射时，未检测到任何细胞或畸胎瘤。在仅接受H9治疗的治疗组中，研究人员注意到，在大脑内的给药部位出现空化现象，表明细胞没有存活或移植。当以1×106的剂量单独给药时，大脑中H9细胞生长乏力，原因不明。然而，由于相同数量的H9细胞掺入1×106个NR1细胞导致形成畸胎瘤(第4组)，第5-8组中使用的较低数量的H9细胞也是如此，因此上述原因并非是所使用的H9细胞缺乏活力。治疗后约50天，接受脑内注射不同细胞培养基(DMEM/F12加0.5％ HSA，含30％基质胶，而非40％)中的1×106个H9细胞/只的大鼠出现了可见畸胎瘤。以最高1×107的剂量进行肌肉注射的细胞NR1和NR1+H9缺乏持久性，原因可能是由于肌肉注射部位生长环境的宽松程度较低。
在任何仅采用NR1细胞治疗的大鼠中，大脑或外周组织中未检测到畸胎瘤。共100只无胸腺裸大鼠接受了最高2×106个NR1细胞/只，移植后进行随访，最长随访时间为6个月。在已制备的NR1和H9细胞的混合物中，该模型能够检测到H9水平(低至0.1％的H9细胞)(向2×106个NR1细胞/只的剂量中添加2000个H9细胞)畸胎瘤。众所周知，NR1药物产品中含有<0.01％的H9细胞。检测NR1中hESC的检测灵敏度至少比最低H9 hESC加标水平0.1％低10倍，其中只有1/19的动物出现未分类的微观组织畸形，而在50％的H9 hESC加标NR1经治疗的动物中，这一比例为67％，其中在67％的动物中观察到畸胎瘤，大多数动物未能在研究的整个持续时间内存活。
非临床研究结果概述
NR1的给药靶点是与皮层下卒中相邻的脑组织皮层下部分，在功能性人脑成像和临床前研究中，该区域在组织修复和重组中显示出高活性。
进行上述生物分布研究，研究证明NR1仍然停留在脑内注射部位。移植后NR1细胞在脑内和外周组织中的生物分布对安全性评估具有重要意义。此外，对大脑中NR1持久性的评估提供了关于NR1作用机制的信息。在大脑中动脉闭塞ISS模型中，在将NR1细胞移植到免疫抑制Sprague Dawley(SD)大鼠的梗死周围区域后，进行了为期2个月的GLP顺应性生物分布研究。USF-1研究中也采用了该模型，该研究显示了NR1移植在部分恢复运动和行为功能方面的疗效。该模型为良好表征的ISS模型，该模型通常用于卒中领域，能够提供与慢性ISS受试者的拟定靶标适应症最接近的匹配。
采用经过鉴定和验证的实时qPCR测定法，对NR1细胞在大脑和神经轴以及选定的外周组织、大体病变和组织块中的存在和水平进行量化，采用人抗核抗体HuNu，检测组织的人核DNA和免疫组织化学(IHC)染色。GLP顺应性生物分布和毒理学研究采用的NR1是一种按照cGMP生产的cGMP产品，同时也是研究USF-1中使用的产品。
生物分布结果显示，在以每只动物最高4×105个细胞的总剂量(高剂量)注射到大脑皮层和纹状体的薄壁组织中之后，在急性和慢性卒中动物的大脑中，NR1细胞持续存在至少45天。NR1细胞仍位于给药部位，而并未离开注射针道迁移到邻近大脑区域(除非细胞可能会在非故意的情况下注射到脑室中)或外周非CNS组织。在GLP毒理学研究中，注射部位NR1细胞的持久性评估为一致性评估。免疫组织化学染色(IHC)结果显示，在移植后30天-180天，细胞仍以一致的低水平存在。
在进行GLP毒理学研究的同时，还进行了细胞持久性研究，但后者在有基质胶的情况下进行。在治疗后180天，在大多数已经接受治疗的动物中，同时利用IHC和qPCR分析，检测到最低至中等水平的NR1细胞。与生物分布研究相同，注射部位存在NR1细胞，显微镜下的NR1细胞呈现为脑实质内的空穴化空隙，在脑室空隙内则较少出现，没有证据表明NR1细胞离开注射部位发生了迁移。在移植过程中，细胞在非故意的情况下被注射进入脑室中，由此导致脑室中偶尔有NR1细胞存在。
总体而言，多细胞分布或持久性研究的结果显示，在注射后，脑内移植的NR1细胞在大脑中的持久性长达180天。这些研究发现和两项药理学研究的结果显示，移植后，通过几种不同评估测量的NR1诱导的一般运动行为、神经功能和运动协调的持续部分恢复持续时间长达3个月，持续时间最长的一次研究的结束为卒中治疗提供了令人鼓舞的成果。NR1生物分布研究清楚地表明，NR1细胞并未离开注射部位发生迁移。当观察到脑室中NR1细胞偶尔出现不一致的个别检查结果时，这些检查结果看似是由于在非故意的情况下将细胞注射到脑室中(鉴于啮齿动物大脑中的给药面积较小而且脆弱)(当给药面积大得多时，在NR1的临床使用中不会出现此情况)而产生，或者由于收集过程中污染所致。
在选定的免疫缺陷(无胸腺)原始态(非卒中)裸大鼠动物模型中进行的GLP毒理学研究清楚地证明移植后30天和180天大脑中NR1的持久性。动物接受剂量为4×105个NR1细胞(低剂量)或2×106个NR1细胞(高剂量)。IHC染色载玻片的显微镜检查显示，在低剂量(17/20)和高剂量(16/20)动物中，NR1给药后30天，NR1细胞以最低至中等水平存在。在第180天尸体剖验时(移植后6个月)，在给药后180天，低剂量(22/30)和高剂量(23/30)动物中的NR1细胞以最低至显著水平存在。在移植后30天和180天，NR1细胞大多存在于注射部位，显微镜下的NR1细胞呈现为脑实质内的空穴化空隙，在脑室空隙内则较少出现，没有证据表明NR1细胞离开注射部位发生了迁移。
GLP毒理学研究旨在证明无胸腺裸大鼠模型中NR1的细胞存活和缺乏致瘤性/畸胎瘤形成，该研究还表明，研究中使用的无胸腺裸大鼠模型将会通过包含治疗组(这些治疗组也包含添加到NR1中的规定数量的H9 hESC)来支持该模型中干细胞源性畸胎瘤的发展。这些H9加标治疗组不仅显示出畸胎瘤形成，而且还显示出与所添加H9细胞水平相关的剂量相关的畸胎瘤形成，在高H9(50％)和低H9(0.1％)加标剂量下，畸胎瘤形成分别占接受治疗动物的约67％(约14/20)-近5％(约1/19)。人们并未完全了解基质胶在促进畸胎瘤生长方面的总体作用，但是很明显基质也能够支持NR1的生长和持久性，而不会产生畸胎瘤或毒性，该研究比较了基质胶存在和不存在情况下的细胞持久性。然而，即使没有基质胶，NR1细胞在移植后也能在大脑中存活长达45天，并且会得到相同的结果。
当向大脑中注射NR1细胞时，或者当进行掺入H9细胞的NR1细胞的肌肉注射时，未检测到任何细胞或畸胎瘤。当向大脑中单独脑内(IC)注射H9细胞时，未检测到任何细胞或畸胎瘤。仅注射H9细胞后180天，未检测到H9细胞。研究人员注意到，在大脑内的给药部位出现空化现象，表明细胞没有存活或移植。当以1×106的剂量单独给药(未掺入NR1)时，大脑中H9细胞生长乏力，原因不明。然而，由于相同数量的H9细胞掺入1×106个NR1细胞确实导致了畸胎瘤形成，第5-8组中使用的较低数量的H9细胞也是如此，因此上述原因并非是所使用的H9细胞批次缺乏活力。治疗后约50天，接受脑内注射不同细胞培养基(DMEM/F12加0.5％ HSA，含30％基质胶，而非40％)中的1×106个H9细胞/只的大鼠出现了可见畸胎瘤。以最高1×107的剂量进行肌肉注射的细胞(NR1、NR1+H9)缺乏持久性，原因可能是由于肌肉注射部位生长环境的宽松程度较低。
在采用NR1进行的GLP长期毒理学研究中，经NR1治疗的动物中未检测到肿瘤。50只雄性和50只雌性无胸腺裸大鼠接受最高2×106个NR1细胞/只的剂量，移植后进行随访，最长随访时间为6个月。治疗后，未出现局部或全身毒性。NR1已移植并在研究期间持续存在，NR1未从给药部位分布或迁移，大脑或外周组织中未形成任何肿瘤或畸胎瘤。
通过表明在剂量水平递增的情况下，随着H9百分比的增加，向NR1中添加H9 hESC确实产生了与剂量相关的肿瘤，对显示出肿瘤/畸胎瘤的动物模型进行验证。检测NR1中hESC的检测灵敏度至少比最低H9 hESC加标水平0.1％低10倍，其中只有1只动物(约5％)出现未分类的微观组织畸形，而在50％的H9 hESC加标NR1经治疗的动物中，这一比例为67％，其中观察到畸胎瘤，在研究的持续时间内，动物存活是个大问题。见下图：
在注射NR1的动物中未观察到肿瘤，这一结果与所有毒理学评估一致。当H9加标水平升高，NR1水平降低时，接受治疗的动物出现了肿瘤。因此，在H9低至0.1％的情况下，该动物模型可有效显示H9，NR1药物产品本身不产生肿瘤。除了上述其他研究外，本研究也支持NR1的安全性。
非临床研究的相关性；外推人用剂量
NR1的给药靶点是与皮层下卒中相邻的脑组织皮层下部分，在功能性人脑成像和非临床研究中，该区域在组织修复和重组中显示出高活性。这种给药与非临床药理学研究一致，在这些研究中，基于这些模型中预先确定的平均损伤尺寸和位置，确定注射坐标，从而将NR1直接递送到皮层下和皮层缺血性卒中啮齿类动物模型中的卒中损伤附近的组织中。在该非临床模型中，经NR1治疗的动物功能得到改善。
拟定的临床研究剂量递增受试者分组及其各自的剂量如下表所示：表1
在非临床模型的毒理学研究中，对最高2×106个细胞的剂量进行了评价。基于大鼠与人纹状体体积比1:74，可以将相应的等效临床剂量(即148×106个细胞)外推为潜在的最大剂量。但是拟定的第一临床测试剂量为2.5×106个细胞/mL，根据纹状体体积比，将该剂量调整为60倍的安全裕度。提出后续剂量递增至5.0×106、10×106或20×106个NR1细胞(安全裕度为30倍、15倍和7.5倍)/固定体积1mL。这一剂量与采用脑内递送的其他卒中干细胞临床测试中使用的剂量和浓度相当，同时也未超出外推剂量范围，在非临床药理学研究中已观察到疗效，在这些研究中，1×105和4×105个细胞的剂量对啮齿动物有效。使用大鼠与人纹状体之比1:74，大鼠剂量1×105和4×105个细胞将分别扩展到740万和2960万个细胞的临床剂量。
这些关于在人类中进行NR1安全给药的能力的结论以来自上述广泛测试的数据为基础，对以下数量的成年无胸腺裸大鼠进行了测试，测试提供了充足的数据和结果，以计算安全裕度的确定。
·有382只成年无胸腺裸大鼠接受脑内NR1治疗。在382只成年无胸腺裸大鼠中，102只动物以2×106个细胞/只的剂量接受了IC NR1治疗，24只成年无胸腺裸大鼠以1×106个细胞/只的剂量接受了IC NR1治疗。
·治疗后，对60只成年无胸腺裸大鼠进行180天随访，其中一半动物接受2×106个细胞，一半接受4×105个细胞。
·成年无胸腺裸(40只)大鼠接受1×107个细胞/只的NR1肌肉注射治疗，并随访180天，这些动物中未出现细胞迁移或细胞外生长。
·新生无胸腺裸(6只)大鼠以1×106个细胞/只的剂量接受脑内NR1治疗。
NSG小鼠(6只)以1×106个细胞/只的剂量接受脑内NR1治疗。
高剂量动物接受最大可行剂量的治疗，给药后30天和180天选择处死时间点。GLP毒理学研究中包括较长的随访持续时间(6个月)，以便有时间检测是否存在可能由NR1细胞生长或污染干细胞前体引起的缓慢形成的畸胎瘤和异位组织块。细胞注射培养基含有基质胶，众所周知，基质胶可以促进干细胞源性神经祖细胞在体细胞组织中的存活，以增强NR1细胞生长，同时优化罕见畸胎瘤形成的检测。采用NR1治疗后，未发现局部或全身毒性，其中包括对存活率、临床病理学终点和组织中的显微镜检查结果的任何影响。在为期6个月的研究期间，任何组织或器官在NR1治疗后均未发现肿瘤或畸胎瘤形成的证据。IHC染色和qPCR分析显示，在移植后30天-180天，细胞保持在较低但一致的水平，且并未从注射部位迁移。在其他几项研究(包括前导性毒理学研究和两项药理学研究)中，已经显示出NR1的持久性以及缺乏迁移。NR1生物分布研究也表明，NR1细胞并未离开脑内注射部位发生迁移。
在大脑中动脉闭塞ISS模型中，在将NR1细胞移植到免疫抑制Sprague Dawley(SD)大鼠的梗死周围区域后，进行了生物分布研究。USF-1研究中也采用了该模型，NR1的初步药理学研究显示了NR1在诱导运动和行为功能的部分恢复方面的疗效。该模型为良好表征的ISS模型，该模型通常用于卒中领域，能够提供与慢性ISS受试者的拟定靶标适应症最接近的匹配。
在生物分布研究中，在以每只动物4×105个细胞的剂量注射到大脑皮层和纹状体之后，NR1细胞在梗死周围注射部位至少持续存在45天。NR1细胞仍位于给药部位，而并未离开注射针道迁移到邻近大脑区域或外周组织。在非卒中无胸腺裸大鼠中进行的GLP毒理学研究的结果证实了这些结果，NR1细胞并未离开注射针道发生迁移，并且这些细胞在大脑中的注射部位长期持续存在。
临床研究中证明NR1给药安全性的证据优势
对所有前导性药理学研究、免疫抑制SD大鼠中ISS大鼠模型的为期60天的GLP生物分布研究以及无胸腺裸大鼠中为期6个月的GLP毒理学研究进行评价，以评估单次IC剂量NR1在每只动物最高2×106个细胞水平下的长期安全性。临床上证明NR1给药安全性的证据优势包括：
·通过向NR1中掺入H9，经验证的无胸腺裸大鼠模型显示，如果存在足够数量的h9hESC细胞，则前体污染将检测出畸胎瘤；
·随访持续时间长，可以有足够时间检测是否存在可能由NR1引起的缓慢形成的畸胎瘤和异位组织块；
·用于毒理学研究的细胞注射培养基中含有基质胶，众所周知，基质胶可以促进干细胞源性神经祖细胞在体细胞组织中的存活持续时间(Akbasak等人，1996；Jin等人，2010a；Jin等人，2010b；Kutschka等人，2006)，以促进NR1细胞生长，同时优化畸胎瘤形成的检测；
·延长NR1治疗后，缺少局部或全身毒性，其中包括对存活率、临床病理学终点和组织中的显微镜检查结果没有任何影响。
上述结论使我们坚信，由于在持续6个月的研究期间，在NR1治疗后，在任何组织或器官中均未检测到毒性、肿瘤或畸胎瘤形成的证据，因此可以通过脑内注射(IC)向大脑安全地施用动物模型中使用的NR1剂量。NR1未从给药部位分布或迁移，没有任何证据表明在大脑注射部位或身体其他组织的任何距离处存在人类细胞。利用非常灵敏的测定，检测到了人类DNA，并通过对显微镜载玻片上的人类细胞进行免疫组织化学染色，证明注射部位存在NR1细胞，移植后180天，梗死周围注射部位有明显的可检测细胞。
在非临床模型中，对卒中模型动物中最高2×106个细胞的剂量进行了评价。如上所述，以最高2×106个细胞/mL的剂量接受治疗的卒中动物恢复了一部分卒中前的运动功能。
基于大鼠与人纹状体体积比1:74，可以将相应的等效临床剂量(即148×106个细胞)外推为潜在的最大剂量。但是拟定的第一临床测试剂量为2.5×106个细胞/mL，根据纹状体体积比，将该剂量调整为60倍的安全裕度。提出后续剂量递增至5.0×106、10×106或20×106个NR1细胞(安全裕度为30倍、15倍和7.5倍)/固定体积1mL。这一剂量与采用脑内递送的其他卒中干细胞临床测试中使用的剂量和浓度相当，同时也未超出外推剂量范围，在非临床药理学研究中已观察到疗效，在这些研究中，1×105和4×105个细胞的剂量对啮齿动物有效。使用大鼠与人纹状体之比1:74，大鼠剂量1×105和4×105个细胞将分别扩展到740万和2960万个细胞的临床剂量。
示例2
非临床概述
NR1药物产品是源自人胚胎干细胞(hESC)(hESC)H9的神经干细胞产品。目前该产品正处于研发阶段，可用于治疗患有偏瘫的成年受试者中伴有运动缺陷的慢性缺血性皮层下卒中。NR1的给药靶点是与皮层下卒中相邻的脑组织皮层下部分，在功能性人脑成像和非临床研究中，该区域在组织修复和重组中显示出高活性。两项非临床研究的进行旨在测试NR1治疗的疗效，其中一项研究在免疫抑制SD大鼠缺血性皮层下卒中(ISS)模型中进行，另一项研究在免疫缺陷无胸腺裸大鼠的缺血性皮层卒中(ICS)模型中进行。采用免疫缺陷或免疫抑制动物，以最大限度地减少潜在的人NR1细胞排异。进行调查性研究有助于阐明两种疗效模型中与NR1相关的部分感觉运动恢复的作用机制，同时证明GLP生物分布和毒理学研究采用了适当的动物模型。
由于NR1药物产品具有细胞状性质，因此药代动力学、新陈代谢或排泄研究并不适用。在免疫抑制SD大鼠的ISS卒中模型(也是关键性药理学研究中使用的模型)中，在脑内(IC)注射NR1后进行了GLP生物分布研究。关键性GLP毒理学研究中采用了原始态(非卒中)无胸腺裸大鼠。GLP毒理学研究评价了移植后180天内脑内注射NR1的潜在不良影响。该研究还包括接受最高50％ NR1治疗剂量水平的NR1药物产品和H9hESC的混合物的治疗组，以确定免疫缺陷大鼠模型检测治疗后可能发生畸胎瘤的能力。是一种结构蛋白质和细胞生长因子的非均匀混合物，将其包含在毒理学研究的细胞培养基中，以提高如果NR1药物产品中残留污染H9细胞时形成畸胎瘤的可能性。基质胶既不会用于人类受试者的临床研究，也不会用于非临床药理学或GLP生物分布研究。
为了评估NR1的疗效、生物分布和毒理学而进行的一些研究称为“联合研究”，即其研究终点包括多个上述终点，同时也会进行数据收集。例如，研究可能包括药理学和毒理学终点，但不包括生物分布终点，或者可能包括全部三个领域。单一研究中的多学科终点评估允许对同一动物模型系统中的活性和毒性的相互关系进行综合评估，从而对疗效、活性和生物分布的关系以及安全性产生独到的见解。NR1细胞是否分布在大脑外部，或者NR1细胞的存活时间是否延长等问题可以为毒性非预期靶器官提供路线图。这种综合性的非临床测试策略提供了对NR1细胞疗法疗效和安全性的最相关非临床评估以及临床环境的外推。
主要药效学
进行了两项非GLP药理学研究，旨在测试缺血性皮层下卒中(ISS)和缺血性皮层卒中(ICS)非临床大鼠模型脑内注射NR1治疗的疗效和安全性。利用一组运动和行为测试测量部分功能恢复，从而量化感觉运动功能的损伤后恢复。利用组织学评价，探究两项研究中与NR1影响存在潜在相关性的候选作用机制。在这两项药理学研究中，潜在毒性评价仅限于记录不良影响的临床体征、体重变化和存活率，以避免对恢复评估做出推理。进行了几项小规模调查性研究，旨在评价NR1药物产品的作用机制。在这些专门性研究中，对细胞存活率、炎症、小胶质细胞和自然杀伤细胞、神经可塑性和炎症对NR1相关感觉运动恢复的作用进行了评价，对NR1进行了分泌蛋白质组分析，并检查了TSPO-PET作为NR1诱导的卒中后功能恢复的预测因子的用途。
关键性疗效研究对ISS大脑中动脉闭塞模型中的免疫抑制Sprague-Dawley(SD)大鼠中NR1的脑内(IC)移植的潜在治疗价值进行了评价。该系统为良好表征的ISS模型，该模型通常用于卒中领域，能够提供与慢性ISS受试者的拟定靶标适应症最接近的匹配。该研究的主要终点是验证以下假设，即在卒中后7天或28天进行NR1治疗在抬高身体摇摆试验(EBST)中将产生显著改善，次要终点是在神经系统检查和转棒测试中产生改善。研究表明，在ISS模型中，NR1的IC移植可促进一般运动行为、神经功能和运动协调的恢复。在移植后第2个月，开始通过测试进行功能恢复，一直持续到移植后至少3个月(研究结束)。总体而言，卒中急性期和慢性期低细胞剂量和高细胞剂量条件下的移植均能显著促进持续性功能恢复，但根据EBST和转棒测试的结果，慢性期和高剂量条件下的移植似乎才是最佳移植方案。
组织学分析证实，缺血性损伤为单侧损伤，并且观察到运动功能和运动协调的功能丧失最为明显。在治疗后第3个月进行的组织学评估表明，在卒中后急性期(7天)，以及在卒中后慢性期(28天)高剂量NR1下的梗死周围小胶质细胞/免疫细胞活化减少与NR1相关的功能恢复增强之间，当施用NR1时，梗死周围血管密度增加与NR1相关功能恢复增强之间存在联系。虽然宿主大脑修复的其他机制可能也会促成观察到的对功能恢复的影响，但有必要对作为NR1候选作用机制的新生血管和免疫调节进行深入研究。虽然移植后3个月，在注射部位或附近未发现存活的NR1细胞，但是从治疗后2个月开始可观察到功能恢复已经改善，并持续到治疗后至少3个月(研究结束)，这表明在明显缺乏长期NR1持久性的情况下，慢性恢复有所增强。
辅助疗效研究采用ICS模型(另一种广泛使用的卒中模型)对无胸腺裸大鼠中NR1IC移植的治疗效果进行了评价。在卒中损伤前1周开始进行感觉运动功能测试，然后每周进行一次，直到治疗后8周为止。寿命内评估完成后，在治疗后9周，收集脑组织进行组织学评价。Stanford-5功能恢复的主要衡量标准是感觉运动行为测试，称为触须-前爪反应测试。同时还包括二次测试模态和组织学评估。测试结果显示，采用高剂量(而非低剂量)NR1细胞进行治疗可以改善感觉运动功能。治疗后4周，首次出现改善，并一直持续到研究结束。组织学评估显示，在治疗后9周，相对于溶媒对照组，以高剂量治疗的大鼠梗死周围皮层的小胶质细胞/免疫细胞活化减少，但这种情况与功能恢复无关。相对于溶媒治疗，在采用NR1剂量的情况下，梗死面积、梗死周围血管密度或梗死周围轴突保留/生长方面均未观察到任何显著差异。在给药后9周，在任何动物中均未检测到存活的人类细胞(NR1细胞)，这表明在这种异种移植物损伤模型中，NR1细胞无法在该实验中长期持续存在。
进行了几项专门调查性研究，以检查NR1细胞在刺激动物卒中后功能恢复方面的作用，以及确定提高人NR1细胞存活率的最佳方式。研究包括评价炎症和细胞可塑性对功能恢复所起到的相对作用、移植NR1细胞的分泌蛋白质组分析、评价NK或小胶质细胞耗竭对NR1细胞持久性的影响、评价T2-FLAIR信号是否可以作为NR1细胞相关功能恢复的预测因子以及评估治疗的免疫调节功能。
我们评估了NR1移植到卒中大鼠大脑中所引发的炎症反应的作用。与对照动物相比，尽管经NR1治疗的动物表现出可变性更强的免疫反应，但是在移植后早期，NR1通过将巨噬细胞从M1/促炎状态变为M2/抗炎状态做出免疫应答，这与体外可塑性研究的结果相关。为了进一步评价NR1移植对慢性卒中的免疫调节作用，在大鼠卒中模型中，将T2-FLAIR MRI信号作为NR1诱导的卒中受试者功能恢复的潜在临床预测因子。T2-MRI FLAIR信号通常与炎症有关。利用该信号和第二非侵入性成像模态(即转运蛋白18kDa(TSPO)的PET成像，称为TSPO-PET)，可以监测大鼠中的大脑炎症。TSPO包括活化的免疫细胞，包括脑部驻留免疫细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞，以及浸润骨髓细胞，如单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞。健康大脑中的TSPO水平较低，但在炎症条件下，TSPO水平上调。因此，TSPO-PET放射性配体成为了有用的神经炎症指标，并且在卒中后5天-24个月的时间内，在卒中受试者的卒中损伤和远端脑区已经观察到TSPO-PET信号增加。与FLAIR损伤相关的针道区域免疫组织化学分析显示，经NR1和溶媒治疗动物之间在炎症反应上存在质的差异，其中经治疗动物的注射针道边界上有更多活化的巨噬细胞/小胶质细胞。来自卒中裸大鼠的TSPO-PET数据与FLAIR检查结果一致，经NR1治疗的大鼠移植部位附近和更远部位的免疫细胞活性高于经溶媒治疗的大鼠。大部分免疫细胞活性存在于大脑的连接区域，这意味着hNSC具有广泛的免疫调节作用。本研究的结果(特别是与下文讨论的经NR1治疗的大鼠的体内分泌蛋白质组分析一致的结果)强调免疫调节是NR1促进卒中恢复的主要作用机制。
进行了两项研究，旨在评价分泌因子在NR1活性方面所起到的作用。一项研究通过分析NR1细胞如何影响卒中后裸大鼠梗死周围区域皮层活性，评估了NR1细胞对神经可塑性的影响。在人和啮齿动物卒中后观察到的自发恢复中，大脑可塑性或重连起到关键作用，重连出现在梗死周围区域附近的存活回路中，使健康脑区能够补偿受损区域的功能。移植后第7天，NR1移植显著(p<0.05)增加了梗死周围皮层的运动回路活性，其中第2和第3皮层中活性增加最明显。相反，抑制连接的幅度显著减小(p＜0.05)，发病也有所延迟。未发现NR1对兴奋性连接有任何显著影响。这些研究结果表明，NR1细胞通过从抑制性控制中释放梗死周围区域内的单个神经元来增加运动回路活性。体外研究表明，NR1细胞会影响神经元细胞的可塑性，特别是通过增强视网膜神经节神经元细胞(RGC)的突触发生。基因本体论分析将NR1移植与可塑性相关基因的表达联系起来，表明NR1相关早期调节神经元活性和早期可塑性能够实现后期功能恢复。研究发现，NR1细胞导致参与刺激成人神经前体细胞增殖、神经分化、直接参与神经元电生理特性的门控通道、轴突导向、轴突生成和突触发生的基因的特异性和差异性表达。总体而言，NR1细胞似乎通过从抑制性控制中释放梗死周围皮层中的单个神经元，以及通过分泌刺激突触发生的因子来调节可塑性，促成了卒中后梗死周围区域的可塑性。在卒中大鼠接受GFP标记NR1之后2天，NR1细胞的分泌蛋白质组分析采用了TRAP分析和RNA测序(TRAP/RNAseq)。该分析确定了分泌蛋白的175个基因，前20个富集过程与大脑修复相关，包括细胞外基质(ECM)重塑(参与大多数大脑修复机制)以及与炎症和轴突导向相关的过程。其次，NR1分泌因子起到调节大脑修复和轴突导向的作用。体外分析确定了编码分泌因子的约400个基因，其中近200个基因与炎症有关，主要是细胞因子活性，其他基因则参与细胞外基质(ECM)的组织。具体而言，在体内卒中环境中，上调NRG3和TGFb3。总体而言，这两项研究表明，NR1细胞分泌的因子能够调节参与大脑后期功能恢复的各种其他因子。
为了改进生物分布和毒理学研究用动物模型，进行了两项研究，以评价移植后大脑中NR1细胞存活涉及的因素。组织学分析结果表明了在ISS诱导后的慢性期(28天)梗死小胶质细胞/单核细胞活化减少所产生的影响。由于小胶质细胞作为巨噬细胞介导CNS中的免疫应答，它们(小胶质细胞)可能会对移植后NR1的存活产生有害影响。利用饲养层中的PX5622，可以耗竭小胶质细胞，使移植后一周内大脑中的小胶质细胞数量减少多达40％，血液中的小胶质细胞数量减少52％。移植后一周，NR1细胞存活率未受任何影响。在第二项研究中，在NR1移植前后，通过采用抗唾液酸/GM1抗体进行治疗，考察了耗竭自然杀伤(NK)细胞数量对NR1存活率的影响。与先前的研究一样，尽管NK水平降低了约80-90％，但是NR1存活率并未提高。在这两项研究中，仅测量了NR1存活率，而未测量对卒中恢复的直接影响，恢复过程的复杂性可能会影响我们对NR1细胞存活率与卒中恢复关系的理解。次要结论是，小胶质细胞和NK细胞的耗竭都不会提高NR1存活率，也不会得到用于测试NR1疗效和安全性的更好动物模型。
分析方法
位于马塔瓦查尔斯河实验室(CRL-MTWN，前身为MPI,Inc.)开发了一种定量实时PCR(qPCR)方法，用于量化啮齿动物组织中人核gDNA的水平。采用完全限定的测定法，经验证，该测定法可用于大鼠GLP生物分布和毒理学研究。对经验证的测定法进行交叉验证，即可利用来自HK293细胞的DNA，针对来自研究USF-1的固定和冷冻大鼠组织中的NR1 gDNA绘制标准曲线。在用于这些研究的所有测定中，用于检测人核DNA的引物和探针序列均相同。
按照MPI SOP CMB-19和CMB-78，从大鼠组织中提取总DNA。按照CMB方法CMB-2122-007-B，在96孔板上进行qPCR反应。采用标准曲线、一组QC样本和研究样本，分别运行各平板。对于标准点，以每次反应104、105、103、2×102、102、50、20和0(零)个拷贝的频率，重复运行标准曲线3次。采用具有零拷贝且仅包含基质的标准品，以确认试剂纯度。
浓度限值如下：检出限(LOD)：gDNA/μg组织的10个拷贝；低于LOD的样本确定为BLOD；定量下限(LLOQ)：gDNA/μg组织的20个拷贝；每次反应结果介于10-20个拷贝之间的样本确定为BLOQ；定量上限(ULOQ)；gDNA的104个拷贝
采用完全限定、经验证的qPCR方法。
吸收
未进行NR1的吸收研究。
分布
未进行NR1的蛋白结合、分布或胎盘转移研究。在几项研究中，对生物分布进行了评价。
在免疫抑制的正常大鼠中，进行了为期两个月的GLP顺应性生物分布研究，大鼠接受缺血性皮层下卒中(ISS)程序，然后采用NR1进行IC治疗。在移植后最多60天的多个时间点，利用经验证的qPCR测定法，对NR1水平进行量化。作为GLP毒理学研究的一部分，还对细胞持久性和分布进行了其他研究。移植后三(3)个月，在尸体剖验时，收集SD大鼠(USF-1)的选定组织，其中SD大鼠已使用IHC和/或qPCR进行了ISS，以便对NR1细胞进行量化。同样，在移植后9周，从已接受ICS的无胸腺裸大鼠中收集选定的组织进行NR1量化。
我们对移植到“卒中模型”大鼠大脑中的供试品NR1的分布进行了监测。在该模型中，通过大脑中动脉闭塞，用外科方法诱导ISS，并在卒中后3-5天(急性卒中)或卒中后28-30天(慢性卒中)脑内注射NR1细胞。通过腹腔注射环孢菌素A，对大鼠进行免疫抑制，以降低人NR1细胞免疫排斥反应的可能性。在移植后24小时-60天的时间点，提取大脑切片制备载玻片，并选用外周组织，利用苏木精与伊红(H&E)染色和IHC染色进行显微镜检查，以鉴定人细胞。利用严格的无菌技术，收集非中枢神经系统组织(如上所列)和脑组织的样本，采用经验证的实时qPCR测定法进行分析，以检测人核DNA。根据IHC显示，在移植后的45天内，急性和慢性卒中组动物大脑中NR1细胞的最低至轻度至中等数量级NR1的发生率和数量级均呈总体下降趋势。NR1细胞的存在局限于细胞注入的大脑半球，在任何大鼠的任何其他器官中均未检测到细胞。
表2大脑中NR1的持久性(IHC测定)
利用qPCR分析，并未在急性卒中组动物的任何大脑样本中检测到NR1细胞gDNA，其原因很可能是由于组织取样程序中最靠近注射部位的组织被用来进行组织病理学研究，而qPCR分析只能使用更远端的组织。相反，在慢性卒中组的两项分析中，在注射部位及其附近均收集到组织。在这种情况下，在给药后24小时，在6/10只动物中检测到NR1细胞gDNA(拷贝数范围为33-601个拷贝/μg样本DNA)，在给药后3天，在2/10只动物中检测到NR1细胞gDNA(拷贝数为68和91)，在给药后一周，在2/10只动物中检测到NR1细胞gDNA(均为BLOQ)。在给药后30、45或60天，利用qPCR均未检测到NR1细胞。与急性组相比，慢性组早期时间点存在NR1 gDNA的原因可能是由于qPCR分析用组织收集部位发生变化，而非由于NR1细胞存活率方面存在真实差异。
利用IHC或qPCR进行检测时，在远离注射部位的大脑任何区域内或外周组织中均未发现NR1细胞，少数动物可能会出现的例外情况是在非故意的情况下细胞被注射进入脑室中。在所有大鼠中，NR1细胞局限于大脑半球，特别是注射针道，通过IHC染色，即可在显微镜下对移植的NR1细胞进行鉴定。在大脑中远离注射部位的部位或任何外周器官中，均未检测到NR1细胞。在六只动物中，在接近或低于qPCR测定法的定量极限的水平上，在单个脊髓切片中检测到非常低的NR1水平(一只动物的最高拷贝数为22，其他5只动物为BLOQ值)。提交动物的脊髓切片，进行人细胞的IHC HuNu染色，以评价这一研究结果。除了一只患病动物外，所有患病动物的样本都含有偶见HuNu阳性细胞(每个患病动物载玻片的单个细胞个数范围为1-3个细胞)。所有细胞或者存在于脊髓脑脊膜的边缘/外部，或者与脊髓组织切片不在同一切片上。这些研究结果不能说明NR1细胞从注射部位直接迁移到脊髓中，相反手术过程很可能造成了污染，这种污染与啮齿动物颅骨和大脑的工作区域较小、意外注射到脑室和蛛网膜下腔CSF空隙和/或尸体剖验或组织处理程序引入了偶见细胞有关。人外科手术则不会存在这一问题，因为与大鼠相比，人颅骨手术野要大得多，能够避免污染，从而避免意外注射到脑室和蛛网膜下腔CSF间隙中。在大脑或任何其他组织中，无论用肉眼还是显微镜，均未检测到畸胎瘤存在的证据。
在免疫缺陷原始态(非卒中)裸大鼠中进行的GLP毒理学研究中，还评价了移植后30天和180天大脑中NR1的持久性。利用IHC染色，在注射部位或其附近，在低剂量(17/20)和高剂量(16/20)动物中，在NR1给药后30天，可以看到存在最低至中等水平的NR1细胞，相比之下，在移植后6个月进行给药后的180天，在低剂量(22/30)和高剂量(23/30)动物中，存在最低至显著水平的NR1细胞。与生物分布研究相同，NR1细胞主要存在于注射部位，显微镜下的NR1细胞呈现为脑实质内的空穴化空隙，在脑室空隙内则较少出现，没有证据表明NR1细胞离开注射部位发生了迁移。脑室中存在NR1细胞的原因可能是移植过程中细胞在非故意情况下被注射到脑室中(参见上文评注)。qPCR分析结果一致：在移植后30天和180天，低剂量和高剂量脑内注射的动物中存在NR1细胞。在给药后30天，与高剂量下21-37个拷贝(14/20只动物)的范围相比，低剂量下测量的每μg脑裂解物gDNA(6/20只动物)的NR1 gDNA拷贝范围为21-54个。到给药后180天为止，与在18/20只高剂量动物中检测到25-97个拷贝相比，在17/20只低剂量动物中检测到25-73个拷贝。在接受1×107个NR1细胞的第11组动物的肌肉注射部位未检测到NR1 gDNA，在对照动物中也未检测到NR1 gDNA。
对NR1在大脑中的持久性进行评价的其他研究包括：在原始态(非卒中)NSG小鼠或裸大鼠中进行的三项前导性毒理学研究，以及在原始态裸大鼠中进行的小规模作用机制研究。
在最大规模的研究中，在DMEM/F12培养基加0.5％ HSA(含或不含30％基质胶)中，对原始态(非卒中)裸大鼠中通过脑内注射的NR1细胞的持久性进行了评价。通过对人核蛋白抗原HuNu进行半定量IHC染色，对细胞持久性进行了为期约88天的随访。在第88天时，仅在含有基质胶的动物组中检测到低水平(在2/4只动物中，小于原始细胞剂量的0.2％)的细胞，而在非基质胶动物组中未检测到细胞。虽然检测到的细胞数量远低于两项GLP研究中检测到的细胞数量，但结果也表明通过脑内移植的NR1细胞的存活时间有所延长。两项较小规模的研究也一致显示，在给药后长达60天的时间内，存活率水平较低，并且与不含基质胶的情况相比，当细胞培养基中含有基质胶时，NR1存活率有所提高。
总体而言，多细胞分布或持久性研究的结果显示，在注射后，脑内移植的NR1细胞在大脑中的持久性长达180天。这些研究发现和两项药理学研究的结果显示，移植后，通过几种不同评估测量的NR1诱导的一般运动行为、神经功能和运动协调的持续部分恢复持续时间长达3个月，此时持续时间最长的一次研究结束。NR1生物分布研究清楚地表明，NR1细胞并未离开注射部位发生迁移。研究人员认为，脑室中NR1细胞的偶见研究结果是由于细胞在非故意情况下被注射到脑室中(由于人类受试者的手术野较大，临床使用NR1时不会出现此情况)，或者由于收集时污染造成。
单剂量毒理学
在啮齿动物中进行了几项单剂量研究NR1毒理学研究，包括三项前导性研究和一项为期180天的GLP顺应性研究。在原始态(非卒中)雄性和雌性无胸腺裸大鼠中，使用cGMPNR1药物产品进行了GLP研究，持续时间为180天。其主要目标是评价NR1药物产品的耐受性和一般毒性。本研究还评价了细胞移植后6个月内NR1细胞从注射部位迁移的持久性和可能性。此外，该研究设计还包括在特定水平下(范围为2×106个细胞NR1剂量的0.1％-50％(2×103-1×106个H9细胞/动物))采用掺入H9 hESC的NR1细胞进行治疗的动物组，以确定无胸腺大鼠模型检测干细胞相关畸胎瘤形成的能力。
在进行GLP毒理学研究之前，进行前导性研究，以选出最佳动物模型，并确定三种免疫缺陷动物模型(NSG小鼠、新生无胸腺裸大鼠和成年无胸腺裸大鼠)在移植后28天内的适用性。基于其研究结果，选择成年无胸腺裸大鼠进行进一步评价。注射后，NR1在大脑中最多可持续存在2个月，之后，第二项前导性研究进一步表征了成年无胸腺裸大鼠模型。研究还评估了基质胶(包含在细胞培养基中，以支持细胞存活)对注射部位NR1持久性的影响。同时还在成年裸大鼠中进行了最早期的NR1前导性研究，但这次研究采用了不同的细胞培养基(DMEM/F12加0.5％ HSA)，而未采用关键性毒理学研究和上述两项前导性研究中使用的勃脉力A加0.5％ HSA。这次研究之后，未使用DMEM/F12培养基，因为有人认为DMEM/F12培养基不适合人类受试者使用。这项研究还包括H9 hESC，以评价模型的适用性，同时评价基质胶对移植后细胞持久性的影响。与其他研究的结果一样，NR1具有良好的耐受性。NR1持久性数据较有限，这与后期大规模GLP研究中看到的情况一致。在三项前导性研究中，细胞培养基中包含基质胶，为细胞生长提供了最佳环境，有助于评估NR1细胞的存活率和畸胎瘤的潜在生长。在对包含基质胶的作用进行评估的两项研究中，通过加入基质胶，提高了大脑中NR1细胞的持久性。
GLP毒理学研究的动物模型和设计以前导性研究的结果为基础，前导性研究表明，移植后，大脑内基质胶对细胞持久性具有有益影响，并且与新生裸大鼠或NSG小鼠相比，成年无胸腺裸大鼠中NR1细胞的持久性相对增加。两项调查性研究显示，由于缺少减少小胶质细胞或NK细胞数量对NR1持久性的影响，因此放弃使用这些选择GLP研究动物模型的方法。在初步工作的基础上，选用成年无胸腺裸大鼠进行GLP毒理学研究，这些成年无胸腺裸大鼠未进行预治疗，以选择性地减少特定的细胞群，包括向细胞培养基中添加基质胶，以提高细胞存活率。
在GLP研究中，由原始态(非卒中)雄性和雌性裸大鼠组成的九个治疗组按组别接受以下物质的脑内移植：cGMP NR1细胞(美国希望之城医疗中心生产)，或者以H9hESC作为阳性对照，或NR1细胞和H9细胞的组合。通过立体定向方式将细胞注入大脑每个半球的两个皮层和一个纹状体注射部位。基质胶是一种结构蛋白和细胞生长因子的非均匀混合物，细胞培养基中就含有基质胶，提高了畸胎瘤细胞存活和生长的可能性。三个治疗组通过左后肢股二头肌肌肉注射(IM)供试品或阳性对照和供试品的组合。剂量为4×105或2×106(脑内注射)或1×107(肌肉注射)。保持动物存活约30天或180天，以进行最终尸体剖验。组合组包括掺入NR1细胞，NR1水平的范围为2×106NR1剂量的50％(1×106个H9细胞)-0.1％(2000个H9细胞)。对标准毒理学终点进行监测。在NR1移植后约30天和180天，进行尸体剖验。用组织制备载玻片，并用H&E染色，或进行IHC染色，以鉴定人类细胞。收集大脑左半球或大腿肌肉以及潜在靶器官进行qPCR分析。
在最高2×106个NR1细胞(脑内注射)或1×107个细胞(肌肉注射)的剂量下，施用NR1与任何意外死亡率、临床发现、体重或摄食量的变化、临床病理学或骨髓终点的变化或宏观或微观观察无关。不存在与NR1相关的早期死亡和/或安乐死，并且在任何仅采用NR1进行治疗的组别中，大脑或外周组织中均未发现畸胎瘤形成。在为期180天的研究期间，在高剂量(2×106个细胞/动物)下对NR1耐受良好。
对第1组到第10组的大脑右半球注射针道和第11组到第13组动物的肌肉注射部位进行NR1 HuNu染色。在仅接受NR1药物产品脑内注射的第2组和第3组中，在给药后28天，在低剂量(17/20只动物)和高剂量(16/20只动物)下，NR1细胞以最低至中等水平存在。在第180天尸体剖验时，低剂量(22/30只动物)和高剂量(23/30只动物)动物中的NR1细胞以最低至显著水平存在。在移植后28天和180天，NR1细胞大多存在于注射部位，显微镜下的NR1细胞呈现为脑实质内的空穴化空隙，在脑室空隙内则较少出现，没有证据表明NR1细胞离开注射部位发生了迁移。一些动物在脑脊膜和/或注射针道中表现出轻度软骨/骨化生，原因是开颅手术产生的残留碎片，即先前在大鼠中观察到的这一给药程序的伪影。在一只雄性动物(动物编号3018)中，给药程序中一部分NR1细胞培养基发生沉积，因此化生(描述为分化良好的非肿瘤性间充质化生的小型包裹性病灶，以软骨岛、最小骨和致密纤维结缔组织厚包膜为特征)具有分散的HuNu阳性细胞。
根据早期研究的预测，并经本次GLP研究证实，无胸腺大鼠模型能够检测到干细胞相关畸胎瘤的形成，表明该模型适用于NR1毒性和畸胎瘤/致癌评估。当动物接受掺入H9细胞的NR1细胞组合时，在大脑注射部位有明显肉眼可见的畸胎瘤，导致第4组的9/20只动物(50％的H9)、第5组的7/20只动物(25％的H9)和第6组的2/10只动物(10％的H9)提前终止。第7组(1％的H9)和第8组(0.1％的H9)中未出现肉眼可见的畸胎瘤。在接受低于10％的H9细胞加标部分的组别中，未发生提前终止死亡。完整数据如表2.4.4.1.A所示：畸胎瘤形成的发病率。根据预期，在剂量注射液掺入更高浓度H9细胞的组别中，早期可见畸胎瘤。在所有H9加标治疗组中均出现剂量依赖性畸胎瘤的情况下，显微镜检查一致。显微镜下可见，第4-6组中存在的畸胎瘤由内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的组织构成，包括各组织(如皮肤、腺体、软骨和/或骨形成以及神经组织)的混合物。这些畸胎瘤往往会形成较大的组织块。相对而言，第7组(NR1掺入1％的H9；4/20只动物)和第8组(NR1掺入0.1％的H9；1/19只动物)动物的畸胎瘤较小，主要由偶然出现的神经组织较小结构组成，并包含脉络丛样结构、室管膜上皮和/或接近正常外观的白质的膨出部，畸胎瘤的特征在于，畸胎瘤不包含来源于所有三个胚层的组织。在H9加标治疗组中，肉眼和/或显微镜下看到的所有畸胎瘤HuNu染色呈阳性。在任何H9加标组或任何仅接受NR1药物产品治疗的组别中，均未观察到大脑外部或远离注射部位处有形成畸胎瘤的证据。
表3畸胎瘤形成的发病率
在移植后长达180天的治疗后观察期间，当单独脑内注射H9细胞或NR1细胞时，或者当肌肉外周注射掺入H9细胞的NR1细胞时，未检测到人类细胞或畸胎瘤。在接受H9治疗的治疗组中，研究人员注意到，在大脑内的给药部位出现空化现象，表明细胞没有存活或移植。当以1×106的剂量单独给药时，大脑中H9细胞生长乏力，原因不明，但是显然不支持H9移植。然而，由于相同数量的H9细胞掺入1×106个NR1细胞导致形成畸胎瘤(第4组)，第5-8组中使用较低数量的H9细胞也是如此，因此上述原因并非是所使用的H9细胞缺乏活力。治疗后约50天，接受脑内注射不同细胞培养基(DMEM/F12加0.5％ HSA，含30％基质胶，而非40％)中的1×106个H9细胞/只的大鼠出现了可见畸胎瘤。以最高1×107的剂量进行肌肉注射的细胞(NR1、H9和NR1+H9)生长不足，原因是由于肌肉注射部位生长环境的宽松程度较低。
本研究的结果证明，通过脑内注射，以最高2×106个细胞的剂量向大脑实质中施用cGMP NR1药物产品耐受性较好，且此给药未导致动物死亡，或没有证据表明导致局部或全身毒性、致瘤性或畸胎瘤形成。NR1进行了移植，在研究持续期间持续存在，并保留在给药部位。在为期180天的无治疗观察期内，在大脑或任何外周组织中，在最高2×106个NR1细胞/动物的剂量下，NR1(即配制的药物产品)未形成畸胎瘤，当H9细胞以规定的浓度掺入NR1并以低至2000个H9细胞的剂量(NR1剂量的0.1％)进行脑内注射时，即使存在生长促进基质胶，所使用的无胸腺裸大鼠模型也能检测到畸胎瘤的发展。
即使为了最大限度地提高细胞生长的可能性而在含有40％基质胶的细胞培养基中移植，在为期6个月的研究持续时间内，单独使用最高2×106个细胞/动物剂量的cGMPNR1药物产品(H9细胞残留率低于0.01％)进行治疗也并未导致畸胎瘤形成。基质胶是一种来源于小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤细胞的复合蛋白质混合物，据报道，基质胶中含有鼠类生长因子。基质胶仅用于促进人类细胞在啮齿动物中的存活，临床NR1药物产品的注射介质中不会含有基质胶。
概述和结论
如上所述，对NR1药物产品进行了大量药理学、生物分布和毒理学研究。开展相关研究的关键在于使用相关的动物模型。所使用的模型必须支持足够数量的人NR1细胞在啮齿动物中存活足够的时间，以便对疗效、分布和毒性进行评估。采用免疫缺陷或免疫抑制的啮齿动物模型，以最大限度地减少啮齿动物测试系统中人NR1药物产品发生排异反应的可能性。具体而言，对于药理学研究，为了对疗效做出最佳判断，动物模型和实验条件应尽可能复制人类群体的临床条件，包括治疗模式和途径、NR1活性的靶标以及使用与人类受试者相关的方法和终点进行结果测量。对于生物分布研究，该模型还应尽可能模拟人类受试者的临床状况，包括缺血性皮层下卒中，即，应选用卒中动物，以提供针对卒中大脑中NR1分布的相关评估。对于毒理学研究，动物模型应能评估NR1的一般毒性，并且对于这种干细胞源性细胞疗法，该动物模型应能成为支持干细胞相关畸胎瘤和肿瘤的生长发育的动物模型。为了避免卒中对毒性、致瘤性和畸胎瘤形成的评价可能产生混淆影响，应在原始态非卒中动物中建立毒理学模型。
动物模型
药理学：所使用的主要模型是免疫抑制Sprague-Dawley大鼠缺血性皮层下卒中(ISS)的大脑中动脉闭塞模型。该模型为良好表征的非临床模型，通常用于卒中领域，能够提供与慢性ISS受试者的拟定NR1靶标临床适应症最接近的匹配。该免疫抑制Sprague-Dawley大鼠ISS大脑中动脉闭塞模型用于评价NR1在急性环境(卒中后7天进行NR1治疗)和慢性环境(卒中后28天进行NR1治疗)中采用NR1进行治疗的效果，研究共持续3个月。在另一个临床相关性动物模型中进行支持性疗效研究，该模型为通过闭塞大脑中动脉远端接受缺血性皮层卒中(ICS)的免疫缺陷无胸腺裸大鼠。
生物分布：同时还对免疫抑制Sprague-Dawley大鼠的ISS模型进行了GLP生物分布研究，旨在为卒中动物中IC注射NR1细胞的持久性和迁移提供最完整的评估，最大限度地模拟患有慢性卒中的人类受试者的临床状况。
毒理学：在有基质胶存在的情况下，在免疫缺陷无胸腺裸大鼠中进行GLP毒理学研究，最大限度地提高NR1存活率和生长以及畸胎瘤发展的可能性。基质胶是一种来源于小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤细胞的复合蛋白质混合物，据报道，基质胶中含有鼠类生长因子(Hughes等人，2010)。采用接受H9 hESC的治疗组，以证实无胸腺大鼠模型可以支持畸胎瘤的发展并具有足够的灵敏度水平，可以检测到非常低水平的污染hESC。此外，该研究的持续时间足够长(180天)，以便在出现畸胎瘤时为畸胎瘤的发展留出时间。
动物模型中的NR1细胞存活率(持久性)。在模型中，NR1细胞的持久性对于获得人活性、分布和毒性的准确预测至关重要。为了提高NR1细胞存活率和持久性，采取以下方法：
在第一步中，选择正确的动物模型，比较不同免疫缺陷啮齿动物模型中的NR1存活率。研究比较了成年和新生无胸腺裸大鼠和成年NSG小鼠。在免疫缺陷成年无胸腺裸大鼠中，测量最高细胞存活率和持久性，用于进一步测试方法，以提高持久性。
接下来，在成年无胸腺裸大鼠中，耗竭特定的免疫细胞群，从而提高人源NR1细胞存活率。在前导性研究中，在CNS中充当巨噬细胞的小胶质细胞的数量耗竭了40-50％，但这种减少并未增加NR1的持久性。同样，高达80-90％的自然杀伤细胞数量耗竭对NR1细胞持久性没有任何影响。后续研究未采用其中任一方法。
最后，对细胞注射培养基中包含基质胶的作用进行了评价。前导性研究表明，基质胶显著提高了成年无胸腺裸大鼠的长期NR1细胞存活率。因此，在毒理学研究中，注射培养基中包含基质胶，以提高NR1存活率和生长。由于可能存在混淆作用，因此基质胶未用于药理学和分布研究。
为了证实NR1存在，在关键性GLP生物分布和毒理学研究中，测量了动物模型中的细胞持久性。在药理学研究中，尽管NR1治疗产生了积极作用，但是没有证据表明大脑中存在NR1细胞。然而，在ISS卒中模型(与初步药理学研究中使用的模型相同)的GLP生物分布研究中，采用IHC和qPCR方法检测到少量NR1细胞在给药后45天持续存在。与药理学研究相比，研究结果差异可能与生物分布研究中使用的更好的样本保存和更灵敏的检测方法有关，在药理学研究中，仅当收获了其他终点的关键组织后，方可收集到用于测量细胞持久性的组织样本。生物分布研究的结果准确地证明了NR1细胞在测试系统中的长期持久性。几项前导性研究和GLP毒理学研究显示了基质胶存在的情况下成年无胸腺裸大鼠的细胞持久性。后一项研究中的IHC和qPCR检测证明，在基质胶存在的情况下，在原始态无胸腺裸大鼠中，NR1细胞持续存在的时间长达180天。
总之，持久性研究结果虽然具有可变性，但其提供了有分量的证据，表明NR1细胞在IC注射后数月持续存在，在无胸腺裸大鼠模型中，NR1细胞持续存在时间长达6个月。
检测畸胎瘤。为了对NR1药物产品的潜在不良影响进行相关评估，毒理学模型必须能够支持干细胞源性畸胎瘤的发展。为了证实包含基质胶的成年无胸腺裸大鼠模型可以检测到畸胎瘤，GLP毒理学研究中选定的治疗组接受了NR1细胞混合物的脑内注射，NR1细胞掺入预先指定水平的H9 hESC，H9 hESC占NR1细胞总剂量的0.1％-50％。移植后28天，未检测到畸胎瘤，但到治疗后180天为止，在50％ H9的掺加剂量下，可以看到与剂量相关的畸胎瘤发病率影响了多达三分之二的接受治疗的动物，证实了无胸腺裸大鼠模型能够满足支持畸胎瘤发展的要求。
测量NR1的毒性。通过证明完全评估毒性(包括畸胎瘤形成)所需的NR1细胞存活时间已经延长，在几种免疫功能受损的实验室啮齿动物模型中进行的前导性毒理学研究的结果可以指导我们选择无胸腺裸大鼠模型，作为GLP毒理学评估的最佳模型。在细胞注射培养基中包含基质胶的成年无胸腺裸大鼠模型表现出增强的NR1存活率和持久性。本研究的关键终点是评估NR1的一般毒性、确认大脑中NR1的持久性、证明其没有从治疗部位迁移、评价其引起畸胎瘤的可能性以及其他毒理学终点。
一般毒性。最高2×106个NR1细胞(脑内注射)或1×107个细胞(肌肉注射)剂量的NR1耐受性良好。无意外死亡率、临床发现、体重或摄食量的变化、临床病理学或骨髓终点的变化或宏观和微观观察的变化。不存在与NR1相关的早期死亡，并且NR1在给药后180天内耐受性良好。
细胞持久性和迁移。NR1并未分布或从脑内给药部位迁移到大脑的其他区域或外周组织。敏感性IHC和qPCR评估证实，在长达180天的研究持续时间内，少量NR1细胞能够长期存活。
畸胎瘤形成。在任何仅采用NR1药物产品治疗的大鼠中，大脑或外周组织中未检测到畸胎瘤。共100只无胸腺裸大鼠接受最高2×106个NR1细胞/只的剂量，移植后进行随访，最长随访时间为6个月。在已制备的NR1和H9细胞的混合物中，该模型能够检测到H9掺加水平(低至0.1％的H9细胞)(向2×106个NR1细胞/动物的剂量中添加2000个H9细胞)的畸胎瘤。研究表明，NR1药物产品中含有<0.01％的H9细胞。
本研究的结果表明，NR1药物产品在高剂量下耐受性良好，并未从脑内给药部位迁移，在研究持续时间内持续存在于注射部位，并且在给药后长达180天的时间内，未引起畸胎瘤发展。
效用和作用机制测量
效用测量。通过多重评估的测量，NR1治疗使卒中免疫抑制SD大鼠的感觉运动功能得到部分恢复，具体体现在众所周知的测量仪器提供的积极结果：
在环孢素免疫抑制的Sprague-Dawley(SD)大鼠中，采用ISS(USF-1)的大脑中动脉闭塞模型，进行初步效用论证。这里NR1的脑内移植可促进一般运动行为、神经功能和运动协调的恢复。在移植后第2个月，开始通过测试进行功能恢复，一直持续到移植后至少3个月。
在无胸腺裸大鼠的ICS模型(Stanford-5)中获得了支持性研究结果，该模型具有类似的结果：根据几种性能测量仪器的评估结果，NR1细胞的脑内移植改善了感觉运动功能。治疗后第4周首次出现改善，一直持续到给药后8周动物终止。
作用机制。研究提供的证据表明，NR1细胞的活性与免疫调节功能和NR1相关的活性调节因子分泌刺激部分相关，如下所述：组织学评估和药理学研究表明，梗死周围小胶质细胞/免疫细胞活化减少与NR1相关的功能恢复增强之间存在联系。
有证据表明，NR1相关的巨噬细胞极化从M1/促炎状态变为M2/抗炎状态，主要方式是通过分泌因子，将未受刺激和M1/M2刺激的巨噬细胞同时推向有益的M2/抗炎状态。
IHC分析定性表明，与对照大鼠相比，经NR1治疗的卒中大鼠具有更多的活化巨噬细胞/小胶质细胞。
卒中大鼠的TSPO-PET成像显示，与经溶媒治疗的大鼠相比，在移植部位附近和更远端但连接的大脑区域，经NR1治疗的大鼠的免疫细胞活性增加，这意味着NR1具有广泛的免疫调节作用。
分泌型TRAP分析确定了编码分泌蛋白的175个高表达基因，前20个富集过程与大脑修复相关，包括细胞外基质(ECM)重塑(参与大多数大脑修复机制)以及与炎症和轴突导向相关的其他过程。培养NR1的TRAP/RNAseq分析鉴定了400多个基因，这些基因编码具有NR1相关卒中恢复核心生物过程的分泌因子：炎症(162个基因，其中144个基因编码与细胞因子活性相关的蛋白质)和ECM组织(65个基因)。在体内鉴定的目标基因中，作为对卒中环境的反应，上调NRG3和TGFb3。
大脑可塑性研究表明，在移植后第7天，NR1移植显著增加了活体脑切片梗死周围皮层的运动回路活性。接受NR1细胞治疗的动物的大脑差异性地表达了近300个基因，众所周知，这些基因能够刺激成年神经前体细胞增殖、神经元分化、直接参与神经元电生理特性的门控通道、轴突导向、轴突生成和突触发生。
调查性研究强调，NR1细胞通过分泌调节因子产生免疫调节作用，在NR1的作用机制中，这些调节因子有助于实现梗死周围区域的可塑性。有证据表明，正是由于卒中恢复核心过程(包括炎症过程和细胞外基质的组织)的刺激，且部分由于基因表达增加(众所周知，基因表达增加会在体内影响免疫功能和刺激大脑可塑性)，使NR1具有此影响。
生物分布
在免疫抑制的Sprague-Dawley大鼠中进行GLP生物分布研究，利用ISS的大脑中动脉闭塞模型，以最佳方式模拟慢性卒中人类受试者的临床状况。大鼠接受NR1治疗，并重复初步疗效研究中使用的治疗剂量和时间点。采用灵敏且经过验证的实时qPCR测定法，在大脑和神经轴、外周组织和大体病变中，对NR1细胞进行量化，采用人抗核抗体HuNu，对组织进行NR1 gDNA和IHC染色。移植到大脑皮层和纹状体后，在急性和慢性卒中动物中，在最高4×105个细胞/动物的剂量下，NR1细胞在大脑中持续存在至少45天。在给药部位所在区域外部未检测到NR1细胞，NR1细胞未迁移到大脑的邻近区域或外周组织。
结论
在免疫抑制的Sprague-Dawley大鼠的缺血性皮层下卒中(ISS)模型中进行的NR1治疗促进了感觉运动功能的部分恢复，具体体现在几种众所周知的测量仪器提供的积极结果。人们尚未完全理解确切的恢复机制，但这种机制似乎至少部分与免疫调节功能有关，包括与NR1治疗后观察到的部分和潜在完全功能恢复相关的免疫细胞活化减少(与治疗相关)。研究表明，NR1通过体内免疫调节因子的分泌，并通过刺激对卒中恢复至关重要的过程(包括炎症和细胞外基质的组织)而发挥作用。NR1细胞持久性研究表明，脑内注射(IC)后，NR1细胞在大脑中长时间存在，这种现象与药理学研究中发现的感觉运动功能改善有关，但NR1细胞未离开脑内注射部位发生迁移。毒理学研究表明，NR1药物产品(经证明含有低于0.01％的H9细胞)的脑内移植并未导致动物死亡，细胞未离开治疗部位发生迁移，并且即使当注射介质中包含生长促进基质胶时，在单独注射NR1细胞后，在单独采用NR1细胞治疗后进行注射后长达6个月的时间内，也未导致一般毒性或畸胎瘤形成。
总之，在最高2×106个细胞/动物的剂量下，NR1药物产品耐受性良好，外推到人类受试者为148×106个细胞/剂量，NR1药物产品并未从脑内给药部位迁移，在注射部位持续存在数月，耐受性良好，且未导致畸胎瘤或肿瘤的发展。
示例3
缺血性卒中模型中NR1神经祖细胞(NPC)的神经移植
动物要求
物种：大鼠鼠龄/体重：2个月/250-300g性别：雄性
品系：Sprague-Dawley大鼠
动物数量：95只成年雄性大鼠入组研究
免疫抑制方案：在细胞移植前2天，对大鼠进行免疫抑制，此后每天通过腹腔注射环孢菌素A(20mg/ml，山地明，诺华制药公司，在无菌生理盐水中稀释)并持续一周。然后，在饮用水(无菌去离子水)中，以210mg/ml的剂量口服环孢菌素，直到安乐死。
本研究旨在评价NR1 NPC(由斯坦福大学提供)脑内移植在成人缺血性卒中的动物模型中的潜在治疗价值。在卒中后7天或28天，在两个细胞剂量水平下进行移植，在移植后的随后3个月内，进行行为和组织学缺陷的功能读数。我们在基线水平上(卒中前)、卒中后7天或28天(移植前)以及移植后每月对运动和神经学表现进行了表征。在移植后3个月，完成行为测试，然后通过穿心灌注，对动物实施安乐死，然后收获大脑并将其运至斯坦福大学进行组织学检查(参见扫描版记录本，第57-61页)。主要终点是从抬高身体摇摆试验(EBST)中的统计学改善可以看出，卒中后7天或28天进行NR1NPC的脑内移植改善了行为恢复。次要终点是从神经系统检查和转棒测试中的统计学改善可以看出，卒中后7天或28天进行NR1 NPC的脑内移植改善了行为恢复。
供试品和对照品
供试品。NR1 NPC，第18代细胞，由希望之城根据GMP生产(批号1299-128-0002)。
对照品(溶媒)。含有0.5％人血清白蛋白(HSA)(Talecris Biotherapeutics,Inc.货号13533-684-20，批号26NJ6H1)的勃脉力A(Baxter产品货号2B2544，批号C878264)。
实验设计
1.治疗条件如表4所示。
治疗条件
组别 组别规模 供试品 剂量(剂量体积) 移植时间
A 15 NR1 NPC低剂量 1e5细胞(9μL) 卒中后7天
B 15 NR1 NPC高剂量 4e5细胞(9μL) 卒中后7天
C 15 溶媒 9μL 卒中后7天
D 15 NR1 NPC低剂量 1e5细胞(9μL) 卒中后28天
E 15 NR1 NPC高剂量 4e5细胞(9μL) 卒中后28天
F 15 溶媒 9μL 卒中后28天
共100只动物(90只研究用动物加10只备用动物)接受MCAo卒中。95只动物入组进行寿命内研究；所有卒中动物均随机分配到A-F组中，并在卒中后第7天或第28天接受治疗。通过每周临床观察和体重记录，监测动物的总体健康状况。在移植后3个月，通过穿心灌注4％多聚甲醛，对动物实施安乐死。
结果测量：使用以下参数，评价移植结果：1)运动行为(通过抬高身体摇摆试验(EBST))、转棒和神经学表现(通过神经系统检查)。在USF中进行这些行为测试；2)梗死体积(通过尼氏/苏木精和伊红组织学染色)；3)移植物存活(通过免疫组织化学)，使用所示的特异性抗体检测人类细胞；4)梗死周围区域内的新生血管、炎症反应改变和宿主细胞存活的初步机制导向的免疫组织化学分析。结果测定#2、#3和#4将在斯坦福大学进行。
细胞移植结果的参数
测试目的
实验程序
MCAo卒中手术：所有外科手术均在无菌条件下进行。用1.5％异氟烷对动物实施麻醉，并检查是否有疼痛反射。动物在深度麻醉下接受MCAo手术。MCA缝合技术涉及穿过颈动脉插入细丝，到达MCA的交界处，从而阻断来自颈总动脉和脑底动脉环的血流。通过颈部腹侧正中切口，识别并分离右颈总动脉。缝线尺寸为4-0，由无菌非吸收性缝线(Ethicon,Inc.)制成，利用橡胶胶水，使缝线尖端的直径逐渐变细至线号24-26。将约15-17mm的细丝从颈外动脉和颈内动脉的交界处插入，以阻断MCA。右侧大脑中动脉(MCA)闭塞1小时。根据我们的研究及其他几项研究，MCA闭塞一小时可导致最大面积的梗死。此外，研究发现，在体重介于250g和350g之间的动物中，缝线尖端的长度和大小产生了完全MCA闭塞。加热垫和直肠温度计可使体温维持在正常限值范围内。为了确定闭塞和再灌注成功，使用了激光多普勒。激光多普勒探头测量了闭塞前、闭塞中和闭塞后的脑血流量。如激光多普勒所示，只有在MCA闭塞期间表现出脑血流量减少>80％的动物方可进入后续程序(即移植)。所有其他动物立即排除在研究之外。此外，基于健康观察和体重，出于人道原因，将动物排除在外(即安乐死)(n＝8只动物死于卒中手术)。最后，将动物随机分配到治疗组，治疗组的采样如下：每个手术日至少有15只动物表现出成功的MCA闭塞(>80％脑血流量)；在卒中后预先设置的时间点(第7天或第28天)，移植至少15只动物；在每个移植日，将5只动物随机分配到NR1 NPC高剂量组，5只动物随机分配到NR1 NPC低剂量组，5只动物随机分配到溶媒组。在细胞或溶媒移植前2天，对所有组别中的大鼠进行免疫抑制，此后每天通过腹腔注射环孢菌素A(20mg/ml，山地明，诺华制药公司)并持续一周。然后，在饮用水中，以210mg/ml的剂量口服环孢菌素，直到安乐死。
在研究过程中，每周观察动物的总体健康状况。在治疗开始时、研究期间的每周和研究终止时，记录体重。
移植程序：每天移植15只动物。所有外科手术均在无菌条件下进行。用1.5％异氟烷对动物实施麻醉。一旦达到深度麻醉(通过检查是否有疼痛反射)，即可在手术切口区域(颅骨区域)周围备皮，留出足够的边界，以防止污染手术部位，然后擦拭手术部位两次进行手术杀菌，并用无菌帷帘覆盖。然后将动物固定在立体定位仪(Kopf Instruments)上。然后，将26号汉密尔顿701系列微量注射器针头放入颅骨小毛刺开口(调整移植坐标，使其与纹状体对应：前侧0.5mm，前囟外侧2.8mm，硬脑膜表面下方5.0mm、4.0mm和3.0mm；基于Paxinos和Watson的图集，1998)。在单次进针中，进行3次供试品沉积，包括2次进入纹状体，1次进入皮层(如上所述：硬脑膜表面下方5.0mm、4.0mm和3.0mm)。基于先前建立的类似立体定向植入物的靶标部位，靶标区域是对应于缺血性梗死周围(或半影区)区域的内侧纹状体和内侧皮层(Yasuhara等人，《干细胞和发展》，2009)。每次沉积包括3分钟内输注量3μl(例如，总体积9μl中注射40万个细胞的剂量)。再吸收2分钟，之后收回针头，用不锈钢缝合夹缝合伤口。在整个手术过程中和麻醉恢复后，加热垫和直肠温度计可使体温维持在约37℃。
行为和神经系统测试：所有参与动物测试的研究人员均不清楚治疗条件。对动物进行抬高身体摇摆试验(EBST)、神经系统检查，并将动物放置在转棒装置上。研究表明，这些测试是对由单侧卒中手术产生的运动/感觉缺陷的敏感测定。EBST涉及抓住动物的尾巴，并记录摇摆的方向。测试装置由透明Plexiglas箱(40×40×35.5cm)组成。将动物轻轻地从尾巴底部提起，尾巴抬高，直到动物鼻子处于表面以上2英寸(5cm)的高度。一旦动物的头部从身体的中线位置侧向移动约10度，就可以计算摇摆的方向(左或右)。摇摆一次后，将动物放回Plexiglas箱中，在重新测试前，使其自由移动30秒。对于每只动物，重复这些步骤20次。在正常情况下，正常的大鼠表现出50％的摇摆偏置，即向左和向右摇摆的次数相同。在20次测试中，75％的摇摆偏置表明在一个方向上摇摆15次，在另一个方向上摇摆5次。我们之前使用过EBST，并注意到在黑质纹状体损伤后一个月，受损伤动物出现>75％的偏摆活动；不对称性可以稳定长达六个月。EBST后大约一小时，按照前面介绍的程序进行神经系统检查，并对程序稍作修改。利用3项测试，得到每只大鼠的神经功能评分，这3项测试包括(1)前肢回缩，测量动物在前肢横向位移2-3cm后更换前肢的能力，按从0(立即更换)到3(几秒钟后更换或不更换)分级；(2)平衡木行走能力，对于轻松横穿2.4cm宽、80cm长平衡木的大鼠，分级为0；对于不能在平衡木上停留10秒的大鼠，分级为3；(3)双侧前爪抓握，该测试测量的是握住直径2mm钢棒的能力，对于具有正常前爪抓握行为的大鼠，分级为0，对于不能用前爪抓握的大鼠，分级为3。在每个评估日，在约15分钟内进行的全部3项测试的得分相加，得到平均神经功能缺陷得分(最高可能得分，9分除以3项测试＝3)。神经系统测试完成后，在转棒中对动物进行测试，其中涉及将大鼠放在转棒圆筒上。测量动物停留在转棒上的时间。在60秒内，速度从4rpm缓慢提高到40rpm。当动物从梯级上掉下或抓住装置并连续转身2圈时，测试结束。卒中前，这些动物接受了3天训练。在卒中诱导(基线)前1天，记录装置上的最大持续时间(以秒为单位)，含3个转棒测量值。在基线处(卒中前)、卒中后7天和28天(移植前)以及移植后的随后3个月内每月对动物进行一次全部3项测试。
组织学：移植后3个月，对动物实施安乐死，收获大脑并将其运至斯坦福大学进行组织学检查。
统计分析：研究完成后，计算平均行为数据，并与其他治疗组的行为数据进行比较。进行统计分析，以利用多重比较方差分析(ANOVA)和Bonferonni事后分析，将治疗组与对照组(溶媒给药)进行比较。
结果
如图4所示，脑内移植NR1 NPC可缓解运动功能障碍，如EBST所示。ANOVA显示，治疗(p<0.0001)和测试(p<0.0001)的主要影响以及相互作用效应(p<0.0001)很显著。组内比较显示，单独接受溶媒(C，F)的卒中动物在卒中后表现出显著的运动功能障碍，并在整个3个月的研究期间持续存在(与基线相比p’s<0.005)。相反，接受NR1 NPC(A，B，D，E)的卒中动物在卒中后和移植后第1个月也出现了运动损伤(与基线相比p’s<0.005)，但此后从移植后第2个月和第3个月开始，表现出运动功能恢复(与卒中后相比p’s<0.005)。这些移植后的卒中动物在移植后第2个月和第3个月出现了恢复，但与基线相比仍有损伤(p’s<0.005)。组间比较显示，所有组别在基线处都显示了类似的运动功能，在卒中后和移植后1个月也表现出相似的运动损伤。然而，在移植后第2个月和第3个月，与输注溶媒的卒中动物(C，F)相比，接受NR1 NPC(A，B，D，E)的卒中动物在运动行为方面表现出显著的改善(p’s<0.0033)。一般而言，虽然卒中急性和慢性期移植以及低剂量和高剂量细胞移植都能显著促进运动功能的恢复，但慢性期和高剂量移植似乎是最理想的移植方案(参见E与A、B或D之间的比较，p’s<0.0033)。
图5.神经系统测试显示，脑内移植NR1 NPC NSC可减轻神经功能缺陷。ANOVA显示，治疗(p<0.0001)和测试(p<0.0001)的主要影响以及相互作用效应(p<0.0001)很显著。组内比较显示，单独接受溶媒(C，F)的卒中动物在卒中后表现出显著的神经功能缺陷，并在整个3个月的研究期间持续存在(与基线相比p’s<0.005)。相反，接受NR1 NPC(A，B，D，E)的卒中动物在卒中后和移植后第1个月也出现了神经功能障碍(与基线相比p’s<0.005)，但此后从移植后第2个月和第3个月开始，表现出神经功能恢复(与卒中后相比p’s<0.005)。这些移植后的卒中动物在移植后第2个月和第3个月出现了恢复，但与基线相比仍有损伤(p’s<0.005)。组间比较显示，所有组别在基线处都显示了类似的神经功能，在卒中后和移植后1个月也表现出相似的神经功能缺陷。然而，在移植后第2个月和第3个月，与输注溶媒的卒中动物(C，F)相比，接受NR1NPC(A，B，D，E)的卒中动物在神经学表现方面表现出显著的改善(p’s<0.0033)。在改善神经系统结果方面，卒中急性和慢性期移植以及低剂量和高剂量细胞移植的差异不显著(p’s>0.0033)。
图6：转棒测试显示，脑内移植NR1 NPC可促进运动协调性的恢复。ANOVA显示，治疗(p<0.0001)和测试(p<0.0001)的主要影响以及相互作用效应(p<0.0001)很显著。组内比较显示，单独接受溶媒(C，F)的卒中动物在卒中后表现出显著的运动协调不足，并在整个3个月的研究期间持续存在(与基线相比p’s<0.005)。相反，接受NR1NPC(A，B，D，E)的卒中动物在卒中后和移植后第1个月也出现了运动协调缺陷(与基线相比p’s<0.005)，但此后从移植后第2个月和第3个月开始，表现出运动协调恢复(与卒中后相比p’s<0.005)。这些移植后的卒中动物在移植后第2个月和第3个月出现了恢复，但与基线相比仍有损伤(p’s<0.005)。组间比较显示，所有组别在基线处都显示了类似的运动协调，在卒中后和移植后1个月也表现出相似的运动协调损伤。然而，在移植后第2个月和第3个月，与输注溶媒的卒中动物(C，F)相比，接受NR1 NPC(A，B，D，E)的卒中动物在运动协调方面表现出显著的改善(p’s<0.0033)。一般而言，虽然卒中急性和慢性期移植以及低剂量和高剂量细胞移植都能显著促进运动协调的恢复，但慢性期和高剂量移植似乎是最理想的移植方案(参见E与A、B或D之间的比较，p’s<0.0033)。
当前的数据显示，脑内移植NR1 NPC可促进一般运动行为、神经功能和运动协调的恢复，如EBST、神经系统测试和转棒测试所示。在移植后第2个月，开始通过测试进行功能恢复，一直持续到移植后至少第3个月(研究结束)。总体而言，卒中急性期和慢性期移植以及低剂量和高剂量细胞移植均能显著促进功能恢复，但根据EBST和转棒测试的结果，慢性期和高剂量条件下的移植似乎才是最佳移植方案。未观察到明显的副作用，接受移植的卒中动物与接受溶媒的卒中动物的体重和一般健康状况类似。总之，本研究的结果支持将NR1NPC用作卒中脑内移植的供体细胞。
示例4
NR1人神经祖细胞在裸大鼠皮层卒中模型中疗效的剂量反应研究
本非GLP研究的目的是测试NR1人神经祖细胞(hNPC)在无胸腺裸(NIH)大鼠缺血性卒中皮层模型中增加功能恢复的效用。此前我们小组的研究证明，卒中后一周，NR1或其他hNPC系的直接脑实质内移植提高了该模型内的功能恢复率。本研究的主要终点是比较单独采用测试用溶媒(勃脉力A加0.5％人血清白蛋白)治疗的动物与采用含NR1的测试用溶媒治疗的动物在相同剂量(4×105个细胞/大鼠)下的功能恢复，这些动物之前采用类似的hNPC进行过测试，测试结果发现，治疗后1-5周的恢复率有所提高。选择一种称为触须-前爪反应测试的感觉运动行为测试，作为功能恢复的首要衡量标准，这是因为该测试可重复显示出皮层缺血性卒中和hNPC治疗后功能恢复增加的情况。次要终点包括附加行为测试(即姿势-反射测试，研究发现，该测试与触须-前爪反应测试呈正相关)；行为测试三个附加时间点功能恢复的可持续性评估(移植后6-8周)；以及与单独使用溶媒相比，第二较低NR1剂量(10万个细胞/大鼠)的功能恢复和功能恢复可持续性评估。三级终点包括对两种积极治疗的剂量效应趋势进行比较；作为功能恢复的潜在测试进行研究的第三项行为测试(改良神经功能评分测试)；以及几个基于组织学的量化终点(包括宿主脑损伤大小和宿主脑修复通路，如新生血管、炎症和通过宿主神经元增加的轴突发芽，称为可塑性)。先前对这些内源性修复通路进行研究时，将其作为替代性恢复措施和潜在的hNPC体内作用机制。此外，经评估，移植细胞在大脑中的存活可表征NR1的持久性及其在移植后分化、迁移、异位组织形成和致瘤性中的潜力。
如前所述，雄性无胸腺裸大鼠患上缺血性皮层卒中(ICS)。在ICS诱导后7天，以拟定临床配方(勃脉力A加0.5％人血清白蛋白)中的两种剂量水平中的一种(1×105个细胞/大鼠或4×105个细胞/大鼠)，施用NR1进行脑内(IC)注射。在假定的卒中病变内侧的四个注射部位使用预期的临床递送装置后，使用模型化的汉密尔顿微量注射器进行NR1给药，每个部位注射2.5×104或1×105个细胞，体积为1μL。采用相同的注射方法，向单独的动物分组注射溶媒对照品(勃脉力A加0.5％人血清)。治疗组如表1所示。在卒中损伤前1周和之后的每周，由操作人员进行感觉运动功能的行为测试，持续时间为治疗后8周，相对于治疗组，操作人员对治疗条件并不知情。此外，通过临床观察和体重记录，每周监测动物的总体健康状况。寿命内评估完成后，在治疗后9周，收集脑组织进行后续组织学评价。
表5治疗组
a NR1的浓度在0、2.5×104和1.0×105个细胞/μL之间变化，使每个治疗组每只大鼠的注射体积固定在4μL。
b 卒中后时间
c 治疗后时间
表6寿命内和验尸后评估及目的
IF＝基于免疫荧光的检测。
RECA-1＝大鼠内皮细胞抗原1。
Iba-1＝离子化钙结合衔接分子1(活化的小胶质细胞/免疫细胞标志物)。
SM-312＝泛轴突神经丝标志物。
hNUC＝人核抗原。
使用与cGMP NR1生产相同的程序，在斯坦福大学生产NR1试生产批#1。NR1试生产批#1从希望之城p15主细胞库扩增至p18，并在气相液氮中冻存至移植日。
NR1试生产批#1的分析表征
表8
a由细胞系遗传中心(威斯康星州麦迪逊市)进行的核型分析。
b在斯坦福大学斯坦伯格实验室，使用Lonza MycoAlert检测试剂盒进行支原体检测。
c尼尔森实验室(犹他州盐湖城)进行的内毒素检测。
d通过流式细胞术测定的结果显示为平均值±标准差。
e通过定量实时PCR测定的结果，显示为相对于GAPDH的平均ΔCt±标准差。
f通过台盼蓝拒染法测定的结果。
NR1的剂量制备。在每个移植日，根据作为附录1(研究方案)的附录1纳入的细胞准备SOP，制备NR1细胞。简言之，细胞解冻后，在测试用溶媒中洗涤三次。最终离心后，在测试用溶媒中，以1×108个细胞/mL或2.5×107个细胞/mL的浓度重悬细胞，分别进行高剂量和低剂量NR1给药。在移植程序中，将细胞放在冰上静置，然后在6.5小时的制备时间内给药。在移植前的最后洗涤步骤后和移植手术完成后，使用标准血细胞计数器，通过台盼蓝对NR1细胞浓度和活力进行评分。
溶媒对照
表8
所使用的测试用溶媒为。
实验方法
动物受试者。从美国国家癌症研究所弗雷德里克实验室(NCI-Frederick)(马里兰州弗雷德里克)获取约5-6周龄的成年雄性Cr:NIH-RNU裸大鼠(品系代码02N01)，并允许其适应畜舍设施，直至8-12周龄(手术时体重约230-350克)。每个笼子饲养2-3只动物，采用自由采食方式，提供辐照食品和蒸压水。以12/12小时为光/暗周期饲养动物，并在白天标准照明条件下进行行为观察。所有动物送达时健康状况良好，视为可接受入组研究。所有程序均按照斯坦福IACUC批准的方案进行。
缺血性皮层卒中的诱发。对动物使用所述的缺血性卒中的永久性大脑中动脉远端(MCA)闭塞模型(Kelly等人，2004)。简言之，在使用异氟烷麻醉的情况下，通过腹侧正中切口，露出颈总动脉(CCA)。通过左耳和眼睛之间的钻孔，露出远端MCA，通过用双极钳烧灼，使远端MCA永久闭塞，并在罗朗岩鼓裂正上方切开远端MCA。将微动脉瘤夹夹到每根血管上并停留30分钟，以暂时闭塞CCA。然后移除夹子，伤口闭合，让动物恢复，直至其能够完全走动，然后再回到饲养笼。
将动物分配到治疗组中。根据卒中后移植前的基线行为评分，将动物分配到各治疗组，使三个治疗组的缺陷平均值和标准差尽可能等效。由于触须-前爪反应测试先前表现出了严重缺陷和治疗后恢复能力，因此将该测试作为治疗组分配的主要决定因素(Horie等人，2011，Andres等人，2011)。将动物分布在治疗组(溶媒，1×105NR1，4×105NR1)中，使每个治疗组在卒中后第6天的触须-前爪反应测试中的平均评分和标准差尽可能接近等效。如果两只动物在触须-前爪反应测试中得到相同的缺陷分数，则利用姿势-反射测试确定其治疗组分配。此外，仅当动物符合以下标准时方可入组研究：在卒中诱发之前，未观察到触须-前爪反应测试或姿势-反射测试中存在任何缺陷。在卒中后1-6天，在非严重体重下降后第6天的触须-前爪反应测试中，>7/10的试验中右前肢功能丧失(<40％体重)。
细胞移植手术。在缺血性存在诱发后七天，通过立体定向方式将测试用溶媒、1×105个NR1细胞或4×105个NR1细胞输注到卒中损伤内侧皮层内的4个部位中。动物处于异氟烷麻醉状态时，在颅骨上做一个中线皮肤切口，然后皮肤发生回缩。使用25号针头在颅骨上手动钻孔，以便在以下4个部位引入泵控26号微量注射器针头：1)前后(AP)：+1.0mm，内侧和外侧(ML)：+1.2mm，背腹侧(DV，从硬脑膜开始)：-1.5mm；2)AP：-0.3mm，ML：+1.2mm，DV：-1.4mm；3)AP：-1.8mm，ML：+1.2mm，DV：-1.4mm；4)AP：-2.8mm，ML：+1.4mm，DV：-1.4mm。以0.5μL/分钟的速度施用含或不含细胞的测试用溶媒，总注射量为1μL，每个部位2分钟内送达。输注后，将微量注射器针头在原位再放置2分钟，然后小心收回。全部四次输注完成后，用无菌缝线缝合露出区域。
动物术后护理和保养。在卒中手术前，直至移植后一周，在饮用水中(1g/L)给予大鼠氨苄西林(氨苄西林胶囊，美国药典(USP)，DAVA Pharmaceuticals,Inc.)，以降低感染风险。在卒中和移植手术后，每天检查大鼠是否出现脱水、明显不适、自噬或手术并发症。观察时记录任何健康并发症，在兽医的指导下，由动物设施技术人员给予动物适当的照顾。手术前记录体重，卒中手术后一周每天记录体重，之后每周记录一次体重。
感觉运动功能的行为测试方法。行为测试用于评估基线处(卒中前和卒中后6天/移植前)和移植后1-8周(卒中后2-9周)的感觉运动和运动恢复情况。在研究开始和损伤前基线测试之前，大鼠接受所有行为测试的训练，为期三天。在触须-前爪反应测试、姿势-反射测试和改良神经功能评分测试中，依次评估每只大鼠，在每个测试日，每只大鼠的一组测试共持续不到10分钟。所有行为测试均由操作人员进行，相对于治疗组，操作人员对治疗条件并不知情。
触须-前爪反应测试。触须-前爪反应测试用于测试动物在身体同侧胡须受到刺激后的前肢反射能力，因此同时对感觉和运动功能进行了评估(Schallert等人，2000)。在左侧体感运动皮层中诱发缺血性卒中后，动物右侧表现出反射受损，而左侧的反射能力保持完好(因而作为阳性对照)。进行测试时，抱住动物，约束除测试前肢以外的所有肢体，并将身体同侧胡须贴在桌角上，以评估反射能力。在每天的测试中，每侧进行10次试验，因此“10”分表示没有缺陷，而“0”分表示功能完全丧失。
姿势-反射测试。姿势-反射测试用于测量动物在被放到桌上时对称使用两个前肢的能力，以及静止时承受从一边推到另一边的能力(Andres等人，2011)。进行测试时，从尾巴底部抓住动物，并将其放在桌面上，观察对称和不对称前肢着地情况。不对称前肢着地得到缺陷评分“1”分，对称着地得到“0”分(无缺陷)。然后将动物放在桌上，轻轻地从一边推到另一边。由于无法抵抗推动，得到额外缺陷评分“1”分，因此最大可能缺陷评分＝2分。
改良神经功能评分测试。所使用的改良神经功能评分测试是对先前所述方法的调整(Chen等人，2001)，在本研究中，作为探索性终点，进行该测试。通过一组行为测试，该测试测量了感觉和运动功能的能力，这组测试采用累计式评分给出最终的缺陷评分。当受试者无法进行测试或缺少给定的反射时，给予分数，基于功能性量度，得到14分的最高可能缺陷评分。
组织学处理、染色和免疫组织化学法。在卒中后10周，认真检查大鼠是否存在外部异常，包括可触及肿块。在使用异氟烷麻醉的情况下，大鼠通过穿心灌注生理盐水，然后灌注4％的多聚甲醛。解剖大脑，在4％多聚甲醛中固定后，在30％蔗糖/PBS中冻存72小时。此外，在灌注后收集以下外周器官，以相同的方式冻存，并在-80℃下储存，以备将来检查时使用：肺、心、脾、肝。使用徕卡冷冻切片机制备自由浮动的40μm冠状大脑切片，以备后续组织学分析使用。进行所有组织学分析，相对于治疗组，操作人员对治疗条件并不知情。
尼氏染色对梗死面积的定量。将每个大脑的六个冻存切片(横跨梗死区)(切片间的增量为960μm)安置在Superfrost Plus显微镜载玻片(VWA)上，并在室温(RT)下风干1小时。然后，在室温下的以下溶液中孵育载玻片上安置的大脑切片：95％乙醇(EtOH)2分钟，100％ EtOH 2分钟，甲苯5分钟，95％ EtOH 2小时，95％ EtOH 2分钟，水1分钟，甲酚紫溶液(1％甲酚紫醋酸盐/0.25％冰醋酸水溶液)15分钟，水(以10秒/次的速度浸泡10次)，70％EtOH 1分钟，95％ EtOH 1分钟，100％ EtOH 1分钟，甲苯5分钟，新鲜甲苯5分钟。立即用带DPX安装介质(Sigma)的盖玻片覆盖已经染色的切片，并在室温下放入通风橱卒中干过夜。
在平板扫描仪上，以300dpi的分辨率进行染色切片成像，并使用ImageJ软件(NIH)分析所得图像，得到完整(尼氏染色为阳性)和受损(尼氏染色为阴性)组织的面积测量值。在所述的六个大脑切片中，将每只动物的梗死面积量化为左侧损伤脑半球的总半球面积相对于完整右侧脑半球的总半球面积的差值(Kelly等人，2004)。
免疫荧光染色法量化血管密度。利用内皮特异性抗体、大鼠内皮细胞抗原-1(RECA1，Abcam产品货号AB9774)进行免疫荧光染色，检查每只大鼠的血管密度(BVD)，作为对损伤部位附近梗死周围组织中相对新生血管的量度。
进行免疫荧光染色时，在PBS中洗涤自由浮动的大脑切片，并在65℃下用预热的抗原修复溶液(10mM/0.05％吐温20/PBS，pH 6.0)处理20分钟。然后，切片在室温下的封闭液(2％正常山羊血清/1％牛血清白蛋白/0.5％曲拉通x-100PBS溶液，pH7.2-7.4)中孵育1小时。清除封闭液，并将切片与初级抗体(抗RECA1)在4℃下的封闭液(1:200)中孵育过夜。在定轨摇床上，用PBS洗涤切片3×10分钟，然后与用PBS按1:250稀释的二抗(山羊抗兔IgG-Alexa555，Invitrogen产品货号#A-21428)在室温下的定轨摇床上孵育2小时。在二抗孵育期的最后5分钟内，添加4’,6’-联脒-2-苯基吲哚(DAPI，0.5μg/mL，Sigma)，以复染细胞核。切片在PBS中洗涤3×5分钟，安置在Superfrost Plus显微镜载玻片(VWA)上，在室温下风干10-20分钟，用聚乙烯醇(PVA，Sigma)盖玻片覆盖，在室温下风干1小时，然后在4℃下避光暗处存放，直至成像。
在蔡司荧光显微镜上进行成像，对于每个大脑切片，获取梗死周围组织内的两张图片(每只大鼠6个切片，共12张图片)。对于每张图片，使用ImageJ软件(NIH)测量BVD，以确定阈值化RECA-1阳性的平均荧光面积(MFA)。然后，计算每只大鼠所有图片的平均MFA，并在统计学上比较治疗组平均值。
采用免疫荧光染色法进行小胶质细胞/免疫细胞活化的定量。对于每只大鼠，采用抗离子化钙结合衔接分子1(Iba1，美国Waco Chemicals产品货号#019-19741)抗体，通过免疫荧光染色法，在损伤部位附近的梗死周围组织中，对小胶质细胞/免疫细胞活化进行量化。
对自由浮动的大脑切片进行免疫荧光染色，并获得所述相应的梗死周围图片，以便对上述BVD进行量化。对于每张图片，使用ImageJ软件(NIH)测量小胶质细胞/免疫细胞活化，以确定阈值化Iba1阳性的平均荧光面积(MFA)。然后，计算每只大鼠所有图片的平均MFA，并在统计学上比较治疗组平均值。
采用免疫荧光染色法进行轴突密度的量化。对于每只大鼠，采用泛神经丝抗体(SMI312，Abcam产品货号ab24574)，通过免疫荧光染色法，对损伤边界处的轴突密度进行量化。
对所述自由浮动的大脑切片进行免疫荧光染色，以便量化BVD，然后获取损伤边界的图片(2张图片/切片，12张图片/大鼠)。对于每张图片，使用ImageJ软件(NIH)测量轴突密度，以确定阈值化SM312阳性的平均荧光面积(MFA)。然后，计算每只大鼠所有图片的平均MFA，并比较治疗组平均值。
采用免疫荧光染色法进行NR1存活率的量化。使用人细胞核特异性抗体(抗hNUC，密理博产品货号MAB1281)，通过免疫荧光染色法，研究移植的NR1细胞在卒中损伤大脑中的存活率和迁移。使用与4个移植部位对应的切片和包含可见针道的切片进行染色。如果检测到任何潜在的hNUC阳性，则对AP这两个方向上间隔80μm的额外切片进行染色(即保存每个间隔处的1个相邻切片进行共染色研究)，直至检测不到hNUC阳性为止。
对所述自由浮动的大脑切片进行免疫荧光染色，以便对BVD进行量化。将一抗(抗hNUC)以1:200稀释，并使用按1:250稀释的山羊抗小鼠IgG-Alexa488二抗(Invitrogen产品货号#A11001)，对一抗进行检测。在二抗孵育期的最后5分钟内，添加4’,6’-联脒-2-苯基吲哚(DAPI，0.5μg/mL，Sigma)，以复染细胞核。与来自先前经证实含有移植的人胚胎肾细胞(HEK 293T细胞)的单独动物分组的阳性对照大脑切片相同，对于每组已染色的载玻片，包括经溶媒处理的阴性对照大脑切片。
在不了解治疗组的情况下，使用蔡司反射荧光显微镜，手动筛查所有染色切片是否存在hNUC阳性。对于每只动物，至少有四个大脑切片用hNUC染色，对于每个染色切片，对整个组织进行hNUC阳性扫描。
数据分析和统计方法。使用JMP软件(V 11.0.0，SAS Institute,Inc.，北科罗拉多州凯利)，通过重复测量变异数分析，比较每个治疗组的平均体重。
所有行为测试均由操作人员进行，相对于治疗组，操作人员对治疗条件并不知情。为了对每项行为测试进行分析，将个别动物在治疗后每个时间点的行为评分标准化为其卒中后/治疗前基线(卒中后1周)。然后，利用标准化行为评分，计算每个时间点的治疗组平均值。
对于触须-前爪反应测试，使用JMP软件(V 11.0.0，SAS Institute,Inc.，北科罗拉多州凯利)，通过Bonferonni事后检验，利用多重比较方差分析(ANOVA)，在治疗后1-5周(卒中后2-6周)，对4×105个NR1和溶媒治疗组平均值进行统计比较。此外，使用JMP软件(V11.0.0，SAS Institute,Inc.，北科罗拉多州凯利)，通过Bonferroni事后检验，利用多重比较方差分析，对所有三个治疗组进行全行为时程(治疗后1-8周)的统计分析。利用R(R核心开发小组，2010)中的Mann-Whitney检验，在治疗后第1-5周，对4×105个NR1和溶媒治疗组平均值的触须-前爪反应测试总分进行非参数化统计分析。此外，通过R(R核心开发小组，2010)中的Benjami-Hochberg调整法，利用Wilcox多重比较测试，对4×105个NR1和溶媒治疗组的全行为时程(治疗后1-8周)进行非参数化分析。
对于姿势-反射测试和改良神经功能评分测试，使用JMP软件(V 11.0.0，SASInstitute,Inc.，北科罗拉多州凯利)，通过Bonferroni事后检验，利用多重比较方差分析，对所有三个治疗组进行全行为时程(治疗后1-8周)的统计分析。
所有组织学数据收集和处理均由操作人员进行，相对于治疗组，操作人员对治疗条件并不知情。图像获取和数据处理完成后，对治疗组进行揭盲，以便进行统计比较。对于每个组织学终点，使用JMP软件(V 11.0.0，SAS Institute,Inc.，北科罗拉多州凯利)中的学生t检验单独比较高剂量和低剂量NR1治疗组平均值与溶媒组平均值。
使用JMP软件(V 11.0.0，SAS Institute,Inc.，北科罗拉多州凯利)，对每个个体动物在治疗后8周的触须-前爪反应测试中的行为评分以及组织学终点进行线性回归分析。
结果汇总
动物的命运及处置。共计42只动物接受了缺血性卒中手术，其中7只动物在移植手术前就已经死亡或不符合研究入选标准。在符合研究入选标准的动物中，12只动物接受4×105个NR1细胞，11只动物接受1×105个NR1细胞，12只动物接受溶媒。接受移植手术的动物均已存活，并仍在接受研究，直至移植后9周按预定计划终止为止。
图7：触须-前爪反应测试原始数据(含热图叠加)。热图描绘了每个治疗组中每只个体动物的来自触须-前爪反应(V-P)测试的原始行为数据(第1列中列出了个体动物的ID)。“10”分(橙色)表示卒中前所有动物(第2列)关于该测试的完全功能(即无缺陷)，如图所示。“0”分(深灰色)表示在移植前一天，卒中诱发后大多数动物(红色垂直箭头)的功能完全丧失(即完全缺陷)，如图所示。
为了进行统计分析，将每只动物的移植后评分标准化为移植前的基线评分，并比较各组平均值。采用Bonferonni事后检验，通过多重比较ANOVA，对主要终点(治疗后1-5周、卒中后2-6周)进行统计分析，分析表明，相对于治疗后4周开始的溶媒治疗，4×105个NR1细胞的效果较显著。利用卒中后2-6周内触须-前爪反应测试总评分的Mann-Whitney检验，通过非参数分析进一步证实了这些结果，结果表明，相对于溶媒(p＝0.0106)，采用4×105个NR1细胞治疗的效果较显著。在触须-前爪反应测试中，在超出主要终点的另外三个时间点，对所有动物进行评估，以测试功能是否持续恢复(卒中后7-9周)。采用Bonferonni事后检验，通过多重比较ANOVA，全行为时程(卒中后2-9周)进行统计分析，分析表明，相对于卒中后7周、8周和9周的溶媒，4×105个NR1细胞治疗的效果较显著(p分别等于0.0004、0.0021和0.0001)。通过Benjami-Hochberg调整，利用Wilcox多重比较检验进行非参数分析，分析表明，卒中后5周、6周、7周和9周，4×105个NR1细胞治疗的效果较显著(p＝0.0469)。相反，相对于溶媒对照组，在采用1×105个NR1细胞治疗的动物中，未观察到显著的治疗相关作用。
图8：对于每个治疗组，图中显示了V-P测试中相对于时间的平均功能恢复。计算每只动物的功能恢复，作为该动物在治疗后给定时间点的V-P评分，并按治疗前基线(第X周-第1周V-P评分)进行标准化。误差条形＝平均值的标准误差(SEM)。相对于通过Bonferroni事后检验采用多重比较方差分析的溶媒对照组，对于4×105个NR1的治疗，*、**和***分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001。
姿势-反射测试。将姿势-反射测试作为卒中后和NR1治疗后运动功能和运动协调的额外辅助措施。与触须-前爪反应测试类似，在卒中后5-9周，相对于溶媒对照组，采用Bonferonni事后检验，通过多重比较ANOVA，在采用4×105个NR1治疗的姿势-反射测试中观察到了显著作用(卒中后5周、6周、7周、8周和9周，p分别等于0.0194、0.0115、0.0007、0.0028和0.0003)。结果如图9所示。
图9：姿势-反射测试中，每个治疗组相对于时间的平均功能恢复。为了计算治疗后每个时间点的平均功能恢复率，将每只动物的原始姿势-反射评分标准化为其治疗前的基线(第X周-第1周)，并确定每个治疗组的平均恢复率。误差条形＝SEM。相对于通过Bonferroni事后检验采用多重比较ANOVA的溶媒对照组，对于4×105个NR1的治疗，*、**和***分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001。
改良神经功能评分测试。改良神经功能评分测试用于通过一组行为测试，测量感觉和运动功能的能力(参见第3.6.3节表5)，并作为本研究的额外探索性终点。采用与其他行为测试相同的方式，对结果进行分析，将每个治疗后评分标准化为个体的治疗前基线，并通过多重比较ANOVA比较各组平均值。与触须-前爪反应测试和姿势-反射测试相比，在改良神经功能评分测试中，未观察到治疗组之间存在任何显著差异。结果如图10所示。
图10：在改良神经功能评分测试中，每个治疗组相对于时间的平均功能恢复。为了计算治疗后每个时间点的平均功能恢复率，将每只动物的原始累计得分标准化为其治疗前的基线(第X周-第1周)，并确定每个时间点每个治疗组的平均恢复率。误差条形＝SEM。
解剖学结果测量。行为测试完成后，在移植后9周(卒中后10周)对动物进行灌注，并对脑组织进行组织学检查。使用多组并行的冠状大脑切片(40μm)，量化梗死面积，并获得梗死周围皮层的血管密度、小胶质细胞/免疫细胞活化和轴突密度的定量测量。此外，对含有可见针道或近似移植坐标的切片进行评估，以确定NR1持久性以及任何与治疗相关的肿瘤或异位组织形成。
组织学终点的代表性图片。甲酚紫染色切片的代表性显微照片如图11所示，图片提供了采用溶媒或4×105个NR1细胞处理的动物中中度和重度梗死的示例。
图11：甲酚紫染色冠状大脑切片的代表性显微照片，显示了卒中后10周的梗死面积。图中显示了两只动物，分别来自溶媒组和4×105NR1组，反映了左大脑皮层中度(36号、40号动物)或重度(10号、31号动物)梗死。在某些情况下，额外的组织损失似乎由侧脑室增大引起(例如，10号、36号和40号动物)。
为了研究NR1治疗对宿主大脑修复的潜在影响，分别采用RECA1、Iba1和SMI-312进行免疫荧光标记，评估梗死周围皮层的血管密度、小胶质细胞/免疫细胞活化和轴突密度。对于采用溶媒或4×105个NR1细胞进行治疗的动物，每次染色的代表性图片如图12所示。
图12.治疗后9周(卒中后10周)梗死周围皮层免疫荧光染色的代表性显微照片。图中显示了四只具有代表性的动物，包括采用溶媒进行治疗的两只动物(15号和40号动物，第1行和第2行)，以及采用4×105个NR1细胞进行治疗的两只动物(36号和39号动物，第3行和第4行)。对于每只动物，附图面板显示了1.)采用抗RECA1抗体进行免疫荧光标记的血管(左列)，2.)采用抗Iba1抗体活化的小胶质细胞/免疫细胞(中列)，以及3.)采用SMI-312抗体进行免疫荧光标记的轴突密度(右列)。
功能恢复和组织学终点的线性回归分析。为了确定功能恢复与解剖学结果测量之间的潜在相关性，进行了行为和组织学数据的线性回归分析。根据以下每个解剖学结果测量，单独绘制了来自治疗后8周的触须-前爪反应测试的个体动物数据：梗死面积、梗死周围血管密度、梗死周围小胶质细胞/免疫细胞活化和梗死周围轴突密度。基于该方法，对于溶媒组和1×105个NR1治疗组中的动物，治疗后9周的梗死面积显示出与治疗后8周触须-前爪反应测试中表现的显著相关性，其中，梗死面积增加与触须-前爪反应测试表现下降相关。相反，对于4×105个NR1治疗组中的动物，梗死面积与触须-前爪反应测试表现下降无关，表明在该治疗组中观察到了显著的恢复增强。在治疗后8周的功能恢复与任何其他组织学终点之间，未观察到任何显著相关性。对于每次比较，在表9“治疗后8周触须-前爪反应测试和组织学终点的线性回归分析”中，相应的R2值和p值显示为治疗组的函数。
表9
治疗组对平均梗死面积的定量。对于每只动物，使用甲酚紫对一组中六个冠状切片进行染色，并由一名操作人员使用ImageJ软件(NIH)测量每个切片每个半球的完整组织总量，相对于治疗组，该操作人员对治疗条件并不知情。计算每个半球全部六个切片的完整组织总和，并将梗死面积计算为[(1-(损伤半球内完整组织的总面积/未损伤对侧半球的总面积))*100]。由学生t检验可知，相对于溶媒组，1×105个NR1治疗组或4×105治疗组中未观察到梗死面积的任何显著差异(1×105NR1与溶媒，p＝0.3825；4×105NRl与溶媒，p＝0.888)。
梗死周围皮层解剖学结果测量的量化。为了对梗死周围皮层的解剖学结果测量进行量化，对横跨损伤部位的四个冠状切片进行免疫荧光染色处理，并对每个切片采集腹侧梗死周围皮层内的两个像场(8个像场/只动物)。由操作人员使用ImageJ软件(NIH)计算每次染色的阈值化面积测量值，相对于治疗组，该操作人员对治疗条件并不知情。然后，使用JMP 11(SAS)比较治疗组平均值，通过学生t检验，将NR1高剂量组(4×105个细胞/大鼠)和NR1低剂量组(1×105个细胞/大鼠细胞/大鼠)分别与溶媒组进行比较。
治疗组对平均梗死周围血管密度的定量。计算每个治疗组的RECA1阳性的平均荧光面积，并通过学生t检验，将两个NR1治疗组与溶媒组进行独立比较。未观察到治疗组间存在任何显著差异(4×105NR1与溶媒，p＝0.3352；1×105NR1与溶媒，p＝0.4420)。
治疗组对平均梗死周围小胶质细胞/免疫细胞活化的定量。计算每个治疗组的Iba1阳性的平均荧光面积，并通过学生t检验，将两个NR1治疗组与溶媒组进行独立比较。基于这一分析，4×105NR1治疗显示，梗死周围小胶质细胞/免疫细胞活化显著减少(p＝0.0340)。相反，1×105NR1与溶媒的组平均值之间无显著差异(p＝0.0690)。
治疗组对平均梗死周围轴突密度的定量。计算每个治疗组的SMI-312阳性的平均荧光面积，并通过学生t检验，将两个NR1治疗组与溶媒组进行独立比较。未观察到治疗组间存在任何显著差异(4×105NR1与溶媒，p＝0.7838；1×105NR1与溶媒，p＝0.2538)。
NR1持久性评估。在治疗后9周(卒中后10周)，对含有可见针道或近似移植坐标的切片进行评估，以确定NR1持久性以及任何与治疗相关的肿瘤或异位组织形成。采用抗hNUC进行免疫荧光标记，评估NR1持久性。基于这种方法，在治疗后9周，在任何所评估的动物中，均未检测到hNUC阳性细胞。此外，在任何所评估的动物中，均未观察到异位组织或肿瘤形成的迹象。
结果解释
行为评估结果测量。利用以下行为测试，在损伤前、损伤后/治疗前以及治疗后1-8周每周对动物进行行为评估：触须-前爪反应测试、姿势-反射测试和改良神经功能评分测试。
在卒中损伤前的任何行为测试中，动物均未表现出缺陷。卒中损伤后1周(治疗前)的行为评估表明，基于全部三项测试的同样广泛的功能缺陷表现为对侧胡须/前肢反射系统(相对于卒中侧的对侧)感觉运动功能的严重受损(基于触须-前爪反应测试)，整体运动协调和平衡受损程度较轻(基于姿势-反射测试和改良神经功能评分测试)。
触须-前爪反应测试。利用触须-前爪反应测试，评估对侧胡须和前肢的综合感觉运动功能。触须-前爪反应测试结果见第4.3.1节。卒中损伤后，大多数动物在该测试中表现出完全缺陷，在卒中后1周的10项试验中的10项试验中，动物对对侧胡须刺激未做出反应。治疗后，接受溶媒的动物在该测试中表现出最低功能恢复，在7周时平均恢复率达到28％，在8周时(卒中后8周和9周)平均恢复率达到26％。在采用1×105个NR1细胞治疗的动物中观察到类似的恢复，治疗后7周和8周，该组的平均恢复率达到31％和38％。相反，相对于采用溶媒治疗的动物，在触须-前爪反应测试中，采用4×105个NR1细胞治疗的动物表现出功能恢复率的显著增加，到治疗后4周，组平均恢复率达到34％(溶媒组平均值＝10％)，在治疗后8周，组平均恢复率增加到61％(通过Benjami-Hochberg调整，利用Wilcox多重比较测试治疗后4周、5周、6周和8周，p＝0.0469)。在触须-前爪反应测试中，采用溶媒治疗的动物自发恢复程度低，这有可能反映出该模型卒中损伤的具体位置，通常同时包含左侧胡须体觉皮层(负责接收来自右侧胡须的感觉刺激)和负责控制右前肢的运动皮层。因此，本研究的结果表明，触须-前爪反应测试可以为缺血性皮层卒中的永久模型提供对功能缺陷和恢复的灵敏度量，此外，在损伤部位的内侧和紧邻损伤部位处施用4×105个NR1细胞而不是1×105个NRl细胞可以选择性地增强这些脑区的功能恢复。
姿势-反射测试。为了提供前肢运动功能的第二度量和运动协调的度量，使用姿势-反射测试。姿势-反射测试结果见第4.3.2节。卒中损伤后，大多数动物在测试中都表现出严重的缺陷，大多数动物在被放到桌上时无法进行对称的前肢着地，很多动物在静止时表现出抵抗从一边到另一边的轻微推动的能力受损。接受溶媒治疗的动物在该测试中表现出中度功能恢复，在8周时平均恢复率达到50％。在采用1×105个NR1细胞治疗的动物中观察到类似的恢复，治疗后8周，该组的平均恢复率达到35％。相反，相对于采用溶媒治疗的动物，在姿势-反射测试中，采用4×105个NR1细胞治疗的动物表现出功能恢复率的显著增加，到治疗后4周，组平均恢复率达到46％(溶媒组平均值＝29％)，在治疗后8周，组平均恢复率增加到88％(采用Bonferonni事后检验，通过多重比较ANOVA，治疗后4周、5周、6周、7周和8周，p分别等于0.0194、0.0115、0.0007、0.0028和0.0003)。相对于触须-前爪反应测试，在该测试中观察到，溶媒组中的自发恢复程度较高，其原因很可能是由于一般运动协调的恢复(尽管右前肢运动缺陷持续存在)。
改良神经功能评分测试。将改良神经功能评分测试作为卒中后功能缺陷和恢复的第三探索性度量，提供对前肢感觉运动功能、行走时肢体协调和平衡的累积评估(所测试的参数见表6)。改良神经学测试结果见第4.3.3节。卒中损伤后，大多数动物在该测试中表现出中度缺陷，表现为右前肢屈曲、右前肢感觉运动功能和平衡木穿越能力受损。与其他行为测试对比，在改良神经功能评分测试中，所有治疗组均表现出实质性的恢复，主要是由于平衡木表现的改善。相对于溶媒，未观察到采用1×105个NR1细胞或4×105个NR1细胞进行治疗的动物在恢复方面存在任何显著差异，其原因很可能是由于在采用溶媒治疗的动物中也观察到自发恢复和/或适应的程度。
解剖学结果测量。就组织学分析而言，在治疗后9周(卒中后10周)收集并处理脑组织，对梗死面积、梗死周围皮层的完整性/修复(通过血管密度、活化的小胶质细胞/免疫细胞的存在和轴突生长确定)、人类细胞持久性进行组织学评估，以及对任何异位组织或肿瘤形成进行鉴定。
为了证明观察到的右侧胡须/前肢感觉运动功能损伤，卒中诱发的梗死主要局限于左侧体感运动皮层，包括胡须体觉皮层和负责控制右前肢的运动皮层区域。梗死面积的范围介于所评估的左半球总面积的7-49％之间，有些梗死涉及同侧侧脑室扩张(例如参见图6)。相对于溶媒组，未观察到任一NR1治疗组(1×105个NR1细胞或4×105个NR1细胞)的梗死面积存在任何显著差异。
在卒中后10周，对梗死周围皮层进行组织学评估，以鉴定宿主脑组织保留和/或修复的变化，这些变化可能与NR1相关的卒中后功能恢复增强有关。脉管系统(RECA1)、活化的小胶质细胞/免疫细胞(Iba1)和轴突的免疫荧光标记分别用于获得梗死周围血管密度、炎症和轴突保留/生长的定量度量。结果见第4.4.2节-第4.4.8节。基于这些分析，在卒中后10周，相对于溶媒组，4×105NR1治疗组表现出活化小胶质细胞/免疫细胞的显著减少(通过学生t检验，p＝0.0340)。然而，线性回归分析表明，在卒中后9周，每只动物的功能恢复(通过触须-前爪反应测试确定)与其梗死周围小胶质细胞/免疫细胞活化之间并无相关性，这表明梗死周围组织炎症的调节可能并不是驱动该卒中模型中观察到的与高剂量NR1治疗相关的恢复增强的主导机制。此外，通过线性回归分析进行的梗死周围血管密度和轴突保留/生长的组织学评估表明，在卒中后9周，治疗组平均值之间无显著差异，并且不存在与个体行为恢复的相关性。
在治疗后9周(卒中后10周)，通过抗人核抗体(hNUC)的免疫荧光标记，对NR1细胞持久性进行组织学评估。结果如表9所示。对于每只采用NR1进行治疗的动物，对含有可见针道的脑切片以及含有靶标移植坐标的脑切片进行人工评估，确定是否存在hNUC阳性细胞。对于所有所评估的动物，在治疗后9周，未检测到任何hNUC阳性细胞，这表明在这种异种移植物损伤模型中，NR1细胞无法长期持续存在。此外，在任何所评估的动物中，均未观察到异位组织或肿瘤形成的迹象。
结论
本研究的目的是对免疫功能受损大鼠缺血性皮层卒中后7天NR1移植的功能性作用和解剖学作用进行评估。脑组织的行为评估和组织学分析证实，缺血性损伤为单侧损伤，并且观察到对侧(右)前肢功能的功能丧失最为明显。在研究期间，任一NR1剂量的施用都未对动物健康、体重或死亡率产生不利影响。
与溶媒对照组相比，采用4×105个NR1细胞而非1×105个NR1细胞进行治疗使对侧胡须和前肢的感觉运动功能得到改善，这表明NR1在该模型中具有潜在的剂量效应。
在卒中后10周进行的组织学评估表明，根据治疗组平均值，与溶媒对照组相比，对于采用4×105个NR1细胞(而非1×105个NRl细胞)进行治疗的动物，其梗死周围皮层的小胶质细胞/免疫细胞活化减少，但这一结果与治疗后8周的个体功能恢复无关。
对于所有所评估的动物，在给药后9周，未检测到任何存活的人类细胞，这表明在这种异种移植物损伤模型中，NR1细胞无法长期持续存在。从治疗后4周开始，持续到治疗后至少8周(研究结束)，在采用4×105个NR1细胞进行治疗的动物中，观察到行为恢复改善，这表明在缺乏长期NR1持久性的情况下，出现了慢性恢复增强。在任何所评估的动物中，均未观察到异位组织或肿瘤形成。
示例5
NR1即为所述药物产品。它由NR1主细胞库(MCB)制成，通过NR1原料药(DS)制成产品NR1。表2提供了所使用的各种细胞库和药品原料的名称。
NR1是一种可扩增的人神经干细胞系，其来源于威州细胞研究所WA09(H9)人胚胎干细胞(hESC)(hESC)系。在不丧失表型潜力或核型稳定性的情况下，NR1在体外形成了可扩增的同质长期培养物。NR1制造过程无需重复使用hESC和分化为神经干细胞，相反，在无饲养层的贴壁培养中，传代至15代(p15)时冻存的NR1主细胞库(MCB)小瓶在限定的培养基中解冻并扩增至p18，即可生产出NR1原料药(DS)。
一小瓶药物产品中含有作为活性物质的6×106个NR1神经干细胞。将细胞冷冻保存在50％的培养基中(细胞在培养基中扩增)，以及50％的冷冻保存培养基(由市售冷冻保存溶液(85％)(ProFreeze CDM，Lonza)和DMSO(15％)组成)中。
根据剂量递增分组，每位患者将解冻2-12瓶，以各种细胞浓度，将细胞洗涤并浓缩成含0.5％ HSA的勃脉力ATM的给药配方，并且注射体积在整个剂量递增期间保持恒定。细胞将利用立体定向颅内注射进行给药。
所述适应症用于1期/2期合并临床研究，其设计旨在评估NR1脑内移植(ICT)在慢性缺血性皮层下卒中(cISS)受试者中的安全性、耐受性并获得疗效指征。拟将其作为一项在18-75岁稳定型缺血性卒中引起偏瘫的受试者中，利用立体定向颅内注射NR1细胞进行的开放标签的安全性和耐受性研究。
药物研发
工艺开发并未被隔离在原料药与产品之间，这是因为药物产品NR1的生产是一个连续的过程，采用最低限度的制程控制，最后进行装瓶和冷冻保存。
进行探索性研究旨在研究生产结束(EOP)时cGMP MCB源性NR1药物产品的生长行为。只有一种p18 NR1培养物生长到这些较高的传代数。本研究涉及到生产的两个方面：操作人员作用的变化，以及达到零生长所需的传代数。1)由技术人员在斯坦福完成EOP，该名技术人员与培养七个试生产批和一个研究批的技术人员不同，2)EOP时，对比生长速率达到零之前可能出现多少传代进行了研究。
EOP样本核型分析
为了确定细胞生长超过p18时是否能够保持核型稳定性，2014年6月26日，将p28的冻存细胞样本送往位于威斯康星州麦迪逊市的细胞系遗传中心进行核型分析。结果表明，达到p28的细胞具有正常核型。p30原料的代表性样本并未提交核型评价，这是因为该传代的理论产量很大，并且可以确定的是，在cGMP或非临床生产中，可能永远不会出现这么大的传代数。在第18代和第28代之间，细胞不太可能转变为异常核型之后再恢复为正常核型。
EOP样本的微阵列和免疫组织化学分析
此外，作为这项探索性研究的一部分，将第18代、第24代、第28代和第30代的细胞样本送交加州大学洛杉矶分校的William Lowry博士，以评价NR1 EOP细胞的转录组和体外分化特征。这些技术并非目前用于进行cGMP NR1放行检测的合格方法。相反，这些研究或者是1)对每个传代时间点的一个培养物的培养细胞进行组织免疫组织化学染色，基于对免疫荧光染色的密度或亮度的定性观察，对细胞进行评分，或者是2)基于研究的微阵列分析，其再现性尚未确定。
简言之，本次初步实验的结果表明，来自不同传代的NR1细胞相互转录群集，并且与所介绍的任何其他细胞类型(hESC、hiPSC、NSC、血管内皮、平滑肌、角质形成细胞、间皮、肝细胞、神经元、肾脏和肌上皮细胞)相比，NR1细胞更与成纤维细胞类似(但独特不同)。此外，在所提供的NR1传代样本中，早期传代似乎与后期传代不同，这表明随着时间的推移出现了一些选择。p18的NR1显示出与p24-30所显示的基因表达谱相当的个体基因表达谱，并且与p18 NR1 DS细胞一样，p24-30也是群集在一起。尽管来源于hESC系，但是在RNA或蛋白水平上均没有证据表明，在所分析的任何NR1传代中，关键多能性基因发生了重新活化。在所测试的所有传代中，NR1细胞分化为神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的有限能力并未表现出差异。
生产工艺
NR1由稳定的可扩增同质培养物形成，并且可以传代至少15次，而不会失去表型潜力或核型稳定性。NR1生产过程无需重复使用hESC和分化为神经祖细胞，相反，在无饲养层的贴壁培养中，传代至15代(p15)时冻存的NR1主细胞库(MCB)小瓶在限定的培养基中解冻并扩增至p18，即可生产出NR1原料药(DS)。DS生产是连续过程的一部分，之后会将DS灌封和冻存形成NR1，因此任何NR1 DS小瓶都不会以这样的方式生产。
在cGMP NR1 MCB产生时，开始进行COH时的原料药和药物产品的cGMP生产，2012年9月1日装瓶并冻存。为了生产出NR1，从MCB“源”材料开始，到目前为止已进行了三次cGMP运行。由原料药的连续过程生产药物产品。本发明提供了整个过程的示意图(图2)，以帮助划定连续生产中原料药和药物产品步骤的轮廓。为了清晰起见，图中原料药和药物产品的轮廓划定以黑色水平线表示，并在垂直的第一板块中注明。在NR1 MCB解冻和后续扩增时，将p15、p16和p17的细胞接种，但在酶促释放和收获时，传代数增加了一代。在细胞扩增过程中，在单层暴露于胰蛋白酶之后，培养传代数增加一次；(例如，当接种第16代细胞，然后将其扩增为接近汇合的单层并进行胰蛋白酶化时，将由此产生的悬浮液视为第17代)。
研究人员认为，原料药(BDS)是通过酶促细胞培养容器释放和初始汇集细胞重悬收获的最终传代(p18)，对其进行计数，以确定细胞浓度和收集到的总细胞数。此时，p18的最终配制开始，以便准备NR1装瓶和冻存。
药物产品NR1的生产过程开始于最初收获、离心、重悬和汇集的细胞，这些细胞是从4天前接种的第17代细胞中消化(释放)的胰蛋白酶。
从BDS到灌装成品冷冻NR1的所有工艺步骤都与BDS收获同一天发生。简言之，对细胞进行计数，即可计算出已收获细胞的浓度和总细胞产量。然后，对细胞进行离心，除去上清液，并以1.2×107个细胞/mL的密度将细胞重悬于完全培养基中。对细胞重新计数，以确保细胞浓度填充精度，然后用2倍ProFreeze/DMSO冷冻溶液以1:1(v:v)稀释，得到最终DMSO浓度7.5％。然后，以每个聚丙烯冷冻小瓶1mL的标称体积，手动灌装该细胞悬液。通过使用控制降温速率的深冷冰箱进行冷冻，冻存已装瓶的NR1。将NR1(药物产品)储存在气相LN2深冷冰箱中。
关键步骤和中间体的控制
药物产品生产的关键步骤包括细胞计数、离心和控制速率的冻存。
细胞计数：手动细胞计数，使用台盼蓝染料，以便于细胞活力的可视化和评估。
离心：按照批次记录规范进行离心控制，转速规定为NNN x g，任何离心机/转子组合的转速均可计算。根据cGMP IOQ文件安装设备，并根据COH PM和校准程序进行设备校准和维护。
控制速率的冻存：使用平面控制速率冷冻柜，将药物产品放在1.2mL冷冻小瓶中冻存(第3.2.P.7节)。COH利用其“标准”1.0mL冻存冷冻程序，使冷冻室温度每分钟降低约1℃，直至达到-40℃，然后加快冷却速率。根据方案SOP-0948A进行冻存。
示例6
脑卒中啮齿动物模型中的神经可塑性和移植NR1细胞
本研究的目的是通过分析NR1细胞如何影响远端皮层卒中后裸大鼠梗塞周围区域皮层活性，研究NR1细胞对可塑性的影响。
在人和啮齿动物卒中后观察到的自发恢复中，大脑可塑性或重连起到关键作用，重连出现在卒中部位(即梗死周围区域)附近的存活回路中。可塑性使健康的大脑区域能够补偿卒中受损区域的功能。移植的干细胞可增强卒中后的大脑可塑性。因此，我们通过分析NR1细胞如何影响裸大鼠梗死周围区域的皮层活性，研究了NR1细胞对可塑性的影响。
使用与cGMP NR1生产相同的程序，在斯坦福大学生产NR1试生产批#7：
材料和方法
研究设计总结——高通量电生理学测定。本研究中使用的高通量电生理学方法如下：在经历远端皮层卒中一周后，对裸大鼠进行NR1细胞或溶媒对照移植。移植后七天，对大鼠实施安乐死，收集大脑，制作活体切片，并将多通道记录探针置于梗死周围垂直于皮层的运动皮层(M1区)，使记录位点横跨所有皮层。激活皮层电路后(利用通过电极传递的短暂电刺激)，在所有皮层中同时测量局部场电位，即一种神经元集群活性的度量。
视网膜神经节神经元细胞(RGC)的体外突触发生。根据斯坦福大学巴雷斯实验室的标准实验室方案，培养视网膜神经节神经元细胞(RGC)。然后在RGC上方的培养室中进行NR1细胞的共培养，防止细胞间接触，但允许交换分泌因子。作为对照，将星形胶质细胞与RGC平行共培养。24小时后处理RGC，并通过统计细胞体的数量确定突触发生的程度。
NR1移植部位周围脑组织的RNA测序。接受NR1和对照溶媒的大鼠大脑的基因表达模式汇总如下：移植后7天，从大鼠脑活检中提取总RNA，并按照标准分子生物学程序生成cDNA文库。在用7只经NR1治疗的大鼠和4只经对照溶媒治疗的大鼠制备cDNA文库后，使用LuminexR Hiseq 2500高通量测序仪完成RNA测序。使用DESeq2软件，完成随后的基因本体分析。
结果汇总
NR1细胞通过从抑制性控制中释放梗死周围区域内的单个神经元来增加运动回路活性。电刺激后，对照组和NR1移植组均产生特征反应，这种反应从大脑表面附近的浅层开始，然后传播到更深层。最为显著的是，移植后第7天，NR1移植显著(P<0.05)增加了梗塞周围皮层的运动回路活性，其中皮层2/3中活性增加最明显。
其他实验通过测量施加电刺激后皮层2/3中单个锥体神经元的反应，研究了NR1治疗如何影响梗死周围区域内的单个神经元。随后的分析可以可靠地估计出抑制性与兴奋性连接对神经元整体测量反应的贡献。在NR1组中，所记录的抑制性连接的幅度显著减小(P<0.05)，发病也有所延迟，而NR1对兴奋性连接没有任何显著影响(图1c)。总之，这些数据表明，NR1细胞通过从抑制性控制中释放梗死周围区域内的单个神经元来增加运动回路活性，并且表明了NR1细胞有利于改变大脑活动。NR1分泌的TGFβ3是体内表达最高的NR1因子之一，5可参与NR1对皮层2/3可塑性的影响，这是因为卒中后TGFβ3在皮层2/3神经元中存在特异性上调。6
图13.通过移植的NR1细胞，将梗死周围区域内的神经元从抑制性控制中释放出来。卒中诱发的大脑在梗死周围区域内注射有NR1细胞。7天后，对活体切片进行电刺激，并同时测量所有皮层中的局部场电位。a)热图显示了运动皮层对L2(兴奋性)和L3(抑制性)刺激反应的时空模式。b)皮层2在一系列刺激中的最大兴奋。数据为平均值+SEM。c)皮层2和皮层3中单个神经元的反应分为兴奋性(Ge)和抑制性(gi)成分，反应幅度在y轴上，时间在x轴上。每种条件下的代表性痕迹如图所示。
NR1细胞增加了体外突触发生：除了改变体内可塑性外，NR1细胞还能改变体外可塑性，在这种情况下，通过突触形成改变。与斯坦福大学巴雷斯实验室合作完成的研究结果表明，NR1细胞与视网膜神经节神经元细胞(RGC)非接触式共培养，在与星形细胞相同的程度上增强了RGC突触发生6(见图14)。这一初步结果提供了一种潜在效价测定和一种鉴定参与调节可塑性的NR1分泌因子的方式。
图14：在体外，通过添加NR1细胞，增强了突触发生。在非接触条件下，视网膜神经节神经元细胞(RGC)与星形胶质细胞或NR1细胞共培养。通过统计细胞体计数来量化突触发生。在对照星形胶质细胞、星形胶质细胞和NR1细胞之间观察到了显著差异(表明NR1细胞通过分泌因子刺激突触发生。图形＝平均值+平均值的标准误差(SEM)。**P<0.01，Dunn事后检验。***P＝0.003，克鲁斯卡尔-沃利斯检验。
为了研究移植的NR1在抑制性回路减少中的作用，我们比较了接受NR1和对照溶媒的大鼠大脑的基因表达模式。移植后7天，从NR1和对照溶媒移植部位的大鼠脑活检中提取RNA。在用七只经NR1治疗的大鼠和四只经对照溶媒治疗的大白鼠制备cDNA文库后，通过Hiseq 2500(50双末端测序)进行测序。基因本体论分析将NR1移植与可塑性相关基因的表达联系起来，表明NR1细胞调节神经元活性和早期可塑性能够实现后期功能恢复。在比较来自NR1和对照溶媒样本的cDNA文库时，共有267个基因出现差异表达(DEG，p<0.05，图15)。
图15：NR1细胞在早期调节神经元活性和可塑性，从而实现了后期功能恢复。给卒中诱发的成年裸大鼠注射NR1或对照溶媒，并在移植后7天处死。对NR1移植部位和对照溶媒样本的脑活检生成的cDNA文库进行的基因本体分析表明，接受NR1细胞差异表达基因的大脑参与刺激成人神经前体细胞增殖、神经分化、直接参与神经元电生理特性的门控通道、轴突导向、轴突生成和突触发生。
在皮层2/3中差异表达的基因包括：Hapln4/Bral2、Kcnc1/Kv3.1、SCN1a、Slit3和Slitkr1(表3)。7-10这些数据表明，移植的NR1在早期调节神经元可塑性，从而实现了后期功能恢复。
结论。NR1细胞通过从抑制性控制中释放梗死周围皮层内的单个神经元，有助于实现梗塞周围区域的可塑性。NR1细胞通过分泌刺激突触发生的因子来调节可塑性。
示例7
卒中啮齿动物模型的炎症反应
本研究的目的是表征NR1细胞移植到发生卒中损伤的裸大鼠大脑中引发的炎症反应。
在临床前研究中，慢性卒中的干细胞治疗表现出令人兴奋的潜力，卒中后数周至数月进行的干细胞移植则显著改善了啮齿动物的功能恢复。临床前工作支持这样一种假设，即，移植的细胞通过分泌旁分泌因子(例如VEGF)来调节大脑的自然修复过程，如可塑性、炎症和血管生成，从而增强卒中后的恢复。因此，移植干细胞诱导卒中后恢复的可能作用机制是免疫反应/炎症的调节。我们在体外研究了卒中大脑中的炎症反应，以及NR1细胞对巨噬细胞的影响，长期目标是提供一种关于炎症在移植干细胞引发的卒中恢复中的作用的可测试模型。
材料和方法
脑卒中诱发大脑中NR1细胞的移植。卒中诱发一周后，按照斯坦福大学批准的方案，将裸大鼠麻醉并保持在立体定位仪中。根据标准方案(NCP-001.01)制备NR1细胞，并以1×105个细胞/μL的浓度在含有勃脉力A和0.5％ HSA的溶液中稀释NR1细胞。将NR1细胞移植到皮层和纹状体中。对于皮层，在以下预定坐标处，移植两个1.0μL剂量的NR1(1×105个细胞/注射，总共注射2×105个细胞)：AP 1.0，ML 1.2，DV-1.5：AP-1.8，ML 2.0，DV-2.0。对于纹状体，在以下预定坐标处，移植一个1μL剂量的NR1(1×105个细胞/注射)：AP-1.8，ML2.0，DV-5.0。以0.5μL/分钟的速率移植细胞。所有细胞移植后，移植针在坐标部位再保持2分钟，然后再缓慢移除。这样做是为了最大限度地减少NR1细胞在移除移植针时被“吸出”移植部位的情况发生。
M1/M2巨噬细胞的定量。根据斯坦伯格实验室的方案，处理所有大鼠组织，并分离和制备细胞。使用斯坦福共享FACS设施上的LSR II分选器，将巨噬细胞/单核细胞分选为CD11b+Lin-细胞，将M1促炎/M2抗炎巨噬细胞分别分选为Ly6C+/-F4/80+细胞。使用FlowJo软件(FlowJo LLC)，对所得的数据进行分析。
体外方法。首先，使用脂多糖将骨髓源性巨噬细胞(BMDM)极化到M1/促炎状态，或使用IL-4极化到M2/抗炎状态。然后，将NR1细胞在与BMDM相同的孔中共培养，或在巨噬细胞上方的培养室中共培养，防止细胞间接触，但允许交换分泌因子。24小时后，处理BMDM，并使用M1/M2巨噬细胞特异性引物对完成qPCR分析(M1/促炎标志物＝TNFα。CCL3/MIP1a。M2/抗炎标志物＝CD206，Arg1，TGFβ)
结果汇总
在移植后早期，NR1细胞改变了免疫反应：已经确定，炎症/免疫细胞亚群有助于损伤后CNS的恢复。因此，调节卒中后的免疫反应可能是NR1细胞诱导恢复的机制。使用上述卒中和移植范式，在移植后的不同时间，收集大脑、血液和脾脏，并通过流式细胞术分析其免疫细胞图谱。数据显示，NR1和缓冲液移植的大鼠之间存在免疫反应差异(图16a-c)。与缓冲液治疗组相比，采用NR1治疗的卒中诱发大鼠表现出更可变的反应。在移植后第3天，经NR1治疗的大鼠也显示出大脑粒细胞和M1和M2样单核细胞/巨噬细胞数量增加的趋势。到第5天，NR1组中的这些亚集群的水平出现下降。相反，在第5天(与第3天相比)，单独用缓冲液治疗的大鼠显示出两种亚型单核细胞/巨噬细胞增加的趋势。这表明这些集群的时间反应在各治疗组之间存在差异。在NR1组中，血液中的主要效应是在第5天有更多的“M2”单核细胞和调节性B细胞。
图16：将NR1注射到大鼠卒中损伤大脑中会改变免疫反应。根据Stanford-5疗效研究，将NR1细胞移植到卒中诱发大鼠的皮层和纹状体中。12在第3天和第5天，处死动物，并对大脑、血液和脾脏组织进行FACS处理，以便分析免疫调节细胞的图谱。a)第3天和第5天M1样单核细胞/巨噬细胞的图谱。b)第3天和第5天M2样单核细胞/巨噬细胞的图谱。c)第3天和第5天粒细胞的图谱。
NR1细胞在体外将巨噬细胞极化从促炎极化转变为抗炎极化：将巨噬细胞分为一系列功能亚型(促炎/抗炎)，并可根据其所处的微环境进行亚型间切换。图谱的一端是M1巨噬细胞，它们通常具有促炎性；另一端是M2巨噬细胞，其通常会产生抗炎介质并参与免疫调节和组织修复反应。为了确定NR1细胞在多大程度上影响巨噬细胞极化，将骨髓源性巨噬细胞极化为促炎M1(通过LPS)或抗炎M2(通过IL-4)亚型，然后与NR1细胞一起孵育，24小时后收获，进行M1或M2相关标志物的qPCR分析(图17a)。对于M1/LPS刺激的巨噬细胞，NR1显著降低了M1促炎因子TNFα和CCL3的表达，同时增加了M2抗炎细胞因子IL-10的表达。对于M2/IL-4刺激的巨噬细胞，NR1细胞增加了M2标志物(Arg1、CD206、TGFβ)的表达。这些数据表明，通过增加M2和减少M1巨噬细胞基因表达，NR1细胞将巨噬细胞推向了有益的M2样状态。
图17：NR1细胞对巨噬细胞的体外极化。首先，通过LPS或IL-4，分别将骨髓源性巨噬细胞极化到M1/促炎状态，或M2/抗炎状态。然后，将M1和M2巨噬细胞与NR1细胞或对照溶媒一起培养(注：巨噬细胞和NR1细胞发生相互接触)。24小时后，对细胞进行处理，并使用M1/M2巨噬细胞特异性引物对进行qPCR分析。a)NR1细胞或对照溶媒存在情况下M1/促炎巨噬细胞的相对基因表达。b)NR1细胞或对照溶媒存在情况下M2/抗炎巨噬细胞的相对基因表达。这些数据表明，通过增加M2和减少M1巨噬细胞基因表达，NR1细胞将巨噬细胞推向了有益的M2样状态。注：M1/促炎标志物＝TNFα。CCL3/MIP1α。M2/抗炎标志物＝CD206，Arg1，TGFβ
在先前的体外实验中，NR1细胞和巨噬细胞发生了相互接触。为了确定NR1分泌的因子对巨噬细胞极化的影响，将NR1细胞在巨噬细胞上方的培养室中共培养。从NR1和巨噬细胞发生接触的共培养实验可以看出，在本研究中，NR1细胞也使巨噬细胞朝着M2/抗炎表型极化，这表明产生这种作用的原因是NR1细胞分泌的因子(图18)。在M1极化的巨噬细胞中，M1标志物TNFα的表达显著降低，M2标志物TGFβ的表达增加，M2标志物ARG-1的表达显著增加(图18a)。在M2极化的巨噬细胞中，M1标志物MIP1a/CCL3和TNFα显著减少，M2标志物ARG-1显著增加(图18b)。
图18：NR1分泌因子对M1/M2巨噬细胞的体外极化。如前所述，首先，骨髓源性巨噬细胞极化为M1或M2状态。然后在巨噬细胞上方的培养室中进行NR1细胞的共培养，防止细胞间接触，但允许交换分泌因子。24小时后，对巨噬细胞进行处理，并使用M1/M2巨噬细胞特异性引物对进行qPCR分析。a)NR1分泌因子或对照溶媒存在情况下M1/促炎巨噬细胞的相对基因表达。b)NR1细胞或对照溶媒存在情况下M2/抗炎巨噬细胞的相对基因表达。b)NR1分泌因子或对照溶媒存在情况下M2/抗炎巨噬细胞的相对基因表达。这些数据表明，观察到的通过NR1向M2/抗炎状态的转变由分泌因子引起。注：M1/促炎标志物＝TNFα。CCL3/MIP1a。M2/抗炎标志物＝CD206，Arg1，TGFβ
为了确定NR1分泌因子是否仅对受刺激的M1/M2巨噬细胞发挥了这种极化作用，如前所述，将未受刺激的巨噬细胞与放置在培养室中的NR1细胞共培养。M1标志物MIP1a的显著减少和M2标志物CD206和ARG1的显著增加表明，NR1分泌因子也将未受刺激的巨噬细胞推向了M2状态，如M1标志物基因减少和M2标志物基因表达增加所示(图19)。
图19：NR1分泌因子对未受刺激的巨噬细胞的体外极化。将BMDM与NR1共培养，其中NR1细胞放置在巨噬细胞上方的培养室中，防止细胞间接触，但允许交换分泌因子。24小时后，处理巨噬细胞，并使用M1/M2巨噬细胞特异性引物对进行qPCR分析。M1标志物(MIP1a)的显著减少和M2标志物(CD206、ARG1和TGFβ)的显著增加表明，通过减少M1标志物基因和增加M2标志物基因表达，NR1分泌因子也将未受刺激的巨噬细胞推向了M2状态。注：M1/促炎标志物＝TNFα。CCL3/MIP1a。M2/抗炎标志物＝CD206，Arg1，TGFβ。
结论。在移植后早期，NR1细胞通过将巨噬细胞从M1/促炎状态极化为M2/抗炎状态，改变了免疫反应。在体外，NR1细胞通过分泌因子改变免疫反应，通过增加M2巨噬细胞基因表达和减少M1巨噬细胞基因表达，将未受刺激的巨噬细胞和M1-/M2刺激的巨噬细胞同时推向有益的M2/抗炎状态。
示例8
原始态啮齿动物大脑中NR1细胞存活率的研究。
本研究的目的是确定移植后第1天、第3天和第7天移植到原始态啮齿动物大脑中的NR1细胞的存活水平。
已经确定，将包括NR1细胞在内的神经干细胞或再生细胞移植到卒中诱发的啮齿动物大脑中显著改善了功能恢复。作为这一过程的初步表征，确定移植后NR1细胞随时间推移的存活率图谱就显得十分重要。因此，我们进行了一项关于移植到原始态裸大鼠大脑中的NR1细胞存活率的研究。
材料和方法
NR1细胞移植到原始态裸大鼠大脑中。按照斯坦福大学批准的方案，将成年大鼠麻醉并固定在立体定位仪中。使用直肠温度计测量动物体温，并在实验期间使用恒温毯装置保持温度。根据标准方案(NCP-001.01)制备NR1细胞，并以1×105个细胞/μL的浓度在含有勃脉力A和0.5％HSA的溶液中稀释NR1细胞。将NR1细胞移植到皮层和纹状体中。在皮层中，在以下预定坐标处，移植两个1.0μL剂量的NR1(1×105个细胞/注射，总共注射2×105个细胞)：AP 1.0，ML 1.2，DV-1.5：AP-1.8，ML 2.0，DV-2.0。在纹状体中，在以下预定坐标处，移植一个1μL剂量的NR1(1×105个细胞/注射)：AP-1.8，ML 2.0，DV-5.0。以0.5μl/分钟的速率移植细胞。所有细胞移植后，移植针在坐标部位再保持2分钟，然后再缓慢移除。这样做是为了最大限度地减少NR1细胞在移除移植针时被“吸出”移植部位的情况发生。
组织处理。在细胞移植后第1天、第3天和第7天，用1X PBS和4％ PFA灌注大鼠。小心地取出整个大脑，固定后过夜，并在30％蔗糖中达到平衡。从AP+1.2开始到AP-2.0，在30μm处切开冠状切片。在填充冷冻保护剂的24孔板中收集连续切片。每个大脑取六个连续切片中的一个，从A-P+1.1开始，以0.18mm为间隔(因为其中包含移植部位)。所有选取的切片均使用标准免疫组织化学程序进行处理。
免疫组织化学。将对人细胞核进行特异性染色的小鼠抗HuNu一抗在4℃(1:1000倍稀释，MAB1281，美国密理博公司)下孵育过夜。将一抗与山羊抗小鼠生物素化的二抗(1:1000，Vector Laboratories)在室温下孵育2小时，洗涤后与抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物孵育(30分钟，ABC，Vectastain Elite；Vector Laboratories)。为了将NR1细胞可视化，采用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色，仅将人NR1细胞染为褐色。然后将切片按由前到后的顺序放在载玻片上。
体视学细胞计数。使用Stereo Investigator软件(MBF Bioscience，美国佛蒙特州威利斯顿)，并采用光学分馏器体视学方法，获得HuNu阳性细胞核总数的估计值。对皮层和纹状体进行单独计数。简言之，从AP+1.2延伸到AP-2.0的每六个切片(切片间隔180μm)进行采样，使测量值共跨越3.2mm(每只动物约18个切片)。使用2.5倍物镜和生成的75×75μm计数栅，对移植的NR1细胞进行绘制。将无偏计数框置于第一计数区域上，并系统地穿过所有计数区域，直至能够对整个绘制区域进行采样为止。使用63倍油浸物镜进行实际计数。
使用以下公式，求得染色NR1细胞总数的估计值：E＝k∑N，其中，E为每只动物中染色NR1细胞总数的估计值，∑N为所有分析切片中n值的总和，k表示考虑到每k个切片。
结果汇总
移植后第1天-第7天，移植在皮层和纹状体中的NR1的存活率显著降低：移植后第1天，皮层和纹状体中存活NR1细胞的百分比分别为12.1％和29.2％。第3天，皮层和纹状体中存活NR1细胞的百分比分别为10.1％和17.5％。第7天，皮层和纹状体中存活NR1细胞的百分比相似——分别为2.1％和2.8％(图20)。在皮层或纹状体移植中，在第1天和第3天之间，未观察到存活NR1细胞的百分比有任何显著差异。然而，在皮层和纹状体移植中，在第1天和第7天以及第3天和第7天之间看到了显著差异。
图20：原始态裸大鼠皮层/纹状体移植中NR1细胞的存活率。将NR1细胞移植到大鼠的皮层(两次1μL注射，1×105个细胞/注射)或纹状体(一次1μL注射，1×105个细胞/注射)。在移植后第1天、第3天和第7天，将其处死，并用DAB和Iba1(仅检测人/NR1细胞核)对来自每个时间点的脑组织30μm切片进行染色。采用光学分馏器体视学方法，对每个切片内的染色细胞核进行计数，使用光学显微镜对NR1细胞核的数量进行量化。在第1天和第7天之间以及第3天和第7天之间，在皮层和纹状体移植中均观察到存活NR1细胞百分比的显著差异。
结论。在移植到皮层和纹状体后的第1天-第3天，存活NR1细胞的百分并未显著降低。在皮层和纹状体移植中，在移植后第1天-第7天和第3天-第7天，存活NR1细胞的百分比显著降低。在移植后第7天，皮层和纹状体移植中存活的NR1细胞的百分比约为2-3％。
示例9
NR1分泌蛋白质组分析研究
本研究的目的是表征NR1细胞的分泌蛋白质组。
已经确定，将NR1细胞移植到卒中诱发的啮齿动物大脑中显著改善了啮齿动物的功能恢复。作为这一过程的初步表征，需要确定NR1细胞随时间推移的分泌蛋白质组图谱。因此，我们进行了关于NR1分泌蛋白质组的体外和体内研究。
材料和方法
研究设计总结
脑卒中诱发大脑中GFP标记细胞的移植。卒中诱发一周后，按照斯坦福大学批准的方案，将裸大鼠麻醉并保持在立体定位仪中。使用直肠温度计测量动物体温，并在实验期间使用恒温毯装置保持温度。根据标准方案处理含有GFP标记的核糖体亚基的NR1细胞，并以1×105个细胞/μL的浓度在含有勃脉力A和0.5％ HSA的溶液中稀释NR1细胞。3将NR1细胞移植到纹状体中。在以下预定坐标处，移植一个1μL剂量的NR1GFP标记细胞(1×105个细胞/注射)：AP-1.8，ML 2.0，DV-5.0。以0.5μL/分钟的速率移植细胞。所有细胞移植后，在坐标部位再保持移植针2分钟，然后再缓慢移除。这样做是为了最大限度地减少NR1细胞在移除移植针时被“吸出”移植部位的情况发生。
TRAP。体内分泌蛋白质组：2天后，处死大鼠，并根据既定程序，对接受NR1-GFP移植的脑组织区域进行处理，以便于TRAP分析。3简言之，通过用抗GFP抗体进行亲和纯化，可以分离核糖体及其结合的mRNA。将结合的mRNA物种进一步分离并进行RNA测序和分析。
体外分泌蛋白质组：将NR1 GFP标记的细胞在NR1完全培养基(含0.1％和1％人血清)中培养24小时。为了在基因水平上分析体外分泌蛋白质组，如上所述，将NR1细胞分离并进行TRAP/RNA seq分析。
蛋白质分析。为了在蛋白质水平上分析体外分泌蛋白质组，利用蛋白质微阵列芯片(含对已知分泌因子具有特异性的抗体)，以及对免疫调节因子有偏倚的63-plexLuminex检测(Immune Monitoring 63-Plex Human ProCartaPlexR Panel，产品货号EPX650-10065-901)，对来自NR1培养物的条件完全培养基进行分析。由于完全培养基中含有1％人血清(PHS)，因此血清蛋白有可能会掩盖NR1分泌蛋白质组特征。为了控制这种情况，使用低(0.1％)人血清中生长的细胞，进行NR1分泌蛋白质组分析。为了解决低血清条件可能改变NR1分泌蛋白质组分析的问题，对生长在正常(1％)人血清中的NR1的条件培养基(CM)进行平行分泌蛋白质组分析。
结果汇总
体内分泌蛋白质组的TRAP分析表明，NR1细胞可表达调节大脑修复和轴突导向的因子：体内分泌蛋白质组：利用TRAP和RNA测序，对移植NR1细胞体内分泌蛋白质组的分析确定了175个编码分泌蛋白的基因。这些基因的基因本体分析表明，前20个富集过程(图21)与大脑修复相关，包括细胞外基质(ECM)重塑(参与大多数大脑修复机制)以及与炎症和轴突导向相关的过程。这些数据支持这样一种假设，即NR1分泌因子在大脑修复和轴突引导的调节中发挥作用。
在体内通过NR1高表达的大多数分泌性基因中的部分基因包括：Col1A1(1型胶原α1链)，其参与ECM组织，并能影响白细胞迁移和炎症4；LGALS1(半乳糖凝集素1)，已有证据显示其在卒中后将巨噬细胞极化在体内转变为M2样(具有更强的抗炎作用)状态5；TGFβ3，其调节ECM形成并具有促炎和抗炎作用；TIMP1，一种参与ECM降解的MMP抑制剂。它还具有MMP非依赖性作用，并作为生长因子，在髓鞘修复中发挥作用。在利用DAVID生物信息学资源鉴定的NR1体内分泌蛋白质组中，有一些与可塑性有关的表达程度较高的基因，包括：COL6A1、COL3A1、MMP2、SPARC、NRG3和SDF1。
图21：NR1体内分泌蛋白质组的基因本体论表明，NR1细胞可表达与卒中恢复相关的基因。如前所述，将NR1细胞移植到卒中诱发的大鼠中。在移植后第2天，处理脑组织，并根据既定方案分离来自NR1细胞的GFP标记的核糖体。对分离的RNA转录物进行分离、测序，然后进行分析。a)基于生物过程，基因本体分析对表达基因进行分组。b)基于分子功能，基因本体分析对表达基因进行分组。
体外分泌蛋白质组：培养的NR1细胞的TRAP/RNAseq在体外鉴定了编码分泌因子的433个基因。随后的基因本体分析显示，前5个生物过程涉及NR1相关卒中恢复的核心过程：炎症(162个基因，其中144个基因编码与细胞因子活性相关的蛋白质)和ECM组织(65个基因)。使用DESeq2软件，对NR1体外和体内RNA序列分泌蛋白质组数据进行的比较表明，在体内表达的175个分泌型基因中，作为对卒中微环境的反应，有个分泌型基因下调，34个分泌型基因显著上调。在体内鉴定的目标基因中，作为对卒中环境的反应，NRG3和TGFb3上调，而大多数基因的表达在体外和体内并无显著差异。这表明，这些目标基因中的任一基因都可能是NR1效力标志物的潜在候选基因。
为了在蛋白质水平上表征体外分泌蛋白质组，对来自NR1培养物的CM进行了两次测定。
测定1：在含有已知分泌因子特异性抗体的蛋白质微阵列芯片上，对CM进行测试。研究发现，基于五种蛋白质(FGF18、CSF3、CCL2、FGF7和FGF17)对可塑性、炎症和血管生成的已知影响，这五种蛋白质有可能参与NR1的作用机制。其中，仅CCL2在体外RNA序列分析中表现出了稳健的表达。
测定2：在63-plex Luminex assay上运行CM(对免疫调节因子有偏倚)。在已鉴定的25个因子中，最突出的因子是：纤溶酶原激活物抑制因子1(PAI1/丝氨酸蛋白酶抑制因子1)——一种细胞外基质重塑的调节剂；VEGF——一种血管生成因子，其也能促进轴突发芽、神经发生和突触发生；MCP1——一种对包括单核细胞和DC在内的免疫细胞具有趋化作用的因子；SDF1a——一种血管生成因子，对淋巴细胞和神经祖细胞具有趋化作用(图22)。当NR1细胞在低或正常人血清水平(分别为0.1％和1％)下培养时，观察到这些结果。
图22：NR1分泌与卒中恢复相关的蛋白质。NR1细胞在低(0.1％)人血清或正常人血清(1％)中的任一完全培养基中培养。24小时后收集CM，并运行63-plex Luminex assay。a).来自CM的低(0.1％)和正常(1％)人血清(0.1％)样本和仅培养基(对照)样本的平均荧光强度(MFI)。b).最突出的NR1分泌因子参与单核细胞和树突细胞的趋化作用(MCP-1)、ECM重塑(PAI1)、淋巴细胞和神经祖细胞的趋化作用(SDF-1)以及血管生成(VEGF)。
表10NR1体内/体外分泌蛋白质组汇总
*＝所示测定中检测到的基因
ND＝未检出。NA＝不适用(测定中不存在候选基因/蛋白质)
结论。NR1细胞的体内/体外分泌蛋白质组表明，NR1细胞能够分泌调节多种因子的因子，这些因子参与与后期功能恢复相关的过程。
示例10
小胶质细胞耗竭对原始态NSG小鼠大脑中移植NR1的存活率的影响。
本研究的目的是确定通过在NR1移植到原始态NSG小鼠大脑前后使用PLX5622来耗竭小胶质细胞是否会提高NR1存活率。
在移植到啮齿动物大脑中之后，NR1细胞的存活期非常短，移植后1周仅有约2％的细胞存活。对细胞的宿主免疫反应可能会对NR1的存活产生有害影响。由于小胶质细胞是脑部驻留巨噬细胞，并且很可能是移植NR1细胞的第一反应者，因此我们利用PLX5622研究了小胶质细胞耗竭对原始态NSG小鼠大脑中移植NR1存活的影响。
研究设计总结。实验概述
a)利用PLX5622，测试NSG小鼠中的小胶质细胞耗竭
b)采用PLX5622，测试小胶质细胞耗竭后的NR1存活率
i.研究1：纹状体加皮层NR1移植
ii.研究2：仅纹状体NR1移植
通过暴露于PLX5622，成年NSG小鼠的小胶质细胞耗竭。成年NOD scid gamma小鼠(NSG)，每笼饲养5只小鼠，喂食标准食物或每公斤含有1200mg PLX5622的标准食物，即靶向CSF1-/小胶质细胞的药物。1化学物质PLX5622由Plexxikon(加利福尼亚州伯克利)提供，并由Research Diets(新泽西州新不伦瑞克)配制并添加到AIN-76A标准食物中。采用自由采食方式，喂食NSG小鼠对照组或PLX5622食物1或3周。经过3周治疗后，小鼠接受NR1细胞大脑移植。移植后，再向小鼠投喂标准食物或PLX5622食物7天。在治疗过程中，每饲喂一段时间对小鼠进行一次监测，以确保其健康。将食物储存在无菌袋中，直至投喂给小鼠。将动物安置在斯坦伯格实验室小鼠室(SCORE，P059N)的笼子里，笼子上贴有一张写有具体信息的粉红色卡片，包括化学品名称(PLX5622)、剂量、动物给药日期/时间、预计治疗结束日期和一张黄色危险药物贴纸。每周检查两次笼子，确保食物水平和正确标贴。
将NR1细胞移植到原始态NSG小鼠体内的外科手术。按照斯坦伯格实验室的既定手术程序，准备成年原始态NSG小鼠的NR1移植手术。2使用PCP-001.01，2以最终浓度1×105个细胞/μl制备NR1细胞，并在拟定的临床配方(勃脉力A加0.5％ HSA)中，作为脑内注射剂给药。对于研究1，将细胞注射到纹状体(2μl/注射部位，即2×105个细胞/沉积；共4×105个细胞)和皮层(1μl/注射部位，即1×105个细胞/沉积，共2×105个细胞)中，坐标如下：
AP：-0.34，ML：+2.5，DV：-2.5(纹状体)
AP：-0.34，ML：+2.5，DV：-0.95(皮层)
AP：+0.96，ML：+1.5，DV：-2.25(纹状体)
AP：+0.96，ML：+1.5，DV：-0.75(皮层)
对于研究2，细胞仅注射到纹状体中，以减少因从皮层中“漏出”而导致的潜在细胞损失。如上所述，使用相同的纹状体坐标和注射体积。在预期的临床递送之后，使用模型化的汉密尔顿微量注射器，进行NR1给药。采用相同的注射方法，向单独的动物分组注射溶媒对照品(勃脉力A加0.5％ HSA)。以0.5μL/分钟的速率移植细胞。所有细胞移植后，移植针在坐标部位再保持2分钟，然后再缓慢移除。这样做是为了最大限度地减少NR1细胞在移除移植针时被“吸出”移植部位的情况发生。通过临床观察和体重记录，每周监测动物的总体健康状况。寿命内评估完成后，在指定的治疗后时间点，收集脑组织进行后续FACS分析。
小胶质细胞的定量。根据斯坦伯格实验室的方案，处理所有小鼠组织，并分离和制备细胞。小胶质细胞是指CD45int/CD11b+/Lin-，“Lin”包含谱系标志物B220、CD3、CD11c、CD49b、CD90.2、Ly6G、NK1.1、Ter119。使用斯坦福共享FACS设施上的LSR II分选器，对小胶质细胞进行定量，并使用FlowJo软件(FlowJo LLC)分析所得数据。
针对存活NR1细胞定量的组织处理。在细胞移植后7天，用1X PBS和4％ PFA灌注小鼠大脑。小心地取出整个大脑，固定后过夜，并在30％蔗糖中达到平衡。从AP+1.2开始到AP-2.0，在30μm处切开冠状切片。在填充冷冻保护剂的24孔板中收集连续30μM厚切片。对于研究1，整个大脑取六个连续切片中的一个，间隔0.18mm；对于研究2，取四个连续切片中的一个，间隔0.12mm。所有选取的切片均使用标准免疫组织化学程序进行处理。
大脑切片的免疫组织化学。在4℃下，将大脑切片与抗人抗体(1:1000倍稀释的抗HuNu，MAB1281，美国密理博公司)孵育过夜。将二抗与生物素化的二抗(1:1000，VectorLaboratories)在室温下孵育2小时，洗涤后与抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物孵育(30分钟，ABC，Vectastain Elite；Vector Laboratories)。利用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色，将人干细胞染成褐色。然后将切片按由前到后的顺序放在载玻片上。
NR1细胞计数。使用Stereo Investigator软件(MBF Bioscience，美国佛蒙特州威利斯顿)，对NR1细胞进行计数。由于每个大脑切片的存活细胞数量很少，因此对染色切片中的所有细胞进行计数，而不是使用体视学计数方法。使用63倍油浸物镜，采用盲法进行计数。简言之，对整个大脑中的切片，每六个切片(研究1)或每四个切片(研究2)抽取一次。将NR1细胞总计数计算为按1:6系列计数的6倍细胞数，或按1:4系列计数的4倍细胞数。
结果
喂食PLX5622食物的小鼠的小胶质细胞水平下降。喂食PLX5622的NSG小鼠大脑中小胶质细胞水平出现显著下降，与PLX5622治疗1周相比，在3周后观察到更大范围的小胶质细胞耗竭。在NR1移植前1周内喂食PLX5622的小鼠中，小胶质细胞水平为对照组的61％，即下降了40％。在NR1移植前3周内喂食PLX5622的小鼠中，小胶质细胞水平为对照组的25％，即下降了75％。基于这些数据，对于后续的NR1存活率研究，选择采用PLX5622进行为期3周的预治疗。
图23：PLX5622使大脑小胶质细胞出现显著耗竭。在处死前a)1周或b)3周内，向NSG小鼠喂食PLX5622或对照食物。平均值±SD。*p<0.05，双尾T检验；***p<0.001，采用Welch校正的双尾t检验。
小胶质细胞耗竭对NR1存活率的影响。在NR1脑内移植之前3周内和NR1移植之后1周内，向NSG小鼠喂食PLX5622食物或对照食物，之后处死动物。在对照组和PLX5622组中，均观察到NR1存活(图24)。
图24：NSG小鼠大脑中的NR1存活率。原始态NSG小鼠按所述方法喂食对照/PLX5622小鼠食物，并在NR1移植后7天处死。为了检测小鼠纹状体中存活的NR1，采用HuNu对对照和PLX5622样本的30μm大脑组织切片进行染色，仅检测到人/NR1细胞核。a)喂食对照小鼠食物的原始态NSG小鼠的30μm大脑切片的代表性图片，显示了染色后的NR1细胞(红色箭头)。b)喂食PLX5622小鼠食物的原始态NSG小鼠的相应染色切片。
研究1：在该研究中，使用相同的针道，将NR1细胞同时移植到纹状体和皮层中。总体而言，在经PLX5622治疗的动物中，NR1存活率有增加的趋势，但在统计学上并不显著，NR1存活率为2.37％，仍然很低。
研究2：在本研究中，仅将NR1细胞移植到纹状体中，以最大限度地减少细胞沿针道从大脑中泄漏的可能性。NR1存活率的量化表明，在经PLX5622治疗的动物中，NR1存活率略有上升趋势。
结论。PLX5622使大脑中的小胶质细胞数显著减少。在移植后7天，NSG小鼠中耗竭的小胶质细胞数仅使存活NR1细胞的百分比略微增加。
实施例11
作为NR1诱导慢性卒中功能恢复预测因子的T2-FLAIR信号和TSPO-PET
为了研究NR1移植对慢性卒中的免疫调节作用，在大鼠模型中，使用T2-FLAIR MRI信号，作为NR1诱导卒中患者功能恢复的临床预测因子。
在最近的两项干细胞临床试验之后，实现卒中引起的慢性残障疾病的“治愈”距离成为现实又近了一步。在这些早期试验中，当所有自然恢复趋于平稳时，将干细胞注射到卒中后超过6个月-几年(即慢性时间点)患者的大脑中。然而，通过干细胞治疗，大多数患者都出现了具有临床意义的改善。最值得注意的是，SanBio试验中的两名患者表现出显著的恢复状态，重新恢复了显著的肢体使用功能。
这些结果提出了关于“这些患者的大脑中发生了什么情况才引发了恢复”的基本问题。潜在的线索是SanBio试验中的惊讶发现，即移植后6个月、12个月和24个月的运动恢复程度与大脑MRI信号——特别是主要位于前运动皮层中的T2-FLAIR信号——的大小呈正相关。这意味着，通过鉴定干细胞诱导的大脑变化(引起FLAIR信号)，我们可以开始剖析参与卒中恢复的细胞机制和分子机制。
研究目的。为了研究干细胞诱导的FLAIR信号背后的大脑变化，我们在进行了卒中慢性期干细胞移植的慢性皮层下卒中大鼠模型中再现了这一现象。
由于T2-MRI FLAIR信号通常与炎症有关，因此我们对大鼠FLAIR病变(与炎症一致)进行了初步免疫组织化学分析。鉴于SanBio试验中FLAIR信号与恢复之间的相关性，这意味着大脑炎症可能是对慢性期卒中恢复有用的生物标志物。
为了以更高的灵敏度和特异性进行此研究，我们建立了第二种非侵入性成像模态，以监测大鼠的大脑炎症——转运蛋白18kDa(TSPO)的PET成像，即TSPO-PET。在健康大脑中，TSPO水平较低，但在神经炎症条件下，TSPO显著上调。表达TSPO的优势细胞类型有活化的免疫细胞，包括脑部驻留免疫细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞，以及浸润骨髓细胞，如单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞。因此，TSPO-PET放射性配体成为了有用的神经炎症指标，并且在卒中后为期5天-24个月的研究中，在卒中患者的卒中损伤和远端脑区已经观察到TSPO-PET信号增加。7-10
研究设计/方法
在Sprague Dawley(SD)大鼠中，使用皮层下卒中的缝合模型进行T2-FLAIR研究。在慢性期(卒中后1个月)进行干细胞移植，以最佳方式模拟SanBio临床试验的参数。由对治疗组不知情的实验员进行FLAIR损伤分析。根据斯坦伯格实验室IHC方案，对与FLAIR损伤相关的针道区域进行免疫组织化学分析。
在卒中的亚急性期(卒中后7天)，通过NR1细胞的皮层移植，使用皮层卒中的dMCAO模型，在裸大鼠中进行TSPO-PET研究。
结果
T2-MRI FLAIR。啮齿动物FLAIR信号模拟人类对应物，原因在于，该信号在移植后第一周内沿针道短暂出现，但在运动皮层中最为普遍(尽管细胞为皮层下移植细胞)。该信号呈弥散加权成像(DWI)阴性，表明FLAIR信号并非由新发急性缺血性梗死引起(DWI对卒中后早期变化的敏感性高于更传统的MRI测量)。最值得注意的是，在溶媒注射后，我们尚未观察到FLAIR信号，证实了FLAIR信号是一种细胞特异性现象。在三次单独的实验中一致发现了这些数据。
免疫组织化学分析。与FLAIR损伤相关的针道区域的免疫组织化学分析表明，经NR1治疗的动物与经溶媒治疗的动物的炎症反应之间有本质上的差异。在移植后1天，经细胞治疗的动物似乎具有更多的Iba1阳性巨噬细胞/小胶质细胞，特别是在针道边界处出现了更多的活化阿米巴样细胞。星形胶质细胞(GFAP)数量看起来并没有太大差异，但细胞动物中的星形胶质细胞比溶媒动物中的初级突起更厚、分支更少，这表明尽管无法通过形态学确定A1与A2的极化，但星形胶质细胞处于更活化的状态。这些数据为NR1改变FLAIR损伤中的炎症反应开创了先例。
图25.NR1移植前后大鼠皮层中的T2-FLAIR信号。(A)卒中位置(灰色)和移植坐标示意图。(B)移植前后大鼠针道区域中的T2-FLAIR MR图像(tx)(红色箭头指向FLAIR信号)。(C)FLAIR信号的定量分析。平均值±SEM；n＝5/组，来自单独的实验。未观察到小n存在统计学显著差异。
图26.与FLAIR损伤相关的针道区域的免疫组织化学分析。采用NR1或溶媒治疗后第1天皮层卒中损伤SD大鼠的分析。GFAP表示星形胶质细胞。*表示针道。
图27.NR1移植增加了卒中后的TSPO-PET信号。在卒中亚急性期(卒中后第7天)，患有皮层卒中损伤和采用NR1皮层移植的裸大鼠(A)在NR1移植后的前3天表现出皮层TSPO信号增加，但在经溶媒治疗的大鼠中未表现出皮层TSPO信号增加(B，C：平均值±SEM；n＝6)。移植后第3天增加的TSPO信号出现在移植附近(B)，梗死核心(B：红色虚线区域表示核心)、基底神经节(D中的箭头：放射自显影和甲酚紫染色)和海马体(未示出)。
我们的TSPO-PET数据与FLAIR数据一致，表明经NR1治疗的大鼠的免疫细胞活性高于经溶媒治疗的大鼠。在移植部位附近和更远端但相连的大脑区域，均观察到了这一现象，意味着NR1具有广泛的免疫调节作用。研究人员认为，远端炎症十分有害。然而，在慢性卒中患者中，大脑远端区域的TSPI-PET信号与功能恢复相关。因此，在这一卒中阶段，远端炎症可能有益。
结合我们的体内分泌蛋白质组分析和SanBio临床试验，这项工作有力地表明了免疫调节是干细胞在卒中恢复中的主要作用机制。
实施例12
NR1毒理学总结
使用NR1药物进行的一项GLP毒理学研究和三项前导性毒理学研究提供了一致的结果，表明脑内注射到脑实质中的NR1细胞产品具有安全性和耐受性。此外，一项GLP生物分布研究、两项药理学研究和7项其他调查性研究得出了相似的结果，证明NR1药物产品耐受性良好，并且当NR1脑内剂量高达2×106个细胞/动物时，NR1药物产品与大脑或外周组织中的畸胎瘤形成无关。
关键性的单剂量GLP毒理学研究具有长达180天的无治疗随访期，以便有相当长的时间检测可能与NR1药物产品治疗相关的缓慢形成的畸胎瘤。本研究中使用的细胞注射培养基中含有基质胶，它是一种来源于小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤细胞的复合蛋白质混合物，据报道，基质胶中含有鼠类生长因子。众所周知，基质胶促进了干细胞源性神经祖细胞在体细胞组织中的存活。加入基质胶的目的是充分支持细胞生长，NR1细胞和任何污染干细胞都会产生“最糟糕的情形”，从而通过提供最佳生长条件来增加畸胎瘤发展和生长的可能性，从而为NR1安全性评估设定尽可能高的标准。即使存在包含40％基质胶的生长辅助基质，在使用NR1进行的任何研究中也未检测到畸胎瘤，特别是在GLP毒理学研究中，未检测到任何畸胎瘤，在该研究中，100只雄性和雌性无胸腺裸大鼠接受最高2×106个NR1细胞/动物，并在移植后接受长达6个月的随访。
研究中使用的无胸腺裸大鼠模型能够在研究条件下支持干细胞源性畸胎瘤的生长。含有NR1细胞的治疗组确实导致了畸胎瘤形成，其中掺入H9 hESC，其含量范围从2×103个细胞/动物到1×106H9个细胞/动物(分别为NR1总剂量的0.1％-50％)。在H9加标组中，畸胎瘤以剂量依赖的方式出现，范围从第4组的67％(12/18只动物)(50％H9加标)到第8组的5.3％(1/19只动物)(0.1％ H9加标)。在单独使用未加标的NR1药物产品进行治疗的组中，无任何一组形成畸胎瘤。显微镜下可见，接受10％及以上水平H9加标NR1的治疗组中存在的畸胎瘤主要由内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的组织构成，包括各组织(如皮肤、腺体、软骨和/或骨形成以及神经组织)的混合物。这些治疗组中的畸胎瘤往往很大。在接受1％和0.1％ H9加标的组(第7组和第8组)中，显微镜下的畸胎瘤可见，但未看到肉眼可见的畸胎瘤，这些畸胎瘤主要由较小的偶然出现的神经组织组成，具有脉络丛样形成、室管膜上皮和/或接近正常外观的白质的膨出部。它们不包含来源于所有三个胚层的组织。在单独使用NR1药物产品进行治疗的组中，无任何一组形成畸胎瘤。在任何H9加标组或任何接受NR1 IC或IM治疗的组别中，均未观察到大脑外部或远离注射部位处有形成畸胎瘤的证据。
人们并未完全了解基质胶在促进畸胎瘤生长方面的作用，但是研究表明，很明显基质也能够支持NR1的生长和持久性，该研究比较了人类细胞注射培养基中存在和不存在基质胶情况下的NR1细胞持久性。在所有非临床研究中，当细胞注射培养基中有基质胶时，NR1存活率总会提高。然而，即使有40％基质胶，在毒理学研究的6个月内，单独使用最高2×106个细胞剂量的cGMP NR1药物产品(残留H9细胞少于0.01％)进行治疗在成年无胸腺裸大鼠中未导致毒性或畸胎瘤形成或肿瘤形成，证明其在长期随访中的安全性。
表11
实施例13
效价测定研究
临床前研究已经证明，NR1细胞分泌一系列蛋白质，其功能可能有助于修复发生卒中损伤的脑组织。基于蛋白质在轴突发芽、神经发生、突触发生和基质/组织重塑中的已知作用，我们选择了其中六种蛋白质作为候选效价测定标志物，即NR1生物活性的度量。
对于下列每种候选蛋白质，对符合FDA要求的市售试剂盒(三个ELISA试剂盒和三个ProCartaPlexR/Luminex试剂盒)进行了鉴定。
表12
是否接受每个试剂盒作为效价测定的组成部分取决于试剂盒是否达到以下标准：
目标1：将NR1细胞分泌的几种蛋白质选定为效价测定的候选蛋白质。用于选择这些候选蛋白质的标准以临床前研究为基础。
目标2：对符合FDA单克隆抗体对捕获和检测抗体的要求的市售试剂盒进行鉴定。
目标3：确定在完全培养基(CM)存在的情况下，可用试剂盒的性能是否没有改变。确定在NR1完全培养基存在的情况下，检测试剂盒标准滴度的性能。
目标4：确认效价测定各部分的特异性。
目标5：确定是否检测到有限数量的生长因子或其是否导致靶抗原的任何干扰。
目标6：确定在脱靶候选蛋白质的浓度发生变化的情况下，在靶候选蛋白质是否仍能准确定量，并采用以下物质，对效价测定的每个部分进行测试：a)脱靶候选蛋白质，作为阴性对照；b)一系列样本，其中，用浓度变化的脱靶候选蛋白质稀释在靶候选蛋白质。
目标7：使用在各种生长条件下产生的NR1条件培养基(CM)，确定适合每种候选蛋白质鉴定的稀释比例。一旦确定，将对该测定的每个组成部分进行分析内/分析间精密度、线性稀释准确性、动态范围和再现性测试。
三个ELISA试剂盒和四个ProCartaPlexR/Luminex试剂盒中的三个试剂盒已经达到目标1-6。我们正在完成所有试剂盒的目标7。我们希望及时完成剩余目标和测定鉴定，以便提交NR1干细胞疗法，用于任何III期临床试验和后续许可/上市申请。
前述内容仅说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，这些布置尽管在本发明中未明确描述或示出，但是体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本发明所列举的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和诸位发明人为拓深领域而提供的概念，并且应被解释为不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本发明中记载本发明的原理、方面和实施例及其特定示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，其意图在于该等同物包括当前已知的等同物以及将来研发的等同物，即所研发的执行相同功能的任何要素(无论其结构如何)。因此，本发明的范围并非旨在限制本发明所示和所述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神通过所附的权利要求书体现。

Claims (41)

1.一种通过增加大脑皮层中的外源性营养因子，以增强受试者中的内源性神经修复过程，从而治疗患有卒中或创伤性脑损伤的受试者的方法，所述方法包括：
向受试者施用治疗有效量的具有正常核型的非基因修饰NR1 ES源性神经干细胞，所述细胞表达营养因子，以恢复受试者的神经功能，从而治疗患有卒中或创伤性脑损伤的受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述神经干细胞是分离的非基因修饰NR1 ES源性神经干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述卒中是缺血性卒中或出血性卒中。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述给药通过大脑皮层移植或大脑皮层下移植进行。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述NR1 ES源性神经干细胞的给药包括将所述NR1 ES源性神经干细胞植入到受试者的大脑皮层中或其附近。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述受试者的大脑皮层包括前额皮层、运动联合皮层、初级运动皮层或初级体感皮层中的任何一种。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，给药包括在卒中或创伤性脑损伤后至少一周，将NR1 ES源性神经干细胞移植到受试者的大脑皮层下区域或皮层区域中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，大脑皮层下区域是海马体、杏仁核、泛杏仁核、屏状核、基底神经节或基底前脑中的任何一种。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述大脑皮层区域是前额皮层、运动联合皮层、初级运动皮层或初级体感皮层中的任何一种。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述NR1 ES源性神经干细胞表达ColA1、LGALS1、TGF-B3、TIMP1、COL6A1、COL3A1、MMP2、SPARC、NRG3、SDF1(a)、半乳糖凝集素1、FGF18、CSF3、CCL2(又名MCP-1)、FGF7、FGF17、PAI1/丝氨酸蛋白酶抑制因子1、VEGF-A、MCP1(CCL2)和/或SDF1α中的一种或多种或其组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述营养因子是可以通过增加大脑皮层和/或皮层下区域内的血流量和血管信号以及增加结构可塑性来增强神经新生血管修复过程的营养因子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述营养因子包括生长因子、细胞因子和/或细胞外基质蛋白的组合。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述细胞外基质蛋白是ColA1、LGALS1、TGF-B3、TIMP1、COL6A1、COL3A1、MMP2、SPARC、NRG3、SDF1(a)、半乳糖凝集素1、FGF18、CSF3、CCL2(又名MCP-1)、FGF7、FGF17、PAI1/丝氨酸蛋白酶抑制因子1、VEGF-A、MCP1(CCL2)和/或SDF1a中的任何一种或其组合。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，增加的结构可塑性涉及突触发生、树突分支和轴突发芽中的任何一种。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述恢复的神经功能可使上肢功能部分或完全恢复。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述上肢功能是抬起或举起受试者的手臂。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，恢复神经功能包括恢复行走或平衡能力，或逆转步态障碍、无法行走或失去平衡。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，步态障碍包括行走速度下降、行走方式不对称、步长缩短、步宽增加、患肢摆动期延长、通过物理障碍的能力下降、根据地形变化调整行走的能力下降、节律性运动丧失、跨过横梁的能力减弱中的任何一种及其组合。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，逆转受试者行动障碍包括提高行走速度、增加对称行走方式、提高步长、减小步宽、减少患肢摆动期的持续时间、提高通过物理障碍的能力、提高根据地形变化调整行走的能力、增加节律性运动、提高跨过横梁或梯子的能力中的任何一种及其组合。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述脑损伤位于受试者大脑皮层或皮层下区域外侧。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述脑损伤位于受试者大脑皮层或皮层下区域处或周围。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述受试者是从人、猴子、黑猩猩、猿、狐猴、小鼠、大鼠、松鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、鼩鼱、鼹鼠、水貂、猫、狗、猪、牛、山羊、驴、马、绵羊和非人灵长类动物中选择的哺乳动物。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
24.一种通过增加大脑皮层中的外源性营养因子，以增强受试者中的内源性神经修复过程，从而抑制、减少或逆转卒中后受试者运动缺陷的方法，所述方法包括：
向受试者施用治疗有效量的神经干细胞，所述神经干细胞表达营养因子，以便恢复受试者的神经功能，从而抑制、减少或逆转受试者的运动缺陷。
25.一种通过增加大脑皮层中的外源性营养因子，以增强受试者中的内源性神经修复过程，从而治疗卒中后受试者运动缺陷的方法，所述方法包括：
向受试者施用治疗有效量的神经干细胞，所述神经干细胞表达营养因子，以便恢复受试者的神经功能，从而治疗受试者的运动缺陷。
26.一种通过采用权利要求24所述的方法抑制、减少或逆转运动缺陷，减少或逆转受试者的运动缺陷，从而使因卒中而患有运动缺陷的受试者康复的方法。
27.一种通过采用权利要求25所述的方法治疗受试者的运动缺陷，使因卒中而患有运动缺陷的受试者康复的方法。
28.一种具有正常核型的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞的隔离群体，所述细胞分泌营养因子，所述营养因子包括生长因子、细胞因子和/或细胞外基质蛋白的组合。
29.根据权利要求28所述的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞，其保藏号为ATCCNo.xxxx。
30.根据权利要求28或29所述的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞，所述细胞源自具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞，所述具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞培养了至少15代，从而表现出正常核型。
31.根据权利要求30所述的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞，其中，所述具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞培养了至少16代，从而表现出正常核型。
32.根据权利要求30所述的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞，其中，所述具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞培养了至少17代，从而表现出正常核型。
33.根据权利要求30所述的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞，其中，所述具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞培养了至少18代，从而表现出正常核型。
34.根据权利要求30所述的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞，其中，所述具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞培养了至少19代，从而表现出正常核型。
35.根据权利要求30所述的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞，其中，所述具有异常核型的非基因修饰NR1 ES神经干细胞培养了至少20代，从而表现出正常核型。
36.一种限定的细胞群体，包括权利要求28-35中任一项所述的多个NR1 ES源性神经干细胞。
37.一种组合物，包括权利要求36所述的哺乳动物NR1 ES源性神经干细胞的限定群体；以及药学上可接受的载体。
38.一种未分化的人NR1 ES源性神经干细胞的持续培养物，包括：
一种预处理的饲养基质，
条件培养基；以及
具有正常核型的NR1 ES源性神经干细胞。
39.一种在限定的细胞培养条件下生产具有正常核型的人NR1 ES源性神经干细胞的方法，其中，所述方法包括：
(a)在不存在饲养细胞的情况下，在含有gluatmax、N2添加剂和B27(不含RA、EGF、FGF、LIF和PHS)的培养基中的固态支撑体上培养人NR1 ES源性神经干细胞；
从而在限定的细胞培养条件下体外产生人NR1 ES源性神经干细胞。
40.一种用于治疗与受试者脑损伤相关的行动障碍的套件，所述套件包括：
(a)具有正常核型的NR1 ES源性神经干细胞，所述细胞表达营养因子；
(b)一个标签和关于如何使用所述套件的说明书。
41.根据权利要求40所述的套件，进一步包括一个含有NR1 ES源性神经干细胞的注射器。
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